segunda practica pqaa vmarzo2015

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Químico Farmacéutico Biólogo

MANUAL DE PRÁCTICAS DE QUÍMICA ANALÍTICA AVANZADA

Dr. Jorge Luis Guzmán Mar Dra. María del Rayo Camacho Corona Dra. Ma. Araceli Hernández Ramírez Dr. Abraham García

Registro ISBN en trámite

Manual de Prácticas de Química Analítica Avanzada Químico Farmacéutico Biólogo

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ÍNDICE GENERAL

Página PRÁCTICA No. 1 Determinación de metanol y etanol en bebidas alcohólicas por cromatografía de gases.

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PRÁCTICA No. 2 Determinación de cafeína en bebidas por cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC).

PRÁCTICA No. 3.

Resonancia Magnética Nuclear de Protón (RMN 1H). 8

ANEXO 1.

Residuos y colectores. 15 BIBLIOGRAFÍA 17


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Constantes de acoplamiento de los protones vinílicos del ácido Z-3-cloropropenoico y el ácido E-3-cloropropenoico

ÍNDICE DE TABLAS

Página Tabla 2.1.

Relación entre fase normal y fase reversa. 10 Tabla 3.1.

Intensidades relativas de los multipletes de primer orden

Tabla 3.2. Algunos valores típicos de constantes de acoplamiento

Tabla 3.3. Desplazamientos químicos de RMN 13C para algunos grupo funcionales


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PRÁCTICA No. 2

DETERMINACIÓN DE CAFEÍNA EN BEBIDAS POR CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN

(HPLC) Introducción.

La cafeína (Figura 2.1) es un alcaloide del grupo de las xantinas, sólido cristalino, blanco y de sabor amargo, que actúa como una droga psicoactiva y estimulante. La cafeína fue descubierta en 1819 por el químico alemán Friedrich Ferdinand Runge: fue él quien acuñó el término Koffein, un compuesto químico en el café, el cual pasaría posteriormente al español como cafeína.

Figura 2.1. Estructura molecular de la cafeína. La cafeína puede encontrarse en cantidades variables en las semillas, las hojas y los frutos de algunas plantas, donde actúa como un pesticida natural que paraliza y mata ciertos insectos que se alimentan de las plantas. Es consumida por los humanos principalmente en infusiones extraídas del fruto de la planta del café y de las hojas del arbusto del té, así como también en varias bebidas y alimentos que contienen productos derivados de la nuez de cola. Otras fuentes incluyen la yerba mate, el fruto de la Guaraná y el acebo de Yaupón. En los humanos, la cafeína es un estimulante del sistema nervioso central que produce un efecto temporal de restauración del nivel de alerta y eliminación de la somnolencia. Las bebidas que contienen cafeína, tales como el café, el té, algunas bebidas no alcohólicas (especialmente los refrescos de cola) y las bebidas energéticas gozan de una gran popularidad. La cafeína es la sustancia psicoactiva más ampliamente consumida en el mundo. En Norteamérica, el 90% de los adultos consumen cafeína todos los días. En los Estados Unidos, la FDA (Administración de Drogas y Alimentos, por sus siglas en inglés) se refiere a la

N

NN

N

H3C

O

O

CH3

CH3


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cafeína como una "sustancia alimenticia generalmente reconocida como segura que se utiliza para múltiples propósitos". El consumo en cantidades muy grandes puede provocar una intoxicación. Sus síntomas son: insomnio, nerviosismo, excitación, cara rojiza, aumento de la diuresis y problemas gastrointestinales. En algunas personas los síntomas aparecen consumiendo cantidades muy pequeñas, como 250 mg por día. Más allá de un gramo al día puede producir contracciones musculares involuntarias, desvaríos, arritmia cardiaca, y agitaciones psicomotrices. Los síntomas de la intoxicación con cafeína son similares a los del pánico y de ansiedad generalizada. La LD50 estimada de la cafeína es de 10 g, cuyo equivalente es de un promedio de 100 tazas de café. Objetivo. Determinar la concentración de cafeína en bebidas por cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) con detección espectrofotométrica UV-Vis. Instrumentación.

La cromatografía es una herramienta útil y versátil para la separación de especies químicas muy relacionadas. Se puede emplear para la identificación cualitativa y la determinación cuantitativa de las especies ya separadas. Los métodos cromatográficos se pueden clasificar de dos tipos según donde se encuentre contenida la fase estacionaria:

a) Cromatografía en columna: donde la fase estacionaria está contenida en un tubo estrecho a través de la cual se hace pasar la fase móvil por presión.

b) Cromatografía plana: donde la fase estacionaria se fija sobre una placa plana o a los intersticios de un papel; en este caso la fase móvil se desplaza a través de la fase estacionaria por capilaridad o por gravedad.

Otra clasificación se basa en el tipo de fase móvil y estacionaria, y en la clase de equilibrios implicados en la transferencia de los solutos entre las fases; las tres clases generales de esta clasificación son: cromatografía de líquidos, cromatografía de gases y cromatografía de fluidos supercríticos. La cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC), es la técnica más versátil y más utilizada de todos los tipos de cromatografía de elución en columna. La fase móvil es un disolvente líquido que contiene a la muestra como mezcla de solutos.


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La cromatografía de líquidos de alta resolución se puede clasificar según la naturaleza de la fase estacionaria en:

a) Cromatografía de reparto o cromatografía líquido-líquido. b) Cromatografía de adsorción o líquido-sólido. c) Cromatografía iónica o de intercambio iónico. d) Cromatografía de exclusión por tamaño. e) Cromatografía de afinidad.

Clases principales de fases estacionarias en cromatografía líquido-líquido:

a) Fase normal: Las columnas están empacadas con un soporte de gel de sílice a la cual se le une químicamente cualquiera de los siguientes grupos polares: ciano (-C2H4CN), diol (-C3H6OCH2CHOHCH2OH), amino (-C3H6NH2), dimetil amino (-C3H6N(CH3)3); estas trabajan en el modo partición.

b) Fase inversa: las fases estacionarias de fase inversa en cromatografía es la forma más común de HPLC, es un tipo de cromatografía de partición. Frecuentemente, las columnas se empaquetan con n- octadecilo enlazado químicamente a gel de sílice. Tales columnas están referidas como C-18 y son no-polares. Otras fases estacionarias no polares son siloxano de octilo (C-8) y siloxano de metilo (C-1).

El eluente (fase móvil) usado en las columnas de fase inversa es relativamente polar, ej. MeOH/H2O. Los componentes más polares en la mezcla son conducidos preferentemente por el eluente, por lo tanto en esta separación son relativamente desfavorables los componentes no polares. Al aumentar la polaridad de los solventes aumenta el tiempo de la retención de un componente en particular. La situación se invierte cuando se utiliza una cromatografía de adsorción (fase estacionaria polar: gel de sílice) o cromatografía liquido líquido de fase normal (Tabla 2.1).

Tabla 2.1. Relación entre fase normal y fase reversa.

Normal Inversa

Polaridad del empaquetado Alta Baja

Polaridad del Solvente Baja Alta

Orden de elución de los analitos en la columna

Primero no-polar, después polar

Polar primero, después no polar


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En HPLC, se usan columnas estrechas con diámetros interiores 2-80 mm. Estas columnas se condensan con partículas que tienen un diámetro menor a 50 micras. Tales columnas requieren presiones altas (1000-6000 psi) para mantener un flujo conveniente del solvente de arrastre (fase móvil), normalmente en el rango 0.1-10 mL/min. La resolución es considerablemente superior a lo logrado con una columna ordinaria, en parte debido al empaquetado firme de la fase estacionaria que reduce difusión lateral y debido al área de la superficie grande del empaquetado. Comparada con la columna clásica de cromatografía, donde las columnas son alimentadas por gravedad, una separación puede tardar horas o incluso días, la técnica de HPLC puede ofrecer tiempos del análisis de 5-30 min. Tales tiempos son comparables a los necesitados para los análisis de Cromatografía de Gases (CG). La eficiencia de un detector cromatográfico depende de la relación entre la cantidad física medida y la composición del eluente, así como también de las características de la señal transferida. Los tipos de detectores en HPLC se clasifican en:

a) Detectores basados en una propiedad de la fase móvil. Ejemplo: Detector de Índice de Refracción.

b) Detectores basados en una propiedad de la sustancia a separar. Ejemplo: Detector de Fluorescencia, Detector Ultravioleta-Visible.

Los detectores más utilizados en HPLC son:

a) UV-Vis. b) Arreglo de Diodos. c) Índice de Refracción. d) Fluorescencia. e) Fluorescencia Inducida por Laser. f) Electroquímicos: Amperométrico, Conductimétrico y Potenciométrico.

La técnica de HPLC se utiliza para el análisis de componentes no reconocibles en ensayos por cromatografía de gases. Por ejemplo, los compuestos térmicamente inestables pueden ser analizados por HPLC a temperatura ambiente, y los compuestos no volátiles o de alta polaridad. El tratamiento de la muestra es a menudo mínimo, pueden usarse soluciones acuosas (Figura 2.2).


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Figura 2.2. Esquema general de un sistema de HPLC. Soluciones y reactivos.

1. Muestra real: bebida energética de marca comercial, por equipos de trabajo.

2. Prepare 100 mL de una solución estándar de 50 mg/L de cafeína. 3. Metanol grado HPLC, 200 mL. 4. Agua grado HPLC o NanoPure, 300 mL. 5. Ácido fosfórico grado analítico, 10 mL. 6. Preparación de fase móvil: Prepare un volumen de 500 mL, en una relación

volumen/volumen (v/v) metanol/agua/ácido fosfórico de 40:59.92:0.08, equivalentes a 200 mL de metanol, 299.6 mL de agua y 0.4 mL de ácido fosfórico, mezclar adecuadamente, filtrar y desgasificar en baño de ultrasonido.


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Aparatos y materiales.

1. Cromatógrafo de líquidos de alta resolución con detector espectrofotométrico UV-Vis.

2. Columna cromatográfica C18. 3. Jeringa de inyección para cromatografía de líquidos. 4. Balanza analítica. 5. Matraces aforados de 10 y 25 mL. 6. Pipetas volumétricas de 1, 5 y 10 mL. 7. Pipetas graduadas de 1, 5 y 10 mL. 8. Vasos de precipitado de 50 y 100 mL.

Procedimiento. 1) Se preparan disoluciones del estándar puro de cafeína que contienen 5, 10, 15,

20, 25 y 30 mg/L de cafeína en fase móvil, respectivamente. 2) Se fija la longitud de onda de detección en 254 nm y el caudal de fase móvil en

1.0 mL/min. Se procede a estabilizar la columna y monitoreo de la línea base. 3) Estabilizada la columna, se procede a inyectar cada uno de los estándares de

cafeína y se registran los cromatogramas calculando la altura y el área del pico cromatográfico de la cafeína. Anotar el tiempo de retención (tR) de la cafeína.

4) Se gráfica la curva de calibrado representando el área del pico cromatográfico frente a la concentración de cafeína y también frente a la altura de pico, se comparan ambas curvas.

5) Se tomas 3 alícuotas de 10 mL de la muestra problema (véase Preparación de Muestras) y se adicionan a tres matraces aforados de 25 mL, cada uno de ellos se procede a su desgasificación, de ser posible de 10 a 15 min en un baño de ultrasonido, finalmente se aforan con fase móvil.

6) Cada muestra es inyectada al cromatógrafo de líquidos, registrando el cromatograma y calculando tanto la altura como el área de cada pico al tiempo de retención correspondiente a los estándares puros de cafeína.

7) Con dichos valores determine la concentración de esta sustancia en la muestra problema a partir de la ecuación lineal de la curva de calibración.

Nota. El instructor explicará las partes básicas y el manejo del equipo

cromatográfico. Además de los ajustes necesarios de operación. Preparación de muestras. 1.- Café Instantáneo: Coloque 2.5 g de café instantáneo en 150 mL de agua caliente contenida en un matraz Erlenmeyer de 250 mL. Deje hervir 1 minuto, enfríe a temperatura ambiente y afore con agua en matraz volumétrico de 200 mL. Tome 10 mL de la bebida y filtre para remover partículas mayores de 0.45 µm.


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Tome 5 mL del filtrado y afore con la fase móvil en un matraz volumétrico de 250 mL para obtener una dilución 1:50. 2.- Café Arábiga: Coloque 5 g de café molido en 200 mL de agua caliente contenida en un matraz Erlenmeyer de 250 mL. Deje hervir 5 minutos y después retire para enfriar a temperatura ambiente. Afore con agua a 200 mL en caso necesario. Tome 10 mL de la bebida y filtre para remover partículas mayores de 0.45 µm. Tome 5 mL del filtrado y afore a 250 mL en un matraz volumétrico con la fase móvil para obtener una dilución 1:50. 3.- Té: Coloque 5 g de té verde (o té mate) en 200 mL de agua caliente (en ebullición) en un matraz Erlenmeyer cerrado y con agitación continua por 30 minutos. Deje enfriar a temperatura ambiente y afore con agua a 200 mL en caso necesario. Tome 10 mL de la bebida y filtre para remover partículas mayores de 0.45 µm. Tome 5 mL del filtrado y afore a 250 mL en un matraz volumétrico con la fase móvil para obtener una dilución 1:50. 4.- Cacao, Chocolate oscuro: Coloque 5 g de cacao en polvo (o 8.85 g de chocolate en polvo o triturado) en 200 mL de agua a 60 Celsius en un baño de ultrasonido por 30 minutos. Tome 10 mL de la bebida y filtre para remover partículas mayores de 0.45 µm. Tome 5 mL del filtrado y afore a 250 mL en un matraz volumétrico con la fase móvil para obtener una dilución 1:50. 5.- Bebidas energizantes y de cola: Desgasifique las bebidas en un baño de ultrasonido por 15 minutos para liberar el CO2. Tome 10 mL de la bebida y filtre a través de un filtro de nylon de 0.22 µm. Tome 5 mL del filtrado y afore a 250 mL en un matraz volumétrico con la fase móvil para obtener una dilución 1:50. Disposición de reactivos. Coloque los residuos generados en esta práctica en el colector C. Los reactivos y soluciones sobrantes regresarlos al auxiliar de laboratorio. Reporte. 1. El cromatograma obtenido del estándar y de la muestra problema de cafeína. 2. El tiempo de retención de cafeína (tR). 3. La curva de calibración por área y altura. 4. Informe la concentración de cafeína presente en la muestra problema y el

intervalo de confianza, si fue posible realizar al menos 3 réplicas de la muestra problema.

5. Todos los cálculos desarrollados. 6. Reportar la bibliografía consultada. Cuestionario.


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1. ¿Cómo se afecta la altura de plato teórico (H) con el tamaño de las partículas del empaquetamiento de la columna?

2. ¿Cómo se afecta la altura de plato teórico (H) con la velocidad de flujo de la fase móvil?

3. ¿Cuál es la diferencia entre una elución isocrática y una elución en gradiente? 4. ¿En qué consiste la cromatografía de adsorción?, dé un ejemplo de aplicación. 5. ¿En qué consiste la cromatografía de partición?, dé un ejemplo. 6. ¿En qué consiste la cromatografía en fase inversa (o reversa)?, dé un

ejemplo. 7. ¿Qué son los empaques con fase ligada químicamente y para qué se usan? 8. ¿En qué se basa la cromatografía de intercambio iónico?, dé un ejemplo. 9. ¿En qué se basa la cromatografía de permeación en gel?, qué aplicaciones

tiene y de un ejemplo. 10. Compare la cromatografía de líquidos con la cromatografía de gases

(semejanzas y diferencias, ventajas y desventajas, desplegadas en una tabla).


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ANEXO 1 Colectores para la disposición de residuos y productos generados durante las prácticas de laboratorio.


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