manual laboratorio de microbiología agosto 2012
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ÍNDICE
Presentación…………………………………………………………………
Normas generales para el trabajo en el laboratorio……………………….
Procedimientos de laboratorio………………………………………………
Materiales indispensables para cada práctica…………………………….
Práctica 1. La bioseguridad en el laboratorio de microbiología………...
Práctica 2. Manejo y uso del microscopio óptico compuesto…………
Práctica 3. Tinción Gram……………………………………………………
Práctica 4. Tinción de Ziehl Neelsen…………………………………….
Práctica 5. Tinción de cápsula y espora……………………………………..
Práctica 6. Preparación y esterilización de material y medios de cultivo…
Práctica 7. Obtención de un cultivo puro de bacterias y mohos…………
Práctica 8. Preparación de medios de cultivo enriquecidos……………...
Práctica 9. Preparación y utilización de medios de cultivo selectivos…..
Práctica 10. Preparación de medios de cultivo diferenciales para
enterobacterias (bacilos Gram negativos)………………………………….
Práctica 11. Pruebas de diferenciación bioquímica………………………….
Práctica 12. Recuento en Placa de Unidades Formadoras de Colonias….
Práctica 13. Efecto de los metales pesados y detergentes………………...
Práctica 14 .Control de microorganismos utilizando luz ultravioleta……….
Bibliografía……………………………………………………………………..
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PRESENTACIÓN
La microbiología es la ciencia que estudia a los organismos microscópicos. Esta
definición implica que el objeto material de la microbiología viene delimitado por
el tamaño de los seres que investiga, lo que supone que abarca una enorme
heterogeneidad de tipos estructurales, funcionales y taxonómicos: desde
partículas no celulares como los virus, viroides y priones, hasta organismos
celulares tan diferentes como las bacterias, los protozoos y parte de las algas y
de los hongos.
Los microorganismos están presentes por todas partes a nuestro
alrededor y, a pesar de sus aspectos más negativos, son absolutamente
necesarios para el desarrollo de la vida en nuestro planeta.
El estudio de los microorganismos comprende el conocimiento de su
forma, estructura, reproducción, fisiología, metabolismo e identificación. Trata
de su distribución en la naturaleza, de sus relaciones recíprocas, así como los
efectos benéficos o perjudiciales para el hombre y los demás seres vivos, y
por último, de las transformaciones físicas y químicas que ejercen en su medio
circundante.
El presente manual de prácticas de Microbiología General pretende de
manera general, introducir al estudiante en el estudio de los microorganismos,
en sus características morfológicas, de cultivo y crecimiento, medidas de control
4
así como del conocimiento de la metodología y herramientas básicas del
trabajo de un laboratorio de microbiología, garantizando con ello la
manipulación adecuada de los microorganismos para evitar la contaminación
del medio ambiente y personal, complementando así los temas comprendidos
en las sesiones teóricas.
Este manual comprende 14 prácticas, que de manera gradual introducen
al estudiante con los procedimientos de bioseguridad, técnicos de tinción,
observación al microscopio de la morfología de los diferentes tipos de
microorganismos, técnicas de aislamiento y cultivo de acuerdo a las
necesidades nutricionales, detección de su metabolismo, cuantificación y
medidas de control. Este manual puede ser utilizado en el programa de la
materia de Microbiología General de las licenciaturas de Químico Biólogo
Clínico y Químico en Alimentos, ofrecidas en la Universidad de Sonora.
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NORMAS GENERALES PARA EL TRABAJO EN EL
LABORATORIO
Para el Desarrollo de las Prácticas es Conveniente Tener Siempre en Cuenta
las Siguientes Normas Básicas
1. Indispensable el uso de bata (abrochada) quitarse antes de salir del
laboratorio.
2. Lavarse las manos con agua y jabón al inicio y al final de cada práctica y
cada vez que se sospeche el contacto con material contaminado, usar
guantes, cubrebocas y además lentes de seguridad y para el uso de
luz UV.
3. Prohibido, comer, beber, fumar, almacenar alimentos, aplicarse
cosméticos, cambiarse lentes de contacto.
4. Usar lentes de contacto solamente cuando no sea posible otro tipo de
lentes. Trabajar con el cabello recogido cuando éste sea largo.
5. No pipetear con la boca, usar bombilla o pipeteador automático.
6. No deben dejarse mecheros encendidos si no se está trabajando con
ellos. Asimismo, debe evitarse la proximidad del mechero a sustancias
inflamables, tales como alcohol, éter, entre otras.
7. Minimice la generación de aerosoles.
8. En caso de accidente (ruptura de material contaminado, derramamiento
de microorganismos) se comunicará inmediatamente al instructor o al
responsable del laboratorio.
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9. Observe las medidas de seguridad establecidas en el laboratorio.
10. No se admitirán visitas personales que distraigan y pongan en riesgo la
seguridad en el trabajo que se realiza.
PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO
1. Mantener la disciplina dentro del laboratorio, hablando lo necesario sin
levantar la voz, manteniendo siempre el orden y evitando cualquier
escándalo.
2. Desinfectar el área de trabajo antes y después de trabajar, mantener
ordenado y limpio su espacio.
3. Siempre deberá dejar perfectamente limpios todos los equipos utilizados
(microscopios, autoclave, balanza analítica, etc.)
4. Al concluir cada práctica el estudiante deberá asegurarse de que los
materiales de desecho u objetos contaminados sean colocados en
recipientes específicos para ello, colocarlos en lugares apropiados, que les
indicará el profesor.
5. Por ningún motivo se podrá sustraer el material y/o equipo sin la
autorización del maestro responsable del laboratorio.
6. Abstenerse de intentar reparar equipo por iniciativa propia y/o manipular
equipo del cual se desconoce su operación.
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7. Libros, mochilas, carpetas y cualquier otro material que no se utilice en la
realización de la práctica deben ser apartados del lugar de trabajo.
8. Las siembras y resiembras deberán realizarse siempre en el área de
esterilidad del mechero Bunsen (aproximadamente 15 cm). Se deben evitar
los desplazamientos innecesarios por el laboratorio, ya que crean corrientes
de aire que originan contaminaciones o pueden ser causa de accidentes.
MATERIALES INDISPENSABLES PARA CADA PRÁCTICA
1. Bata de laboratorio limpia, manga larga y con sistema de apertura rápido.
2. Protocolo de la práctica y bitácora de laboratorio
3. Marcador indeleble, tijeras, cerillos u encendedor, masking tape, cinta
adhesiva transparente.
4. Portaobjetos, cubreobjetos, asas de punta recta y punta redonda.,
5. Mechero bunsen o Fisher.
6. Placas Petri desechables.
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Práctica Nº 1
SESIÓN TEÓRICA
LA BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA
Objetivo
Cubrir los diferentes aspectos básicos de la Bioseguridad desde las
prácticas estándar, técnicas de desinfección, niveles de bioseguridad, buenas
prácticas de laboratorio, el uso de equipo de protección personal y el manejo
de residuos de acuerdo a la Norma Oficial Mexicana NOM-087-SEMARNAT-
SSA1-2002).(http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/087ecolssa.html)
(Último acceso 19 de junio de 2012.)
Introducción
La bioseguridad es un concepto amplio que implica una serie de medidas
orientadas a proteger al personal que trabaja en el laboratorio, a los pacientes y
al medio ambiente que pueden verse afectados como resultado de las
actividades en el laboratorio. Al trabajar en un laboratorio existe un riesgo, el
cual implica la probabilidad de que ocurra un daño, lesión o enfermedad. En el
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contexto de los laboratorios clínicos, la evaluación del riesgo se concentra
principalmente en la prevención de infecciones de laboratorio, cuando se trate
de actividades de laboratorio que involucren material infeccioso o
potencialmente infeccioso, la determinación del riesgo representa un ejercicio
crítico y productivo. Ayuda a asignar los niveles de bioseguridad (instalaciones,
equipo y prácticas) que reducen al mínimo el riesgo de exposición del
trabajador o del ambiente a un agente (OMS, 2005).
Los factores de interés en la evaluación del riesgo incluyen: La
patogenicidad del agente infeccioso, la ruta de transmisión (por ejemplo,
parenteral, por aire o por ingestión), la estabilidad del agente, la dosis infecciosa
del agente, la concentración (número de organismos infecciosos por unidad de
volumen), el origen del material potencialmente infeccioso. Otro de los factores
esenciales a ser considerados es la disponibilidad de una profilaxis eficaz o la
intervención terapéutica (Chosewood y Wilson, 2009).
Actividad:
Realizar un resumen de la NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002
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Práctica Nº 2
MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO COMPUESTO
Objetivo
El alumno identificará cada una de las partes del microscopio compuesto
y lo manejará correctamente, observando la presencia de microorganismos en
muestras biológicas a través de preparaciones húmedas.
Material
Porta y cubreobjetos, 2 tubos de 13x100, guantes y cubrebocas. Reactivos:
Lugol. Material biológico: Orina o materia fecal humana, agua de estanques o
yogurt
Introducción
El microscopio es el instrumento más frecuentemente utilizado y el más
útil en un laboratorio de microbiología, proporciona la amplificación o
agrandamiento que nos permite ver organismos y estructuras invisibles a simple
vista. Los microscopios permiten una amplia gama de amplificaciones, desde
cien veces a cientos de miles de veces. Con el microscopio podemos observar
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forma, tamaño, características tintoriales y ciertas estructuras presentes en los
microrganismos (Becker, y col., 2007).
Las dos categorías de microscopios disponibles son los microscopios
ópticos y los microscopios electrónicos. Los microscopios ópticos utilizan un
sistema de lentes ópticos y comprenden los microscopios de campo claro,
campo oscuro, fluorescencia y contraste de fases. Los microscopios
electrónicos emplean flujos de electrones en lugar de ondas de luz por lo que,
mientras que con el microscopio óptico ordinario o el de contraste de fases las
estructuras más pequeñas que pueden observarse tienen unos 0.2 µm, con el
microscopio electrónico pueden verse fácilmente objetos de 0.001 µm (Arenas-
Alatorre, 2005).
El examen directo de microorganismos vivos puede tener gran utilidad
para determinar relaciones de tamaño, forma y movilidad. Puede ser
preparación en fresco y gota suspendida. La ventaja de esta última técnica, es
que la preparación permanece húmeda y puede ser observada durante un
tiempo más largo. Ambos métodos preservan la forma natural de los
microorganismos y reducen los efectos de distorsión que suelen ocurrir cuando
los especímenes se secan y fijan. Las preparaciones en fresco se utilizan para
observar microorganismos vivos principalmente parásitos en heces (Versalovic,
2011).
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Manejo y Uso del Microscopio Óptico
1. Colocar el microscopio sobre una superficie plana, limpia y libre de objetos
o material que pudiera entorpecer la labor.
2. Si es necesario mover el microscopio hscerlo con una mano en el brazo y
otra debajo de la base. Acomodar el microscopio con los oculares y platina
frente al observador en una posición cómoda frente a Usted.
3. Colocar el portaobjetos con la preparación sobre la platina sujetándola con
las pinzas metálicas.
4. Colocar el objetivo de menor aumento en posición de uso y hacer
descender la platina con el tornillo macrométrico
5. Iniciar la observación con el objetivo de 4 aumentos (4X) o colocar el de
10 aumentos (10 X) si la preparación es de bacterias.
6. Para realizar el enfoque:
a) Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación, haciendo subir la
platina con el tornillo macrométrico. Esto debe hacerse mirando
directamente y no a través del ocular, ya que se corre el riesgo de
incrustar el objetivo en la preparación pudiéndose dañar alguno de ellos
o ambos.
b) Una vez logrado el mayor acercamiento entre la preparación y el objetivo,
observar a través de los oculares y hacer descender lentamente la
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platina con los tornillos macrométrico y micrométrico hasta lograr un
enfoque del material presente en la preparación.
7. Luego mover el revólver y colocar el siguiente objetivo de mayor aumento
la imagen debería estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover
un poco el tornillo micrométrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de
objetivo se perdió por completo la imagen, es preferible volver a enfocar
con el objetivo anterior y repetir la operación desde el paso 3. El objetivo
de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparación y por ello es fácil
que ocurran dos tipos de percances: 1) incrustarlo en la preparación si se
descuidan las precauciones anteriores y 2) mancharlo con aceite de
inmersión si se observa una preparación que ya se enfocó con el objetivo
de inmersión.
8. Girar el objetivo seco fuerte, fuera de la trayectoria de observación.
Adicionar una gota de aceite de inmersión sobre el área del portaobjetos,
ajuste el objetivo de inmersión (100X) en posición y enfoque la preparación
con el tornillo micrométrico. Registrar sus observaciones.
9. Cuando haya finalizado su observación, girar el revólver para colocarlo en
el objetivo de menor aumento (posición inicial). Nunca hacer girar el
objetivo seco fuerte (40X) sobre el aceite de inmersión.
10. Limpiar cada uno de los objetivos con papel y solución para lentes (el
exceso de aceite del portaobjetos, primero elimínelo mediante el uso de un
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trozo de papel absorbente, sin tallar y el resto con un trozo de papel
especial para lentes o de un pañuelo desechable).
11. Cubrir el microscopio sin desconectarlo.
Preparación Directa o en Fresco ("entre porta y cubre")
Muestra de Orina:
1. Centrifugar aproximadamente 5 mL de orina a 2,500 rpm durante 5 minutos.
2. Desechar el líquido sobrenadante en el lavabo y proceder a mezclar el
sedimento urinario.
3. Con la ayuda de una pipeta Pasteur colocar una gota del sedimento
mezclado en el centro de un portaobjetos limpio y seco.
4. Colocar encima un cubreobjetos y observar con el objetivo débil, seco-
fuerte y si es necesario aplicar una gota de aceite de inmersión y
observaron el objetivo de mayor aumento (100X). Registrar sus
observaciones.
Muestra de Materia Fecal con Solución de Lugol:
1. En un portaobjetos limpio y seco, colocar una gota de solución de lugol.
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2. Con un aplicador de madera tomar una pequeña cantidad de materia fecal y
depositarla en el portaobjetos mediante movimientos de rotación y
extendiendo la muestra por toda la gota, observar y registrar igual que con
las muestras anteriores.
Observaciones
Dibuje lo observado en los diferentes objetivos para cada muestra que preparó
durante la práctica.
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Cuestionario
1.- ¿Qué es poder de resolución?_____________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________ 2.- ¿Cuáles son los usos del microscopio compuesto? ________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________ 3.- ¿Cuál es la importancia que tiene el diafragma en el microscopio? ________________________________________________________________
________________________________________________________________
4.- ¿Qué importancia tiene el estudiar y observar los microorganismos en
muestras biológicas?______________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
5.- ¿Cuáles son los principales cuidados que se deben de tener con el uso del
microscopio?_____________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
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6.- Escriba el nombre de cada una de las partes del microscopio compuesto.
1. _________________________________
2. _________________________________
3. _________________________________
4. _________________________________
5. _________________________________
6. _________________________________
7. _________________________________
8. _________________________________
9. _________________________________
10. _________________________________
11. _________________________________
12. _________________________________
Conclusiones
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
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Práctica No. 3
TINCIÓN GRAM
Objetivo
Que el alumno clasifique algunas especies bacterianas en Gram
positivas o Gram negativas de acuerdo a la tinción Gram y que comprenda la
importancia que tiene para la caracterización e identificación de las bacterias.
Material
Portaobjetos, asa de punta redonda y en punta recta, guantes y
cubrebocas. Reactivos: Solución salina 0.85%, cristal violeta, alcohol etílico con
acetona, lugol y safranina. Material biológico: Escherichia coli y Staphylococcus
aureus
Introducción
Para observar las características morfológicas de las bacterias, las
preparaciones fijas y teñidas son las que se usan con mayor frecuencia. Las
ventajas de este procedimiento son que:
a) Las células y otros materiales presentes en la preparación son más
19
claramente visibles después de ser teñidas.
b) Las tinciones facilitan la observación de diferencias entre células.
Para teñir los microorganismos se dispone de un gran número de compuestos
orgánicos coloridos llamados colorantes. En general estos colorantes pueden
presentar grupos alcalinos que les permite unirse a compuestos ácidos
presentes en la preparación o viceversa (Koneman y col., 2008).
La tinción Gram fue desarrollada en 1884 por el bacteriólogo Danés Hans
Christian Gram. Es uno de los procedimientos de tinciones más utilizado porque
permite dividir a las bacterias en dos grandes grupos, Gram positivas y Gram
negativas de acuerdo a la retención o no del cristal violeta (Cisternas, 2007).
Los resultados de la tinción son más consistentes cuando la técnica es
utilizada en bacterias jóvenes o en desarrollo (cultivos nuevos). En muchos de
los casos, el informe de la tinción Gram brinda información relevante para la
aplicación de un mejor tratamiento médico frente a un proceso infeccioso. Por
ejemplo: las infecciones causadas por bacterias Gram positivas pueden ser
tratadas con antibióticos del tipo de las penicilinas, en cambio las infecciones
causadas por bacterias Gram negativas pueden requerir la aplicación de
cefalosporinas o aminoglucósidos (Koneman y col., 2008).
Preparación de Frotis
1. Flamear el portaobjeto lavado y seco para desengrasarlo.
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2. Si el frotis se va a preparar a partir de una colonia aislada, colocar una
pequeña gota de solución salina al 0.85% en el centro del portaobjeto, y con
el asa bacteriológica, tomar una pequeña cantidad del centro de la
superficie de la colonia o material, emulsionar el material en la gota de
solución salina y extenderla uniformemente en una superficie aproximada de
1 cm2.
3. Si el frotis se va a preparar a partir de un cultivo líquido, tomar directamente
del caldo o material con el asa de inoculación de punta redonda estéril fría y
extenderlo uniformemente sobre la superficie marcada.
4. Dejar secar la extensión al aire, para evitar la formación de aerosoles y no
provocar una contaminación ambiental.
5. Una vez seca la extensión, fijarla al calor suave, pasando rápidamente el
portaobjetos sobre la flama del mechero, sin que se caliente demasiado,
unas 5 veces.
6. Las extensiones deben ser finas y uniformes para permitir el paso de la luz a
través de ellas y se facilite su observación.
7. Preparar 4 extensiones a partir de cada cultivo o muestra.
8. Realice la tinción al Gram.
Tinción Gram
1. Cubrir los frotis con una solución de cristal violeta y dejar actuar el colorante
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durante 1 minuto (figura 1-1).
2. Lavar los 4 frotis bajo el chorro de agua con poca presión (evitando el
barrido de la muestra) y separar una de las preparaciones para observar al
microscopio. Cubrir con lugol los tres frotis restantes y dejarlo actuar por 1
minuto. Escurrir el lugol y lavar bajo el chorro de agua con poca presión,
separar un segundo frotis (figura 1-2).
3. Decolorar con alcohol-acetona hasta que las preparaciones dejen de perder
color. Para llevar a cabo esto, tomar el portaobjetos con el dedo pulgar e
índice, inclinarlo y agregar el decolorante gota a gota hasta que no salga
más colorante (esto dura aproximadamente 10 segundos)(figura 1-3)
4. Lavar nuevamente bajo el chorro de agua con poca presión o como en el
paso anterior y retirar otro frotis para observación.
5. Cubrir el último frotis con safranina por 1 minuto. Lavar con agua (figura 1-
4).
6. Secar la preparación al aire o suavemente en papel absorbente y examinar
con el objetivo seco débil hasta el de inmersión los cuatro frotis, realizar las
comparaciones pertinentes.
7. Se observarán las bacterias Gram positivas teñidas en violeta obscuro y
las bacterias Gram negativas en rojo o rosa.
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Figura 1. Procedimiento de la Tinción Gram.
http://uriel-93.over-blog.com/article-32225521.html
Observaciones
Realice los dibujos correspondientes a las tinciones realizadas
Lugol
3
2
Alcohol- acetona
4
Safranina
Cristal violeta
1
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Cuestionario
1. ¿Por qué es conveniente realizar una capa fina al momento de hacer el
frotis del microorganismo a estudiar?_____________________________
________________________________________________________________
_______________________________________________________________
2. ¿Cuál es la ventaja que ofrece la observación con aceite de inmersión, con
respecto a la observación con los objetivos secos?¿Qué diferencia existe entre
ellos?__________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
3. Explique el fundamento de la coloración Gram. _______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
4. Explique cuál es la utilidad de la tinción Gram
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
5. Escriba correctamente el género y especie de 3 bacterias patógenas
Gram positivas. Mencione la enfermedad que causa cada una de ellas.
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
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_______________________________________________________________
6. Escriba correctamente el género y especie de 3 bacterias patógenas Gram
negativas. Mencione la enfermedad que causa cada una de ellas.
_______________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
Conclusiones
________________________________________________________________
________________________________________________________________
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________________________________________________________________
________________________________________________________________
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Práctica No. 4
TINCIÓN DE ZIEHL NEELSEN
Objetivo
El alumno llevará a cabo la tinción de Ziehl -Neelsen en una muestra de
expectoración para la observación de bacilos ácido-alcohol resistentes.
Material
Portaobjetos nuevos, aplicadores de madera, papel filtro, lámpara de
alcohol, guantes y cubrebocas. Reactivos: Carbol-fucsina, alcohol etílico con
ácido y azul de metileno. Material biológico: Expectoración.
Introducción
Esta tinción es para colorear bacilos ácido alcohol resistentes (BAAR) en
el diagnóstico de la tuberculosis y otras enfermedades producidas por bacterias
ácido-resistentes. Las tinciones ácido alcohol resistentes como la de Ziehl-
Neelsen, Kinyoun y fluorocrómica, son utilizadas principalmente para teñir
bacterias del género Mycobacterium cuya pared celular compuesta por lípidos
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tipo cera impiden su coloración en la tinción Gram. Estas tinciones se
fundamentan en la aplicación de calor a colorantes mezclados con fenol. Una
vez teñidos las bacterias ácido-alcohol resistentes no se decoloran al tratarlas
con una solución de alcohol etílico y ácido clorhídrico (Versalovic, 2011).
En casos de tuberculosis pulmonar es fácil demostrar la presencia de
BAAR a partir de muestras de esputo, cuando se encuentren en
concentraciones de 107 o más bacilos por mililitro. En otros tipos de muestras,
como orina y lavados gástricos, la presencia normal de micobacterias no
patógenas, entorpece la interpretación del hallazgo de BAAR. Los bacilos se
buscan en esputo debido a que la localización pulmonar es la forma más
frecuente de tuberculosis. Dada la importancia que requiere la obtención de un
producto que sea representativo de las vías respiratorias bajas se le deberá
explicar al paciente detalladamente que para su recolección tendrá que toser y
recoger flemas (no saliva) en un recipiente de boca ancha, rotularlo
adecuadamente y enviarlo al laboratorio (Manual para el diagnóstico
bacteriológico de la tuberculosis).
Procedimiento
1. Preparar un frotis a partir de la muestra de esputo, con un lápiz graso se
traza una línea divisoria en el portaobjetos dividiendo su superficie en un
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tercio para el etiquetado (con un lápiz con punta de diamante anotar el
número de muestra, nombre del paciente y procedencia) y dos tercios
para el frotis.
2. Destapar el envase de la muestra a procesar colocándolo junto al
portaobjetos. Se recomienda hacerlo sobre un papel negro para facilitar
la elección de muestra útil.
3. Tomar un aplicador de madera y partirlo en dos porciones; una de las
mitades entre el pulgar y el índice de cada mano y con los extremos
irregulares de la madera se selecciona la partícula útil de muestra,
constituida por la parte purulenta, sanguinolenta o más densa de la
misma. Se recomienda enrollar la muestra en una de las mitades del
aplicador con ayuda de la otra, para cada muestra se utiliza aplicador
diferente.
4. Colocar la muestra sobre el portaobjetos cerca de la línea divisoria y
extenderla con el aplicador, mediante movimientos circulares hasta lograr
un grosor homogéneo. El resto de la muestra regresarla al envase con
el mismo aplicador. Los aplicadores se desechan en un recipiente que
contenga una solución de cloruro de benzalkonio.
5. Secar al aire a temperatura ambiente, fijar al calor y cubrir la zona donde
se encuentra la muestra con un pedazo de papel filtro
6. Colocar en las varillas para iniciar su tinción, se recomienda inclinarlas un
poco para evitar el contacto del colorante con el etiquetado del frotis.
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7. Cubrir el frotis con el colorante carbol-fucsina y calentar por debajo del
mismo utilizando la flama pequeña de un mechero de alcohol, hasta la
emisión de vapores blanquecinos visibles. Retirar la flama y cuando los
vapores desaparezcan volver a aplicar calor. Esto se repite durante 3 a 5
minutos, evitar que hierva y/o seque, añadiendo más colorante conforme
éste se evapora.
8. Lavar bajo el chorro de agua con poca presión (o con piceta).
9. Cubrir el frotis con la solución de alcohol-ácido, hasta lograr la
decoloración completa del frotis, tomando el portaobjetos por el lado del
etiquetado con movimientos de vaivén, alrededor de 2 minutos, lave con
agua igual que antes. Si el portaobjetos está de color rosa aplicar
nuevamente alcohol ácido y manténgalo durante 1 ó 3 minutos más y
vuelva a enjuagar con agua.
10. Cubrir con el colorante de contraste azul de metileno durante 60
segundos.
11. Lavar con agua, secar al aire y observar con el objetivo de inmersión.
Los bacilos ácido resistentes retienen el color de la fucsina (color rojo) y
se observan en un fondo azul.
Observación Microscópica: Se realiza la observación microscópica en
cada campo del microscopio siguiendo las manecillas del reloj, realizando el
recorrido del portaobjetos como se observa en la figura 2.
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Figura 2. Procedimiento para la observación microscópica de un frotis para la
búsqueda de bacilos ácido alcohol resistentes.
Cuestionario
1. ¿Qué características debe tener la muestra de expectoración para
obtener un resultado confiable?______________________________________
________________________________________________________________
_______________________________________________________________
2. ¿Todas las bacterias ácido resistentes son patógenas?
_______________________________________________________________
3. La presencia de una bacteria ácido resistente en esputo ¿puede
significar la presencia de tuberculosis en el paciente? Explique.
________________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
4. ¿Qué componentes celulares son responsables de las características
acidorresistentes?_________________________________________________
________________________________________________________________
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5. Mencione dos organismos los cuales posean propiedades ácido
resistentes_______________________________________________________
________________________________________________________________
Conclusiones
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
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Práctica No. 5
TINCIONES SELECTIVAS
OBSERVACIÓN DE CÁPSULAS Y ESPORAS
Objetivo
Que el alumno observe estructuras bacterianas especiales, como las
endosporas y cápsulas a través de tinciones selectivas.
Material
Portaobjetos, asa de punta redonda, mechero Bunsen, lámpara de
alcohol, guantes y cubrebocas. Reactivos: Nigrosina (tinta china), safranina,
verde de malaquita al 5%, Cristal violeta, lugol y alcohol etílico con acetona.
Material biológico: Klebsiella pneumoniae y Bacillus subtilis
.
Introducción
La cápsula es una sustancia viscosa que rodea a las bacterias que la
poseen formando una cubierta alrededor de ellas. De acuerdo a su grosor,
composición y solubilidad se puede llamar microcápsula o material limoso. La
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microcápsula es delgada compuesta por polisacáridos, lípidos y proteínas. Se
encuentra en bacterias Gram negativas, se le reconoce también como
endotoxina. El material limoso es similar a las cápsulas, pero es más soluble y
tiene menor integridad estructural. La función de la cápsula es la de protección
y almacén de alimento, aumenta la capacidad infecciosa de bacterias
patógenas (Kenneth y col., 2011). El procedimiento de tinción negativa para
cápsula no tiñe a la bacteria pero en su lugar el colorante actúa sobre el fondo
para impartir un contraste.
Las endosporas son estructuras celulares que poseen unas cubiertas
exclusivas que las hacen resistentes a los factores ambientales adversos
(Madigan y col., 2009). Además, estas cubiertas hacen que las esporas
aparezcan en el microscopio óptico como estructuras refringentes y de difícil
tinción. Se aplica un colorante primario en solución acuosa al espécimen y se
le hace vaporizar para incrementar la penetración de los recubrimientos
relativamente impermeables de las esporas que sometidas correctamente al
método resistirán la substitución por el colorante de contraste y se podrían
observar esporas verdes dentro de células rojas (técnica de Schaeffer-Fulton)
(Hussey y Zayaitz, 2007).
Tinción Negativa (para observación de cápsula)
1. Colocar una gota de tinta china en uno de los extremos de un portaobjetos
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limpio, poner junto una gota del cultivo de Klebsiella sp. Mezclar
cuidadosamente con la tinta china.
2. Colocar el portaobjeto sobre la mesa para afianzar el portaobjeto. Usar un
segundo portaobjeto para deslizar y distribuir la tinta china y el cultivo (figura
3).
3. Dejar secar al aire.
4. Observar bajo el objetivo de aceite de inmersión y realizar una tinción Gram
para comparar entre ambas tinciones y reportar sus observaciones.
Figura 3. Preparación de frotis para la observación de cápsula.
http://www.educa2.madrid.org/web/ejemploclase/practicas-de-laboratorio.
Tinción de Schaeffer-Fulton (tinción de esporas)
1. Preparar frotis de los cultivos proporcionados.
2. Cubrir el frotis con verde de malaquita 5%.
3. Calentar hasta producir vapores durante 5 min.
34
4. Dejar que la preparación se enfríe durante otros 5 min.
5. Enjuagar con cuidado bajo una corriente suave de agua (usar una piceta).
6. Agregar safranina 0.5% durante 1 minuto, para contrastar.
7. Lavar nuevamente con cuidado, como se hizo en el paso 5; secar con
presión leve con la ayuda de una sanita o papel absorbente o al aire y
observar mediante el objetivo de inmersión.
Observaciones:
Cuestionario
1. Explique el fundamento de la tinción de endosporas y diga ¿por qué se
debe calentar la preparación? __________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
____________________________________________________________
2. Hacer una lista de 3 patógenos aerobios y anaerobios que forman esporas,
así como de las enfermedades que causan.
35
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
______________________________________________________________
3. ¿Explique el fundamento de la tinción negativa y qué tipo de información se
obtiene?_____________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
______________________________________________________________
4. Mencione 3 ejemplos de bacterias encapsuladas y si causan alguna
enfermedad.__________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
_______________________________________________________________
Conclusiones
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
36
Práctica No. 6
PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DE MATERIAL Y MEDIOS DE
CULTIVO
Objetivo
Que el alumno se involucre en la preparación de algunos medios de
cultivo y materiales para el cultivo de microorganismos, así como en la técnica
para su esterilización por vapor húmedo.
Material
Matraz Erlen Meyer de 500 mL, probeta de 100 mL, mechero Bunsen,
dos tubos de 13X100/con tapón de rosca, pipeta serológica de 10 mL,
guantes y cubrebocas. Medios de cultivo: Agar Sabouraud, agar nutritivo, medio
SIM y caldo BHI.
Introducción
Para estudiar y conocer a los microorganismos, sean éstos bacterias u
hongos; es necesario aislarlos y cultivarlos de manera in vitro. Para lo cual se
37
debe disponer de medios de cultivo que favorezcan su desarrollo, para realizar
esto, es necesario que todo material que se emplee esté rigurosamente
esterilizado (eliminación completa de cualquier forma de vida) para evitar
contaminaciones y por consiguiente, resultados erróneos. La elección del
método depende de la naturaleza física del material que se va a esterilizar y del
uso que se le piensa dar (Madigan y col., 2009).
El método más empleado para esterilizar medios de cultivo, soluciones,
cantidades medias de agua en tubos o botellas, materiales de cristalería, etc.,
es a través de la esterilización por vapor. El vapor a presión es un agente
esterilizante debido a que se alcanzan temperaturas superiores a las
alcanzadas por ebullición, además del poder de penetración comparado con
otros métodos, el resultado de lo anterior es la desnaturalización de proteínas.
El equipo de laboratorio diseñado para esterilizar por este método, se llama
autoclave, consiste en una doble cámara que puede saturarse de vapor y
mantenerse a una determinada presión y temperatura durante un tiempo largo.
Es importante que el aire de la cámara sea reemplazado por completo por
vapor saturado. Si hay aire presente, se alcanzará una temperatura inferior.
Generalmente se opera a una presión de 15 lb/pulg2 (121° C). El tiempo de
operación depende de la naturaleza del material por esterilizar, del tipo de
recipiente y del volumen (Madigan y col., 2009).
38
Procedimiento
Preparar: 2 placas con agar Sabouraud, 2 placas con agar nutritivo, un tubo
con medio SIM y un tubo con caldo BHI, por equipo.
El material de vidrio, lavar con agua y jabón, enjuagar con agua de la llave y
al final con agua destilada.
1. Es importante antes de empezar a preparar cualquier medio de cultivo,
leer cuidadosamente las instrucciones del frasco contenedor del medio.
2. Pesar el medio de acuerdo a las instrucciones y a la cantidad a preparar.
3. En el matraz Erlen Meyer, agregar una pequeña cantidad conocida de
agua destilada y se le adiciona el medio de cultivo pesado, se le agrega
el resto de agua de acuerdo a la cantidad de medio de cultivo a realizar.
(Nota: se recomienda que el matraz sea del doble de la capacidad del
volumen del medio a preparar).
4. Calentar lentamente con agitación continua, hasta que el medio se
observe homogéneo ( transparente, no turbio y sin grumos en las
paredes del matraz ), cuidando que no se queme ni se derrame.
Tapar con algodón y gasa.
5. Los medios que van en tubo agregar al mismo, dejando el tapón flojo sin
riesgo de caer, para permitir que el vapor entre.
6. Comprobar el nivel de agua de la autoclave y asegurar que el dren se
encuentre bien cerrado. Colocar en su interior el material permitiendo la
39
correcta distribución del vapor de agua. Para ello se deben tomar las
siguientes precauciones:
a) Distribuir el material en forma ordenada en toda la superficie interna
disponible.
b) Evitar acumular el material en un área específica. No colocar el
material uno sobre otro.
c) Evitar que el material toque las paredes de la autoclave.
7. Colocar la ampolleta del indicador biológico (Bacillus
stearothermophilus) en el lugar que se considere más difícil que llegue
el vapor.
8. Si no se cuenta con autoclave autómatica puede utilizarse ollas de
presión o autoclave manual, en donde se tiene que calentar con la
válvula abierta hasta que se observe una columna constante de flujo de
vapor, cerrar o colocar la válvula, dejar subir la temperatura hasta 121°C
(15 lb de presión) e iniciar la contabilidad del tiempo manteniendo la
temperatura constante de 121°C.
9. Esterilizar por 15 minutos o de acuerdo a las instrucciones del
proveedor.
10. Cuando termine el tiempo de esterilización, esperar que baje la presión
hasta que se indique "cero" en el manómetro, antes de abrir la autoclave.
11. Una vez que se abra, con mucha precaución y con ayuda de un guante
de asbesto, sacar el material.
40
12. Retirar el indicador biológico e incubarlo bajo las condiciones que señale
el fabricante. Después del periodo de incubación observar las
características del mismo.
13. Dejar enfriar los tubos (cerrar bien) y el matraz a temperatura a ~45oC
(hasta tolerar en el dorso de la mano), distribuirlo (aproximadamente de
15 a 20 mL) en las cajas Petri estériles colocadas en la mesa
previamente desinfectada con lisol, estando éstas alrededor de un
mechero (zona estéril).
14. Para hacer esta operación retirar el tapón del matraz, sin dejarlo en la
mesa, y pasar por la flama del mechero la boca de éste, luego levantar
la tapa de la caja de Petri estéril, solamente lo necesario para permitir la
entrada del cuello del matraz para vaciar el agar. Es necesario mover
ligeramente la caja para que el medio se distribuya uniformemente.
NOTA: Las cajas no pueden ser destapadas a menos que sea entre los
mecheros o dentro de la campana de flujo laminar. Las tapas no se tocan
por dentro con los dedos, ni se sacan del área de esterilidad.
15. Solidificado el agar, cerrar las placas, etiquetar y someterlas a prueba de
esterilidad.
41
Se recomienda el uso de controles biológicos por lo menos una vez a la
semana para verificar el buen funcionamiento del autoclave. En caso de que se
sospeche de alguna falla se debe colocar un indicador biológico en cada carga
de esterilización.
Prueba de Esterilidad
1. Colocar TODAS las placas Petri con agar nutritivo a incubar a 37ºC
por 24 hrs y las de agar Sabouraud 5 días a temperatura ambiente.
2. Al finalizar la incubación revisar y descartar las placas contaminadas,
éstas se guardan en el refrigerador para su posterior esterilización.
3. Las placas que no están contaminadas se etiquetan con el tipo de medio,
equipo, grupo y fecha de elaboración. Guardar en forma invertida en el
empaque original, y almacenarlas en el refrigerador para utilizar en la
siguiente sesión práctica.
NOTA: Llevar 1 placa de agar Sabouraud a su casa por equipo y dejarla
abierta por 30 min. Después cerrarla, colocándole cinta masking-tape (para
que no se destapen y provoquen una posible contaminación personal o
ambiental) e incubar a temperatura ambiente (observar diariamente el
crecimiento sin abrirla) y traerla para la próxima práctica.
42
Resultados:
Hacer la descripción morfológica de las colonias obtenidas en las placas
Petri contaminadas.
Reportar el crecimiento en forma cualitativa: (-) no hay crecimiento, (+)
poco crecimiento, (++) regular y (+++) abundante.
Cuestionario
1. Investigue la composición de cada uno de los medios utilizados y su
fundamento______________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
43
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
_______________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
2. ¿Qué tipo de material se puede esterilizar por calor húmedo?
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
3. ¿A qué condiciones de temperatura y presión se destruyen todas las
formas vegetativas? _______________________________________________
4. ¿Cuáles son las condiciones de temperatura y presión que permiten la
destrucción de endosporas?________________________________________
5. ¿Por qué es necesario trabajar en una zona o área estéril y con material
estéril?__________________________________________________________
________________________________________________________________
44
Conclusiones
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
45
Práctica No. 7
OBTENCIÓN DE UN CULTIVO PURO DE BACTERIAS Y MOHOS
Objetivo
Al finalizar el trabajo práctico el alumno estará capacitado para llevar a
cabo las técnicas básicas para el aislamiento de bacterias y mohos en un
cultivo puro.
Material
Asa de punta redonda, recta y en L, portaobjetos, mechero bunsen,
guantes y cubrebocas. Medios de cultivo: 2 placas de agar Sabouraud (una con
crecimiento previo de hongos del ambiente), 2 placas de agar nutritivo, 1 tubo
de medio SIM y 1 de caldo BHI. Reactivos: Cristal violeta, lugol, alcohol etílico
con acetona, safranina y azul de lactofenol.
Introducción
En los ambientes naturales los microorganismos se encuentran usualmente en
poblaciones mixtas, pero si queremos estudiarlos, caracterizarlos e identificarlos
46
por los métodos tradicionales, se requiere su aislamiento y purificación. Un
cultivo puro, aquél en el que todos los microorganismos provienen, en teoría,
de una sola célula. La obtención de un cultivo puro, a partir de una población
mixta, se lleva a cabo en dos etapas (Willey y col, 2011):
1. La muestra debe diluirse de manera tal, que los diferentes microorganismos
queden lo suficientemente separados sobre la superficie de un medio de cultivo
sólido, con el objetivo de obtener colonias aisladas. Este proceso se conoce
precisamente como aislamiento. En esta placa tendremos diferentes tipos de
colonias correspondientes a los diferentes microorganismos presentes en la
población original.
2. Después de obtener colonias aisladas, se elige una de ellas y se transfiere,
en el caso de bacterias y levaduras con el asa en punta a un tubo con caldo
nutritivo estéril y se incuba. Para mohos se transfiere directamente a un agar
sólido con una asa en L Se considerará que se ha obtenido un cultivo puro,
cuando al volver a cultivar en un medio sólido, todas las colonias obtenidas
presenten las mismas características, macro y microscópicas.
Otro método para obtener colonias aisladas y así iniciar la obtención de un
cultivo puro, es realizando diluciones en caldo y posteriormente depositar un
inóculo medido sobre un medio sólido o aplicando la técnica de placa vertida.
Esta forma se utiliza para la cuantificación de microorganismos pero puede
cumplir con un segundo objetivo, como lo es el de obtención de colonias
aisladas.
47
Procedimiento para Aislar Bacterias: Estría cruzada
1. Esterilice el asa y tome la muestra, levante la tapadera de su caja Petri con
su mano izquierda (preparada con el agar correspondiente para su
utilización y etiquetada) lo suficientemente alto para que le permita introducir
el asa de inoculación (estéril y fría) y moverla libremente con la mano
derecha. Coloque el asa con la muestra cerca del borde del agar y
enseguida distribúyalo con movimientos de izquierda a derecha, hasta que
haya cubierto aproximadamente una cuarta parte de la placa( figura 4-1).
2. Esterilizar el asa y enfriarla después de la primera estría, hacer las
siguientes estrías en forma perpendicular a las estrías anteriores (figura 4-
2).
3. Repita este mismo procedimiento hasta que haya cubierto aproximadamente
90% del área de la superficie de la placa, lo cual se logra generalmente en la
cuarta vez (figura 4-3 y 4-4). Es importante no tocar la primera estría con la
última, ya que esto afecta el proceso de aislamiento.
4. Identifique su placa, utilizando para ello el revés de la parte que contiene al
agar.
5. Incubar de 18-24 horas/35-37o C la placa en forma invertida para evitar que
el agua de condensación caiga sobre la superficie del agar y evite la
formación de colonias separadas.
48
6. Observar si hubo o no aislamiento de colonias, anote las características
coloniales desarrolladas, teniendo especial cuidado en considerar la
información que considere relevante para la posterior identificación del
microorganismo.
7. Prepare un frotis para tinción Gram.
8. Inocular a partir de una de las colonias aisladas un tubo de caldo nutritivo
para la obtención del cultivo puro. Incubar de 18-24 horas/35-37oC.
9. Después de este período, a partir del cultivo puro inocule una placa de agar
nutritivo en estrías para observar si efectivamente hubo crecimiento de un
solo tipo de morfología colonial.
Figura 4. Procedimiento de Estría Cruzada para el aislamiento bacterias.
3
4
1
2
49
Procedimiento para Aislar Mohos del Aire
1. Recordar llevar al laboratorio las placas con hongos en agar Sabouraud de
la práctica anterior.
2. Observar la presencia de colonias filamentosas de diversos tipos y colores.
También pueden encontrarse colonias de levaduras presentes, las cuales
son similares en apariencia a las colonias bacterianas.
3. Anotar las características de las colonias seleccionadas ya que esta
información es un criterio importante para la identificación del moho.
4. Seleccionar una de las colonias aisladas y con el asa bacteriológica de
punta en L, inocular el agar Sabouraud , tocando la colonia y depositando
unas esporas sobre la parte central de la superficie del medio. Incubar a
temperatura ambiente por 5 días.
Método de Montaje Húmedo para Mohos.
1. Seleccionar una colonia aislada.
2. Calentar una aguja de disección en forma de L y extraer un pequeño
fragmento de la colonia tratando de tomarlo desde la base del agar.
3. Depositar el fragmento extraído sobre un portaobjetos en el cual,
previamente, se ha depositado una gota de azul de lactofenol.
50
4. Colocar un cubreobjetos y presionar directamente sobre el fragmento de
colonia usando el extremo de un lápiz con borrador.
5. Observar bajo el microscopio, con el objetivo seco débil buscando
estructuras representativas. Cambiar al objetivo seco fuerte para observar
mejor las estructuras seleccionadas, procurando que éstas presenten la
estructura completa del hongo para facilitar su identificación
Disposición de Residuos Peligrosos Biológicos Infecciosos (RPBIs)
Las cajas Petri que contengan los cultivos de bacterias colocarlas en una bolsa
de plástico, pesar y anotar en bitácora. Posteriormente esterilizar a 121°C por
30 min. En autoclave (olla de presión). Después de esterilizar desechar en
basura ordinaria
Observaciones:
51
Conclusiones
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
Cuestionario
1. ¿Defina cultivo axénico o puro de microorganismos?
________________________________________________________________
________________________________________________________________
_______________________________________________________________
2. ¿Que es un inóculo?____________________________________________
________________________________________________________________
3. Físicamente en un medio de cultivo de microorganismos ¿cuándo se dice
que no se obtiene un cultivo puro__________________________________
_______________________________________________________________
52
4. ¿En qué consiste el aislamiento por estrías?_______________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
_______________________________________________________________
5. Indique otros métodos para el aislamiento de bacterias diferente al de
siembra por estría. ________________________________________________
_______________________________________________________________
6. Mencione las características macroscópicas de las colonias
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
7. ¿Cuáles son los componentes del agar Sabouraud?
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
_______________________________________________________________
8. ¿Cuáles son los componentes del agar Sabouraud?
________________________________________________________________
________________________________________________________________
_______________________________________________________________
53
Práctica No. 8
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO ENRIQUECIDOS
Objetivo
El alumno aprenderá a preparar correctamente los medios de cultivo
enriquecidos como el agar sangre y agar chocolate para el cultivo y aislamiento
de bacterias
Material
Portaobjetos, asa de punta redonda y en punta recta, mechero Bunsen,
matraz Erlen Meyer 250 mL, probeta de 100 mL, guantes y cubrebocas.
Medios de cultivo: Agar sangre. Reactivos: Cristal violeta, alcohol etílico con
acetona, lugol y safranina
Introducción
Los requerimientos nutricionales de los microorganismos son amplios y
variados, por lo que es necesario conocer cual es el medio de cultivo adecuado
para su crecimiento. Existen algunos microorganismos exigentes para los
cuáles se requiere adicionar algunas substancias o suplementos a los medios
54
generales, con el propósito de satisfacer sus necesidades nutricionales y de
este modo recuperarlos in vitro. A estos medios se les denomina, medios
enriquecidos y entre los más utilizados está al agar sangre que lleva en su
composición 5% de sangre de cordero. Este medio, además de permitir el
crecimiento de microorganismos exigentes, puede utilizarse para observar la
actividad de hemolisinas que poseen algunas bacterias y así determinar su
carácter hemolítico, que en algunos casos permite la clasificación presuntiva
como por ejemplo con el género Streptococcus, el cual está agrupado en
Streptococcus alfa, beta o no hemolíticos. Otro medio utilizado frecuentemente
sobre todo para patógenos obligados es el agar chocolate en el cual también se
le adiciona sangre pero ésta es desnaturalizada mediante calor (DIFCO & BBL
Manual).
Preparación de Agar Sangre y Agar Chocolate
1. Pesar las cantidades correspondientes de agar base sangre para preparar el
volumen que se requiera de agar sangre y agar chocolate (se usa el mismo
medio base), de acuerdo a lo recomendado por el fabricante.
2. Disolver las cantidades pesadas en el volumen correspondiente de agua
destilada, utilizando los matraces Erlen Meyer será necesario calentar por
algún tiempo, agitar constantemente para que la disolución sea uniforme. El
medio estará disuelto cuando se observe transparente.
55
Tapar con algodón y gasa, y esterilizar los medios de cultivo en autoclave a
15 libras de presión (121 °C) por 15 minutos.
3. Una vez esterilizados, dejar enfriar a temperatura ambiente 5 minutos o en
agua bajar a 80°C el medio base para agar chocolate y en condiciones
asépticas agregar la sangre (3-5%), homogenizar y enfriar al chorro del
agua a unos 50°C (hasta tolerar en la dorso de la mano), distribuirlo en las
cajas Petri estériles.
4. Para el agar sangre una vez esterilizados los medios, enfriar al chorro del
agua a unos 50°C (hasta tolerar en el dorso de la mano) y en condiciones
asépticas agregar la sangre (5%), homogenizar y distribuir en las cajas
Petri estériles.
NOTA:
Para hacer esta operación se retira el tapón del matraz, sin dejarlo en la
mesa y se pasa por la flama del mechero la boca de éste, luego se levanta la
tapa de la placa Petri estéril, solamente lo necesario para permitir la entrada
del cuello del matraz para vaciar el agar. Inmediatamente se vuelve a tapar la
placa Petri. Es necesario mover ligeramente la caja para que el medio se
distribuya uniformemente.
56
Inoculación de Agar Sangre y Agar Chocolate
1. A partir de muestras de oído, nariz, exudado faríngeo o cepa de
Streptococcus, inocular en agar sangre y agar chocolate, empleando la
técnica de siembra por estría cruzada.
2. Incubar las placas de agar sangre en posición invertida en una jarra para
cultivo de anaerobios (sistema Gaspak® ) e incubar a 37ºC por 24h.
3. Las placas de agar chocolate incubarlas a 37ºC por 24h en anaerobiosis.
4. Preparar un frotis de las diferentes colonias obtenidas en los cultivos, teñir
con la técnica de Gram y observar al microscopio con objetivo de inmersión
Disposición de Residuos Peligrosos Biológicos Infecciosos (RPBIs)
Las cajas Petri que contengan los cultivos de bacterias colocarlas en una
bolsa de plástico, pesar y anotar en bitácora. Posteriormente esterilizar a
121°C por 30 min. En autoclave (olla de presión). Después de esterilizar
desechar en basura ordinaria
Observaciones:
57
Conclusiones
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
Cuestionario
1. ¿Qué significa la presencia de un halo de hemólisis?
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
2. ¿Cuál es la diferencia entre el agar sangre y agar chocolate?
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
58
Práctica No. 9
PREPARACIÓN Y UTILIZACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO SELECTIVOS
Objetivo
El alumno comprenderá las ventajas que supone la utilización de medios
de cultivo selectivos en la identificación de bacterias, y describirá las
características de cultivo, morfológicas y bioquímicas más relevantes de los
géneros Staphylococcus sp y Salmonella sp.
Material
Porta objetos, asa en punta recta, mechero bunsen, matraz Erlen Meyer
de 250 mL, espátula, probeta de 100 mL, guantes y cubrebocas. Medios de
cultivo: Agar sal manitol y agar Salmonella Shigella. Reavctivos: Cristal violeta,
alcohol etílico con acetona, lugol, safranina, peróxido de hidrógeno al3%.
Introducción
Los medios selectivos se utilizan para aislar grupos específicos de
bacterias. Incorporan en su composición sustancias químicas que inhiben el
59
crecimiento de un tipo de bacterias concreto mientras permite el crecimiento de
otros facilitando así su aislamiento.
Como ejemplos de medios selectivos tenemos al agar sal y manitol, el cual es
utilizado para el aislamiento y diferenciación de estafilococos a partir de
muestras clínicas y diversos materiales. Este medio fue formulado por
Chapman para obtener el aislamiento de estafilococos, inhibiendo el
crecimiento de otras bacterias al utilizar una alta concentración de sal. Otro
medio selectivo utilizado con frecuencia es el Agar Salmonella Shigella
también conocido como Agar SS, el cual es utilizado para el aislamiento de
especies de Salmonella y Shigella a partir de muestras clínicas y de alimentos
donde las sales biliares y el verde brillante actúan como inhibidores de bacilos
Gram positivos y de la mayoría de bacilos coliformes, permitiendo el crecimiento
de Salmonella sp. (DIFCO & BBL Manual).
Procedimiento
1. Preparar los medios de cultivo siguiendo el procedimiento de la práctica No.
6, en caso de que ya se hayan preparado, continuar con el siguiente paso:
2. Tomar una asada del tubo conteniendo la cepa proporcionada por el
maestro y/o de la muestra seleccionada (faringe, nariz, oído, queso, para el
medio de sal manitol y muestra de heces, vísceras de pollo, carne molida,
etc).
60
3. Sembrar por estría cruzada para aislarlo, incubar por 18-24 horas entre 35-
37ºC.
4. Seleccionar la colonia típica, leer características macro y microscópicas.
5. Realizar tinción Gram, prueba de catalasa (para diferenciar entre los
géneros Staphylococcus y Streptococcus), siguiendo la metodología
descrita a continuación:
Prueba de la Catalasa:
Se comprueba la presencia de la enzima catalasa que descompone el
peróxido de hidrógeno en oxígeno y agua. Por lo general los microorganismos
que no poseen el sistema citocromo tampoco poseen la enzima catalasa y por
lo tanto no pueden descomponer el peróxido de hidrógeno. Esta prueba la da
positiva Staphylococcus y negativa Streptococcus.
Procedimiento por el Método de Portaobjetos:
1. Se recoge del centro de la superficie de una colonia aislada de un cultivo de
18-24 horas de desarrollo, con un asa de inoculación y se coloca sobre un
portaobjeto de vidrio limpio.
2. Sobre el microorganismo puesto en el portaobjeto se agrega una gota del
reactivo peróxido de hidrógeno (H2O2). No se debe invertir el procedimiento
61
o mezclar con el asa el microorganismo y el peróxido porque pueden
producirse resultados falsos positivos si el platino es el material del asa
utilizada. Con asa de nicromo no existe este problema.
3. Se observa la inmediata formación de burbujas de oxígeno (liberación de
gas) y registrar el resultado como positivo y negativo con la ausencia de
burbujas.
Disposición de Residuos Peligrosos Biológicos Infecciosos (RPBIs)
Las cajas Petri que contengan los cultivos de bacterias colocarlas en una
bolsa de plástico, pesar y anotar en bitácora. Posteriormente esterilizar a
121°C por 30 min. En autoclave (olla de presión). Después de esterilizar
desechar en basura ordinaria
Observaciones:
62
Conclusiones
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
Cuestionario
1. Describa el fundamento bioquímico de la prueba catalasa.
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
2. ¿Cuál es la composición química de los medios Sal manitol y SS?
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
63
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
______________________________________________________________
3 ¿Cuáles son los componentes responsables de su función como medio
selectivos del Sal Manitol y del SS?___________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
64
Práctica No. 10
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO DIFERENCIALES PARA
ENTEROBACTERIAS (BACILOS GRAM NEGATIVOS)
Objetivo
El alumno aprenderá a preparar, conocer y comprender las ventajas de
la utilización de medios de cultivo Diferenciales en la identificación de
enterobacterias de muestras de heces y/o cepa.
Material
Portaobjetos, asa redonda y en punta mechero bunsen, matraz Erlen
Meyer, 250 mL, espátula, probeta de 100 mL, guantes y cubrebocas Medios de
cultivo: Agar Endo, agar Eosina y Azul de Metileno (EMB), Agar Mac Conkey.
Reactivos: Cristal violeta,alcohol etílico con acetona, lugol y safranina. Material
biológico: Escherichia coli, Proteus sp. Klebsiella sp. y Salmonella sp.
Introducción
En los medios diferenciales se pueden distinguir tipos diferentes de
microorganismos que se encuentran generalmente relacionados ya sea
65
morfológica o bioquímicamente. Incorporan compuestos químicos que tras la
inoculación e incubación producen un cambio característico en el aspecto del
crecimiento bacteriano y/o en el medio que los rodea lo cual permite su
diferenciación. Ejemplo Agar Eosina y Azul de Metileno (EMB, por sus siglas en
inglés), ENDO y Mac Conkey (DIFCO & BBL Manual).
Procedimiento
1. Preparar los medios de cultivo siguiendo el procedimiento de la práctica No.
6, en caso de que ya se hayan preparado pasar al siguiente paso:
2. Tomar una asada del tubo conteniendo la cepa de enterobacterias
correspondiente a trabajar.
3. Sembrar por estría cruzada para aislarlo, incubar por 18-24 horas entre 35-
37ºC.
4. Seleccionar la colonia típica, leer características macro y microscópicas.
5. Realizar las pruebas bioquímicas de la siguiente práctica.
Observaciones:
66
Conclusiones:
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
_______________________________________________________________
67
Cuestionario
Complete la siguiente tabla
Medio de
Cultivo
Indicador de
pH
Agente
Inhibidor
Nutrientes y/o
Componentes
Agar EMB
Agar ENDO
Agar MacConkey
68
Práctica No. 11
PRUEBAS DE DIFERENCIACIÓN BIOQUÍMICA
Objetivo
Que el alumno realice algunas pruebas bioquímicas en medios de cultivo
con sustratos especiales que permitan demostrar actividades metabólicas de
bacterias y correlacionar su importancia en la caracterización e identificación.
Material
6 tubos c/tapón de rosca 13x100mm, gradilla, asa en punta recta,
mechero Bunsen, matraz Erlen Meyer 125 mL. probeta de 100 mL, espátula,
guantes y cubrebocas. Medios de cultivo: Caldo RM/VP, agar citrato, SIM, urea.
(caldo). Material biológico Escherichia coli, Proteus sp., Klebsiella sp.y
Salmonella sp.
Introducción
En el laboratorio es posible conocer las características metabólicas de
los microorganismos (M.O.), inoculándolos en diferentes medios de cultivo, con
69
sustratos que pueden utilizar como fuente de energía, fuente de carbono y de
otros nutrientes esenciales para su crecimiento. La mayoría de los M.O utilizan
glucosa como fuente de carbono y energía. Al entrar a la célula, la glucosa es
oxidada en forma incompleta (fermentación) o completa (respiración)
dependiendo de la presencia de oxígeno y de las capacidades enzimáticas de
los M.O. (Madigan y col., 2009).
Se han propuesto numerosas pruebas bioquímicas en medios de cultivo
con indicadores de pH, para detectar la producción de ácido o álcali, con
inhibidores selectivos como bilis, cianuros, colorantes, sulfuros etc., que facilitan
la determinación de diferentes actividades metabólicas como son: la capacidad
de fermentar carbohidratos (glucosa, lactosa, sacarosa), catabolizar
aminoácidos y urea, la producción de enzimas como: oxidasas, reductasas,
amilasas, lipasas, etc. (Mac Faddin, 2003).
Preparación de Pruebas Bioquímicas
1. Pesar las cantidades correspondientes de cada una de los medios y
preparar el volumen que se requiera.
2. Disolver en el volumen correspondiente de agua destilada, utilizando los
matraces Erlen Meyer. Será necesario calentar por algún tiempo, agitar
constantemente para que la disolución sea uniforme. El medio estará
disuelto cuando se observe transparente, no turbio y sin grumos en las
70
paredes. Pasar 3 mL. si son caldos y si son agares 4 mL a cada uno de los
tubos (13x 100mm), tapar (tapón flojo). Esterilizar los medios de cultivo en
autoclave a 15 libras de presión (121 °C) por 15 minutos.
3. Una vez esterilizados los medios, los agares ponerlos en plano inclinado y
dejar enfriar para que solidifiquen en forma de pico de flauta a temperatura
ambiente, después guardar en refrigeración hasta su uso.
Técnicas de Inoculación en Tubo
Se utilizarán los cultivos de Escherichia coli, Klebsiella sp., Salmonella sp.,
y Proteus sp. de la práctica anterior.
1. A partir de uno de los cultivos de la práctica anterior, se inocularán los 6
tubos de pruebas bioquímicas de una sola asada, iniciando con los medios
sólidos, siguiendo con semisólidos y al final los caldos. Si dentro de los
sólidos se tiene citrato, inocularlo primero.
2. Los tubos de Citrato se inocularán en estría simple en la superficie y los de
TSI se inocularán por estría simple en la superficie y por picadura hasta≈ 5
mm antes del fondo del tubo.
3. El tubo con medio SIM se inoculará sólo con picadura.
4. Los tubos con caldo RM-VP y Urea, se inocularán agitando el asa.
71
5. Incubar todos los tubos a 37ºC durante 24 horas (rojo de metilo y Voges-
Proskauer 48 horas).
Disposición de RPBI’s
Las cajas Petri que contengan los cultivos de bacterias colocarlas en
una bolsa de plástico (el alumno deberá de traerla) y poner los tubos en gradilla
o en botecitos con tapón flojo para posteriormente esterilizar a 121°C x 30 min,
en autoclave (olla de presión). Desechar en basura ordinaria bolsa con
placas y el residuo de los tubos ponerlo en bolsa de plástico y desechar
en basura ordinaria, lavar los tubos.
Observaciones:
Describa que ocurre después del desarrollo bacteriano en las pruebas
bioquímicas utilizadas en la práctica.
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Conclusiones
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Cuestionario
1. Investigar el fundamento bioquímico de cada una de las pruebas realizadas.
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2. Investigar cómo se realizan las pruebas del Rojo de metilo y del Voges-
Proskauer.
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Práctica No. 12
Recuento en Placa de Unidades Formadoras de Colonias
Objetivo
Que el alumno se familiarice con el método de recuento en placa de
microorganismos
Material
Gradilla, 2 pipetas serológicas de 1 mL, y una de 10 mL,mechero
Bunsen, matraz Erlen Meyer de 250 mL. probeta de 100 mL. espátula, guantes
y cubrebocas. Medios de cultivo: Agar Plate Count. Reactivos: Solución salina
0.85%. Material biológico: Orina, leche, agua y/o queso
Introducción
Este método de recuento está basado en la suposición teórica de que un
microorganismo viable da lugar al desarrollo de una colonia y en que el número
total de colonias que se desarrollan sobre un medio de cultivo sólido es igual al
número original de microorganismo viables presentes en la muestra. A fin de
76
disponer de un número adecuado de colonias para el recuento, es necesario
diluir la muestra original, inocular de forma adecuada una cantidad conocida de
muestra sobre el medio de cultivo e incubar. Luego de la incubación, se cuenta
las colonias formadas. El número total de microorganismos viables en la
muestra original es determinado multiplicando el número de colonias
formadoras por el factor de dilución. Presenta las ventajas de ser muy sensible,
y de que permite determinar unos pocos microorganismos/mL Sin embargo,
tiene la desventaja de que se necesita gran cantidad de medios y tiempo para
visualizar los resultados (Madigan y col., 2009).
Procedimiento
La preparación del medio de cultivo se realizará de acuerdo a las
instrucciones del fabricante, ajustando los volúmenes a la cantidad requerida
para la práctica (100 mL por equipo).
Preparación de la Muestra
1. Preparar 5 tubos con 9 mL de solución salina isotónica o agua peptonada al
0.1% (todo estéril)
2. Hacer diluciones seriadas partiendo de 1 mL de muestra para la primera
dilución 1:10.
77
3. Transferir 1 mL de la primera dilución al siguiente tubo (dil 1:100) y así
sucesivamente, hasta obtener una dilución 1:100 000 (figura 5). .
4. Una vez preparadas las diluciones, se sembrar la muestra dentro de los 15
minutos siguientes.
Inoculación
1. Depositar 1 mL en placas estériles vacías, empezando por la menor dilución
a la mayor.
a. Elegir el medio según el tipo de microorganismo, pudiendo incluso
utilizarse medios selectivos o diferenciales.
2. Agregar a cada placa 15-20 mL del medio de cultivo previamente
fundido y enfriado a 45°C en baño María.
3. CUIDADOSAMENTE agitar la placa tapada sobre la superficie de la mesa
para homogenizar la muestra, con movimientos circulares (4-5 veces en
cada sentido), verticales y horizontales SIN levantar la placa de la mesa
(figura 5).
4. Dejar solidificar a temperatura ambiente, enseguida invertir las placas e
incubar a 37°C de 24 a 48 horas
5. Se observan con buena luz con el fin de visualizar las colonias puntiformes y
diferenciarlas de cualquier partícula extraña que pudiera haber.
6. Realizar el conteo con un contador de colonias.
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Figura 5. Dilución e inoculación de la muestra para el recuento en placa de
Unidades Formadoras de Colonias.
Reglas para Conteo en Placa
Las reglas para seleccionar las cajas para los cálculos son las siguientes:
1. Se consideran “representativas“ las cajas que tienen un número de colonias
dentro del rango de sensibilidad del método, en este caso, entre 25 y 250
Unidades Formadoras de Colonia (UFC).
2. Una vez seleccionadas las cajas y hechos los promedios correspondientes,
se aplica el factor de dilución, que es el inverso de la dilución y se redondea el
número a 2 cifras significativas (o dígitos) y potencias de 10. Cuando el tercer
dígito del promedio es 4 o menor, se omite, dejando el número de 2 cifras
significativas.
1.0mL
79
Por ejemplo, si en una caja se cuentan 312 UFC, se debe reportar como 31 X
101, porque el tercer dígito es 2 y se redondea al segundo dígito. Cuando el
tercer dígito es 5 o superior, el segundo dígito se redondea al siguiente, por
ejemplo: si en una caja se cuantifican 199 UFC se reportará como 20 x 101
UFC, porque el tercer dígito es superior a 5. Otro ejemplo: Si el promedio es de
237.5 en la dilución 10-3, se reportará como 24 x 104 UFC.
3. Cuando las 2 placas de una dilución contienen un número de colonias
características dentro del rango de sensibilidad del método, se promedian los
números y se multiplica por el inverso de la dilución.
4. Cuando hay una placa con crecimiento extendido, no se consideran ésta ni
su duplicado.
5. Cuando una de las 2 placas de una dilución es representativa y la otra no, se
consideran ambas y se promedian.
6. Cuando hay placas representativas en 2 diluciones subsecuentes, se
promedian cada una con su duplicado (aunque el duplicado no lo sea), se aplica
el factor de dilución a cada una y luego se promedia nuevamente.
7. Si en las placas no hay colonias (o no son características del grupo en
estudio), reportar el resultado como: menos de un (grupo) en 10-x (la más baja
utilizada), por ejemplo < 100 / g si la dilución más baja fue 10-2 ó < 1 / mL si la
muestra se sembró directamente, sin diluciones. Se agrega la leyenda:
“valor estimado”.
8. Si no hay placas representativas pero hay alguna con un número menor de
80
UFC, se consideran las de la menor dilución y se agrega “valor estimado”.
9. Cuando el número de colonias por placa exceda de 250, contar las colonias
en aquellas porciones de la placa que sean representativas de la distribución de
colonias. Contar por ejemplo, una cuarta parte o una mitad del área de la caja
y multiplicar el valor obtenido por 4 ó 2, respectivamente. Si solamente pueden
contarse algunos cuadros, considerar que el fondo de una caja Petri de 100
mm de diámetro contiene 65 cuadros de la cuadrícula del contador. Agregar
la leyenda "valor estimado".
10. Se cuentan como una sola colonia: Cadenas o pequeños grupos no
separadas claramente entre sí, que parecen ser causadas por la desintegración
de un cúmulo de bacterias y que están separadas de otras colonias o cadenas.
Disposición de Residuos Peligrosos Biológicos Infecciosos ( RPBI’s)
Las cajas Petri que contengan los cultivos de bacterias colocarlas en
una bolsa de plástico (recordar traerla) y los tubos ponerlos en gradilla o en
botecitos con tapón flojo para posteriormente esterilizar a 121°C x 30 min. En
autoclave (olla de presión). Desechar en basura ordinaria bolsa con placas y el
residuo de los tubos tirar al lavabo y los tubos se lavan.
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Observaciones:
Conclusiones
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________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
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________________________________________________________________
________________________________________________________________
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Cuestionario
1. Indique la importancia de utilizar el método de dilución para el
aislamiento de microorganismos.____________________________________
________________________________________________________________
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1. Comparar el método de dilución con el de estría para el aislamiento de
microorganismos._________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
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________________________________________________________________
________________________________________________________________
3. ¿Por qué el número de microorganismos es el resultado de multiplicar el
número de colonias por el inverso de la dilución?
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________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
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Práctica No. 13
EFECTO DE LOS METALES PESADOS Y DETERGENTES
Objetivo
Que el alumno aplique algunas técnicas para determinar los diversos
efectos, letal, inhibidor o promotor del crecimiento, que los metales pesados o
los detergentes pueden tener sobre los microorganismos
Material
Tubos de 18x150mm con tapón de rosca, hisopos estériles pinzas de
disección, discos de papel estériles, guantes y cubrebocas. Medios de Cultivo
Caldo nutritivo con Tween 80 al 1,3,5,7 y 9 %, gar nutritivo. Reactivos: AgNO3
al 1% MgSO4 al 2% Dodecil sulfato de sodio 1% HgCl2 al 1%, etanol, cloruro de
benzalconio al 2%.Cepas: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus
subtilis, Klebsiella pneumoniae
84
Introducción
Debido a la gran variedad de microorganismos (M.O.) y ambientes que
habitan, no hay un método ideal para eliminar, remover o inhibir a todos los
M.O. de todos los sitios. Los metales pesados y los detergentes han sido
usados profusamente para lograr en parte el control de los M.O. Estos
productos son químicos que ayudan a eliminar M.O. de las superficies inertes
o de los tejidos vivos (Madigan y col., 2009).
Dentro de los compuestos con metales pesados se encuentran
derivados de la plata, mercurio, cobre y estaño. Actúan combinándose con los
grupos sulfihidrilos libres de las enzimas; causando inactivación mediante una
coagulación o precipitación, lo cual puede provocar un efecto microbicida o
microbiostático. El efecto que tienen los metales pesados a bajas
concentraciones de inhibir el crecimiento se conoce como efecto oligodinámico
(Willey y col., 2011).
Los detergentes actúan como agentes tensoactivos y además los
catiónicos alteran el potencial electronegativo de las membranas.
Los detergentes aniónicos son los jabones cuya función principal es la de
arrastre microbiano. Algunos compuestos sin embargo se incorporan a
dentríficos como agentes antiplaca ya que al disminuir la tensión superficial
favorecen la penetración en el interior de la placa (ej.: lauril sulfato sódico). Los
detergentes catiónicos, contienen un átomo de nitrógeno cargado (un grupo
85
amonio) que es hidrófilo con cuatro grupos orgánicos hidrófobos unidos al
nitrógeno, desorganizan membranas. Se utilizan para limpiar heridas y en
odontología como antisépticos bucales (ejemplo cloruro de benzalkonio, cloruro
de bencetonio) (WHO, 2009).
Procedimiento
Efecto de los Metales Pesados y Detergentes en Solución sobre el
Crecimiento Microbiano.
1. Impregnar discos de papel filtro con los diferentes químicos a probar.
2. Sembrar con hisopo una placa de agar nutritivo con cada una de las cepas.
3. Marcar cada caja de Petri con el nombre de la cepa y con la clave del
agente químico distribuyéndolos separados y presionarlos ligeramente con
la punta de las pinzas de disección estériles.
4. Incubar las cajas a 37°C por 24 horas.
5. Medir en mm el diámetro del halo de inhibición del crecimiento (zona
transparente alrededor del disco de papel)
Determinación del Efecto del Tween 80
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1. Colocar en una gradilla los tubos de caldo nutritivo sin y con tween 80 a las
diferentes concentraciones. Escriba el nombre de las cepas que va a
sembrar.
2. Inocular los tubos con una asada de la cepa
3. Incubar a 37°C durante 24 horas
4. Determinar el crecimiento en los tubos por el método de las 4 cruces. Poner
especial cuidado en las características que presenta el tipo de crecimiento
en cada tubo
Observaciones:
Conclusiones
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________________________________________________________________
________________________________________________________________
_______________________________________________________________
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Cuestionario
1. Todos los agentes químicos utilizados en la práctica se disolvieron en agua.
Explique ¿por qué?
_____________________________________________________________
_____________________________________________________________
_____________________________________________________________
_____________________________________________________________
_____________________________________________________________
2. Si los agentes químicos se hubieran disuelto en etanol. ¿Se habrían
obtenido resultados diferentes? Explique su respuesta.
_____________________________________________________________
_____________________________________________________________
_____________________________________________________________
_____________________________________________________________
_____________________________________________________________
3. La concentración del nitrato de plata utilizada en esta práctica es más baja
que la de los otros agentes. Explique la razón.
_____________________________________________________________
_____________________________________________________________
_____________________________________________________________
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Práctica No. 14
CONTROL DE MICROORGANISMOS UTILIZANDO LUZ ULTRAVIOLETA
Objetivo
Que el alumno vea el efecto de la luz ultravioleta sobre las bacterias y su
aplicación como forma de control del crecimiento bacteriano.
Material
1 Matraz Erlen Meyer de 500 mL, 1 Probeta de 100 mL, hisopos
estériles, asa de platino, agar nutritivo y Lámpara de luz UV. Material
biológico: Escherichia coli y Staphylococcus aureus.
Introducción
Algunas radiaciones electromagnéticas son capaces de producir un
efecto letal sobre las células por lo que pueden ser utilizadas como medidas de
control microbiológico. Entre otras se incluyen aquellas con una longitud de
onda por debajo de 300 nm como son: la luz ultravioleta, los rayos gamma y los
89
rayos X. Las radiaciones con una longitud de onda mayor no tienen suficiente
energía para destruir las células (Madigan y col., 2009).
La luz ultravioleta es capaz de producir un efecto letal cuando se irradian las
células con un rango comprendido entre 210-300 nm. Los componentes
celulares capaces de absorber la luz UV son los ácidos nucléicos con el DNA
como diana más importante. Dentro de sus componentes son las pirimidinas las
que absorben especialmente la luz UV, resultando como efecto a esta acción,
la formación de dímeros de timina (unión covalente de dos moléculas
adyacentes de timina). La formación de estos dímeros distorsiona la
configuración de la molécula de DNA y esto interfiere con la replicación y
transcripción del DNA durante la síntesis de las proteínas.
El efecto bactericida puede verse influido por: la densidad de la suspensión
bacteriana, por la naturaleza del medio donde se encuentra y por el tipo y
estado fisiológico de la célula.
La radiación UV debido a su baja penetrabilidad no puede ser usada
como un medio de esterilización por lo que su aplicación se limita a su uso en
superficies y para la desinfección del aire, fundamentalmente en centros
sanitarios e industrias alimentarías (Madigan y col., 2009).
90
Procedimiento
1. Tomar el tubo que contiene el cultivo de 24 horas del microorganismo.
2. Inocular completamente y de modo uniforme la superficie del agar de
cada una de las placas Petri usando el hisopo estéril humedecido con el
cultivo líquido o el asa de platino.
3. Rotular una de las placas como control. No recibirá ningún tratamiento.
4. Retirar la tapa de la placa Petri durante la exposición a la luz UV.
5. Exponer las placas restantes a la luz UV, durante 10 seg, 30 seg, 1 minuto
y 2 minutos.
6. Incubar todas las placas a 37ºC durante 24-48 horas.
7. Anotar las variaciones que se producen en el crecimiento de los cultivos,
según el tiempo de exposición a la fuente de luz UV.
Distribución de trabajo: Cada cuatro personas. Sembrar una placa por
persona y luego se reúnen para ver el efecto.
Observaciones:
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Conclusiones
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
_______________________________________________________________
Cuestionario
Definir los siguientes términos:
1. Esterilización__________________________________________________
________________________________________________________________
_______________________________________________________________
2. Desinfectantes_________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
3. Antisépticos___________________________________________________
________________________________________________________________
_______________________________________________________________
4. Bactericida____________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
92
5. Bacteriostático_________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
93
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