1908612894.guia de laboratorio de microbiología segunda parte (1)

UNIVERSIDAD SANTIAGO DE CALI PROGRAMA DE QUÍMICA MICROBIOLOGÍA Profesora: Lic. Luz Dary Caicedo Bejarano M.Sc.

ANALISIS BÁSICOS DE ALIMENTOS

PREPARACIÓN Y DILUCIÓN DE LAS MUESTRAS DE ALIMENTOS:

INTRODUCCIÓN

Varios factores afectan los resultados obtenidos en un recuento

bacteriano, tales como temperatura de incubación, método empleado, tipo

de alimento, pero definitivamente lo que asegura buenos resultados, es el

cuidado que se tenga para obtener y preparar una buena muestra que

servirá como inoculo preciso y fiel reflejo del numero de microorganismos

presentes. Existen varios métodos para lograr este objetivo, pero nos

centraremos en el recomendado por él.International Standar Organization

(ISO). El diluyente utilizado es el agua peptonada o tamponada con una

solución amortiguadora de fosfatos.

OBJETIVOS:

1. Utilizar las técnicas adecuadas de preparación de las muestras para

análisis microbiano.

2. Adquirir destreza en Ia preparación de las diferentes diluciones de las

muestras que se van a analizar..

3. Establecer que número de diluciones necesitan las diferentes

muestras a analizar.

METODOLOGIA :

La cantidad de alimentos empleada puede variar dependiendo del tipo de

bacterias que se busca; lo importante es conseguir una dilución inicial de

10-1. En nuestro caso emplearemos 10 gramos de alimento y 90 ml del

diluyente.

La homogeneización de la muestra puede hacerse en un agitador,

licuadora o con un mortero cuando se trata de alimentos fácilmente

rompibles. Una vez obtenida esta suspensión se procede a realizar las

diluciones; para conseguirlo se debe disponer de varios tubos que

contienen 9 ml de diluyente a los cuales se transfiere 1 ml de la dilución


anterior. De esta forma y a partir de 10-1 se puede obtener las diluciones

10-2, 10-3, 10-4, etc respectivamente.

Una vez preparadas las diluciones de la muestra, las siembras se realizan

inoculando 1 ml. de cada una cuando se hace en profundidad ó 0.1 ml

cuando es en la superficie de un agar.

RECUENTO MICROBIANO DE MESOAEROBIOS


A los alimentos es común practicarles un examen bacteriológico con la

finalidad de cuantificar las diferentes poblaciones bacterianas que ellos

presentan y la presencia de determinados tipos de microorganismos

puede reflejar deficiencia en el proceso mismo de la elaboración o

posteriormente en la manipulación que conduce al empaque.

RECUENTO STANDARD DE MESOFILOS AEROBIOS VIABLES

(MESOAEROBIOS)

EL método empleado se realiza en caja de Petri utilizando el agar cuenta

gérmenes como medio de cultivo; se realiza a todo tipo de alimento y la

siembra puede hacerse en profundidad, ó en superficie.

OBJETIVO:

Cuantificar la población de microorganismos aerobios viables en un

alimento.

MATERIALES: Por muestra de alimentos

1 Balanza (alimento sólido)

1 Pipeta de 10 ml graduada estériles (sí el alimento es líquido)

1. Papel o vidrio reloj estéril (si el alimento es sólido)

1. Tijera o pinza estéril

1 Morteros estériles (alimento sólido)

1 Hoja de bisturí (Alimento es carne)

1 Bajalenguas estériles (alimentos sólidos)

1 Recipiente frasco con 90 ml de agua peptonada para la primera

dilución

10 Tubos con 9 ml de agua peptonada para las diluciones

5 Cajas de petri vacias estériles.

1 Micropipeta de 100 – 1000 microlitros

5 Tubos o erlenmeyer con 15 mL de plate Count Agar


METODOLOGÍA:

Tradicionalmente se ha recomendado que con la finalidad de minimizar el

error producido en los recuentos, todas las diluciones se siembren por

duplicado.

1. Preparar las diluciones del alimento siguiendo las instrucciones de

la sección anterior.

2. Pipetear de cada dilución 1 ml en una caja de petri vacia y estéril

empezando por la dilución 10-1 hasta 10-5 Se sugiere esta serie de

diluciones cuando no se conoce el grado de contaminacíon que

pueda tener el alimento.

3. Teniendo el medio de cultivo fundido y enfriado a una temperatura

de 45°C aproximadamente agregar a cada caja de Petri que

contiene el ml. de las diferentes diluciones el contenido del tubo.

Con movimientos suaves en sentido vertical, luego horizontal y

finalmente circulares en el sentido de las agujas del reloj y a la

inversa, teniendo el cuidado de no formar burbujas, se logra una

mezcla uniforme entre la muestra y el medio de cultivo. Debe

hacerse siguiendo los pasos anotados para conseguir un

crecimiento bacteriano uniforme y rápido, para evitar la

solidificación del agar.

4. Una vez solidificado el agar se invierten y se incuban a 35-37°C.

REALIZACION DE LOS RECUENTOS: Seleccione para hacer su recuento aquella dilución donde haya

crecimiento bacteriano que contenga entre 30 y 300 colonias.

Cuente las colonias y el número encontrado deberá multiplicarlo por el

reciproco de Ia dilución que utilizo para hacerlo.

Pueden presentarse ciertas variaciones en los cultivos realizados. En la

hoja siguiente usted encontrará las diferentes posibilidades y que hacer

en cada caso. Lo importante es saber que cuando se puedan encontrar


diluciones que contengan entre 30 y 300 colonias si el recuento es

preciso, se informa como Recuento Standard.

RECUENTO ESTIMADO STANDARD

Este cálculo se realiza cuando no es posible encontrar ninguna dilución

que contenga menos de 300 colonias. Para hacer recuentos se puede

dividir la caja en 2-4 6 aun 8 porciones y contar las colonias. Este numero

de colonia se multiplica por el factor apropiado ( 2, 4 u 8) y además por el

reciproco de la dilución, que en este caso sería la más alta.

Cuando hay más de 200 colonias por 1/8 se asume que en toda la caja

hay más de 1.600 (200 X 8). El recuento total deberá ser mayor de 1.600

multiplicado por el reciproco de la más alta dilución.

Si no hubiese colonias en la caja de la dilucíon menor (10-1) se reporta

como menos de 10 colonias puesto que el mínimo número de colonias

que se puede obtener es de 1 y al multiplicarlo por el reciproco de la

dilución dará 10.

EXPRESION DE LOS RESULTADOS: 1. El recuento bacteriano se debe expresar con 2 dígitos y el resto en

potencias de 10.

2. Como no siempre el conteo de colonias produce valores como por

ejemplo 10-20-50-8O-300 etc. es necesario aplicar algunas

correcciones con la finalidad de convertir el numero hallado en uno con

2 dígitos. Ejemplos

1. Si el recuento se realizó en la diluci6n 10-3 y fue de 138 colonias, el

tercer dígito por ser mayor que 5 permite adicionar 1 unidad al 2o. o

sea que el recuento seria 190.000= 14 x 104.

3. Si el recuento fue de 124, por ser el 3o dígito menor que 5 se anula y

se expresa 120.000= 12 x 104.


4. Cuando el recuento de mesoaerobios se utiliza para determinar la

aceptación o rechazo de un alimento, únicamente se considerar el

recuento standard y nunca el estimado.

NORMAS PARA INTERPRETAR Y REPORTAR EL RECUENTO ESTANDAR EN

PLACA.

Características del recuento

Ejemplo Calcular Reportar

Dos cajas de la misma dilución tienen entre 30 y 300 colonias. Contar las dos cajas

Dilución 10-2

Caja 1: 180 Caja 2: 140

Promedio aritmético: Promedio = 160

Recuento estandar en placa: 16 x 10

3

En la misma dilución una caja tiene entre 30 y 300 y la otra < 30 ó >300 colonias. Contar las dos cajas.

Dilución 10-2

Caja 1: 70 Caja 2: 26

Promedio aritmético: Promedio = 48


2

Las cajas de dos diluciones consecutivas tienen entre 30 y 300 colonias Contar las 4 cajas

a. 10-3

: 35 b. 10

-2: 250

Relación 10-2

/10-3

: 35000/25000 = Menos de 2. Tomar promedio.


3

a. 10-3

: 38 b. 10

-2: 150

Relación 10-2

/10-3

: 38000/15000 = Mayor de 2. Tomar el menor.


3

No hay colonias en las cajas de la suspensión más concentrada

Dilución 10-1

Caja 1: <1 Caja 2: <1

Promedio: <1 Recuento estimado en placa: <1x10

1

Dos cajas de la dilución más alta tienen más de 300 colonias. Dividir las cajas en forma radial (2, 4, 8) y contar el número de colonias por sección.

Dilución 10-3

Caja 1: 180 en ¼ Caja 2: 160 en ¼

Promedio aritmético 180 x 4 = 720 160 x 4 = 640 Promedio: 680

Recuento estimado en placa: 68 x 10

4

Más de 200 en 1/8.

>200 x 8 = 1600 Recuento estimado en placa > 16 x 10

5

Presencia de colonias diseminadas en un área menor de la mitad de la caja. Contar la otra mitad

Dilución 10-2

Caja 1: mitad 60 x 2. Caja 2. 180

Promedio aritmético: X = 150

Presencia de colonias diseminadas 15x 10

3


RECUENTO BACTERIANO EN PLACA DE COLIFOMES

INTRODUCCIÓN:

El recuento de coliformes realizado en agar y ca,ia de Petri suministra un

dato acerca de las bacterias que contaminaron el alimento posterior al

proceso. Los coliformes se hacen evidentes por la capacidad que ellos

tienen para fermentar la lactosa que posee el medio de cultivo. Es

necesario anotar que aunque los indicadores de contaminación fecal

(Escherichia coli) son también coliformes, este recuento solo nos

suministra el dato de bacterias que pueden provenir tanto del intestino

humano y animal como de otras fuentes. Esta técnica es recomendada

para el análisis de agua, leche, helados y carnes.

OBJETIVOS

1. Familiarizar al estudiante con el procedimiento y medio de cultivo

empleado para realizar el recuento de coliformes.

2. Medir el grado de contaminación de un alimento procedente de los

manipuladores.

MATERIALES

1. Elementos necesarios para la preparación de las diluciones de las

muestras (Diluciones 10-1 a 10-3)

2. Cajas de Petri estériles y vacias

3. Micropipeta de 100- 1000 microlitros

4. Tubos con 15 ml de Agar Violeta cristal rojo neutro bilis o Mac Conkey

PROCEDIMIENTO: 1. Prepare una muestra de alimento y haga diluciones hasta 10-3.

2. Transferir 1 ml de cada dilución a una caja de Petri estéril.


3. Adicionar 10-15 ml del medio de cultivo licuado y enfriado a 44-45°C y

practicar los movimientos necesarios para conseguir una completa

homogenización de la muestra. Dejar solidificar el medio.

4. Recubrir la superficie del medio solidificado con 10 ml del medio de

cultivo también enfriado s 44 - 45°C:

5. Invertir e incubar las ca,ias a 37°C durante 24 horas. Al cabo de este

tiempo escoja la dilución que contenga entre 30 y 300 colonias de

color rojo y de diámetro mayor de 0.5 mm. El recuento se expresará

multiplicando el número de colonias contadas por la dilución de la caja

en la cual se hizo el recuento.

NMP DE COLIFORMES FECALES Y TOTALES

INTRODUCCIÓN:

El número más probable (NMP) es un método de realizar recuento

bacteriano basado en la probabilidad que existe en el laboratorio de aislar

bacterias en un sistema de medios de cultivo líquidos donde se siembran

los inóculos empleando series de 5 y 3 tubos por cada dilución. Esta

técnica que es tal vez de las más sensibles, se puede aplicar a muchos

microorganismos. En nuestro caso lo utilizaremos en la búsqueda de

Coliformes Totales y Fecales, Escherichia coli y Enterococcus, .como

indicadores bacterianos de contaminación fecal y para Staphylococcus

aureus, indice bacteriano. El NMP para S. aureus es especialmente

recomendado para el análisis de leche en polvo.

OBJETIVOS:

1. Familiarizar al estudiante con la técnica y los medios de cultivo

empleados para realizar el NMP de coliformes totales y fecales,

Enterococos y S. aureus.

2. Aplicar los indicadores bacteriológicos de contaminación fecal.

3. Buscar índices bacterianos en cierto tipo de alimentos.

NMP DE COLIFORMES TOTALES, FECALES Y E. coli


La Prueba consta de tres etapas:

1. Prueba presuntiva

2. Prueba confirmativa

3. Prueba completa

MATERIALES

1. 10 Tubos con 9 ml de Caldo Lauril Sulfato Triptosa de sencilla

concentración y tubo de fermentación.

2. 10 Tubos con 9 ml de Caldo Lactosado Verde Brillante Bilis con tubo

de fermentación.

3. 10 Tubos con caldo Triptona

4. 3 Cajas de Petri con Agar Mac Conkey

5. Pruebas bioquímicas

METODOLOGIA:

Usaremos dos series de tres tubos para cada dilución. La primera serie

consta de tres tubos con Caldo Lauril Sulfato Triptosa de doble

concentración y seis con Caldo Lauril Sulfato Triptosa de concentración

sencilla. Esta técnica es recomendada para el análisis de agua tratada y

será mencionada en detalle en la Práctica de Microbiología del Agua.

La segunda serie, que también se utiliza para agua sin tratar, la

realizaremos para analizar un alimento consta de 9 tubos que contienen

Caldo Lauril Sulfato Triptosa de concentración sencilla con tubo de

fermentación.

A. PRUEBA PRESUNTIVA

1. Prepare la muestra del alimento con los 90 ml de solución sal.ina

peptonada y a partir de ella haga diluciones hasta 10-3

2. Inocule 1 cc de la dilución 10-1 en cada uno de tres tubos con el medio

de cultivo antes anotado


3. Continué sembrando un ml de cada dilución en 3 tubos hasta llegar a

la dilución 10-3.

4. Incube a 37ºC durante 24-48 horas.

5. Registre los tubos que contienen gas en el tubo de fermentación y

presenten turbidez.

PRUEBA CONFIRMATIVA:

1. De todos los tubos positivos en la prueba presuntiva transfiera 2

asadas a otros que contienen Caldo Verde Brillante, lo mismo que a

los tubos con Caldo Triptona.

2. Incubar a 45ºC los tubos brilla y triptona inoculados durante 24-48

horas. La prueba confirmativa también se puede realizar inoculando de

los positivos en la presuntiva a caldo E.C. e incubar a 44.5 ± 0.2°C.

3. Al cabo de la incubación observar los tubos de brilla que presenten

turbidez y gas y practicar prueba de Indol a los Caldos Triptona.

4. Registre los tubos positivos de brilla y para Indol.

5. éstos le darán la fórmula que aplicará a la tabla adjunta para buscar el

NMP de coliformes fecales. No incluya los tubos Indol negativo aunque

el brilla haya sido positivo.

PRUEBA COMPLETA:

1. De cada uno de los tubos con brila positivos y que tambien fueron

Indol positivos tome una asada para sembrar Agar EMB.

2. Incube a 37ºC y al cabo de este tiempo observe la morfología de las

colonias. Si encuentra colonias aisladas y típicas se puede purificar el

cultivo en agar nutritivo inclinado.

3. A partir de una colonia aislada a del agar nutritivo realice las pruebas

bioquímicas para identificar completamente Eschechia coli.


TABLA PARA REALIZAR LA LECTURA DEL NMP DE ALIMENTOS * (COLIFORMES Y ENTEROCOCOS)

Índice del NMP y límites de confianza 95% para varias combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se utilizan tres tubos de cada dilución.**

Número de tubos positivos en cada nivel de dilución

Límites de confianza

Dilución 10-1

Dilución 10-2

Dilución 10-3

NMP/g ó ml

99% 95%

0 0

1 0

0 0

3 4

1 1

23 28

1 1

17 21

1 1 1

0 1 2

1 0 0

7 7

11

1 1 2

35 36 44

2 2 4

27 28 35

2 2 2 2 2

0 0 1 1 2

0 1 0 1 0

9 14 15 20 21

1 3 3 5 5

50 62 65 77 80

2 5 5 8 8

38 48 50 61 63

3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

0 0 1 1 2 2 2 3 3 3

0 1 0 1 0 1 2 0 1 2

23 40 40 70 90 150 210 200 500

>11000

4 10 10 20 20 30 50

<100 100 200

177 230 290 370 520 660 820 1900 3200 6400

7 10 20 20 30 50 80 100 200 300

129 230 210 280 390 510 640 1400 2400 4800

* Calculado a partir de los datos Man (1975) ** En cada nivel de dilución inocular 1 ml en cada uno de los tres tubos de medio. Para calcular el NMP de las diluciones mayores que las que señalan, multiplicar el NMP por el factor apropiado de 10, 100, etc.

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS INTRODUCCIÓN:

La familia Enterobactericeae esta compuesta por bacilos Gram negativos

de tamaño mediano, anaerobios facuitativos, móviles e inmóviles, no

esporulados. Las enterobacterias crecen bien en medios artificiales,

tienen necesidades nutritivas simples, fermentan la glucosa con

producción de ácido o ácido y gas, reducen los nitratos a nitritos y son


oxidasa negativos; son organismos ubicuos de distribución mundial,

encontrándose en el suelo, el agua, la vegetación y formando parte de la

microbiota bacteriana normal de casi todos los animales. Algunos géneros

de la familia se encuentran normalmente en el humano.

Miembros de esta familia se encuentran asociados a cuadros disentéricos,

mientras que otros, pueden producir infecciones oportunistas. Las

infecciones pueden comprometer muchos órganos o sistemas.

METODOLOGÍA:

1. De las enterobacterias aisladas de los alimentos realizar una siembra

por agotamiento en agar Mac Conkey, para observar colonias

fermentadoras y no fermentadoras de lactosa. Incubar a 37°C durante

24 horas.

2. Observar la morfología, tamaño, aspecto y color de las colonias.

Aquellas que presenten color rosado habrán fermentado la lactosa.

3. A partir de las colonias lactosa negativas, hacer subcultivos en agar

Hecktoen.

4. De las colonias aisladas, obtenidas en los dos agares selectivos.

sembrar en los siguientes medios para realizar pruebas bioquímicas:

TSI: contiene glucosa, sacarosa, lactosa y rojo de fenol, indicador de pH

sulfato ferroso, para observar la producción de H2S. La siembra se hace

con asa recta en profundidad y estría en la superficie.

lnterpretación:

REACCIÓN INTERPRETACIÓN

Fondo ácido* Superficie A/K inclinada alcalina Fermentación de glucosa

Todo el medio ácido (Amarillo A/A Fermentador de glucosa y lactosa

Burbujas Producción de gas

Ennegrecimiento del fondo Producción de H2S

Medio alcalino (rojo) K/K No fermentador

Acido: amarillo Alcalino: rojo


Lisina decarboxilasa:

La decarboxilación es el proceso por el cual las bacterias que poseen

decarboxilasas específicas son capaces de atacar a los aminoácidos en

su grupo carboxilo (-COOH), dando una amina o una diamina y anhídrido

carbónico. Se siembra igual que el TSI.

Interpretación:

La prueba es positiva cuando hay cambio de color al púrpura. Los

organismos del grupo de los Proteus cambian el color a rojo, debido a la

acción de la cadaverina. La reacción se observa rojo en la superficie

inclinada y amarillo en el fondo. Se denota como R/A. La prueba es

negativa cuando hay cambio de color al amarillo.

Citrato de Simmons:

Contiene citrato como única fuente de carbono y sales de amonio como

fuente de nitrógeno, no contiene aminoácidos. Las bacterias que pueden

utilizar el citrato tambien extraen nitrógeno con la producción de amonio

que alcaliniza el medio de cultivo; el indicador de pH es azul de

bromotimol. Se siembra solamente en superficie.

Interpretación:

La prueba es positiva cuando se observa crecimiento con un color azul

intenso. La prueba es negativa si no se observa cambio de color.

Urea de Christensen:

Si la bacteria posee la enzima ureasa, hidroliza la urea del medio

liberando amonio y C02. EI indicador utilizado es el rojo de fenol. Se

siembra en superficie.

Interpretación:

La prueba es positiva cuando se observa cambio de color al rosado.

La prueba es negativa cuando no hay cambio de color.


Movilidad:

La siembra se realiza por una punción con asa recta entrando por el

centro del agar, pero sin Ilegar hasta el fondo del tubo que contiene agar

blando. Las bacterias móviles se diseminan en el medio y puede

observarse opaco todo el tubo o como una nube alrededor del sitio por

donde entro el asa. Cuando Ia bacteria es inmóvil, solo se observa

turbidez donde entro el inóculo.

Prueba de Indol:

Las bacterias que poseen la enzima triptofanosa, son capaces de

hidrolizar y desaminar el triptófano con la produccion de indol, ácido

pirúvico y amonio. Para evidenciar la presencia de indol se adiciona el

reactivo de Kovacs. Para sembrar el inóculo se agita el asa en el caldo.

Interpretación:

La prueba es positiva cuando se presenta un anillo rojo en Ia superficie o

todo el medio se torna color mandarina. La prueba es negativa cuando el

caldo continúa turbio o se torna de color amarillo.

Si la bacteria que se identifica, bioquímicamente, es compatible con

Salmonella sp. o Shiguella sp., se hace necesaria la confirmación

serológica con antisueros polivalentes y específicos de grupo.

BÚSQUEDA DE SALMONELLA INTRODUCCIÓN:

La Salmonella es un género bacteriano que se puede encontrar en

muchos alimentos, ya sea proveniente de la materia prima o de

manipuladres que porten la bacteria. Este examen se le practica

rutinariamente a todos los alimentos producidos a base de carne y

huevos, en ocasiones se realiza en cierto tipo de alimentos por ejemplo:


harinas de trigo y de pescado. Su presencia es suficiente para rechazar

un alimento, pues se trata de un índice bacteriológico o sea una bacteria

patógena.

OBJETIVO:

1. Realizar la prueba cualitativa de detección de Salmonella para

aceptar o rechazar un alimento.

MATERIALES:

a. Erlenmeyer con 225 ml de caldo lactosado

b. Tubos con caldos de enriquecimiento Selenito, Tetrationato y Hajna

c. Cajas de Petri con Hecktoen

d. Medios para pruebas bioquímicas de enterobacterias.

e. Micropipetas

f. Asas

METODOLOGIA:

1. enriquecimiento no selectivo. Pesar 25 gramos del alimento e

inocularlo en 225 ml de caldo lactosado e incubar a 37°C durante 18-

24 horas.

2. enriquecimiento selectivo: Transferir 1 ml de caldo crecido a 10 ml

de Tetrationato, Selenito o Caldo Hajna. Incubar a 43°C durante 18

horas. AI cabo de la incubacidn, si se observa crecimiento en los

caldos de enriquecimiento realice subcultivos en agar Bismuto Sulfito y

Mac Conkey e incube a 37°C durante 18 - 24 horas. Efectúe la lectura

del cultivo y si observa colonias lactosa negativas realice las pruebas

bioquímicas necesarias para la identificación de Salmonella e inocule

en agar nutritivo para confirmación serológica.

3. aglutinación con antisuero polivalente somático:. Una vez que por

pruebas bioquímicas se encuentre frente a una posible Salmonella,

debe aglutinar para corroborar su hallazgo. Deposite en agar nutritivo

unas 5 gotas de solución salina para hacer una suspensión

homogénea; coloque una gota de ella en un portaobjetos y al lado una


gota de antisuero, mezclelas y someta a agitación durante unos

segundos. Si es Salmonella deben presentarse unos grumos que

indican positividad en la prueba.

RECUENTO DE MOHOS Y LEVADURAS

INTRODUCCIÓN:

Todo el mundo conoce el crecimiento de los mohos en los alimentos,

caracterizados por un aspecto aterciopelado o algodonoso, a veces

coloreado; generalmente este alimento se desecha como inadecuado

para el consumo. Si bien es cierto que algunos hongos causan el

deterioro de los alimentos, otros son útiles en la elaboración de éstos.

Además ciertos hongos pueden producir metabolitos tóxicos

(micotoxinas). Son contaminantes de harinas, azúcares, granos

almacenados, frutas, condimentos, etc. Son muy importantes los

recuentos de hongos por que nos brindan una idea de cómo se esta

procesando y bajo que condiciones se esta almacenando el producto.

OBJETIVOS:

1. Que el estudiante reconozca los medios de cultivos utilizados para

realizar los recuentos de hongos.

2. Realice el proceso de recuento de unidades formadoras de colonias

por gramo o mililitro de muestra (UFC/ml) y la identificación de hongos.

MATERIALES:

Erlenmeyer de 500 ml Vidrios reloj

Espátula Asas de vidrio estériles

Probeta de 250 ml Balanza de precisión y analítica

Cajas de Petri estériles Mecheros de gas


Asas micológicas Agitador magnético

Autoclave Agar bacteriológico

Peptona Glucosa

Cloranfenicol

METODOLOGÍA.

1. Realice las diluciones de acuerdo con lo especificado en la página 1 y

2. (De 10-1 a 10-3)

2. Inocule en la superficie del agar Saboraud de la siguiente manera:

1 ml de la dilución 10-1 (1:10)

0.1 ml de la dilución 10-1 (1:100)

0.1 ml de la dilución 10-2 (1:1000)

0.1 ml de la dilución 10-3 (1:10000)

3. Distribuya con un asa de vidrio la muestra situada en la superficie del

agar Saboraud.

4. Incúbelos a temperatura ambiente por 5 – 8 días.

5. Haga los recuentos y posible identificación del hongo.


ANÁLISIS BACTERIOLÓGICO DEL AGUA DE PISCINA. BÚSQUEDA

DE Pseudomonas aeruginosa

INTRODUCCIÓN:

EI agua de piscina debe reunir las características del agua potable, por lo

tanto, el análisis a realizar se hace igual que para el agua tratada, con dos

variantes:

A los 100 ml de muestra se le debe agregar 0.3 mls de Tiosulfato de

Sodio al 10%.

La busqueda de Pseudomonas aeruginosa se considera un examen

rutinario en el análisis bacteriológico, por la implicacidn clinica que pueda

tener, como agente etiológico de otitis.

MATERIALES:

a. Un erlenmeyer con 50 ml de Caldo Olson

b. Muestra de agua

c. Agar Cetrimide

d. Asas bacteriológicas de argolla

e. Incubadora a 35°C ± 1°C.

f. Mechero

METODOLOGIA:

1. Sembrar 50 ml de la muestra en 50 ml de Caldo Olson

2. Incube a 35°C f durante 24 horas

3. Transfiera dos asadas al agar Cetrimide y siembre en superficie por

agotamiento.

4. Incube a 42°C durante 24 a 48 horas

5. Informe: Presencia de Pseudomonas aeruginosa: negativa o posiiiva

6. Realice también recuento de mesófilos aerobios viables

7. Haga la prueba de NMP para coliformes totales y fecales


ANÁLISIS BACTERIOLÓGICO DEL AGUA INTRODUCCIÓN:

La orientación de estos análisis ha basado principalmente su interés en

los aspectos sanitarios. No se conocen bien todas las bacterias cuyo

medio propio es el agua, en parte porque es difícil que muchas de ellas

crezcan en medios de cultivo rutinarios, pero hay otras que se han identi

icado como población natural, entre las cuales encontramos Serratia,

Pseudomonas, Sarcina, Micrococcus y Caulobacterias Ilamadas también

bacterias pedunculadas.

Es necesario el análisis bacteriológico del agua para determinar

potabilidad para el consumo humano, así como para controlar la eficacia

de los métodos de tratamiento.

OBJETIVOS:

1. Llevar a cabo análisis bacteriológico de agua tratada y sin tratar para

establecer su calidad sanitaria.

2. Aislar Pseudomonas aeruginosa en muestras de agua de piscinas.

MATERIALES:

a. Solución salina peptonada para las diluciones

b. Agar cuenta germenes. Recuento de mesoaerobios

c. Cajas de Petri vacias estériles

d. Caldo Lauril Sulfato Triptosa. NMP de coliformes totales y fecales

e. Caldo Verde brillante o caldo EC NMP de coliformes totales y fecales

f. Agar MacConkey : Lactosa negativos y positivos.

g. Agar cetrimide. Pseudomona

h. Pipetas serológicas graduadas


METODOLOGIA:

Análisis bacteriológico de agua sin tratar:

Recuento estandar de mesofilos aerobios viables (mesoaerobios) :

1. A partir de la muestra de agua tomar 10 ml y agregarlos a 90 ml de

solución salina peptonada (diluyente), (dilución 10-1), seguidamente

hacer diluciones sucesivas hasta 10-5.

2. Pipelear de cada dilución 1 ml a una caja de Petri vacia y estéril.

3. Teniendo el medio de cultivo fundido y enfriado a una temperatura de

45°C aproximadamente agregar a cada caja de Petri que contiene el

ml de las diferentes diluciones el contenido del tubo. Con movimientos

suaves en sentido vertical, luego horizontal y finalmente circulares en

el sentido de las agujas del reloj y a la inversa, teniendo el cuidado de

no formar burbujas, se logra una mezcla uniforme entre la muestra y el

medio de cultivo. Debe hacerse siguiendo los pasos anotados para

conseguir un crecimiento bacteriano uniforme y rápido, para evitar la

solidificación del agar.

4. Una vez solidificado el agar las cajas se invierten y se incuban a 35 –

37ºC durante 24 a 48 horas.

5. Seleccione para hacer su recuento, aquella dilución donde haya

crecimiento bacteriano que contenga entre 30 y 300 colonias.

6. Cuente las colonias y el numero encontrado deberá multiplicarlo por

reciproco de la dilución que utilizo.

Prueba presuntiva para determinación de coliformes totales por el

méto del NMP:

1. Realice diluciones 1:10, 1:100, 1:1.000, 1:10.000 de su muestra de

agua. Marque sus tubos de dilución y caldo para sembrar, de tal forma

que tenga tubos con caldo para sembrar cada dilución.

2. Transfiera 1 ml de cada dilución a cada uno de los 3 tubos con caldo

con LSTB use una pipeta para cada dilución.

3. Incube a 35°C +/- 1°C durante 24 ó 48 horas.


4. Anote sus resultados tomando como positivo los tubos que tengan

turbidez y gas en el tubo de fermentación.

Prueba confirmativa para determinación de coliformes fecales por el

medio del NMP

1. De los tubos positivos repicar 0.5 ml a caldo E.C., incubar a 44.5 ± 0.2

durante 24 a 48 horas.

2. Considerar como positivos los tubos que presenten turbidez y

producción de gas.

3. Anote sus resultados y busque el NMP en la tabla adjunta.

Determinacion de Escherichia coli:

1. A partir de los tubos E.C. positivos transfiera una asada a agar Mac

Conkey e incube a 35°C - 37°C durante 24 horas.

2. Escoja colonias aisladas lactosa positivas.

3. Realice pruebas bioquímicas e identifique Escherichia coli.


TABLA PARA REALIZAR LA LECTURA DEL NMP DE AGUA* (Coliformes y Enterococo)

Indice del NMP y limites de confianza 95% para varias combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se utilizan tres alicuotas de 10 ml, tres de 1 ml y otras tres de 0.1 ml. Nilmero de tubos positivos Limites de confianza del total de: Indice del NMP 95% 3 tubos 3 tubos de 3 tubos de por 100 ml (nferior Superior 10 ml 1 ml 0.1 ml 0 0 1 3 0.5 9 0 1 0 3 0.5 13 1 0 0 4 0.5 20 1 0 1 7 1 21 1 1 0 7 1 23 1 1 1 11 3 36 1 2 0 11 3 36 2 0 0 9 0 36 2 0 1 14 3 37 2 1 0 15 3 44 2 1 1 20 7 89 2 2 0 21 4 47 2 2 1 28 10 150 3 0 0 23 4 120 3 0 1 39 7 130 3 0 2 64 15 380 3 1 0 43 7 210 3 1 1 75 14 230 3 1 2 120 30 380 3 2 0 93 15 380 3 2 1 150 30 440 3 2 2 210 35 470 3 3 0 240 36 1300 3 3 1 > 460 71 2400 3 3 2 1100 150 4800 * Esta tabla procede de la American Public Health Association.

ANALISIS BACTERIOLÓGICO DEL AGUA POTABLE

Recuento estandar de mesofilos aerobios viables: de la misma forma

que para el agua no tratada.

Prueba presuntiva para determinación de coliformes totales por el

metodo del NMP:

1. A 100 ml de muestra agregar 0.1 ml.de Tiosulfato de Sodio al 10%,

para neutralizar la acción del cloro sobre las bacterias.


2. A cada uno de tres tubos de LSTB concentración doble, agregar 10 ml

del agua sin diluir.

3. A cada uno de tres tubos de LSTB concentración sencilla, agregar 1 ml

del agua sin diluir.

4. A cada uno de tres tubos de LSTB concentración sencilla, agregar 0.1

ml del agua sin diluir.

5. Incubar todos los tubos a 35°C - 37°C durante 24 a 48 horas.

6. Tomar como positivos los tubos que tengan turbidez y gas

Prueba confirmativa para determinación de coliformes fecales por el

metodo del NMP:

Realizar el procedimiento de la misma forma que para el agua no tratada.

Determinación de Escherichia coli:

Realizar el procedimiento de la misma forma que para el agua no tratada.

ANÁLISIS BACTERIOLÓGICO DE LA LECHE

INTRODUCCIÓN:

Los productos Iácteos son en general un excelente alimento para ser

alterados los microorganismos. La leche no contiene microorganismos

que se consideren normales, pero la leche cruda, fresca, de animal sano,

contiene microorganismos en relación con la higiene del ordeño, limpieza

y manipulación del equipo. La leche dentro de la ubre, debe ser estéril, la

leche emana a través del conducto que termina en un esfinter el cual al

dilatarse demora dos horas aproximadamente en volver a contraerse, la

vaca al echarse contamina el pezón. La leche contiene sustancias

bacteriostáticas que limitan el desarrollo de microorganismos, pero el

efecto no es duradero y es termolábil la sustancia que lo ejerce.

Entre los microorganismos patógenos que pueden provenir de la vaca

encontramos: M. tuberculosis, B. abortus, Streptococcus agalactiae

Staphylococcus aureus, entre otros.


La presencia de micobacterias ha servido para determinar la temperatura

empleada en la pasteurización, el cual es un método eficaz que no

garantiza la contaminación, posterior y tampoco elimina la totalidad de las

bacterias cuando la leche pasteurizada esta muy contaminada. Entre los

géneros considerados inocuos para la salud humana, que usualmente se

encuentran contaminando la leche cruda encontramos: Leuconostoc (de

la familia Streptococcaceae, junto con Aerococcus, Gemella, Pediococcus

y Streptococcus no ha sido identificado en humanos); Lactobacillus.

Micrococcus. Coliformes, Proteus, Pseudomonas, Sarcina, Bacillus sp.

AI ser pasteurizada la leche cruda debe eliminarse toda la población,

excepto la bacterias termodúricas principalmente de los géneros

Streptococcus, Lactobacillus y Bacillus, las cuales alteran la leche,

produciendo ácido láctico a partir de lactosa, bajando el pH,

presentándose el cuajado. " Las bacterias termodúricas resisten las

temperaturas del tratamiento pero a diferencia de las termofílicas no

necesitan estas temperaturas para su crecimiento y metabolismo.

Referente a los medios que se utilizan para el análisis microbiológico de la

leche Ia A.P.H.A. recomienda que el Caldo Lauril Sulfato Triptosa se

utilice para la identificación presuntiva de coliformes por el método de

NMP en aguas, afluentes ó aguas residuales, leche y alimentos.

En diferentes estudios se ha evidenciado un crecimiento abundante y

producción de gas a partir de pequeños inóculos de organismos

coliformes. También se ha demostrado su superioridad en el diagnóstico

presuntivo de la presencia de coliformes, comparado con el caldo verde

brillante al 2%.


MATERIALES:

Solución salina peptonada

LSTB de concentracion sencilla

Caldo Brila o caldo EC

Agar MacConkey

Agar cuenta g8rmenes · Pruebas bioquimicas

Bano Maria 63°C

Pipetas serologicas

METODOLOGIA:

ANÁLISIS BACTERIOLÓGICO DE LA LECHE CRUDA.

Se practican siguientes analisis:

Recuento de Mesoaerobios (visto anteriormente)

Determinacibn del NMP de coliformes totales y fecales y E. coli (visto)

ANÁLISIS BACTERIOLÓGICO DE LA LECHE PASTEURIZADA

Recuento de mesoaerobios

Determinacion del NMP de coliformes totales y fecales y E. coli:

Recuento de Termodúricos:

1. Homogenizar la muestra de leche y transferir 5 ml a cada uno de 2

tubos de ensayo.

2. Coloque el tubo en bano Maria a 62.8°C - 63°C durante 30 minutos.

3. Enfrie inmediatamente el tubo en una cubeta con hielo hasta que

alcance 4°C, en uno de los tubos se coloca el termómetro.

4. Siembre por duplicado en agar para recuento e incube a 30°C durante

48 horas.

5. Realice ei contaje e informe UFC/ml.


Prueba de la fosfatasa:

1. Preparación de controles:

2. Negativo: Colocar en un tubo de ensayo 5 ml de leche y en otro en el

cual se introduce además de la leche, un termómetro. Calentar a 90°C

durante 1 minuto, agitando continuamente para asegurar un

calentamiento uniforme y una destrucción de la fosfatasa. Enfriar

rápidamente.

3. Positivo: A 100 ml de leche previamente calentada a 90°C durante 1

minuto y enfriamiento rápido adicionar 1.0 ml de leche cruda y fresca.

Metodología:

1. Pipetear 1 ml de cada muestra de leche a un tubo de ensayo limpio y

seco.

2. Pipetear 5 ml de reactivo p-nitrofenildisódico a cada uno de los tubos

con leche y a los controles.

3. Tapar los tubos, mezclar bien y someterlos a incubación en baño

maria a 35.6°C durante 2 horas.

4. Después de la incubación, colocar los tubo a la luz del día o bajo luz

fluorescente (no se recomienda luz amarilla).

Interpretación:

Si las muestras de leche no presentan cambio de color, o un amarillo

débil, pero que no es más intenso que el color del control negativo, la

prueba se considera negativa e indica que las muestras fueron

pasteurizadas adecuadamente.

Si por el contrario, se presenta un color amarillo la prueba es positiva. Se

recomienda repetir la prueba repasteurizando la leche para excluir un

falso positivo dado por la fosfatasa bacteriana, la cual es más resistente al

calor que la fosfatasa alcalina de la leche cruda.


RECUENTO DE LACTOBACILLUS

Algunos alimentos son preparados inoculando en un sustrato adecuado,

cierto cultivo bacteriano que se utiliza para producir una sustancia que le

dá el sabor característico al alimento. Tal es el caso de algunas bacterias

fermentadoras, productoras de ácido láctico que son empleadas en la

industria de derivados lácteos, néctares y jugos: Un género bacteriano

importante en este tipo de industria son los Lactobacillus, los cuales

deben estar en un alimento en cantidades controladas para evitar la

descomposición prematura del producto.

OBJETIVOS:

1. Cuantificar la cantidad de Lactobacillus presentes es un alimento.

MATERIALES:

1. Todos los elementos necesarios para realizar la dilución.

2. Cuando el alimento es un producto ácido, el diluyente es una solución

amortiguadora pH 7.0.

3. Agar Rogosa en tubos, fundido y enfriado a 45ºC.

4. Cajas de Petri

5. Pipetas

6. Estufa incubadora

PROCEDIMIENTO:

1. Prepare diluciones de la muestra, empleando como diluyente agua

peptonada o buffer segúnun sea el caso.

2. Mida 10 ml de la muestra homogenizada y mezclela con 10 ml de

buffer, pH 7.0. Saque 2 ml de esta mezcla y transfiéralos a un tubo que

contiene 8 ml de agua peptonada y a partir de esta solución realice las

diluciones como se ha hecho siempre.


3. Depositar l ml da cada una de las diluciones en cajas de Petri vacias y

estériles.

4. Adicionar a la muestra 15 ml de agar rogosa fundido. mezclar, dejar

solidificar.

5. Agregar 5 ml de agar para cubrir la superficie. 6. Incubar a 35ºC

durante 3 dias

LECTURA:

Después de incubación, busque la dilución donde haya entre 30 y 300

colonias de 0.5 a 1 mm, opacas, blanquecinas y de borde bien definido.

Realice coloración de Gram para constatar que se trata de una bacilo

Gram positivo.

Haga la prueba de Catalasa, la cual debe ser negativa.

Informe como UFC de Lactobacilos. .

PRUEBA DE ESTERILIDAD DE ENLATADOS

Esta prueba se practica básicamente a los alimentos enlatados, tanto

cárnicos, vegetales y lácteos; su calidad bacteriológica se evalúa bajo las

normas de la prueba de "esterilidad comercial" o "viabilidad bacteriana"

incluyendo las fases de preincubación y la de identificación del

microorganismo causante del deterioro, logrando su aislamiento en

agares o por el crecimiento obtenido en medios líquidos.

OBJETIVOS

1. Familiarizar al estudiante con la técnica de esterilidad comercial

2. Observar la relación que existe entre la presencia de microorganismos

y cualquier cambio presentado en la lata.

MATERIALES

a. Muestras de latas a analizar

b. Incubadoras a 35~C y 55~C.


c. Alcohol

d. Abrelatas estéril

e. Tubos con caldo cerebro corazón

f. Pipetas

g. Láminas portaobjetos

h. Coloración de Gram

METODOTOLOGÍA

1. Tomar un número de muestras de acuerdo al tamaño del lote.

2. Limpiar y retirar la etiqueta, marcar las latas con fecha, número de

muestra, temperatura de preincubación.

3. Desinfectar las latas.

4. Posteriormente incubar entre dos hojas de papel de filtro la mitad de

las latas a 35ºC durante 10 días y el resto a 55°C durante 5-7 dias.

5. Revisar períodicamente las latas (cada dos días), retirar las

abombadas o que presenten fugas de su contenido.

6. Terminado el tiempo de incubación proceder a evaluar la

presencia de microorganismos. Para este efecto desinfecte

cuidadosamente la lata y Abrala asépticamente; transfiera 5 ml de

la muestra a cada uno de 3 tubos que contienen caldo cerebro

corazón e incubelos a 35°C y 55°C, según la temperatura que haya

empleado, durante 24-48 horas. Algunas veces, cuando hay

sospecha, se deben hacer cultivos de anaerobios. Practicar la

lectura observando los tubos que presentan crecimiento.

7. Del contenido que queda aun en la lata hacer un frotis para colorear

con Gram, observar cambios físicos, especialmente el.color, aspecto,

olor, textura, estructura y pH.

8. Debe haber concordancia entre el examen microscópico y el resultado

del cultivo.


a. Interpretacion

b. El abombamiento de las latas puede deberse a contaminación

bacteriana.

c. Una lata no abombada no excluye la presencia de microorganismos.

d. Debe haber por lo menos 2 tubos con crecimiento. Uno solo hace

pensar en contaminación durante el proceso de la siembra.

e. Considerar que el producto es comercialmente estéril, cuando máximo

un tubo muestra desarrollo. Sin embargo, si esto ocurre mejorar la

asepsia durante las manipulaciones.

RECUENTO BACTERIANO DE S. aureus POR LA TÉCNICA DEL

NÚMERO MÁS PROBABLE

INTRODUCCION:

EI Número Más Probable (NMP) es un método de realizar recuento

bacteriano basado en la probabilidad que existe en el laboratorio de aislar

bacterias en un sistema de medios de cultivo liquidos donde se siembran

los inóculos, empleando series de 3 y 5 tubos por cada dilución. Esta

técnica que es tal vez una de las más sensibles, se puede aplicar a

muchos microorganismos. en nuestro caso lo utilizaremos en la búsqueda

de Coliformes totales y fecales, E. coli, y Enterococcus como indicadores

bacterianos de contaminación fecal y para Staphylococcus aureus, índice

bacteriano. EI NMP para S. aureus es especialmente recomendado para

el análisis de leche en polvo. EI NMP comprende la prueba presuntiva

confirmativa y la completa.

Objetivos:

1. Familiarizar al estudiante con la técnica y los medios de cultivos

empleados para realizar el NMP de S. aureus.

2. Buscar índices bacterianos en cierto tipo de alimentos.


Materiales:

Tubos de 20 x 200 mm con 19 ml de caldo de enriquecimiento para

Staphylococcus segun Giolitti y Cantoni más 0.1 ml de telurito de

potasio al 10%.

Cajas de Petri con Agar Baird Parker .

Agar al 2% o parafina sólida estéril

Pipetas Pasteur

Asas de vidrio para extender en superficie .

Pipetas serológicas

Metodología:

Prueba presuntiva:

1. Preparar el alimento en diluciones de 10-1, 10-2 y 10-3 en solución

salina peptonada.

2. Pipetear un ml de cada dilución en tubos con caldo Giolitti y Cantoni,

por triplicado. Si el caldo ha sido preparado mucho tiempo atras debe

regenerarse (Calentar a 100°C por 20 minutos y enfriarlo).

3. Cubrir la superficie del medio con agar al 2% fundido y enfriado con el

fin de hacer anaerobiosis.

4. Incubar a 37°C por 24 - 48 horas.

5. Registrar como presuntivamente positivos los tubos que muestren

ennegrecimiento del medio.

PRUEBA DE LA COAGULASA

Realizada con plasma de conejo, donde la producción de coagulasa por

parte de Estafilococo induce la coagulación del plasma. Tradicionalmente

se ha interpretado como sinónimo de patogenicidad ..la capacidad para

producir coagulasa y decir, Estafilococo Coagulasa Positivo es hablar de

S. aureus, pero se sabe que la coagulasa puede ser producida por otros

Estafilococos distintos al aureus (S. intermedius y S. hyicus) y aún cepas


de S. aureus no reaccionan positivamente, ya sea porque no la producen

o lo hacen en poca cantidad y también por el tipo de plasma y

antiocoagulante con que fue tomado. No se recomienda el nitrato porque

es metabolizado por la bacteria.

COAGULASA EN PLACA

Detecta la coagulasa ligada. Haga en solución salina sobre un

portaobjetos una suspensi6n de la bacteria y observe si no realiza

autoaglutinación, pues algunas cepas rugosas lo hacen. Adicione una

gota de igual tamaño de plasma de conejo, mézclelas y' egítelas unos

segundos; la prueba positiva se manifiesta por la formación de grumos.

COAGULASA EN TUBOS

Detecta la coagulasa libre. Se realiza cuando la prueba en placa fue

negativa.o la cepa autoaglutinó y existe sospecha que se trata de S.

aureus.

En un tubo de ensayo de 12 x 75 mm deposite 0.5 ml de plasma de

conejo, adiciónele luego 0.5 ml de un caldo donde este creciendo la

bacteria y sométalo a incubación en baño María a 37ºC. Prepare un

control positivo; realice la lectura cada media hora y. hágalo hasta que el

control positivo produzca coagulación. (4 horas más o menos). La

intensidad de la reacción se puede clasificar como +, ++, +++

dependiendo de la consistencia del coagulo formado.

PRUEBA DE LA TERMONUCLEASA

a. Es confirmatoria y específica del S. aureus. Consiste en la detección

de una DNasa estable al calor.

b. Transfiera una colonia de Estafilococo a un caldo BHI e incube a 37ºC,

si es necesario 18 horas (puede hacerse en 6).

c. Caliente el tubo con el crecimiento en agua hirviendo durante 15

minutos y dejélo enfriar.


d. En el medio DNasa Test Agar haga perforaciones de 4 mm diámetro

suficientemente separadas.

e. LLene los pozos con el cultivo calentado y enfriado. Haga un control

positivo y otro negativo.

f. La lectura de la prueba se realiza al día siguiente y se consideran

Termonucleasa positivos aquellos pozos que estén rodeados de un

halo rosado que contrastan con el azul del medio de cultivo.

g. Este halo es debido que la bacteria tiene DNasa termoestable

(termonucleasa) e hidrolizó el DNA que posee el medio de cultivo.

RECUENTO DE PSICOTROFOS

Tomado de: CARMONA F., ASTUDILLO M, BARONA G Y DAZA L.H.

Manual de Bacteriología Especial. Universidad del valle, Facultad de

Salud, Departamento de Microbiología, Sección de Bacteriología.

Santiago de Cali. 1994.

Las bacterias psicrotrofas son aquellas que tienen la capacidad de crecer

a temperaturas de refrigeración y congelación. Bacterias del género

Bacillus, Pseudomonas, Enterocococcus, Listeria y algunas

enterobacterias psicrotrofas.

METODOLOGÍA:

El procedimiento de siembra y recuento es igual que para mesófilos, pero

la incubación se lleva a cabo a una temperatura de 5 – 7ºC durante 7 a 10

días.

El resultado se expresa en UFC/ml o gramo de bacterias psicrotrofas.


RECUENTO BACTERIANO DE Enterococcus POR LA TECNICA DEL

NUMERO MAS PROBABLE.

INTRODUCCIÓN:

Los enterococos son cocos Gram positivos incluidos en el grupo D de los

estreptococos; son componentes de la microbiota intestinal del hombre y

de los animales, son resistentes al NaCl y a ciertos productos químicos

empleados en la industria de alimentos, resisten también bajas tempera-

turas. Por su alto grado de resistencia se consideran buenos indicadores

de contaminación fecal en alimentos crudos y procesados, almacenados

en refrigeración y congelación.

OBJETIVOS:

1. Dar a conocer a los estudiantes las técnicas y los medios de cultivo

empleado para realizar el NMP de Enterococcus

2. Aplicar los indicadores bacteriológicos de contaminación fecal.

MATERIALES:

a. Los materiales y medios necesarios para hacer las diluciones.

b. 9 Tubos con caldo glucosa azida

c. 9 Tubos con caldo purpura de bromocresol

d. 12 Pipetas de 1 ml.

METODOLOGIA:

Prueba presuntiva:

1. Preparar la muestra de alimento con los 90 mls de solución salina

peptonada y a pariir de ella hacer diluciones hasta 10-3

2. Inocular 1 ml de la dilución 10-1, en cada uno de tres tubos que

contengan caldo glucosa azida.


3. Continuar sembrando 1 ml de cada dilución por triplicado hasta Ilegar

a la dilucidn 10-3.

4. Incubar a 37°C por 24 a 48 horas.

5. Registrar como positivos los tubos que presenten turbidez.

Prueba confirmativa:

1. De los tubos positivos de la presuntiva, transferir 1 ml a otro tubo que

contenga caldo púrpura de bromocresol azida.

2. Incubar a 37°C por 24 a 48 horas.

3. Considerar como positivos los tubos en los cuales se ha producido un

cambio de coloración del púrpura al amarillo. Anotar el número de

tubos confirmados en cada dilución.

4. Realizar la lectura con ayuda de la tabla adjunta.

RECUENTO DE ENTEROBACTERIAS

INTRODUCCIÓN:

Las enterobacterias son una familla que posee varios géneros que tienen

corno característica bioquímica general la capacidad de fermentar la

glucosa. Por ser un grupo más numeroso que los coliformes, tiene el

examen bacteriológico mas amplia cobertura y proporciona un dato más

preciso del grado de contaminación que posee un alimento, adquirida

generalmente por un proceso de manipulación inadecuado y posterior a la

preparación misma del producto.

OBJETIVOS:

1. Dar a conocer a los estudiantes las técnicas y los medios de cultivo

empleados para el recuento de enterobacterias.


2. Medir el grado de contaminación bacteriana de un alimento, tomando

como indicadores los géneros de la familia Enterobacteriaceae.

MATERIALES:

a. Los materiales y medios necesarios para hacer las diluciones.

b. Cajas de Petri estériles

c. Pipetas de 1 ml graduadas

d. Agar Cristal Violeta Rojo Neutro Bilis Glucosa

e. Agar Glucosa

f. Agar Nutritivo

g. Reactivo de Oxidasa

METODOlOGÍA:

1. Preparar la muestra de alimento y hacer las diluciones.

2. Transferir 1 ml de cada dilución a una caja estéril vacía y depositar en

cada una de ellas el Agar Cristal Violeta Rojo Neutro Bilis glucosa (15

ml) y practicar los movimientos necesarios para conseguir una perfecta

homogenización de la muestra. Dejar solidificar el agar.

3. Seguidamente, cubrir el agar solidificado con 10 ml mas del medio de

cultivo; después de endurecida la segunda capa invertir las cajas e

incubar a 37°C por 24 horas.

4. AI término de la incubación escoja (a dilución que contenga entre 20 y

200 colonias de color rojo, rodeadas de un halo de precipitado rojizo.

EI número de colonias contadas corresponde al dato presuntivo de

enterobacterias.

Prueba confirmativa:


1. Al azar escoger 1 colonia de las características anteriormente

anotadas y sembrar en la superficie de Agar Violeta Rojo Neutro Bilis

Glucosa. Incubar a 37°C durante 24 horas.

2. Simultáneamente con el paso anterior, sembrar en la superficie de

agar nutritivo inclinado, y por punción profunda en 2 tubos de agar

glucosa y cubrir uno de ellos con agar al 2% e incubar a 37°C durante

24 horas.

3. Después de la incubación realizar la prueba de Oxidasa utilizando el

crecimiento del agar nutritivo. Si ella es negativa y el tubo de agar

glucosa que estaba sellado con agar viró a amarillo; indica que hubo

fermentación y se confirma que se trata efectivamente de la familia

Enterobacteriaceae; la tabla adjunta sirve para identificar los géneros

de esta familia.

CONTROL DE HIGIENIZACIÓN DEL EQUIPO

Método de enjuague :

Utilizar un tanque de retención donde se pueda esterilizar casi por

completo durante 10' agua de grifo tratada con 2.5. p.p.m. (partes de cioro

por millón). Bombear dicha agua de enjuague a través de todo el equipo

con el objeto de descubrir fuentes muy pequeñas de contaminación.

Técnica:

1. Prepare envases para toma de muestra del agua de lavado; con

Tiosufato de sodio estéril al 10% .

2. Transfiera 10 ml de muestra al caldo nutritivo ó a medios diferenciales.

3. Transfiera 1 ml y 0.1 ml a cajas petri.

4. Multiplique el número de colonias de la placa con 1 ml; por el número

total de mililitros de agua de enjuague pasado por el equipo,


MÉTODO DE CONTACTO CON HISOPO

Se aplica cuando no se puede usar el método de enjuague debido al

tamaño e irregularidad del equipo.

Material:

Esterilizar hisopos de algodón.

Tubos con solución amortiguada de buffer fosfatos.

Preparación:

Agregue 1.25 ml de solución madre de fosfatos, agregue 5 m1 de

Tiosulfato de sodio al 10% disuelvase en proporciones de 100 gr por litro

de H20 destilada.

Filtrese mantengase en refrigerador.

Técnica:

Humedezca el hisopo en la solución amortiguadora, quitando el exceso de

agua.

Frótese una superficie de aproximadamente 52 cm2 (1.25 de ancho x 40

cm de largo) tres o mas veces.

Repita este procedimiento en 5 áreas diferentes usando para cada área

un hisopo.

Coloque el hisopo en el tubo con la solución amortiguadora cuidando de

quebrar asépticamente por encima del algodón el palillo del hisopo.

Siembre la solución de enjuague, cuente las colonias.

Realización de lectura

Notifique como número de unidades formadoras de colonia por ml de

muestra.

Normas de higienización


El método de enjuague de agua se considera satisfactorias cuando los

cálculos del .agua de enjuague indican menos de una colonia por mililitro.

El método de contacto con hisopo es satisfactorio cuando los recuentos

no exceden de 50U o que tengan un promedio de 12.5 colonias por 6.4

cm2 de superficie o 2 colonias por cm2.

CONTROL DEL MEDIO AMBIENTE

Envase de productos:

Objetivo:

Muchos de los microorganismos transportados por el aire alteran los

productos e inician durante el período de almacenamiento el proceso de

descomposición

Método de sedimentación

Se toma un grupo de cajas Petri con medios diferenciales.

Exponga las cajas 10 - 15' - 30' .

El resultado es de caracter cualitativo.

Toma de muestra

Las . muestran pueden ser tomadas:

a) Aberturas del equipo expuestas a contaminación por microorganismos

transportados por el aíre.

b) Los puntos seleccionados de la sala para el análisis general del aire.

c) Areas donde hay mayor número de empleados.

d) Sitios por donde el aire se incorporan a la planta

Realización de la lectura

Notifique el número de colonias total.


MICROORGANISMOS DEL AMBIENTE:

La presencia de microorganismos en cualquier ambiente es de especial

significado para los trabajos realizados en microbiología. El conocimiento

de este hecho debe tenerse en cuenta con el propósito de mantener libre

de microorganismos los materiales hasta su utilización.

MATERIALES Y MÉTODOS:

Microorganismos del ambiente

PROCEDIMIENTO:

a) Dirijase al sitio que vaya a analizar.

b) Destape 1 caja con agar Saboraud y 1 caja con agar nutritivo.

c) Dejela expuesta al aire durante 5 minutos.

d) Tape la caja y sellela con cinta de enmascarar

e) Dejela incubando a temperatura ambiente. Observe diariamente el

crecimiento de bacterias, si tiene agar nutritivo o de hongos, si

tiene agar Saboraud.

f) Guárdelas en la nevera, cuando ya observe crecimiento

microbiano.

g) Se harán observaciones macro y microscópicas de estos hongos.

h) Deje una caja de cada medio sin abrir (Como testigos de

esterilidad)

MICROORGANISMOS DE SUPERFICIES:

Son aquellos microorganismos que encontramos sobre las paredes, las

mesas de trabajo, los lavamanos, las manos, etc.


1. Cuadricula de cartulina que tenga en el centro un agujero en forma

cuadrado


2. de 10 cms x 10 cms

3. 4 Tubos de ensayo con 9ml de solución salina

4. 2 Pipetas estériles de 1ml

5. 2 Pipetas estériles de 5 ml

6. 2 asas de vidrio estéril

7. 5 Cajas de Petri con agar Saboraud

8. 5 Cajas de petri con agar nutritivo

9. Aplicadores de algodón estériles

PROCEDIMIENTO:

Se realizará de la siguiente forma:

a) Escoja la superficie que va a analizar (preferiblemente un lugar que

no se vea en buenas condiciones de higiene).

b) Coloque la cuadricula en el lugar indicado, sosténgala y con el

aplicador de algodón húmedo recorra de un lado a otro la

superficie que va a estudiar.

c) El aplicador con la muestra se introduce en un tubo de ensayo con

solución salina estéril, se parte el aplicador y se tapa el tubo.

(Dilución 1:10)

d) Se agita fuertemente el tubo

e) Se extrae 1 ml de esta solución con una pipeta estéril y se deposita

en una caja de agar nutritivo (Dilución 1:10), lo mismo se hace con

el agar Saboraud.

F) Se extrae 0.1 ml de esta solución y se deposita en una caja de agar

saboraud y otro 0.1 ml en una caja con agar nutritivo. Se debe

distribuir bien la muestra en el medio de cultivo, utilizando para ello

asas estériles. (Dilución 1:100)

g) Se extrae 0.1 ml de la dilución 1:10 y se agrega a un nuevo tubo

con 9.9 ml de solución salina (Dilución 1:1000).


h) De la dilución 1:1000 se siembra 1 ml en las cajas de saboraud y

agar nutritivo (Dilución 1:1000). Y 0.1 ml en cada medio (Dilución

1:10000)

i) De la dilución 1:1000 se extrae 1 ml y se agrega a un tubo con 9 ml

de solución salina para preparar la dilución 1:10000. De esta última

dilución se toma 0.1 ml y se siembra en cajas con agar saboraud y

agar nutritivo, (Dilución 1:100000. Las muestra se distribuye bien

con asas partiendo de la dilción mayor (1:100000 a la dilución

menor 1:10)

j) Las cinco cajas con las diferentes diluciones (1:10, 1:100, 1.1000,

1:10000 y 1.100000)

se dejan incubando a temperatura ambiente, se observan

diariamente para detallar el crecimiento bacteriano o de hongos y

se guardan en la nevera cuando ya éstos hayan crecido.

k) Los resultados serán analizados en la próxima práctica.

RESULTADOS:

Se informa como UFC/10 centímetros cuadrados de superficie.


CONTROL BACTERIOL0GICO DE MANOS DE OPERADORES,

sección empaque.

Entre los requisitos que deben cumplir los alimentos para que se

consideren de buena calidad (científica) e higiénica, se encuentra el estar

exentos de micro-organismos patógenos. Uno de los vehículos para la

contaminación de alimentos por el grupo coliformes y Staphylococcus

coagulasa (+) es debido, a las manos de los manipuladores de alimentos :

Se debe insistir en el correcto y frecuente lavado de manos con

soluciones o jabones bactericidas.

Otras pruebas que se le hacen a los operarios es el análisis de la

orofoaringe, y garganta en busca de Staphylococcus aureus, coprológico,

búsqueda de hongos patógenos en uñas etc.

Técnicas:

a) Utilice el método de hisopeado.

b) Sumerja el hisopo en caldo nutritivo e incube 24 horas a 36°C

c) Haga subcultivos en los medios específicos para coliformes y

Staphylococcus.

d) Realice un raspado de las uñas y móntelo con KOH al 20%, si desea

se puede hacer el cultivo en agar mycosel.


LABORATORIO DE GARGANTA Cultivos en agar sangre de muestras provenientes de las vías

respiratorias superiores.

Las vías respiratorias, con excepción de los alvéolos poseen organismos

que conforman la microbiota normal y además se pueden asentar otros

microorganismos que pueden originar el estado de portador sano o por el

contrario, causar un cuadro clínico de amigdalofaringitis, faringitis,

laringitis, epiglotitis, tosferina, difteria, neumonía y TBC pulmonar.

El objetivos de la práctica es suministrar al estudiante la información

necesaria para la buena obtención de una muestra clínica, su siembra y

los pasos a seguir para su identificación, además que ellos conozcan la

variedad de organismos presentes en la garganta, entre los cuales se

pueden encontrar Alfa y Beta hemolíticos y no hemolíticos.

Materiales que deben traer por grupo:

Cinta de enmascarar

Encendedor

Marcador de vidrio

Materiales que suministra la universidad:

Cajas con agar sangre (Una por estudiante)

Escobillón de algodón

Bajalenguas

Cámaras para microaerofilía

Mecheros Bunsen

Asas bacteriológicas

Metodología:


Con la ayuda de un bajalenguas y utilizando un escobillón estéril toque

con este último las amigdalas y faringe, evitando el contacto con la úvula y

la lengua. Una vez tomada la muestra extiéndala en una región del agar

sangre; seguidamente haga la siembra por agotamiento utilizando el asa

bacteriológico (Figura 4.1) e incube a 37 grados centígrados haciendo

atmósfera de CO2.

Posibles resultados:

El agar sangre es un medio enriquecido que sirve para diferenciar los

diferentes tipos de hemólisis Alfa, Beta y Gamma. Las bacterias Alfa

hemolíticas produce una hemolisis parcial de los glóbulos rojos que se

manifiesta por una coloración verdosa alrededor de la colonia llamada

también hemólisis viridans; las Beta hemolíticas producen hemólisis

completa y decoloración del agar sangre alrededor de las colonias. La no

hemolíticas se denominan Gamma.

RESULTADOS LABORATORIO (AGAR SANGRE – MUESTRA DE GARGANTA)

NOMBRE DEL ALUMNO :


ENSAYO DE DESINFECCIÓN (MÉTODO DEL INDICE FENÓLICO)

PRINCIPIO DEL MÉTODO:

Se entiende por índice de fenol, la relación entre la capacidad germicida

de un desinfectante y la del fenol actuando en condiciones idénticas.

Este procedimiento se aplica al ensayo de desinfectantes miscibles en

agua y que ejerzan su acción microbicida de modo semejante al fenol.

Se colocan especies bacterianas como Pseudomona aeruginosa,

Salmonella typhi, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis y especies

de hongos como Candida albicans, especies de Aspergillus y especies

de dermatofitos (Trichophyton o Microsporum o Epidemophyton) en

medios de cultivo adecuado. Se toman diferentes concentraciones de la

muestra que se va a ensayar para determinar las concentraciones

mínimas a las cuales el producto es capaz de reducir o inhibir los

microorganismos o elementos indeseables presentes en la superficie, en

el momento de la operación.


Organismos empleados:

1. Las cepas se obtienen en lugares o institutos especializados o fuentes

confiables.

2. Se pasan las cepas de bacterias obtenidas a agares específicos y se

incuban durante 48 horas a una temperatura de 37ºC, los mohos se

dejan durante 5 días a temperatura ambiente (25ºC)

3. Si las cepas están guardadas en la nevera se deben reactivar,

pasándolas primero por caldo y luego a un agar específico.

4. Las cepas deben tener de 24-48 horas/bacterias y 48 para levaduras

y120 horas para mohos)

Medios de cultivo:


1. Para Salmonella typhi: Caldo BHI, Caldo Selenito-cistina, Agar SS,

Agar TSI, Agar MacConkey.

2. Para Staphylococcus aureus: Caldo nutritivo, Agar Baird Parker o

Voges Jhonson.

3. Para Pseudomona aeruginosa: Caldo nutritivo, Caldo BHI, Agar

cetrimide.

4. Para Bacillus subtilis: Caldo nutritivo, Agar nutritivo.

5. Para hongos: Caldo Saboraud y Agar Saboraud.

Equipos de Laboratorio y reactivos:

1. Vidrieria usual de laboratorio, como pipetas, balones aforados y tubos

de ensayo, esterilizada en estufa a una temperatura de 180ºC por dos

horas.

2. Baño maría

3. Gradillas

4. Asas bacteriológicas

5. Solución de fenol al 5%

PROCEDIMIENTO:

1. Se prepara una serie de diluciones del desinfectante que se va a

ensayar

2. Se translada 5 ml de cada una de las diluciones a tubos de ensayo.

3. Se hace una solución madre de fenol al 5% y a partir de ella se

preparan diluciones:

1:90 y 1:100: Salmonella typhi y Bacillus subtilis

1:60 y 1:70 : Staphylococcus aureus

1:80 y 1:90 : Pseudomona aeruginosa

4. Se coloca en tubos de ensayo 5 ml de cada una de las diluciones de

fenol

5. Se preparan diferentes diluciones del organismo con el cual se está

experimentando, a partir del cultivo madre que tiene un tiempo de

crecimiento de 24 – 48 horas.


6. Se agregan 0.5 ml del cultivo madre en caldo, tanto en los tubos con

desinfectante, como en los tubos que tienen fenol.

7. Se repite la operación anterior con cada una de las diluciones del

organismo testigo.

8. Se colocan a continuación todos los tubos (desinfectantes más

organismos y fenol más organismos) en baño de agua a una

temperatura de 20ºC.

9. Se hacen subcultivos a partir de cada uno de los tubos en medio

apropiado, con intervalos de 5 minutos, 10 minutos y 15 minutos.

10. Se incuban los subcultivos durante 24 horas, a una temperatura de

37ºC para bacterias y de 48 a 120 horas a temperatura ambiente para

hongos.

CÁLCULOS Y RESULTADOS:

1. Se observa el crecimiento, se efectúan los cálculos y se expresan en

términos de índice de fenol.

2. La máxima dilución del desinfectante que mata al organismo testigo en

10 minutos, pero no en 5 minutos, se divide por la máxima dilución de

fenol que da el mismo resultado.

3. El cociente de esta división, es el índice de fenol del producto

ensayado. (ver tabla 1)

4. La resistencia al fenol de los cultivos testigos, debe ajustarse al

modelo de la tabla 2.

5. El desinfectante ensayado deberá poseer como mínimo la misma

acción del fenol, actuando bajo condiciones semejantes.


Tabla 1. Ejemplo de resultados obtenidos en el método de índicede fenol

para desinfectantes.

Organismo testigo: Salmonella typhi.

Desinfectante Diluciones Tiempo (minutos)

5 10 15

Desinfectante X 1:100

1:125

1:150

1:175

1:200

0

+

+

+

+

0

0

0

+

+

0

0

0

0

+

Fenol 1:90

1:100

+

+

0

+

0

+

0 = No crecimiento

+ = Crecimiento Indice de fenol = 150/90 = 1.6

Tabla 2. Resistencia al fenol de los cultivos testigos.

Organismo Diluciones

de fenol

5 minutos 10 minutos 15 minutos

Salmonella typhi 1:80

1.100

+ ó 0

+

+ ó 0

+

0

+

Staphylococcus

aureus

1:60

1:70

+

+

0

+

0

+


TEST DE CONCENTRACIÓN INHIBITORIA MINIMA (CMI)

PRINCIPIO:

Los tubos que contienen concentraciones decrecientes del agente a

investigar son inoculados con un organismo testigo. Después de un

período de incubación, los tubos son examinados para detectar la

presencia o ausencia de crecimiento. La actividad del agente analizado es

la mínima concentración que inhibe el crecimiento del organismo y es

expresado como la concentración inhibitoria mínima.

MEDIOS, DILUYENTES Y CULTIVOS:

1. Caldo tripticasa soya o BHI y caldo Saboraud

2. Agar específico para cada bacteria u hongo testigo.

3. Solución buffer fosfato

MATERIALES DE LABORATORIO:

1. Tubos de 13x100 mm

2. Tubos de 20x150 mm

3. Gradillas

4. Agitador vortex

5. Pipetas estériles

6. Pipetas automáticas

7. Incubadora

8. Baño de agua


PROCEDIMIENTO:

Preparación de los disolventes.

1. Prepare el buffer fosfato, adicionando 1.25 ml de la solución stock a 1

litro de agua destilada. Dispense 9 ml en tubos de 20x150mm,

esterilice y enfrié.

2. Prepare el caldo BHI y el caldo Saboraud

3. Dispense 2.4 ml en tubos de 13x100mm (12

tubos/muestra/organismo). Dispense adicional 1.6 ml en el primer

tubo de cada grupo de 12. Esterilice y enfrié.

Preparación de los inóculos:

1. El total de los organismos deben tener: 24-48 horas las bacterias y

levaduras y los mohos 5 días.

2. Se realiza la dilución de la bacteria y levadura (10-3) en solución buffer-

fosfato.

3. Los mohos deben cultivarse en agar inclinado (agar Saboraud)

4. 9 ml de buffer fosfato se adicionan al tubo. Este se considera la

dilución 10-1, la dilución 10-3 es considera como inóculo.

Preparación de las muestras:

1. El producto se puede preparar directamente o utilizar una dilución.

2. Las muestras tales como jabones, o material viscoso tales domo

dentríficos, pueden ser primero diluidas.

3. Los jabones son normalmente diluidos como sigue: Raspe 5 gramos

de jabón con rallador; comine eun gramo de jabón rallado y 9 ml de

agua destilada estéril en un tubo de 20x150 mm estéril; coloque en

una baño maría 44 - 47ºC, agite períodicamente hasta que se disuelva

completamente. Mantenga la muestra a esta temperatura para que no

se vaya a solidifcar.


4. Los dentríficos son diluidos, mezclando una parte del dentífrico con

dos partes de agua destilada (1:3), se agita períodicamente hasta que

se disuelva completamente.

SERIE DE DILUCIONES: Usando técnicas asépticas.

1. Pipetee 0.4 ml de la solución test en el primer tubo de los doce

(volumen total 4 ml dilución 1:10.

2. Agitelo y transfiera 2 ml ml en el segundo tubo.

3. Repita lo anterior con el tubo tercero y así sucesivamente hasta el tubo

No. 12.

4. Descarte 2 ml del último tubo.

5. Inocule a cada tubo 0.1 ml de la dilución 10-3 del microorganismo.

6. Inocule un tubo con medio sin el producto (Control positivo)

7. Deje un tubo con medio únicamente sin inóculo (control negativo)

8. Incube las bacterias, levaduras y hongos de acuerdo a las

temperaturas y días de crecimiento de cada uno de ellos.

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS:

1. El crecimiento se determina por la turbidez de los tubos. La

concentración inhibitoria mínima se determina por el último tubo que

no muestra crecimiento.

2. Se deben hacer subcultivos de los tubos que no muestran crecimiento

para determinar la actividad bacteriostatica o bactericida del producto

e igualmente la actividad fungistatica y fungicida de los hongos.

3. Estos subcultivos se hacen en los agares específicos para cada

microorganismo.

4. De los tubos que muestran crecimiento se debe hacer un subcultivo en

agar para comprobar que realmente es el organismo testigo.

5. El MIC es el último tubo que no muestra crecimiento en los

subcultivos.


Tabla 1. CMI en ppm (mg/Litro)

% 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

0.1 100 50 25 12.5 6.25 3.12 1.56 0.78 0.39 0.19 0.1 0.05

1.0 1000 500 250 125 62.5 31.2 15.6 7.8 3.9 1.9 1.0 0.5

2.0 2000 1000 500 250 125 62.5 31.2 15.6 7.8 3.9 1.9 1.0

3.0 3000 1500 750 375 187 93.7 46.8 23.4 11.7 5.85 2.92 1.46

4.0 4000 2000 1000 500 250 125 62.5 31.2 15.6 7.8 3.9 1.9

5.0 5000 2500 1250 625 312 156 78 39 19.5 9.75 4.88 2.43

6.0 6000 3000 1500 750 375 187 93.7 46.8 23.4 11.7 5.85 2.92

7.0 7000 3500 1750 875 437 218 109 54.6 27.3 13.6 6.83 3.41

8.0 8000 4000 2000 1000 500 250 125 62.5 31.2 15.6 7.8 3.9

9.0 9000 4500 2250

10 10000 5000 2500 1250 625 312 156 78 39 19.5 9.75 4.88

20 20000 10000 5000 2500 1250 625 312 156 78 39 19.5 9.75

30 30000 15000 7500 3750 1875 937 468 234 117 58.5 29.2 14.6

40 40000 20000 10000

50 50000 25000 12500 6250 3120 1560 780 390 195. 97.5 48.8 24.3

60 60000 30000 15000

70 70000 35000 17500

80 80000 40000 20000

90 90000 45000 22500

100 100000 50000 25000 12500 6250 3120 1560 780 390 195 97.5 48.8

1908612894.guia de laboratorio de microbiología segunda parte (1)

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