guía de laboratorio de microbiología 2015

MICROBIOLOGIA AMBIENTAL

NORMAS DE TRABAJO EN EL LABORATORIO

Es importante que el estudiante desarrolle una actitud positiva y respetuosa hacia los

microorganismos y su trabajo con ellos. El mal manejo de una tcnica puede causar la

contaminacin en su prueba e infecciones en usted; en particular cuando se trabaja con

patgenos en potencia. En el laboratorio de microbiologa es necesario observar ciertas

normas que harn de su trabajo prctico, una labor efectiva y sin riesgo.

1. En cada clase prctica es obligatorio el uso de mandil blanco y limpio, cabello

recogido (seoritas).

2. Antes de la realizacin de una prctica debe leer cuidadosamente el o los ejercicios

a desarrollar.

3. Debe mantener la mesa de trabajo libre de materiales no necesarios.

4. Es prohibido fumar, comer o aplicar cosmticos mientras permanece en el

laboratorio de microbiologa.

5. Al inicio y trmino de cada trabajo prctico deber desinfectar cuidadosamente su

rea de trabajo.

6. Cuando manipule cultivos de microorganismos, trabaje siempre bajo la proteccin

de un mechero y sin corrientes de aire.

7. Esterilicemos instrumentos de metal (asas de siembra, pinzas, etc.)siempre antes y

despus de utilizarlos con microorganismos.

8. En caso de accidentes, tales como cortes en las manos, quemaduras, salpicaduras de

cultivos vivos o absorcin de material contaminado reprtelo inmediatamente al jefe

de prcticas de laboratorio.

9. Todo material utilizado en la prctica con posible contaminacin deber ser

colocado en recipientes especiales .Los papeles de desecho sern descartados en el

tacho disponible.

10. Al trmino de cada sesin de prcticas y antes de salir del laboratorio lvese las

manos con jabn y desinfctelas con alcohol.

Equipos y materiales para el Laboratorio de Microbiologa.

1. Gua de Laboratorio.

2. Guardapolvo blanco

3. Dos juegos de lminas porta y cubre objetos (en estuche)

4. Un asa de siembra (o asa de Kolle)

5. Una pinza simple.

6. Lpiz marcador de vidrio

7. Encendedor o fsforos.

8. Papel toalla

9. Algodn

10. Alcohol.

Observacin de Bacterias.

Las formas bacteriana s pueden ser examinadas al microscopio de dos maneras:

observando muestras frescas de clulas vivas, y observando clula muertas teidas con

ciertos colorantes .Las bacterias vivas carecen de color en preparaciones acuosas ,mientras

que en preparaciones teidas , aumentan su contraste con el medio circundante y se hacen

ms visibles. El distinguir claramente la estructura bacteriana permite la mejor

diferenciacin celular interna y la determinacin de tipos morfolgicos existentes. En

microbiologa resultan de uso frecuente para la observacin de microorganismos las

tinciones simples, diferenciales y las tinciones de estructuras.

Tincin de bacterias.

Para entender como tien un colorante la clula bacteriana, debe entenderse en

esencia que es un colorante .La mayora de ellos constituyen sales en las cuales uno de los

iones presenta un color. Una sal es un compuesto formado por un in cargado

positivamente y uno cargado negativamente .Un colorante simple como el azul de metileno,

qumicamente constituye la sal cloruro de azul de metileno que se disocia como sigue:

Cloruro de azul de metileno = Azul de metileno + Cloruro-

El color del azul de metileno reside en el in cargado positivamente.

Las clulas bacterianas tienen por lo general una superficie cargada negativamente

cuando el pH del medio circundante es cercano a la neutralidad, como generalmente ocurre.

La clula cargada negativamente se combina con el in positivo del azul de metileno,

cristal violeta, verde malaquita, safranina, etc.). Si el olor reside en el in negativo, se le

denomina colorante cido (eosina, etc.).

PRCTICA N 1

AMBIENTE Y MATERIALES DE LABORATORIO

Objetivo:

Conocer los diferentes ambientes de laboratorio de microbiologa e identificarlos.

Reconocer los distintos materiales de laboratorios de microbiologa y comprender

sus utilidades, as como de los equipos.

Fundamento.

El ambiente de laboratorio

El laboratorio de microbiologa debe ser un ambiente aislado y protegido de contaminacin

ya sea fsica qumica o biolgica.

En el laboratorio se debern de ubicar las siguientes salas o ambientes:

1. Aula, auditorio, o sala de reuniones:

Ser usado para desarrollar todo lo relacionado a discusiones, exposiciones, y dialogo

respecto al trabajo en el laboratorio, as como de actividades acadmicas.

2. Sala de ejecucin de pruebas y anlisis microbiolgicos :

Principalmente debe poseer las mesas de trabajo. Debe estar protegido de

contaminacin y slo podr ingresar a l personal autorizado y de acuerdo a reglas y

normas establecidas (las descritas anteriormente)

3. Cubculo de anlisis :

Se encuentra cerrado y equipado de luz UV la cual estar encendida mientras no se

encuentre el personal laborando en l y apagada cuando ingrese el personal (altamente

restringido). En este mbito, que debe mantenerse estril se ubicarn los materiales y se

desarrollarn los anlisis por experiencia.

4. Sala de lavados y de preparacin de medios de cultivo y reactivos.

Aqu se preparan los materiales necesarios para realizar las pruebas. Dentro de esta sala

puede ubicarse el almacn.

El almacn debe estar dividido en dos ambientes uno para guardar los medios de

cultivo y reactivo y otro para almacenar los materiales de anlisis.

5. La oficinas:

Generalmente ubicada a la entrada de laboratorio.

El suelo en general debe ser de un material de fcil limpieza y que evite los accidentes,

como por ejemplo: losetas. A la entrada de la sala de ejecucin de pruebas se

recomienda tener un depsito con lquido desinfectante para el calzado o botas de

goma si se tienen.

Materiales de laboratorio

Materiales de vidrio.

Deben poseer las siguientes caractersticas:

Poseer bajo coeficiente de dilatacin, de modo que resistan los cambios bruscos de

temperatura.

Deben ser de vidrio neutro, o con mnima cantidad de lcali libre de modo que no

intervengan en las reacciones.

Resistentes a la accin mecnica.

Transparentes y sin ralladuras de modo que permitan visualizar los eventos que

ocurren en su interior.

Entre los principales materiales se encuentran los siguientes:

Tubos de ensayo o de prueba:

Son de forma cilndrica abierto por uno de sus extremos y resistentes al calor,

presin y fuego directo.

Existen de diversos tamaos: los mas grandes sirven para depositar mayor volumen

de muestra o medio de cultivo, los alargados para poseer un mayor espacio o

superficie de observacin (ver efectos de un medio cultivo), los de tamao regular,

para una mayor comodidad y los mas pequeos para realizar pruebas bioqumicas

de determinadas microorganismos, como sembrado. En general sirven para

conservar medios de cultivo y hacer diluciones.

Probetas:

Son de vidrio de base plana y cuerpo cilndrico graduado, se le emplea para medir

volmenes de lquidos y slidos amorfos.

Pipetas:

Es un material de vidrio pirex de dimetro reducido y se llena por succin.

Existen de 3 tipos :aforadas o volumtricas , con mbolo o en rase y graduadas

,estas ultimas mas usadas .Sirven para medir volmenes de lquidos que requieren

gran presin agregados a medios de cultivo y hacer diluciones . Deben estar

tapadas con algodn

Matraz:

Recipiente de vidrio cnico resistente con dimetro mayor en las base que en la

parte superior. El mas usado es de tipo erlenmeyer, que sirven para preparar

cultivos y medios de cultivo (se tapa con algodn).

Placas Petri:

Recipientes de vidrio pirex compuestos por una base y una de dimetro variable.

Se utilizan para preparar medios de cultivo y sembrar microorganismos, en ese caso

la base debe estar con la tapa.

Esptula de Drigalski:

Material de vidrio o de metal que sirve para homogenizar las siembras por

extensin realizadas en placas petri.

Asa de kolle:

Material de metal con asa de vidrio o material aislante que sirve para transportar con

la argolla un liquido a otra superficie o para extraer muestras (sembrar) y colocarlos

en otro medio y para hacer repiques.

Tubos Durham:

Son de tubos de vidrio muy pequeos (2-3 cm. de largo por 5-6 mm de ancho) que

se introducen boca abajo en un medio de cultivo que contiene microorganismos

para comprobar la formacin de gas por parte del microbio. Al incesar el tubo este

no debe contener gas cuando este en el interior.

Lminas Porta y cubre objeto y porta objetos escavados:

Son placa de vidrio de formas rectangulares, las primeras ms grandes que las

segundas y ms gruesas, que sirven para preparar muestras para ser observadas e el

microscopio. Existen lmina porta objetos escavadas, que poseen una escavadas,

que poseen una excavacin en las que se depositan muestras destinadas a ser

visualizadas a gota pendiente (para ello se usa la lente de inmersin, de mayor

alcance)

Beacker o vaso de precipitacin:

Son vasos de vidrio graduados que permiten medir volmenes de lquidos con cierta

aproximacin. Siendo la ms exacta la probeta.

Fiola aforada:

Recipiente de vidrio de cuelo largo con un aforo que marca un volumen exacto y de

base dilatada. Se emplea en anlisis qumico cuantitativo para obtener soluciones de

determinadas concentraciones.

Matraz de Kitasato o de filtracin al vaco.

Es igual al matraz Erlenmeyer pero difiere en que la parte del cuello posee un

orificio lateral de salida a la cual se coloca una bomba succionadora, sirve para

realizar filtraciones al vaco.

Embudo de Buchner:

Construido generalmente de porcelana, poseen un vstago corto y agujeros en la

parte cntrica sobre el cual se coloca un papel filtro. Se le utiliza para realizar

filtraciones al vaco.

Frasco Gotero y Cuenta gotas

El primero de vidrio con una tapa que posee un pico que permite dejar caer el

lquido que contiene el frasco de gota a gota. El segundo es un tubo de vidrio corto

y delgado que en un extremo se adapta una perilla con bombilla de goma y en el

otro s encuentra estrangulado, se le utiliza para agregar pequeas cantidades (gotas

de un lquido o reactivo).

Esptula:

Instrumento de forma plana, largado de metal, y borde afilado. Sirve para coger,

trasladar o transportar muestras slidas o reactivos qumicos puros, as como medios

de cultivo para pesarlos o colocarlos en otro medio.

De Material Diverso

Trpode:

Instrumento de metal compuesto por un anillo de metal circular apoyado sobre tres

patas equidistantes. Sirve como instrumento de soporte sobre el cual se coloca la

malla metlica y debajo del mechero Bunsen en operaciones de calentamiento.

Mechero de Bunsen:

Instrumento de metal conectado a una fuente de gas y que consta de dos llaves, una

que controla el paso del aire y otra el paso de gas con el fin de conseguir una llama

no luminosa, la cual, se utiliza para esterilizar otros materiales.

Malla metlica con amianto:

Es una malla compuesto por varios alambres entrelazados que posee en la parte

central una sustancia llamada asbesto. Se lo utiliza en operaciones de calentamiento,

permite difundir la llama a lo largo del asbesto con lo que se logra un calentamiento

moderado y se evita el contacto directo del fuego y la sustancia a calentar.

Equipos

Autoclave:

Cmara metlica de cerrado hermtico que sirve para esterilizar materiales y

eliminar muestras a vapor de presin .Posee un manmetro para controlar la presin

del vapor. En el interior se ubica una olla sostenida por un soporte, debajo de ella se

coloca el agua que al hervir desprende el vapor (El agua debe ser agua destilada o

desionizada).

Estufa u Horno Pasteur:

Sirve para incubar microorganismos que requieren una temperatura de 20- 200C o

30-300C, as como para esterilizar materiales

Incubador:

Cmara similar aun horno que sirve para incubar microorganismos en medios de

cultivo que requieren temperaturas que varan entre los 0-50 C.

Jarra de anaerobiosis:

Es una cmara que se utiliza para incubar microorganismos que necesitan

condiciones anaerobias, esta jarra no permite la entrada de oxigeno.

Bao mara:

Equipo que mantiene la temperatura constante en un rango de 0-150 C. Permite dar

un calor indirecto para disolver medios de cultivos slidos o mantener los lquidos.

Microscopio:

Instrumento que permite amplificar los microorganismos de modo que puedan

visualizarse, funcionan en base a la luz natural o artificial.

Contador de colonias:

Equipo pequeo que facilita el conteo de microorganismos cultivados en placas

petra.

Balanza analtica o metlica:

Equipo muy sensible que permite calcular las ms pequeas cantidades de

colorantes, medios, entre otros materiales.

Agitador magntico.

Sirve para conseguir una mejor homogenizacin de una sustancia en u recipiente

cerrado o abierto. En el caso de un agitador magntico consta de un equipo y una

capsulita magntica, la capsulina se introduce en la solucin y gira al prenderse el

equipo homogenizando as la solucin.

Centrfuga:

Equipo que al girar un aparato interno permite aislar clulas microbianas del medio

en el que se encuentra al quedar adheridas a la pared.

Figura 1. Equipo de laboratorio.

PRCTICA N2

PREPARACIN DE MATERIALES Y MEDIOS DE CULTIVO PARA

ESTERILIZAR

Objetivo:

Aprender a preparar los materiales de vidrio para la esterilizacin como su

posterior utilizacin.

Comprender la importancia de la esterilizacin as como la proteccin de los

materiales contra la contaminacin microbiana.

Introduccin.

Existen Varios tipos de medios de acuerdo a las necesidades nutricionales

particulares. Al preparar un medio de cultivo para el crecimiento de microorganismos debe

tenerse en consideracin el proveer de las fuentes de energa, carbono, nitrgeno, fsforo,

azufre y de los factores de crecimiento que sean necesarios. En la formulacin de los

medios de cultivo podemos distinguir entre medios definidos y complejos.

El medio definido Provee de los nutrientes requeridos para el crecimiento en la

forma de compuestos qumicos de concentracin conocida .Por ejemplo un medio definido

para un hetertrofo como Escherichia coli puede ser compuesto de NH4Cl, MgSO4,

KH2PO4, Na2HPO4 y glucosa. Otros elementos como fierro, manganeso y cobre estn

generalmente presentes como contaminantes de los compuestos qumicos en cantidades

adecuadas para el crecimiento.

El medio complejo Contiene todos los nutrientes necesarios para el crecimiento de

microorganismos pero ellos estn contenidos en ingredientes crudos, es decir, que no todos

los componentes del medio ni sus concentraciones exactas son conocidas .Ingredientes de

este tipo son los extractos de la levadura, de carne, los hidrolizados de protenas (peptona,

tristona), que constituyen fuentes de polipptidos aminocidos, vitaminas, algunos

carbohidratos, etc.

De acuerdo al tipo de microorganismo que se quiera cultivar de los medios pueden

clasificarse como:

Comunes: -Permiten el crecimiento indiscriminado de todo tipo de

microorganismos. Ejemplo: Agar nutritivo, Caldo nutritivo, Agar gelatina, etc.

Especiales: -Son formulados teniendo en cuenta exigencias nutricionales diversas o

caractersticas bioqumicas determinadas. Pueden considerarse medios enriquecidos

o mejorados, selectivos y diferenciales.

Medios mejorados o enriquecidos: -Son aquellos a los que se les agrega

determinadas sustancias nutritivas (sangre, yema de huevo, suero, etc.) y con ello

estimulan las exigencias nutritivas de ciertos microorganismos. Ej. Agar sangre,

Caldo selenito, etc.

Medios selectivos: -Se caracterizan porque se incluyen sustancias que favorecen el

crecimiento de determinadas especies y sustancias que inhiben el crecimiento de

otras no deseadas. Ej .Agar salmonella Shigella, Agar Bismuto sulfito, etc.

Medios de diferenciacin: -Ponen de manifiesto algunas propiedades bioqumicas

del microorganismo, como formacin de gas, cambios en le pH, etc. Los cambios de

pH se evalan incorporando indicadores en el medio y se determinan de acuerdo al

rango en estudio. Ej. .Medios azucarados como: Caldo glucosado, Caldo

Lactosado, Kligler, etc.

Frecuentemente los medios selectivos y diferenciales se deben usar juntos para

aislar e identificar especies a la vez. Algunos medios tienen incorporados los ingredientes

convenientes para este doble propsito y resultan de gran utilidad y economa .Ej. .Agar

Manitol salado, Agar Mac Conkey, etc.

Dependiendo de la tcnica de cultivo elegido, los medios mencionados

anteriormente pueden ser preparados como lquidos o slidos .Los medios mencionados

anteriormente pueden ser preparados como lquidos o slidos. Los medios lquidos

contienen los nutrientes y otros elementos en una solucin acuosa que generalmente recibe

el nombre de caldo; los medios slidos contienen adems un agente solidificante llamado

agar que se utiliza para dar parte del nombre del medio e identificarlo como slido. El agar

es un polisacrido complejo derivado de un alga marina y posee caractersticas muy tiles

para microbiologa. Muy pocos microorganismos degradan el agar de tal manera que an

despus de un periodo de crecimiento, el medio con agar se mantiene slido .El agar se

funde a 90C o al punto de ebullicin del agua y permanece en estado lquido hasta que la

temperatura desciende hasta aproximadamente 40C.

Una vez preparado el medio de cultivo lquido o slido debe ajustarse al pH

adecuado, disponerse en un recipiente de vidrio resistente al calor, (Tubo o matraz) y

protegerlo con un tapn de algodn o material plstico que permita el intercambio de gases

y que impida el ingreso de otros microorganismos. El medio de cultivo as dispuesto debe

ser esterilizado en autoclave a 121 C bajo 15 lb. de presin de vapor por 15 minutos. En

caso de contener ingredientes termolbiles, pueden emplearse otros mtodos de

esterilizacin como la filtracin.

EJERCICIO 1

Objetivo.

Preparar y esterilizar medios de cultivo de diferentes caractersticas para el cultivo

de microorganismos.

Materiales.

- Medos de cultivo o ingredientes deshidratados

- Agua destilada o desionizada

- Algodn, gasa

- Balanza

- Erlenmeyers de 250 y 500 ml

- Esptulas

- Lpiz marcador de vidrio

- Papel indicador de pH

- Papel aluminio y papel corriente no absorbente

- Pipetas graduadas

- Probetas de 100 ml

- Tubos de ensayo

Procedimiento

a. Caldo nutritivo (extracto de carne, 0.3 % y peptona, 0.5 %)

1. Utilizando un trozo de papel aluminio pese cuidadosamente la cantidad de

medio deshidratado suficiente para prepara 100ml de caldo nutritivo.

2. Coloque el polvo en un Erlenmeyer de 250 ml limpio y seco, y agregue

cuidadosamente el agua destilada medida en la probeta.

3. Mezcle la preparacin con movimientos giratorios hasta la completa disolucin.

4. Elabore tapones de algodn para 15 tubos.

5. Distribuya el medio lquido con una pipeta graduada a razn de 5 ml en cada

tubo.

6. Coloque los tubos los tapones de algodn evitando que queden flojos o muy

compactos.

7. Disponga los tubos en un contenedor resistente al calor, envulvalos con papel,

identifquelos con el nombre del medio, la fecha de preparacin y el nombre de

la persona responsable en la elaboracin.

8. Esterilice los tubos con medio en un autoclave a 121 C (15 lb. de presin)

durante 15 minutos.

b. Agar nutritivo (Extracto de carne de 0.3; peptona, 0.5 %; agar, 1.5%)

1. Prepare 200 ml de caldo nutritivo. (repita los pasos 1,2 y 3 del procedimiento

anterior con la correccin en el peso para la nueva cantidad solicitada y en le

erlenmeyer a usar, debe tener unas tres veces el volumen que tendr el medio).

2. Agregue 3 g de agar (1.5 %), y lleve a licuar en bao de agua a ebullicin hasta

que el medio luzca transparente a la luz.

3. Elabore tapones de algodn para unos 16 tubos.

4. Una vez licuado el medio, djelo enfriar ligeramente y distribyalos en los

tubos con una pipeta graduada .Prepare 6 tubos con 12 ml y 10 tubos con 7 ml.

5. Repita los pasos 6, 7, 8 del procedimiento anterior.

6. El medio restante debe ser acondicionado para su esterilizacin junto a lo

anterior.

c. Agar mac conkey (peptona, 1.7 %; proteosa peptona, 0.3 %; lactosa,1%, sales

biliares,0.15%; NaCl, 0.5%; agar, 1.5%, rojo neutro, 0.003%, cristal violeta, 0.0001

%)

d. Agar manitol salado (Extracto de carne 0.1 %; proteosa peptona, 1.0 %; NaCl,

7.5%; manitol, 1.0%; agar, 1.5%, rojo fenol, 0.0025%)

1. Pese la cantidad d medio deshidratado necesario para preparar 100 ml de cada

uno. Observando la formulacin de cada medio comprobar que los pesos a

realizar son distintos.

2. Coloque el polvo de cada medio en Erlenmeyers de 25. ml y llvelos a licuar

en bao de agua caliente hasta la completa disolucin del agar.

3. Elabore tapones de algodn para cada erlenmeyer.Luego de colocarlos cubra

los recipientes con papel e identifique el material con el nombre del medio,

fecha de elaboracin y el nombre de la persona responsable de su preparacin.

4. Esterilice en autoclave a 121 C por 15 min.

e. Agar almidn (Peptona, 1%; K2HPO4 ,0.5 %; almidn, 0.3%;agar, 1.5%).

1. Pese cuidadosamente el almidn necesario para preparar 100 ml de medio.

2. Coloque el polvo en un Erlenmeyer de 250 ml con un volumen pequeo de agua

destilada que ha medido en la probeta.

3. Caliente el recipiente con el almidn agitando constantemente hasta su

disolucin.

4. Pese el resto de los ingredientes y agrguelos con la cantidad de agua destilada

restante.

5. Licue el medio al bao de agua cliente hasta la completa disolucin del agar.

Deje enfriar ligeramente y ajuste el pH.

6. Coloque en el Erlenmeyer un tapn de algodn a la medida, cubra con papel,

etiquete el material y esterilice a 121 C por 15 min.

f. Agar gelatina (Peptona ,0.1%; extracto de levadura ,0.3%; gelatina, 0.4%; agar,

1.5%).

1. Pese cuidadosamente la cantidad necesaria de cada ingrediente para preparar

100 ml de medio.

2. Coloque los ingredientes en un esrlenmeyer de 250 ml y agregue agua destilada

medida en probeta.

3. Lleve el recipiente a licuar en bao de agua en ebullicin hasta la completa

disolucin del agar. Deje enfriar ligeramente y ajuste el pH a 7.0.

4. Acondicione su medio para esterilizacin como en los procedimientos

anteriores. Esterilice en autoclave a 121 C por 15 minutos.

Cuestionario.

1. Cuales son las ventajas de los medios complejos para el cultivo de

microorganismos?

2. Por qu no es necesario ajustar el pp. en el caldo nutritivo y s lo es en el agar

almidn?

3. Determine la naturaleza qumica y la funcin nutritiva de cada uno de los

ingredientes que contienen los medios que ha utilizado.

4. Describa la autoclave y su forma de uso.

5. Qu otros mtodos de esterilizacin se emplean para los medios de cultivo?

Qu ventajas otorgan?

PRACTICA N 3

TCNICAS DE CULTIVO DE MICROORGANISMOS

Objetivo

Conocer las diferentes tcnicas de aislamiento en medios de cultivos slidos para la

obtencin de cultivos puros de bacterias.

Identificar las diferentes formas de medios de cultivos de uso general, diferenciales

y selectivos para los cultivos de diferentes especies bacterianas.

Fundamento

Para iniciar un cultivo de microorganismos es necesario que un nmero de clulas

(inculo) sea transferido (inoculado) a un medio fresco estril .Si se quiere cultivar una

especie en particular a partir de una mezcla de microorganismos, deben emplearse

tcnicas de aislamiento que permitan obtenerla en forma pura. Esto involucra un

proceso seriado de varias transferencias y la utilizacin de medios tanto comunes como

especiales, mayormente slidos, seleccionados de acuerdo a la naturaleza del

microorganismo. La tcnica d cultivo por aislamiento pueden ser realizada por:

a) Por estras, que consiste en diseminar los microorganismos en la

superficie se un medio slido dispuesto en placa Petri; si el inculo

inicial se encuentra slido o en polvo, es recomendable llevarlo a

suspensin.

b) Por diluciones sucesivas, que consiste en hacer diluciones seriada de

la muestra o del inculo inicial y disponer alcuotas de ellas en placas

petri con medio. Las colonias de varios microorganismos difieren en

forma, tamao, color, consistencia, por lo tanto su apariencia en

cultivo es importante para propsitos de identificacin. Por otro lado,

si se tiene ya aislado un microorganismo, que a asume puro, desde

un medio agotado en nutrientes hacia un medio fresco. Las tcnicas

de transplante se realizan por lo general en tubos de ensayo con

medios lquidos o slidos, siendo la prctica ms comn de

conservacin de cepas (de forma aerbicas y anaerbicas

facultativas), el realizar estras en tubos de agar inclinado.

En todo procedimiento de inoculacin la aguja o asa de Klle debe ser calentada al

rojo por flameo antes y despus de la transferencia. El flameo destruye la formas vivas

en la superficie del filamento previniendo la contaminacin .Durante la transferencia se

debe sostener el tubo de trabajo en la mano izquierda en posicin casi horizontal y

retirar el tapn sostenindolo con los dedos anular y meique de la mano derecha

(asumir la posicin inversa en individuos no diestros). La boca del tubo de trabajo

(tanto del que se va tomar el microorganismo como del que se va a recibirlo) debe ser

flameada antes y despus de la transferencia. Aparte de destruir los microorganismos en

los bordes del tubo, el flameo crea corrientes convectivas que disminuyen las

probabilidades de contaminacin.

Las tcnicas de cultivo de aislamiento y transplante nos permitirn obtener los

microorganismos en forma pura y en estado activo as como el estudio de sus

caractersticas de crecimiento, el primer registro de datos en la identificacin de todo

microorganismo.

Figura 1. a) siembra masiva; b) estra simple; c) estra con fin capilar.

EJERCICIO 1. Tcnicas de Cultivo de Microorganismos: Caractersticas de

crecimiento en medio de cultivo.

Objetivo

Observar las caractersticas de crecimiento de los microorganismos al transplante en

medios de cultivo lquido y slido.

Materiales

- Cultivo de Microorganismos de 18

horas.

- Asa de kolle.

- Mechero.

- Tubos con agar nutritivo

inclinado.

- Tubos con agar nutritivo vertical.

- Tubos con caldo nutritivo.

Procedimiento

1. Esterilice el asa de kolle por flameo a la llama.

2. Tome el tubo con el cultivo de 18 horas, retire el tap6n, flamee la boca del tubo al

mechero y obtenga una pequea porcin del cultivo con ayuda del asa de kolle.

Flamee la boca del tubo antes de volver a taparlo.

3. Tome el tubo con caldo nutritivo, y con los mismos cuidados anteriores introduzca

el asa en el lquido para dejar el inculo. Homogenice la mezcla girando el tubo

entre las palmas de la mano.

4. Repita el procedimiento 1 para obtener m6s in6culo, pero usando esta vez aguja de

kolle.

5. Tome el tubo con agar inclinado y realice la siembra depositando el inculo a lo

largo de una sola lnea descrita desde la base de la inclinaci6n hasta el extremo.

6. Repita el procedimiento 1 para obtener inculo, usando nuevamente aguja de kolle.

7. Tome el tubo con agar vertical y realice la siembra por picadura profunda del

medio.

8. Rotule los tubos sembrados y pngalos a incubar a 37 C por 24 horas.

9. Cumplido el tiempo de incubacin, evalu el crecimiento y anote sus resultados en

la hoja adjunta, segn lo siguiente:

a) Crecimiento en estras sobre agar inclinado

Cantidad: Escasa, moderada o abundante

Distribucin en la superficie: Uniforme o irregular

Forma de crecimiento difuso, etc. Arborescente, equinulado, rizoide,

filiforme.

Consistencia del crecimiento: Butiroso, viscoso, fibroso

Pigmentacin Coloracin del cultivo

Gua de Prcticas de Laboratorio Microbiologa General

1

b) Crecimiento en agar vertical por picadura profunda

Crecimiento: - Limitado a la lnea de inoculacin o picadura.

- Con propagacin fuera de la lnea de inoculacin.

- Superficial o en profundidad o ambas a la vez.

c) Crecimiento en caldo nutritivo

Cantidad: - Escasa, moderada o abundante

Caldo

Apariencia o tipo:

- Turbidez, aparicin de opacidad en el medio.

- Sedimento, depsito de clulas en el fondo del tubo;

- si el tubo se agita el sedimento se re-suspende el y no

disgregan aun si el tubo se agita.

- Formacin de pelcula, masa de clulas en la superficie

del caldo.

- Mucosidad, depsito de clulas que permanecen adheridas.

Cuestionario

10. Por qu algunos microorganismos desarrollan en caldo un caracterstico

crecimiento tipo pelcula? Qu factores ambientales podran alterar la formacin de

una pelcula superficial?

11. Cundo utiliza tubos de agra inclinado para el estudio de las caractersticas de

crecimiento? Es preferible inocular con aguja de kolle y no con asa? Por qu?

12. Qu factores influyen en la abundancia del crecimiento en caldo, agar? inclinado y

agar vertical


2

EJERCICIO 2. Tcnicas de cultivo de microorganismos: Aislamiento y

Recuento en placas

Objetivo.

Separar colonias individuales a partir de una mezcla de microorganismos utilizando

tcnicas de aislamiento.

Materiales.

- Tubos de caldo conteniendo una mezcla de microorganismos (Serratia marceasen,

Bacillus sp., Escherichia coli, Mlcrococcus sp., Proteos sp.)

- Asa de kolle, aguja de kolle

- Mechero

- Tubos con 12 ml de agar nutritivo licuado y mantenido a 50 C.

- Placas petri estriles

- Placas con agar nutritivo

- Placas con Agar Mac Conkey

Procedimiento

a) Aislamiento por estras

1. Tome el tubo de caldo que contiene la mezcla de microorganismos y con ayuda del

asa o aguja de kolle previamente esterilizada a la llama, retire inoculo. Considere

todas las recomendaciones antes dadas para el trabajo en asepsia.

2. Tome la placa con agar nutritivo con la mano izquierda y con ayuda de los dedos

pulgar e ndice levante hacia un lado la tapa, procurando que la parte expuesta se

encuentre bajo la influencia de la llama del mechero. No descubra por completo la

placa, as evitara mayor contaminacin. Con el asa cargada de inoculo, haga estrias

sobre toda la superficie del medio, procurando trazar una ultima estra en un espacio

libre. Cierre la placa.

3. Esterilice el asa a la llama nuevamente.

4. Repita los pasos 2 y 3 para la placa con agar Mac Conkey.


3

5. Coloque las places en incubaci6n a 37 C por 24 horas.

6. Observe el desarrollo de colonias individuales y describa sus caractersticas de

forma, elevacin, consistencia, bordes, etc. Diferencie las caractersticas de las

colonias desarrolladas en el medio selectivo-diferencial.

Figura 2. Aislamiento por estras.

b) Aislamiento por diluciones

1. Tome el tubo de caldo conteniendo la mezcla de microorganismos y con ayuda del

asa de kolle retire inoculo.

2. Tome un primer tubo de agar licuado y mantenido a 50 C y transfiera

as6pticamente el inoculo. Esterilice el asa a la llama del mechero. Con el tubo

cerrado mezcle el inoculo con el medio, haci6ndolo girar entre las palmas de las

manos.

3. Transfiera una asada del agar mezclado con el inoculo hacia un segundo tubo de

agar licuado. Repita la operacin anterior para obtener una mezcla homognea.

4. Vierta el contenido de cada tubo por separado en dos placas petri est6riles y rtelas

lentamente para distribuir el medio de manera uniforme. Identifique cada dilucin.

5. Incube las placas a 37 C por 24 horas.

6. Examine el crecimiento de las colonias en las placas. Haga un recuento de colonias,

si el estimado no es inferior a 30 ni superior a 300. Describa las caractersticas

diferenciales de las colonias observadas.


4

Figura 3. Aislamiento por diluciones.

Cuestionario

1. Qu procedimiento seguira a continuacin del desarrollado en estos ejercicios

para obtener el cultivo puro de cada cepa contenida en la mezcla? Como

podramos comprobar que estas cepas obtenidas finalmente corresponden a las

colonias aisladas?

2. Qu factores limitan el tamao de las colonias en una placa de cultivo?

3. Suponga que recibe una muestra de leche en polvo y se le pide determinar el

nmero total de colonias por gramo. Plantee una metodologa cuantitativa basada en

diluciones sucesivas para resolver el problema.

4. En qu consiste la tcnica del nmero ms probable y que usos tiene?

5. De qu manera se pueden preservar cepas puras por largos periodos?

6. Qu tcnicas de cultivo se emplean para aislar microorganismos anaerbicos?


5

PRCTICA N4

PREPARACIN DE UNA MUESTRA FIJA PARA TINCIN

Objetivos:

Aprender las tcnicas de preparacin de frotis, de fijacin y coloracin ms

utilizadas en el estudio microscpico de cultivos bacterianos.

Fundamentos:

Previo al desarrollo de una tcnica de tincin, el material a ser observado debe ser

fijado, es decir adherido a una lmina de vidrio sobre la cual ha de realizarse la tincin.

Si la preparacin no es fijada, la muestra tiende a perderse durante los procedimientos

de tincin. El procedimiento de fijacin mata al microorganismo, coagula el

protoplasma celular y provoca su adhesin a la lmina de vidrio .Un agente de fijacin

ideal preserva la estructura de la clula en la forma y posicin normal sin causar la

aparicin de artefactos (estructuras no presentes en las clula viviente). Aunque el

calentamiento es el agente de fijacin ms comn, el alcohol y otros agentes qumicos

tambin pueden ser usados satisfactoriamente.

El procedimiento a seguir en este ejercicio es preliminar a la mayora de mtodos de

tincin usados para las bacterias.

Materiales

- Muestra conteniendo bacterias

- Asa de Kolle

- Lamina porta objeto

- Mechero de alcohol

- Piseta con agua

Procedimiento

1. Coloque una gota de agua sobre una lmina porta objeto completamente limpia.

Con ayuda del asa de Kolle coloque sobre la gota una pequea porcin de la


6

muestra a fijar. Si la muestra que contiene al microorganismo es lquida, puede

aplicarse directamente sin la gota de agua.

2. Distribuya la gota cargada con la muestra en la lmina hasta formar una pelcula

delgada.

3. Seque la lmina al aire o a una razonable distancia sobre la llama del mechero.

4. Cuando la pelcula este seca, pase la lmina a travs de la llama del mechero unas

tres veces, cuidando que la pelcula este hacia arriba y que la lmina no se

recaliente. La sobre exposicin al calor puede alterar la forma y estructura del

microorganismo.

Figura 1. Preparacin y fijacin de cultivos bacterianos.


7

TINCIN SIMPLE CON COLORANTES BSICOS

Objetivo.

Observar las diferentes formas, tamaos y agrupaciones que presentan los

microorganismos aplicando un mtodo simple de tincin.

Fundamentos.

La tincin simple construye una tcnica sencilla y directa que a travs del uso de un

colorante, nos permite contrastar y diferenciar los microorganismos de su entorno.

Los colorantes bsicos, los cales se utilizan comnmente para teir microorganismos,

difieren en el grado de reactividad con las clulas. El azul de metileno reacciona con las

clulas cargadas negativamente a la tasa ms baja, tomando de 20 a 30 segundos para

teir apropiadamente una preparacin microbiana. El cristal violeta es ms reactivo y

generalmente requiere slo 10 segundos. El carbol fucsina es un colorante an ms

reactivo y generalmente requiere solo 15 segundos. Su reactividad es tan grande que

ciertamente puede dificultar una tincin apropiada, sobre todo cuando la muestra

contiene abundante materia orgnica.

Materiales

- Lminas fijadas de microorganismos

- Aceite de inmersin

- Colorantes bsicos:

Azul de metileno

Cristal violeta

Carbolfucsina

- Papel secante

- Piseta de agua

- Soporte para tincin


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Procedimiento

1. Coloque las lminas fijadas de microorganismos sobre el soporte para tincin.

2. Agregue 5 o 6 gotas de cada colorante dejando que acten por un tiempo de 30

segundos para el azul de metileno; 10 segundos para el cristal violeta; y 5 segundos

para la carbolfucsina.

3. Una vez cumplido el tiempo para los colorantes, lave cada lmina con la piseta de

agua.

4. Seque las lminas al aire o dentro del papel secante

5. Examine las preparaciones teida bajo el objeto de inmersin (100 150 x) de un

microscopio compuesto.

6. Elabore esquemas de sus observaciones destacando las diferencias en tamao,

forma y agrupaciones que se presenten.

Cuestionario.

1. Cuales son las asociaciones ms frecuentes en las bacterias?

2. En que rango de tamao se definen las bacterias?

3. Cules son las formas bacterianas ms frecuentes?

4. Qu diferencia a una tincin directa de una tincin negativa?

5. Qu importancia le atribuye a las diferencias en reactividad de los colorantes

empleados?


9

PRACTICA N5

TINCIN DIFERENCIAL GRAM Y TINCIN DIFERENCIAL CIDO

RESISTENTE.

Objetivo.

Demostrar a travs de la tcnica de tincin diferencial de Gram la existencia de dos

grupos principales de bacterias.

Distinguir a travs de dos tcnicas de tincin diferencial la presencia de endosporas

bacterianas y diferenciarlas de las estructuras vegetativas normales.

Fundamento.

Tincin diferencial Gram

Los microorganismos no slo difieren qumicamente de su entorno, sino tambin

muestran diferencias fsicas y qumicas entre ellos. Esto da lugar a que puedan

reaccionar diferencialmente ante un procedimiento de tincin. La tincin diferencial por

lo tanto, nos permite distinguir entre grupos de microorganismos .En particular, la

tincin de Gram, es la ms utilizada de las tcnicas de tincin diferencial para distinguir

entre dos grupos de bacterias: Gram positivas y Gram negativas.

La diferencia entre estos dos tipos de clulas radica en la variacin de capas que

conforman sus paredes. La pared de la gram-positivas es principalmente una gruesa

capa de peptidoglucano, mientras que las gram-negativas la pared es una multicapa

formada por una capa de peptidoglucano rodeada por una capa externa de protena y

lipopolisacrido. La diferente permeabilidad de estas estructuras de superficie ante los

reactivos utilizados en la tincin Gram, permite la diferenciacin en la coloracin final.

La tincin de Gram requiere de cuatro soluciones: Un colorante bsico, Un mordiente,

un agente decolorante y un contraste (otro colorante bsico).

Las propiedades de los colorantes bsicos ya fueron discutidas previamente. Un

mordiente es una sustancia que incrementa la afinidad entre la clula y el colorante, es


10

decir ayuda a la fijacin del colorante en la estructura de inters. Ejemplos de

mordientes son cidos, bases, sales metlicas, y yodo. Bajo la accin de un mordiente

una clula se tie ms intensamente y es ms difcil decolorarla. Un agente

decolorante es una sustancia que retira el colorante de una estructura teida. Algunas

clulas teidas se decoloran ms rpidamente que otras, y est variacin en la tasa de

decoloracin es la que diferencia tipos de bacterias cuando la tincin Gram y otras

tinciones diferenciales se usan. El contraste es un colorante bsico de un color

diferente al usado inicialmente. El propsito de su aplicacin es da a las clulas

decoloradas un color contraste con el inicial. Aquellas clulas que no se decoloran

rpidamente retienen el color del colorante bsico inicial, mientras que las clulas que

se decoloran fcilmente toman el color del contraste.

La tincin Gram se resume en lo siguiente: El primer paso es teir la preparacin

intensamente con un colorante bsico, preferentemente el cristal violeta. Esto es

seguido de por un tratamiento de las clulas teidas con un mordiente, por ejemplo, un

compuesto iodado como el lugol. La preparacin luego es tratada con un agente

decolorante como el alcohol o alcohol-cetona. Las clulas que retienen el colorante

bsico despus de la decoloracin son llamadas gram positivas, y aquellas que son

decoloradas son gram-negativas, y pueden ser reteidas con un contraste como la

safranina.


11

Figura 1.Tipos de Tincin Gram.

Materiales.

- Cultivos jvenes de microorganismos (18-24horas): Bacillus sp; streptococcus sp;

Escherichia coli.

- Colorantes bsicos: Cristal violeta; Safranina

- Decolorante: Alcohol-cetona

- Lminas porta objeto

- Mordiente : Lugol

- Papel secante

- Piseta de agua

- Soporte para tincin

- Asa de Kolle

- Aceite de inmersin.

Procedimiento.

1. Prepare una lmina fija de cada uno de los cultivos microbianos proporcionados y

una lmina fija con la mezcla Streptoccus y Escherichia coli

2. Agregue cristal violeta y deje que acte por 30 segundos.

3. Enjuague con agua

4. Cubra la pelcula teida con lugol y deje que acte por 30 a 60 segundos.


12

5. Enjuague con agua.

6. Decolore con alcohol acetona. Para una pelcula delgada, la exposicin al

decolorante por 10-20 segundos es suficiente.

7. Enjuague con agua

8. Aplique el colorante de contraste safranina por 30 segundos.

9. Enjugue con agua y seque la lmina al aire o dentro del papel secante.

10. Examine cada muestra bajo el objeto de inmersin

11. Elabore los esquemas correspondientes.

Figura 2. Procedimiento para hacer tincin Gram.

Tincin Diferencial cido-Resistente

La tincin cido-resistente es una tincin diferencial que mide en clulas teidas la

resistencia a la decoloracin mediante cido. La propiedad de cido resistencia en

ciertas micobacterias y actinomicetos est correlacionada con su salto contenido


13

lipdico. Teir estas bacterias requiere de un tratamiento de alta temperatura y la

utilizacin de colorantes fuertemente a fines.

El procedimiento consiste en teir con carbolfucsina caliente, decolorar con una

solucin de alcohol-cido y reteir con un contraste. Las bacteria cido en comparacin

a otros microorganismos y retienen el color del colorante inicial.

Este tipo de coloracin es utilizada en el estudio y diagnstico de enfermedades

causadas por especies cido-resistentes como los de la tuberculosis, la lepra, y tambin

para la diferenciacin de estructuras resistentes como las endosporas bacterianas.

Tincin De Endosporas

Las especies del genero Bacillus y Clostridium producen una estructura denominada

endospora. A diferencia de la clula la endospora es una estructura resistente capaz de

sobrevivir por largos periodos en ambientes desfavorables, en condiciones extremas de

alta temperatura o bajo la accin de agentes desfavorables, en condiciones extremas de

alta temperatura o bajo la accin de agentes qumicos.

Existen variadas tcnicas que se utilizan para la tincin de endosporas. Destacan entre

ellas la tcnica Drner y la de Schaeffer & Fulton. En la primera se emplea carbol

fucsina para teir la espora y nigrosina como agente decolorante y de tincin negativa;

la espora se tie de rojo, la parte vegetativa incolora y toda la estructura aparece sobre

un fondo oscuro .La tcnica se Schaeffer y Fulton emplea carbolfucsina para teir la

espora, alcohol cido como decolorante y verde malaquita como colorante de contraste;

la espora se tie de rojo y la parte vegetativa de verde. Ambas tcnicas emplean fenol y

alta temperatura como agentes coadyugantes para lograr la penetracin de la Fucsina en

la estructura de la espora.

Tcnica de Drner

Materiales

- Cultivo de 48 horas: Bacillus_sp; Clostridium sp.


14


- Asa de Klle

- Bao de agua a 100C

- Lmina porta objeto

- Soluciones colorantes: Carbolfucsina, Nigrosina.

- Tubos con agua destilada estril.


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Procedimiento.

1. Haga una suspensin concentrada del organismo en 2 3 gotas de agua destilada

contenida en un tubo pequeo de prueba.

2. Aada igual cantidad de carbolfucsina y coloque el tubo en un recipiente con agua

hirviendo por 10 min.

3. Transfiera una gota de la suspensin de clulas hervidas en un recipiente con agua

hirviendo por 10 minutos.

4. Agregue una gota de nigrosina y extienda la mezcla con ayuda de otra lmina hasta

obtener una delgada pelcula.

5. Seque la lmina al aire o dentro del papel secante.

6. Examine al microscopio compuesto bajo un objeto en inmersin.


Tcnica de Schaeffer y Fulton

Materiales.

- Cultivo de 48 horas: Bacillus sp; Clostridium sp.


- Asa de Klle

- Lmina porta objeto

- Mechero de alcohol

- Pinzas

- Soluciones colorantes: Carbolfucsina; verde malaquita.

- Solucin decolorante: Alcohol cido.

Procedimiento

1. Prepare una muestra fija del microorganismo proporcionado.

2. Agregue a la preparacin carbolfucsina hasta cubrirla totalmente.

3. Con ayuda de una pinza, caliente la lmina con el colorante hacindola pasar

ligeramente por la llama del mechero hasta que observe el desprendimiento de

vapores.


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4. Mantenga esta condicin durante tres minutos , evitando que el colorante se seque o

entre en ebullicin

5. La ve con alcohol cido hasta que este resulte incoloro.


7. cubra la preparacin con unas gotas de verde malaquita dejando que acte por dos

minutos.


9. Seque la lmina al aire o dentro del papel secante.

10. Examine al microscopio compuesto bajo un objeto de inmersin.


Cuestionario

1. Bajo que circunstancia la tincin diferencial de Gram podra resultar errada?

2. Que efecto traera reemplazar el lugol con otro agente oxidante.

3. Podra usted variar el colorante primario y el contraste obteniendo los mismos

resultados?

4. Cul es la influencia del pH? en la reaccin Gram?

5. Liste cinco ejemplos de bacterias gram positivas y cinco de Gram negativas,

sealando su importancia.

6. Cual de los mtodos utilizados le permiti observar mejor las endosporas

bacteriana? A qu atribuye la diferencia?

7. Qu efecto producir el reemplazar el alcohol cido por otro decolorante como el

alcohol cetona?

8. Qu otros gneros de bacterias pueden formar endosporas?

9. Revise otras tcnicas de tincin de esporas y comprelas con las tcnicas usadas en

este ejercicio. Destaque ventajas y desventajas.


17

PRACTICA N6

MICROORGANISMOS DEL AIRE

Objetivo.

Observar el desarrollo de hongos misceleares y levaduriformes en sustrato de

diferente origen e identificar los gneros ms frecuentes.

Observar las muestras diversas para obtener crecimiento bacteriano en colonias

aisladas (cultivo y aislamiento), adems del estudio de reacciones hemolticas en

una amplia variedad de microorganismos.

Materiales.

- Agar Sangre

- Agar sabouraud

- Asa de Kolle o estilete

- Lminas porta objetos

- Cristal violeta

- Safranina

- Lugol

- Alcohol Cetona

- Azul de metileno

Procedimiento.

a) Observacin macroscpica

Hongos y levaduras en Agar Sabouraud

1. Observe cuidadosamente cada sustrato infectado y determine el tipo de colonia que

desarrolla.

2. Describa el aspecto externo de las colonias de hongos

Reacciones Hemolticas en Agar Sangre Humana

1. Observe las caractersticas de las colonias deacuerdo a las reacciones hemolticas.

Hemlisis alfa: lisis parcial de los glbulos rojos. Se observa un halo de

color verdoso alrededor de la colonia en estudio. Es debido a la

oxidacin de la hemoglobina a metahemoglobina (compuesto de color


18

verdoso) por el perxido de hidrgeno generado por los

microorganismos.

Hemlisis beta: lisis total de los glbulos rojos. Se observa un halo claro,

brillante alrededor de la colonia en estudio.

Hemlisis gamma: ausencia de lisis de los glbulos rojos. El medio de

cultivo no presenta modificaciones de color y aspecto alrededor de la

colonia en estudio.

b) Observacin microscpica

Crecimiento de Hongos y levaduras

1. Coloque una gota de azul de metileno en un porta objeto limpio y desgrasado.

2. Con ayuda del asa de Kolle en forma de gacho, extraiga una pequea cantidad de u

micelio de una muestra y coloque en la gota de colorante.

3. Coloque sobre la preparacin la lmina cubre objetos.

4. Observe bajo el objetivo de 10 y 40 aumentos.

5. Reconozca las estructuras ms caractersticas del cuerpo vegetativo del hongo.

6. Elabore los esquemas que correspondan para cada observacin.

7. Con ayuda de lminas referenciales trate de identificar el o los gneros que observe.

Crecimiento de microorganismos por reacciones hemolticas en agar sangre

humana

1. Realice el procedimiento de tincin Gram.

EJERCICIO 1. Aislamiento de hongos , levaduras y microorganismos

exigentes del medio ambiente.

Objetivo.

Aislar en medios de cultivo los diferentes gneros de microorganismos que

frecuentan el medio ambiente y determinar sus caractersticas.

Materiales.

- Placas petri, con medios de cultivo Agar sabouraud, Agar Sangre.


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Procedimiento.

1. Elija u punto determinado en el ambiente que quiera evaluar.

2. Destape la placa petri exponiendo al medio de cultivo al aire (Se asume que las

esporas de hongos se encuentran suspendidas). El tiempo de exposicin puede ser

de 5 a 10 minutos. Vuelva a tapar la placa identifiquela con su nombre, grupo y

lugar muestreado.

3. Trabaje de manera similar para cada placa y lugar.

4. En el laboratorio incube las placas en una estufa de 30 C por cuatro o cinco das.

5. Transcurrido el tiempo, examine las placas y realice una descripcin detallada de las

mismas.

Cuestionario.

1. Qu gneros de Hongos abundan frecuentemente en el medio ambiente?

2. Qu variaciones medio ambientales modificara sustancialmente la presencia de

hongos? Formule su respuesta tomando en cuenta modificaciones en cantidades y

en diversidades de especies.

3. Podran las especies de hongos patgenos estar presentes en el aislamiento de

hongos que usted realizo?

4. Cul es la diferencia entre microorganismos exigentes y no exigentes?

5. Cules son los tipos de reacciones hemolticas?


20

PRACTICA N7

AISLAMIENTO DE COLIFORMES

Objetivos

Familiarizarse con la tcnica de preparacin de muestras slidas.

Determinar la prueba positiva sobre la presencia de coliformes en la muestra.

Fundamento.

Streptococcus.

Son cocos gram (+) de forma esfrica u ovoide que crecen en pares o longitudes

variada. No forman esporas, son catalasa negativa, inmvil, algunos capsulados, y son

anaerobios facultativos. Existen 25 especies identificadas.

A pesar de ser gram (+) pueden convertirse en gram (-) a medida que el cultivo

envejece. En consecuencia su pared consta de:

1. Peptidoglucano, que le confiere rapidez.

2. Protenas.

3. cido teicoico.

Una caracterstica importante es que los Streptococcus son homofermentativos, es decir

forman cido lctico como producto principal de la fermentacin de la glucosa.

Para la clasificacin de streptococcus existen dos criterios que son muy tiles: Segn la

hemlisis y segn el criterio de Lancefield.

Genero Escherichia.

Son enterobacterias, es decir bacterias en forma de bacilos, gram (-), de 2-4 m de

largo, con bordes redondeados, no esporulados. Su metabolismo es respiratorio y

fermentativo. Este gnero contiene ms de veinte gneros y ms de cien especies.


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Por ser la entero bacterias gram (-), su envoltura celular est formada por: Membrana

celular, pared celular (contenida en el periplasma) y membrana externa, siendo sus

componentes individuales:

1. Fosfolpidos.

2. Peptidoglucano.

3. Lipopolisacrido.

4. Protenas de membrana externa.

5. Cpsula.

6. Fimbrias.

7. El antgeno enterobacterial

comn.

Fisiologa y estructura antignica

Esta bacterias crecen de manera abundante en medios de cultivo ordinario, a diferencia

de los streptococcus que requieren medios de cultivo complejos (Son bacterias

exigentes). El crecimiento se realiza entre temperaturas de 10C 46C, siendo el grado

optimo 37C; la mayor parte de la cepas son destruidas con calentamientos a 60C x 30

min.

El gnero Escherichia se caracteriza porque fermenta rpidamente diversos tipos de

azucares, como la lactosa, produciendo cido y gas. El principal cido formado por

cido lctico, y en cantidades menores cido actico y frmico junto con etanol.

Este gnero tiene una estructura antignica compleja, habindose detectado ms de 150

antgenos somtico o termoestables (lipopolisacridos), ms de 100 antgenos k

termolbiles (capsulares) y ms de 50 antgenos H (flagelares).

Este gnero produce as mismo enterotoxinas y hemolisinas. Las enterotoxinas median

el transporte de iones y de agua desde los tejidos hacia el lumen intestinal para originar

una secrecin neta que se manifiesta en forma de diarreas; existen dos tipos de

enterotoxinas: Toxina termolbil (TL) que provoca prdida de agua y electrolitos, y la

toxina termoestable (TS), que produce secrecin de agua y electrolitos, y es muy

resistente al calor (Soporta 100C x 10 min) Tambin produce hemolisinas, cuya

produccin se relaciona con la virulencia, es citxica para leucocitos.


22

Importancia del gnero Escherichia.

Dado que las especies de gnero Escherichia se hallan presentes como comensales en el

intestino humano y animal ,particularmente E. Coli, estos microorganismos son

utilizados como indicadores de contaminacin fecal, aunque no necesariamente indica

que un alimento est contaminado con heces, sino que indica una mala higiene en el

procesamiento de los alimentos.

Aunque existe la probabilidad de reemplazar las bacterias coniformes por los virus

conocidos como colifagos (que infectan los coliformes), que se hallan presentes

constantemente en la heces humanas, desages, aparte que su deteccin es fcil y

rpida, de modo que la relacin coliformes colifagos es muy estrecha, adems los

colifagos tambin seran indicadores de enterovirus en muestras contaminadas. Por

ello se piensa que los colifagos podran ser una alternativa frente a los coliformes

Materiales, reactivos y equipos.

- Frasco para licuar.

- Cucharilla.

- Tubos de ensayo.

- Pipeta 1 ml.

- Papel craft.

- Agar VRBA.

- Alcohol.

- Licuadora.

- Balanza mecnica.

- Mechero Bunsen.

- Matraz Erlenmeyer.

- Placas petri.

- Tapones de algodn.

- Solucin salina peptonada (ssp).

- Muestras a analizar (Chifn,

smola).

- Estufa.

Procedimiento experimental.

3. Preparacin De Muestra Slida.

Cerca de un mechero Bunsen tomamos 10 g de la muestra y la depositamos en un

frasco para licuar estril.

Al frasco se le aade 90 ml SSp estril provenientes de un matraz el cual no ser

desechado.


23

Llevamos el frasco una vez tapado con los 10 g de muestra y los 90 ml de ssp a

licuar, el tiempo necesario hasta que todo se desmenuce y la mezcla quede

uniforme.

Retiramos el frasco y su contenido lo vaciamos al matraz del cual extrajimos los 90

al ssp.

Colocamos tapn de algodn. A esta mezcla la llamamos solucin madre (sm).

4. Preparacin del cultivo

De la SM o de la muestra original (en caso sea lquida de por s) extraemos con una

pipeta de 1 ml cerca del mechero 1 ml y lo depositamos en el tubo de ensayo con 9

ml SSP, lavamos la pipeta. Esta ser la dilucin 10-1.

Realizamos lo mismo con el tubo que contiene la dilucin 10-1 o -1: Extraemos

1ml del tubo -1 y lo depositaos en otro tubo con 9 ml SSP. Lavamos la pipeta, y

tapamos el tubo con tapones de algodn. Siempre cerca del mechero.

Realizamos la tercera dilucin, no olvide lavar la pipeta.

A cada placa agregamos una delgada lmina o capa de agar VRVA, esterilizando el

autoclave, uniformizamos el contenido de la placa movindola en crculos y

esperando que el agar solidifique: siembra por incorporacin.

Luego agregamos una segunda capa y protectora de agar VRBA a las mismas

placas(esta ya deberan estar rotuladas al agregar el 1 ml de la dilucin)

Se espera que solidifique, colocamos papel crac a las placas y rotulamos.

Incubamos las placas en la estufa a 37 C por 24 48 horas.

Contamos las colonias que estn en el fondo de las placas y no en las superficies.

PRCTICA N8

DETERMINACIN DE BACTERIAS DEL AGUA


24

Objetivos

Determinar el nmero de unidad formadora de colonia en un mililitro de agua.

Identificar diferencias entre la flora microbiana del agua.

Identificar las bacterias presentes en el agua y comparar sus requerimientos

nutricionales con el contenido del medio cultivo en el que fueron incubados.

Fundamento.

Bacteria de aguas continentales.

Entre la flora bacteriana del suelo y las aguas continentales hay ciertas relaciones y

esto es particularmente si se trata de aguas que estn constantemente expuestas a la

contaminacin del suelo. No obstante en las aguas y arroyos slo se pueden desarrollar de

las bacterias del suelo menos exigentes. En el caso de microorganismos patgenos ms

frecuentemente transmitidos por el agua producen infecciones del aparato digestivo, como

tifoidea y clera, cuyos agentes, eteolgicos de esta se encuentran en materias fecales y la

orina de los infectados.

Agentes patgenos de las aguas.

Las aguas residuales domsticas son portadores de bacterias y hongos patgenos

conservando su virulencia durante el tiempo, frecuentemente transportan bacteria intestinal,

como S. typi y S. Paratipi, ms caro es la presencia de Shigella y en pases tropicales

abunda el vibrin cholerae, aunque tambin suele encontrarse con frecuencia

microbacterium tuberculosis y esporas Clostridium patgeno.

Se pueden encontrar bacterias patgenas en mariscos procedentes de aguas

contaminadas. Entre los hongos patgenos se hallan la especie levaduriforme, Cndida

albicans (productores de la candidiasis).As mismo las aguas residuales transportan virus de

la especie humana como es la que produce la poliomilitis, virosis intestinal y gripe de

verano.


25

Tanto los virus como las bacterias de agua son ms resistentes en agua dulce que en

agua de mar.

Determinacin de la cantidad sanitaria.

Las investigaciones sanitarias de los sistemas productores de agua incluyen la

infeccin de las fuentes de agua sin tratar y sus condiciones que influyen en su calidad, las

operaciones de la planta purificadora y el mecanismo de distribucin del agua a los

consumidores. Entre las pautas microbiolgicas est la determinacin de microorganismos

patgenos en las aguas particularmente. Escherichia coli, otras coliformes fecales (como

Clostridium faecalis,) y clostridium prfringes, su presencia indica contaminacin fecal.

Entre las caractersticas de la E. Colli estn. Produccin de indol, produccin de

cido, produccin de acetil metil carbinol en medios con pectona glucosado y utilizacin de

citratos de sodio.

Materiales.

- Placas petri

- Tubos de ensayo.

- Matraz Erlenmeyer.

- Pipetas de 1 ml.

- Gradillas para tubos de ensayos.

- Esptulas

Reactivos.

- Muestra suelo.

- Agar nutritivo

- SSP

- Solucin alcohol-cetona.

- Aceite de inmersin.

- Agar VRA

- Violeta de Genciana

- Zafranina

- Agua destilada.

Equipos.

- Microscopio ptico.

- Balanza mecnica.

- Mechero.

- Estufa.

Procedimiento.

a) Preparacin de la solucin madre


26

- En el platillo del abalanza colocaos un trozo de papel craft.

- Con ayuda de una esptula depositamos 10 g de muestra (suelo frtil) sobre el papel.

- Agregaos la muestra sobre el Erlenmeyer con 90 ml de SSP.

- Agitamos y mezclamos la muestra con los 90 ml de SSP, hemos obtenido la

solucin madre o a 10-1(SM)

b) Preparacin de Soluciones e incubacin.

1. Tomar un ml de la SM y la colocamos en un tubo de ensayo de ml SSP. Esta

dilucin ser a la 1 con respecto a la SM o 2 , respecto, a los g/mm. Repetimos

este procedimiento extrayendo del tubo -1 un ml y lo colocamos en un tubo de

ensayo con 9 ml de SSP, esta dilucin ser a la 3, as continuamos hasta obtener la

solucin 4.

2. De cada tubo con la dilucin extraemos u ml con ayuda de la pipeta y lo

depositamos en una placa petri estril, comenzando desde el tubo ms diluido al

menos diluido. Por cada tubo se preparan 2 placas con 1 ml.

3. Cuando todas las placas tienen 1 ml, en una colocamos una capa de agar nutritivo y

en la otra placa perteneciente a la misma dilucin agregamos una capa de agar

VRBA, homogenizamos y dejamos secar: siembra por incorporacin.

4. Luego agregamos una segunda capa del mismo agar a cada placa con el fin de

proteger el cultivo.

5. Rotulamos y envolvemos cada placa en papel craft.

6. Incubamos a 37 C x 24 48 horas.

c) Coloracin gran y conteo

1. Luego de la incubacin extraemos las placas de la estufa y procedemos a contar el

nmero de colonias presentes en la placa del fondo de la placa, no aquellas que se

encuentran en las superficies.

2. Una vez realizado el conteo, con una asa de Kolle extraemos (hacemos un corte) en

el dio de cultivo una parte de la primera capa con el fin de extraer una muestra de

colonia, si es necesario tambin se perforar la segunda capa.


27

3. La muestra de colonia la colocamos y disolvemos en una lmina porta objeto

(previamente la lmina tiene gotas de agua destilada) con agua y procedemos a

realizar la tincin de Gram.

4. Colocamos la lmina tincionada al microscopio y observamos el resultado.


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PRCTICA N9

DETERMINACIN DE BACTERIAS DEL SUELO

Objetivos

Determinar el nmero de unidad formadora de colonia en el suelo.

Identificar diferencias entre la flora microbiana del suelo.

Identificar las bacterias presentes en el suelo y comparar sus requerimientos

nutricionales con el contenido del medio cultivo en el que fueron incubados.

Fundamento.

En la naturaleza los microorganismos se encuentran formando comunidades

de diversos gneros y especies, por lo que es casi imposible encontrar un hbitat con un

solo gnero de microorganismos. Por lo que para los estudios en que se requiera el

conocimiento de un solo organismo de esa comunidad (estudio autoecolgico), es

necesario el aislamiento del mismo. Obviamente se debe tener en mente que

muchas reacciones fisiolgicas, bioqumicas y hasta algunas morfolgicas, requieren

de la presencia del resto de los integrantes de la comunidad para que se expresen

(estudios sinecolgicos).

Se han empleado una serie de mtodos para la propagacin de los

microorganismos a partir de clulas individuales. El cultivo en caja de Petri es un

sistema sencillo y rpido para el aislamiento de los microorganismos de una mezcla,

permitiendo que a partir de una clula o un conglomerado de clulas del mismo gnero y

especie, se forme una colonia (clona), que sea visible a simple vista. Los mtodos

ms usados son: a) mtodo de la estra cruzada y b) el mtodo del vaciado en placa.

El mtodo de la estra cruzada, es un mtodo cualitativo que permite trabajar

un gran nmero de muestras en corto tiempo y consiste en tomar una muestra con

un asa previamente esterilizada y colocarla sobre una superficie del medio de cultivo

slido que se encuentra en una caja de Petri, Posteriormente se trazan una serie de estras

pegadas al borde de la caja, esterilizando el asa al final de cada serie. El mtodo


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de vaciado en placa, es un mtodo cuantitativo, ya que adems de aislar a los

microorganismos, en un cultivo puro (formado por un solo gnero y especie), nos

permite contar el nmero de organismos presentes en esa muestra. Esto es posible

ya que a partir de una muestra perfectamente medida se realizan una serie de diluciones,

lo que nos da la oportunidad de conocer la cantidad exacta de muestra en cada tubo de

dilucin, si despus de sembrar la muestra en nuestro medio conocemos el nmero de

colonias que crecieron, podemos multiplicar este por la inversa de la dilucin y por

la inversa de la alcuota que sembramos, dndonos como resultado el nmero de

unidades formadoras de colonias (UFC) por unidad de volumen o masa de la muestra

original.

Para el trabajo con ambos procedimientos se requiere procesar las muestras bajo

condiciones de esterilidad con objeto de no incorporar microorganismos de otra

fuente extraa a la que estamos analizando.

Materiales.

- Muestra de Suelo.

- 5 pipetas de 1 mL estriles

- Frasco de dilucin de 9 0mL

con agua destilada estril

- 5 tubos con 9 mL de agua

destilada estril.

- Agua destilada

- Capsulas de porcelana

- Pinzas

- Mechero

- Horno o incubadora

- Asa bacteriolgica

- Varilla acodada

- Alcohol

- Metanol

- Succionador para pipetas

- Cajas Petri con medio de

cultivo para hongos y

levaduras (Saboraud)

Procedimiento.

a) Mtodo de la disolucin.

1. Pesar 10g de suelo y colocarlos en condiciones de esterilidad en una botella

de dilucin conteniendo 90mL de agua destilada estril.


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2. Por medio de una pipeta de vidrio, tomar 1mL del sobrenadante de la botella

de dilucin, teniendo cuidado de no arrastrar sedimento y vaciar en condiciones

de esterilidad a un tubo de ensaye con 9mL de agua destilada estril. Agitar

perfectamente para homogenizar la muestra (figura 1).

3. A partir del tubo anterior, tomar 1 mL y vaciarlo a otro tubo de ensaye con 9 mL de

agua destilada estril, agitar perfectamente.

4. Repita el punto tres, tomando siempre 1mL del ltimo tubo inoculado y vacelo a un

tubo nuevo con 9mL de agua destilada estril (figura 1).

5. Al terminar la serie de tubos, tomar de los tres ltimos tubos 0.1mL y colocarlo en

el centro de tres cajas de Petri perfectamente marcadas para su identificacin.

6. Tomar una varilla acodada esterilizarla flameando con alcohol, y una vez

fra, distribuir la muestra sobre toda la superficie de la caja, girando sta y

moviendo la varilla en un sentido.

7. Colocar las cajas en una canastilla e incubarlas a 35 37 C durante 24 h.

Figura 1. Procedimiento para la preparacin de dilucin seriada.

b) Mtodo de estra cruzada.

1. A partir del frasco de dilucin en que se realiz la primera dilucin del

experimento anterior, tomar una asada y colocarla en una porcin de la caja,


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trazando una serie de estras que cubran aproximadamente 1 cm a partir de

la orilla de la caja.

2. Flamear el asa, dejar enfriar y trazar una nueva serie de estras a partir de

un extremo de las anteriores.

3. Repetir el paso anterior durante dos series de estras.

4. Trazar la ltima serie de estras abriendo esta hacia el centro de la caja.

5. Incubar a 35 37C durante 24 - 48 h.

6. Repetir los pasos anteriores para las diluciones 10-5, 10-6 y 10-7.

Figura 2. Procedimiento para la preparacin de estras cruzadas.

Transcurrido el tiempo de incubacin para las cajas utilizadas en ambos

mtodos, haga sus observaciones de morfologa colonial.

c) Determine las UFC/g de suelo seco de la muestra original.

1. Pesar una capsula de porcelana, registre el peso.

2. Pesar aproximadamente 10 g de suelo en la capsula de porcelana, registre el peso.

3. Colquelos en el horno a 105 C por 48 hrs. Una vez concluido el tiempo

de secado enfrelo, pselo y registre el peso.


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Calcular el nmero de unidades formadoras de colonias (UFC) por gramo de suelo

seco:

Determinacin del peso del suelo seco:

Determinacin del % de humedad del suelo:

Cuestionario

1. Desde el punto de vista prctico, qu ventajas y desventajas encontr al utilizar los

dos mtodos de aislamiento?

2. Qu caractersticas generales tienen las colonias bacterianas que las

distinguen de los hongos?

3. Por qu reportamos los resultados como UFC/mL g en la determinacin

cuantitativa de microorganismos en lugar de usar el trmino clulas/mL g?


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PRCTICA N10

ACTIVIDAD ENZIMTICA Y METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS

AMINOCIDOS Y UREA

Fundamento

Para el caso de los microorganismos, la mayora de los carbohidratos de que

disponen se encuentra en la forma de polisacridos. Un ejemplo comn de estos

compuestos es el almidn. Un organismo puede hidrolizar almidn solo si produce la

enzima amilasa. Como no todos los microorganismos producen amilasa, la hidrlisis del

almidn puede ser usado para ayudar a identificar microorganismos desconocidos.

La hidrlisis de la protena, algunas veces Llamada peptonizacin, es tambin til

en la identificacin de especies microbianas; por ejemplo, la gelatina es un buen sustrato

para el ensayo de microorganismos con enzimas proteo lticas. La casena, es la principal

protena de la leche y muchas bacterias producen enzimas que hidrolizan esta protena en

derivados ms solubles como proteosas, peptonas, pptidos y aminocidos; por citarlos en

orden decreciente de tamao.

Muchos microorganismos pueden degradar grasas y aceites (Lipolisis) y obtener as

acetato para el metabolismo de carbohidratos y la sntesis de aminocidos. La presencia de

lipasa constituye otra caracterstica de los microorganismos que puede ser til para su

clasificacin.

Materiales

- Medios de cultivos: Placas de agar almidn, agar gelatina, agar casena, agar

grasa.

- Asa de kolle

- Mechero

- Cultivo de microorganismos de 18 horas


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Procedimiento

1. Con un plumn marcador dividir la base de la placa en cuatro secciones, enumerarlos

como I, II, III y IV.

2. Utilizando la aguja de Kolle, colocar una estra de cada cultivo en un cuadrante.

Dejar el primer cuadrante como control.

3. Invertir las placas e incubar a 37" C por 18 - 24 horas.

Despus de la incubacin determinar los resultados de la prueba como sigue:

a) Hidrlisis del almidn

- Cubrir la superficie de la placa con solucin de Lugol

- Las zonas claras o transparentes alrededor de las colonias bacterianas indican la

hidrlisis del almidn. Anotar sus resultados en el cuadro de conclusiones.

b) Hidrlisis de la gelatina

- Cubrir la superficie de la placa de agar gelatina con HgCl2 por 5'

- La actividad de la gelatinaza se indica por medio de zonas transparentes alrededor

de las colonias. La zona opaca del medio se debe a la gelatina precipitada

- Anotar las conclusiones en la secci6n de resultados y observaciones.

c) Hidrlisis de la casena

- Observar zonas claras de hidr6lisis alrededor de las colonias que indican la

degradacin de la casena. Para incrementar el contraste, se puede utilizar tambin

HgCl2.

d) Hidrlisis de los Lpidos

- Cubrir la superficie del medio con SO4Cu2.

- Un color verde azulado alrededor de las colonias indica la producci6n de la enzima

lipasa.

EJERCICIO 1. Metabolismo de carbohidratos, aminocidos y urea

Materiales

- Medios de cultivos: Agar Kligler, agar citrato de Simmon's, caldo lisina, caldo

triptfano y caldo urea


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- Asa de kolle

- Mechero

- Cultivo de microorganismos de 18 - 24 horas

I. Degradacin de carbohidratos

b) Fermentacin de glucosa y lactosa

Procedimiento

Se realiza en un solo medio: Agar Kligler, en el cual la siembra se realiza por

picadura profunda y una estria en la superficie. Incubar a 37 C por 18 - 24 horas.

Interpretacin

Parte inferior amarillo Fermentacin de glucosa

Parte superior amarillo Fermentacin de lactosa

Indicador del medio Rojo de fenol

Adems:

Ruptura del medio

Ennegrecimiento del medio

Produccin de gas (glucosa)

H2S positivo

b) Asimilacin del citrato

La habilidad para utilizar el citrato como nica fuente de carbono y energa distingue a

ciertos bacilos gram negativos. El agar citrato de Simonas contiene citrato como nica

fuente de carbono y energa. El crecimiento en este medio indica una reaccin positiva

para la utilizacin de citrato. Ciertos organismos que clan una reaccin positiva

incrementa el pH del agar, virando el indicador azul de bromo timol en el medio de verde

a azul.

Procedimiento

1. Inocular con la aguja de Kolle sobre la superficie inclinada del agar citrato

de Simmon's

2. Incubar a 37 C por 24 horas


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3. La prueba es positiva cuando el medio vira del color verde al azul o cuando

se observa crecimiento del microorganismo.

c) Degradacin de aminocidos

Descarboxilacion de la lisina

La Descarboxilacin de un aminocido consiste en la perdida de su grupo carboxilo

para producir una amina y CO2. La descarboxilacin bacteriana puede ser demostrada por

la desaparicin del aminocido, usualmente un procedimiento complejo, o la formacin de

amina y CO2. Como la reaccin resulta en la acumulacin de una amina (la cual es bsica),

la descarboxilacin tambin puede ser demostrada midiendo la elevacin del pH.

La descarboxilacin de los aminocidos aminados da como producto la formacin

de diaminas como putrecsina y cadaverina (con liberacin de CO2), alcalinizando el medio

de un modo acentuado.

Procedimiento

Inocular con el asa de Kolle en el caldo lisina un microorganismo determinado

Incubar a 37 C por 18 - 24 horas.

Interpretacin

Durante las primeras horas el medio se torna amarillo por fermentacin de la

glucosa contenida en el medio y produciendo cido. Posteriormente, al ocurrir la

descarboxilacin del aminocido, el medio se torna alcalino y el indicador vira al rojo

prpura.

Degradacin del triptfano

El indol es un compuesto que contiene nitrgeno que puede ser formado de la

degradacin del aminocido triptfano por ciertas bacterias. La prueba de indol es

importante porque solo ciertas bacterias forman indol, y pueden ser fcilmente

detectadas. De este modo, la degradacin del triptfano es otra reaccin de diferenciacin.


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Las bacterias que poseen triptfanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptfano

con produccin de indol, cido pirvico y amoniaco.

Procedimiento

Inocular con el asa de Klle en el caldo indol un microorganismo determinado

incubar a 37 C por 24 horas. Luego de la incubacin agregar reactivo de Kovacs al

tubo de ensayo.

Interpretacin

La formacin de un anillo color rojo fucsia en la interfase del reactivo y el caldo,

indica la presencia de indol.

Degradacin de la urea

Procedimiento

Inocular en tubos con caldo urea los microorganismos a ensayar. Incubar junto

con un tubo control a 37 C por 24 horas.

Interpretacin

La presencia de un color prpura indica la degradaci6n de la urea por la

ureasa. Anotar los resultados en la hoja de reporte.

Cuestionario

1. Nombre algunos cidos producidos por bacterias. Mencione el gnero principal

que producen cada uno de estos cidos.

2. Algunos microorganismos usan carbohidratos sin formar niveles de cido

detectables. En tales casos, cmo podra determinar si el carbohidrato ha sido

utilizado?

3. Por qu las amilasas, gelatinazas, caseinazas y lipasas son clasificadas como

enzima hidrolticas?


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4. Las enzimas que hidrolizan la casena y gelatina rompen el mismo enlace

qumico. Cul es?

5. Cul es el nombre de la amina formada por la descarboxilacin de la lisina?


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PRCTICA N11

CONTROL DE CRECIMIENTO POR AGENTES QUMICOS

Objetivo

Determinar el efecto bactericida o bacteriostatico de algunos agentes qumicos

Fundamento.

Existen infinidad de compuestos qumicos que afectan la viabilidad de los

microorganismos. Hay sustancias qumicas que pueden interferir o eliminar el desarrollo

bacteriano tales como desinfectantes, colorantes, metales pesados y sus compuestos,

antibiticos, etc. Aqu nos ocuparemos de los que inhiben el crecimiento o matan a la clula

y de modo especial de algunos productos qumicos que se emplean para prevenir la actividad

infecciosa o destructora de los microorganismos.

Varios de los colorantes empleados para teir microorganismos tienen poder

antisptico. Estos colorantes son de gran utilidad para ajustar las condiciones de los

medios bacteriolgicos de tal manera que supriman el crecimiento de ciertas especies. El

colorante mayormente usado es el cristal violeta, a concentraciones relativamente altas, este

colorante inhibe tanto las bacterias Gram (+) como a las Gram (-). Sin embargo, al reducir la

concentracin, la accin del colorante se vuelve selectiva, inhibiendo a las Gram (+) mas no a

las Gram (-). Si la concentracin se reduce aun mas, se alcanza un nivel tolerable para ambos

tipos de bacterias. Otros colorantes como el verde brillante y el verde malaquita inhiben

tambin a los gram positivos. Los desinfectantes y antispticos son agentes antimicrobianos

que se usan en situaciones muy diferentes. Los desinfectantes son sustancias que matan a

los microorganismos y se usas sobre objetos inanimados. Los antispticos son agentes

qumicos, que matan o inhiben el desarrollo de microorganismos, que no son t6xicos

para su aplicacin sobre tejidos vivos. Los agentes qumicos antibacterianos que se suelen

denominar germicidas tienen un amplio use en situaciones donde no es practico usar calor

en la esterilizacin.


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Los metales pesados produce la desnaturalizacin de enzimas y otras protenas.

Actan como desinfectantes o antispticos. Son de uso comn nitrato de plata, mercurio,

cromo, sulfato de cobre, bicloruro de mercurio, etc.

Materiales

- Agar nutritivo en tubos.

- Cultivos en caldo nutritivo: Bacillus sp, E. co/i, Salmonella sp, Staphylococcus sp.

- Discos de papel de filtro

- Placas estriles

- Pinzas

- Asa de Kolle

Reactivos

- Soluciones colorantes:

Cristal violeta: 1/1000, 1/5000, 1110000

Verde malaquita: 1/1000, 1/5000, 1/10000

Azul de metileno: 1/1000, 1/5000, 1/10000

Soluciones desinfectantes: Feno l0.5%, 1 % y 3%

- Soluciones de metales pesados:

Sulfato de cobre 0.5%, 1 % y 3%

Cloruro de mercurio: 0.5%, 1 % y 3%

Procedimiento

1. Colocar dos asadas de uno de los cultivos bacterianos a los tubos con los medios

licuados, mezclar bien y verter el contenido de los tubos en las placas petri. Dejar

enfriar.

2. Despus de la solidificacin del medio dividir la superficie de la placa en seis

partes iguales con un plumn marcador.

3. En condiciones aspticas, coger un disco de papel de filtro con las pinzas y

sumerja ligeramente uno de sus bordes en una de las soluciones antimicrobianas.


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Una vez que el colorante ha impregnado el disco colquelo sobre el agar en uno de

los sectores marcados.

4. Repetir el procedimiento con cada uno de los agentes antimicrobianos y los

cultivos.

5. Incubar las placas a 37 C por 24 horas. Observar los resultados.


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EXPERIMENTO

EXPERIMENTO 1. DEL CURSO DE MICROBIOLOGIA AMBIENTAL

COLUMNA DE WINOGRADSKY

Objetivo: Observar el desarrollo de un ecosistema utilizando como modelos diferentes

columnas de Winodrasky

Una columna de Winodrasky se podra representar con el siguiente esquema.

Los alumnos construirn una columna y contaran con una realizada por personal de la

ctedra.En ella podr comprender la importancia de los distintos tipos de metabolismo que

caracterizan a los microorganismos del suelo (autotrfico, litotrfico, organotrfico y

heterotrfico) y que permiten, entre otras actividades microbianas , la transformacin de

la materia orgnica. La columna de Winodrasky es un medio muy simple que se le

permitir observar el desarrollo de distintos tipos de microbios del suelo.

Esta columna permite el desarrollo de bacterias del tipo fotosinttico. La columna provee

un gradiente de oxigeno desde la superficie al fondo de la misma que junto a una fuente

de luz crea un ambiente adecuado para organismo

guía de laboratorio de microbiología 2015

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