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MANUAL DE LABORATORIO DE

MICROBIOLOGÍA TEXTO GUÍA PARA EL ALUMNO

Carrera de Medicina

MEDI 4032

UNIVERSIDAD PEDRO DE VALDIVIA

Carlos Ivovic Oddo Tecnólogo Médico

Profesor de Microbiología

FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS Manual de Laboratorio de Microbiología

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ÍNDICE DE CONTENIDOS

Tema Página UNIDAD 1: BIOSEGURIDAD Definiciones 3 Simbología 3-4 Categorías del Riesgo 5 Gestión de Riesgos 5 Normas de Bioseguridad 6 Bioseguridad en la Práctica Médica 7 Origen de las Amenazas en Bioseguridad Médica 8 Disminución de Riesgos en Bioseguridad 9 Precauciones Universales 9 Medidas de Contención 10 Bioseguridad en el Laboratorio de Microbiología 11 Niveles de Bioseguridad 11-12 Accidentes de Bioseguridad en Microbiología 13 Ejercicios de aplicación de contenidos (bioseguridad) 13-14 Actividad de laboratorio n° 1 y 2 (bioseguridad) 15-16 Desinfección y antisepsia 17-18 El efecto de los agentes químicos sobre los microrganismos 19-20 Efecto de factores físicos sobre los microrganismos: calor 21-24 Efecto de las radiaciones, Luz Ultravioleta 24-27 Efecto de las radiaciones, Radiación Gamma 27 Esterilización 28-32 Ejercicios de aplicación de contenidos (antisepsia, desinfección y esterilización) 33 Actividad de Laboratorio n°3 al 5 (aislamiento de bacterias) 34-37 Actividad de Laboratorio n°6: observación macroscópica de cultivos 38-39


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UNIDAD 1

BIOSEGURIDAD Definiciones y simbologías Podemos definir la BIOSEGURIDAD como el conjunto de las medidas, normas y procedimientos fijados por una organización para minimizar y/o controlar el riesgo de ocurrencia de un accidente con agentes biológicos. De acuerdo a esta definición, se hace necesario precisar que el RIESGO es el grado de vulnerabilidad de lo que nos interesa proteger, en otras palabras implica la existencia de una posibilidad de que le ocurra un daño a lo que debemos proteger. El riesgo de accidentes con cualquier agente (químico, físico o biológico) está siempre presente, pero se hace cuantitativamente menor o mayor dependiendo del grado de control de las circunstancias que determinan la ocurrencia del accidente. Para dar una dimensión objetiva al riesgo, podemos darle una categoría de valor bajo, medio o alto. La existencia de estos distintos agentes, o los acontecimientos que los liberan o desencadenan son llamados AMENAZAS. De acuerdo a las condiciones de ocurrencia que desencadenan a las amenazas, podemos distinguir dos clases:

1. Amenazas Dirigidas: aquellas que actúan por INTENCIÓN, es decir actos premeditados y dirigidos con el objeto de causar daño.

2. Amenazas No Dirigidas: son las que ocurren en forma aleatoria, impredecible o accidental.

El grado de daño que una determinada Amenaza es capaz de infligir sobre lo protegido puede ser categorizado (como magnitud) y medido (como probabilidad). A la asociación de estas categorías de magnitud y probabilidad la llamaremos PELIGRO. Este es el símbolo internacional que indica la existencia de un agente peligroso (amenaza), que tiene la posibilidad de causarnos daño severo o mortal. No se especifica cuál es la amenaza, pero si el nivel de daño que no puede causar. Lo podemos observar en las etiquetas de los reactivos químicos, a veces asociados a otros símbolos. Ejemplos: Cianuro de Potasio. Acetato de Talio (veneno rodenticida)

Fluoruro de Sodio (anticoagulante usado para la toma de muestras para medición de niveles de glucosa).

Oxido de Etileno (agente esterilizante). Formaldehído (agente conservador de tejidos y esterilizante).


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Los agentes que representan una amenaza para la bioseguridad se identifican internacionalmente con este símbolo, el que debe considerarse como una ADVERTENCIA: En este caso no se hace mención al nivel de peligro, por lo que el daño causado por el supuesto agente puede ser de cualquier magnitud. No se especifica el tipo de agente biológico, este puede ser una muestra para análisis de laboratorio, una sustancia contaminada con agentes biológicos, un extracto de origen biológico, un agente biológico aislado desconocido, o un agente biológico aislado. La simbología no hace distinción entre tipos de agentes: virus, bacterias, hongos, parásitos, su estado estructural ni respecto de su actividad vital. Es posible observar este símbolo en contenedores de transporte de muestras para análisis: orina, sangre, secreciones, deposiciones, biopsias o partes para estudio anatomopatológico sin tratamiento con fijadores. Contenedores con deshechos quirúrgicos, de salas de hospitalización o de laboratorios clínicos, muestras o cultivos en tránsito, partes de seres vivos o seres de naturaleza no bien comprendida deben rotularse con este símbolo, además de las etiquetas que especifiquen contenido. Existe una detallada descripción de las especificaciones aceptadas internacionalmente para el transporte de sustancias biológicas que implican riesgo de bioseguridad. En nuestro país esta actividad esta regulada por el Instituto de Salud Pública de Chile, puedes consultar la normativa vigente en www.ispch.cl/sites/default/.../normativa_Transp_Sust_Infecciosas.pdf Otros símbolos de advertencia de riesgos son:

Sustancia Inflamable Material Explosivo Sustancia Corrosiva

Sustancia Nociva, irritante Material radiactivo Sustancia dañina para el ambiente


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Categorías de Riesgo:

Una forma práctica de objetivar el nivel de riesgo y a la vez establecer un criterio común de valor entre las personas que ven expuestas a diversas amenazas es asignar categorías de riesgo.

Para categorizar el riesgo en bioseguridad (y en otros ámbitos) deben establecerse

mediante consenso valores arbitrarios para las probabilidades de que se manifiesten las amenazas presentes y los peligros latentes que éstas implican. Para esto es necesario previamente constituir grupos de profesionales idóneos y realizar un análisis de riesgo, el que arrojaría un resultado semejante a este:

Valores arbitrarios para la probabilidad de amenaza o para el daño resultante en la

exposición: 1.- amenaza insignificante, ningún daño o daño insignificante. 2.- Nivel bajo o menor. 3.- Nivel medio 4.- Nivel alto Como ahora tenemos asignados valores a las amenazas y sus correspondientes daños,

podemos asociarlos mediante una matriz de numérica, que representa una relación matemática entre el nivel de la amenaza y su daño resultante (peligrosidad)

Categoría de Riesgo: Valores 1 a 6: riesgo bajo Valores 8 a 9: riesgo medio Valores 12 a 16 riesgo alto

Una vez establecidas estas categorías es posible efectuar MANEJO O GESTION DE RIESGO a

nivel institucional.

Gestión de Riesgos:

La Gestión de Riesgos es un proceso analítico, multidisciplinario y dinámico que tiende a

conocer el estado de control de amenazas de un sistema, en otras palabras a determinar la

probabilidad de ocurrencia de daños y sus causas.

La gestión de riesgos es una de las herramientas más eficaces en la contención de

amenazas, apreciación de fortalezas y debilidades, mediadas de reducción y control de riesgos y

reducción de costos implícitos en problemas de bioseguridad. De la gestión de riesgos emana

MAGNITUD DEL DAÑO X PROBABILIDAD DE AMENAZA


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como resultado el conjunto de NORMAS DE BIOSEGURIDAD, que cada institución adopta para la

seguridad de sus profesionales (equipo médico) y trabajadores, de las personas beneficiarias de la

organización (pacientes), y del medio en el que está inserta (ambiente y sociedad).

En el proceso de Gestión de Riesgos se describen varias etapas que lo componen, y se

suceden en forma cíclica o se implementan según la necesidad:

• 1.- Evaluación del Riesgo:

- constituir el grupo de estudio

- definición de amenazas

- definición de daños por exposición a las amenazas

- definición de prioridades

- recopilación de información

• 2.- Clasificación de Riesgos según categorías.

- Asignar valores arbitrarios a las amenazas identificadas

- Asignar valores arbitrarios a los daños resultantes

- Categorizar el riesgo en alto – medio – bajo – nulo.

• 3.- Determinar medidas de reducción de riesgos

- Desplazamiento de personas

- Capacitación

- Modificación de la planta física del establecimiento

- Programas de mantenimiento

- Disposición de desechos hospitalarios

- Instalación de Servicio de esterilización

- Uso de medidas de barrera

• 4.- Control de riesgos

- Formación de Comité de Infección Intrahospitalaria

- Vigilancia epidemiológica

- Control de vectores

- Auditorías de cumplimiento de normativas

- Análisis de fallos en cumplimientos de normas.

Normas de Bioseguridad

Las Normas de Bioseguridad son el conjunto de disposiciones establecidas mediante el

proceso de Gestión de Riesgos, que tienen como finalidad PROTEGER AL INDIVIDUO, LA

COMUNIDAD Y EL AMBIENTE, del contacto con agentes biológicos potencialmente nocivos.

En general, estas normas permiten establecer mecanismos de barrera que impidan la

propagación de todo tipo de agentes biológicos en ámbitos tan diversos como la atención de

salud, la producción industrial de alimentos, medicamentos, biotecnologías, la investigación

científica o policial forense, y la protección del medio ambiente.


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Cada institución donde se manejen sustancias potencialmente infecciosas, seres vivos o

derivados de estos, es responsable de fijar sus propias normas de bioseguridad,

independientemente del deber de cumplir con las disposiciones que la Autoridad Sanitaria

determine para este efecto. En nuestro país estas normas son establecidas por el Instituto de

Salud Pública de Chile como organismo técnico del Ministerio de Salud, y el Instituto Nacional de

Normalización (INN).

Existen muchas normas de bioseguridad disponibles, algunas de alcance muy específico

relacionadas con el manejo de agentes como el Virus HANTA, Micobacterium tuberculosis, Virus

de la Inmunodeficiencia Humana (VIH), etc.

A modo de ejemplo puedes consultar el Manual de Normas de Bioseguridad de Conicyt

2008 en Investigación.uach.cl/archivos/manual_bioseguridad_2008.pdf

Bioseguridad en la práctica de la Medicina:

Los accidentes biológicos en la práctica de la Medicina tienen directa relación con la

exposición a agentes infecciosos mediante la atención de pacientes o por contacto con sus fluidos

y tejidos. Este contacto origina una contaminación que puede tener como consecuencia:

• Contagio: la instalación de agente biológico que

Implica un proceso infeccioso en el profesional

• Estado de portador sano

• Simple transmisión del agente, sea directa o indirecta

La ocurrencia de una infección por contacto accidental va a

depender de la concomitancia de varios factores, además de las medidas

de barrera que el profesional debe emplear, en esto debemos considerar

el grado de susceptibilidad del infectado, las puertas de entrada y el mecanismo de infección, la

cantidad de microrganismo infectante y sus características biológicas (mecanismos de patogenia).

El ambiente también puede condicionar la ocurrencia de la infección (humedad, ventilación,

temperatura ambiental).

Como en cualquier proceso infeccioso, ocurre una alteración del equilibrio de la Tríada

Ecológica en la que se relaciona AMBIENTE – AGENTE – HOSPEDERO.


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Origen de las Amenazas a la Bioseguridad en Medicina:

Las fuentes de amenazas en los ambientes médicos están vinculadas a acciones del público

que recibe atención, sus acompañantes, servicios de apoyo interno o externo, servicios informales,

acciones del equipo de salud y personal administrativo. La alta concurrencia al servicio hospitalario

y la gran variedad de acciones que allí se verifican especialmente cuando existe desorganización y

falta de medidas de control facilitan la ocurrencia de amenazas a la bioseguridad.

En este caso, las fuentes de amenazas podemos categorizarlas como:

• GENERADORES: Todo individuo que mediante acciones, condición

de salud, ejecutante de técnicas o misiones, puede generar,

transmitir o eliminar agentes biológicos potencialmente

peligrosos al ambiente hospitalario. Un generador puede ser

considerado además RESERVORIO de agentes infecciosos.

• TRANSMISORES: Todo individuo que forma parte de una cadena

de acciones en la que se manipulan objetos contaminados o

muestras de pacientes que pueden contener agentes infecciosos.

De esta forma, los pacientes con estados infecciosos y la disposición de residuos biológicos

representan una importante fuente de amenazas a la bioseguridad.

Entre los residuos biológicos peligrosos derivados de la atención médica destacan:

• Residuos provenientes de zonas de aislamiento.

• Cultivos de agentes infecciosos.

• Sangre humana, sus derivados y objetos que la contengan.

• Residuos orgánicos diversos (orina, deposiciones, secreciones)

• Residuos materiales contaminados provenientes de cirugía y autopsias.

• Residuos materiales contaminados de laboratorio.

• Instrumentos cortopunzantes usados.

• Residuos de unidades de diálisis.

• Cadáveres de animales de laboratorio.

• Residuos provenientes de Establecimientos geriátricos.

• Residuos Provenientes de Comunidades terapéuticas o Centros de Rehabilitación

psicofísica donde se realice el tratamiento de adicciones.

La forma adecuada de mantener estas amenazas bajo control es una adecuada Gestión de Riesgos.


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Reducción de Riesgos en Bioseguridad:

El proceso exitoso de Gestión de Riesgos debe tener como resultado la generación de

Normas de Bioseguridad y Medidas de Control. En este sentido la dirección del establecimiento de

salud, o las respectivas jefaturas de servicio pueden determinar una gran variedad de normas y

medidas destinadas a disminuir el riesgo de accidentes relacionados con la bioseguridad, como

pueden ser:

• Programas de capacitación del personal

• Vigilancia de la adecuada aplicación de técnicas médicas

• Uso de medidas de barrera

• Vigilancia epidemiológica

• Organización del desplazamiento de personas

• Programas de mantenimiento permanente de la planta física

• Gestión de Riesgos permanente

• Inmunizaciones, cuando la naturaleza del agente lo determine

• Control del estado de salud del personal médico y administrativo

• Control de manipuladores de alimentos

• Control de vectores

• CONCIENCIA DEL RIESGO Y RESPONSABILIDAD PERSONAL

La responsabilidad y el AUTOCUIDADO son los pilares fundamentales del control de riesgos

en bioseguridad. El compromiso personal de cada integrante del equipo de salud en mantener su

integridad y en observar las normas de bioseguridad es la mejor forma de garantizar la

disminución de riesgos. De lo contrario, cualquier esfuerzo en este sentido puede ser estéril.

Las medidas de autocuidado pueden verse reflejadas en documentos como las

“PRECAUCIONES UNIVERSALES” o “PRECAUCIONES STANDARD”, normas de consenso para el

trabajo con pacientes y sus fluidos corporales destinadas a minimizar el riesgo de transmisión de

infecciones entre pacientes y el personal y vice-versa, por contacto con fluidos de alto riesgo,

especialmente la sangre y sus derivados.

Se consideran fluidos de alto riesgo en bioseguridad:

• Sangre

• Semen

• Secreciones Vaginales

• Leche Materna

• Líquido de cavidades cerradas

• Líquido Cefalorraquídeo

• Líquido Pleural

• Líquido Sinovial

• Y todos los otros fluidos que tengan sangre visible


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Todas las muestras o fluidos corporales provenientes de pacientes deben considerarse

siempre como potencialmente infectantes, independiente del motivo de consulta o de diagnóstico

de ingreso, por lo que su manipulación implica la observación permanente de las Precauciones

Universales.

Puedes revisar documentos relacionados a estas Precauciones Universales en:

http://www.enfermeriajw.cl/pdf/GUIACLINICAIIHPrevenciondeExposicionesaSangreymanejoPost-

exposicion_RES_793_06_09_04.pdf

www.ssvaldivia.cl/hospital/acredita/...iih/04%20NORMA%206.doc

En todo caso, el LAVADO DE MANOS antes de la jornada,

entre pacientes, y al final de la jornada, representa el mejor

ejemplo de una efectiva y sencilla medida de barrera de transmisión

de enfermedades.

Medidas de Contención

Corresponden a la aplicación de las medidas resultantes de la etapa 3ª. Y 4ª. De la Gestión

de Riesgos, es decir las Normas de Bioseguridad y Medidas de Control mencionadas anteriormente

en la página 6.

Podemos clasificar las Medidas de Contención en dos grandes grupos dependiendo del

objetivo de aplicación:

• Medidas de Contención Primaria: están dirigidas al accionar de las personas, en

ámbitos como la protección de la salud, el manejo adecuado de pacientes y las

condiciones del ambiente de trabajo en el establecimiento de salud. En este grupo

podemos mencionar (entre otras) la acción del Comité de Infección

Intrahospitalaria, la adecuada gestión de abastecimiento en insumos de seguridad,

capacitación específica en bioseguridad, etc.

• Medidas de Contención Secundarias: están dirigidas a la protección del ambiente,

y se relacionan con el diseño y la calidad de la planta física del establecimiento, y

de la prestación de servicios externos (extracción de basuras, disposición de

residuos hospitalarios).


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Bioseguridad en el Laboratorio de Microbiología

El Laboratorio Clínico, y especialmente la Sección de Microbiología es una importante

fuente generadora de amenazas, debido a la actividad propia de esta unidad asistencial. Por esta

razón, la adecuada capacitación del personal, la descripción de métodos y procedimientos, la

auditoría de normas, los protocolos de acción frente a accidentes, y el diseño de la planta física

son de vital importancia en el control de amenazas.

Al interior de un Laboratorio de Microbiología podemos observar varias medidas de

contención primaria, como lo son:

• los insumos de seguridad personal (pecheras, guantes, antiparras, mascarillas)

• soluciones de desinfección

• contenedores de material cortopunzante

• protocolos de reacción frente a accidentes

• filtros de aire de alta eficiencia (HEPA)

• lámparas de luz UVC

• mechero

• tapas de contención de aerosoles (centrífugas)

• gabinetes de bioseguridad

o CLASE I: otorga protección para el ambiente y equipos

o CLASE II: otorga protección para el ambiente, equipos y muestras

o CLASE III: protección de alto nivel, aislamiento para el trabajo con agentes

altamente peligrosos.

Niveles de Bioseguridad en Laboratorios de Microbiología:

El conjunto de medidas de contención primarias y secundarias que se han implementado

en un Laboratorio de Microbiología determinan el NIVEL DE BIOSEGURIDAD de esta dependencia,

es decir el grado de seguridad instalada para el trabajo con agentes biológicos. A mayor peligro

representado por los agentes, mayor nivel de bioseguridad.

Podemos distinguir cuatro niveles de bioseguridad para un laboratorio de microbiología:

• NIVEL 1: Instalaciones adecuadas para trabajar con agentes no infecciosos o

que no afectan a personas adultas sanas. Corresponden a laboratorios de

docencia, laboratorios clínicos de baja complejidad o de instalaciones básicas.

Pueden manejarse microrganismos como Escherichia coli, Bacillus subtilis,

Streptococcus viridans por ejemplo.


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• NIVEL 2: Las instalaciones deben poseer gabinetes de bioseguridad de

acuerdo al tipo de agentes que se pretende manejar. Debe existir control de

acceso. Se hace necesario el

contar con protocolos y

aparatos necesarios para la

descontaminación. Corresponde

al diseño de laboratorios de

microbiología clínica o de

investigación, donde se trabaja

con muestras de origen humano,

animal o ambiental, donde es

posible manipular agentes

como Salmonella, Vibrio,

Neisseria gonorrhoeae, muestras para serología viral (Hepatitis B, VIH, Virus

Hepstein Barr).

• NIVEL 3: Estos laboratorios están preparados para el trabajo con

microrganismos transmisibles por vía aérea, y tienen potencial para causar

enfermedades graves. Las barreras de contención deben ser suficientemente

fuertes para proteger a los trabajadores al interior, en áreas contiguas, ambiente y

comunidad. Es necesaria la instalación de lámparas UVC, filtros HEPA y gabinetes

de bioseguridad clase II o III. Las instalaciones deben estar preparadas para el

trabajo con agentes como Micobacterias y Micoplasmas.

• NIVEL 4: Las instalaciones del laboratorio están preparadas para el trabajo

con agentes extremadamente peligrosos, para los que no existen tratamientos o

vacunas disponibles. Todo tipo de trabajo se realiza al interior de gabinetes de

bioseguridad de Clase III, con ropas o trajes de aislamiento. La planta física tiene

aislamiento total del ambiente y el acceso alto nivel de control. Los agentes que

allí se manejan son generalmente virales (virus de fiebres hemorrágicas).

Podemos plantear la existencia de un quinto nivel de bioseguridad para el

almacenamiento y estudio de agentes creados por la ingeniería genética, agentes biológicos

destinados a uso bélico, agentes de biología desconocida o agentes que han sido erradicados de la

vida libre, para los cuales no se han descrito tratamientos de ningún tipo y que podrían tener

efectos catastróficos en la humanidad.


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Accidentes de bioseguridad en el laboratorio de microbiología:

Los accidentes de bioseguridad que originan contaminación del ambiente o de nuestro

cuerpo pueden ocurrir generalmente por falta de conocimiento o destreza, no usar medidas de

barrera, mantenimiento deficiente de aparatos o gabinetes, falta de capacitación, y relajación en

las medidas de control.

Las vías de infección en este tipo de accidentes son por inhalación, ingestión o percutánea.

Acciones como el trabajar sin guantes al manipular muestras o cultivos, pipeterar directamente

con la boca, olfatear cultivos, no usar mechero para generar un área protegida, pasarse los

guantes usados por la piel, el pelo o la ropa, comer en el laboratorio, no lavarse las manos al

terminar la actividad, constituyen un riesgo de contaminación y eventualmente de infección con

agentes biológicos, tanto para el alumno como para la comunidad.

En el caso de ocurrir cualquiera de estos accidentes que implique contacto con agentes

biológicos, el alumno DEBE AVISAR DE INMEDIATO AL PROFESOR. NO ACTUAR POR INICIATIVA

PROPIA.

Ejercicios de Aplicación de Contenidos

1.- Un sujeto liberó el contenido de un frasco con caldo de cultivo de Vibrio cholerae en un

canal de regadío de hortalizas. Responde lo siguiente:

Señala dos amenazas evidentes en este hecho:

-

-

¿Qué clases de amenazas son, de acuerdo a los hechos?

2.- La cepa de Vibrio cholerae resultó no poseer el gen que codifica la enterotoxina. De

acuerdo a los hechos y antecedentes, asigna un valor objetivo y una categoría al riesgo (alto,

medio, bajo). Da dos fundamentos para tu respuesta:

-

-

3.- El profesor le entregó a los alumnos del ramo de microbiología unas placas de cultivo

con Escherichia coli, Streptococcus pyogenes y Neisseria meningitidis.

Averigua respecto del potencial patógeno de estos agentes y ordénalos según peligro de la

amenaza, de menor a mayor.

-

-

-


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4.- Aparte de los microrganismos, hay otras amenazas latentes en el enunciado, discútelas

con otros alumnos y responde cuáles son.

5.- ¿Cuál es la categoría de riesgo que asignarías a un grupo de escolares que tiene a un

compañero de curso con meningitis meningocócica, el que ha sido diagnosticado como caso

índice?

Anota tus fundamentos.

6.- La cepa de Neisseria meningitidis del caso anterior ha sido aislada y referida al Instituto

de Salud Pública (ISP) mediante protocolo de notificación obligatoria. ¿Cuál será la categoría de

riesgo para el microbiólogo del ISP que trabaja con esta cepa, si está en un laboratorio de Nivel III?

Dale valor numérico al riesgo y fundamenta.

7.- Averigua un poco antes de responder, luego propone un nivel de bioseguridad para

trabajar con los siguientes agentes o muestras:

- Determinación de anticuerpos anti VIH

- Urocultivo

- Micobacterium avium

- Vibrio cholerae biotipo El Tor

- Virus EBOLA

- Bacillus pumilus

- Variola virus

- Alternaria solani

8.- Hoy recibiste el honor de ser nombrado Jefe del Comité de Infección Intrahospitalaria.

La Enfermera Jefe del establecimiento te ha solicitado una medida urgente para evitar los

desplazamientos innecesarios del público dentro del establecimiento por el riesgo de introducción

de agentes infecciosos. ¿Qué medida propones, cómo la implementas? Seguramente ya estuviste

en algún hospital y viste la aplicación, trata de acordarte.

Soy una amenaza permanente, no lo olvides.


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Ejercicios de Laboratorio

Actividad n°1: El ambiente y las personas como generadores de riesgo biológico

Objetivos: Observar la existencia de agentes microbianos en el ambiente

Determinar la importancia de la manipulación en la transmisión de

agentes infecciosos

Valorar el lavado de manos como medida de barrera

Determinar la importancia de la mascarilla como medida de

barrera.

Material y Método:

36 Placas Petri con Agar Sangre en Base Columbia, mascarillas, jabón y agua.

Trabajar en tres grupos de cinco personas.

El método de trabajo es por simple exposición de material estéril o mediante contacto

con material estéril.

Grupo 1: Exponer una placa de agar al ambiente, sobre el mesón, durante diez

minutos. Colocar los dedos suavemente sobre el agar durante 30 segundos. Cerrar y

rotular.

Grupo 2: Dos alumnos deben realizar lo siguiente: manipular objetos durante tres

minutos, luego colocar suavemente los dedos sobre el agar.

En seguida, el mismo deberá lavarse las manos con el jabón disponible durante tres

minutos, luego debe dejar secar al aire. Colocar suavemente los dedos sobre el agar.

Cerrar y rotular.

Grupo 3: Un alumno deberá leer un texto en voz alta frente a una placa abierta,

durante dos minutos. Otro repetirá lo mismo utilizando mascarilla.

Cerrar y rotular.

Incubar 48 hrs a 30°C, atmósfera aerobia. Refrigerar y observar los resultados en el

paso práctico siguiente.

Discute los resultados con el profesor y tus compañeros.

Anota tus conclusiones:


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"Todo lo que aquí se hace me parece muy inútil; los fallecimientos se suceden de la forma más simple. Se continúa operando, sin embargo, sin tratar de saber verdaderamente por qué tal enfermo sucumbe antes que otros en casos idénticos".

Ignacio Felipe Semmelweis (1818 -1865)

Actividad n°2: Las manos, una eficaz forma de transmitir enfermedades.

Objetivos: Evaluar la cantidad de bacterias que portamos en nuestras manos.

Comprender el riesgo de transmisión de microrganismos mediante

manipulación.

Valorar el lavado de las manos como medida de barrera.

Material y Método:

500 mL de Caldo Peptonado estéril, envasado en recipientes de boca ancha.

Pipetas estériles

Placas Petri estériles, sin medio de cultivo

Agar Nutritivo standard, envasado en tubos para fundir.

Gradillas.

El método de trabajo consiste en obtener una muestra de un enjuague de manos y

realizar un recuento de las bacterias aeróbicas mesófilas viables, luego calcular el número

total de bacterias en la mano.

Cada grupo de cinco alumnos trabaja de la siguiente forma:

1. Introducir toda la mano en el recipiente de Caldo

Peptonado estéril, realizar fricción con los dedos durante 1 minuto. Retirar

la mano y dejar esta preparación en reposo por 10 minutos al ambiente,

con el recipiente tapado.

2. Fundir dos tubos con Agar Nutritivo Standard en un

vaso de pp. con agua corriente mediante ebullición. Una vez fundido,

retirar del calor y esperar a que se tempere a la temperatura que soporta

la mano (40° a 45°C).

3. Con una pipeta estéril, tomar una muestra de 0,5 mL

del Caldo Peptonado en que hicimos el lavado de manos, y colocarlo en el

centro de la placa de Petri. Repite en otra placa.

4. Agregar cuidadosamente a las dos placas el Agar

Nutritivo fundido y mezclar con las muestras mediante movimientos

rotarios suaves. Dejar solidificar en la superficie del mesón sin mover.

5. Una vez sólido rotular e incubar por 48 hrs. a

temperatura ambiente. Refrigerar hasta el paso práctico siguiente.

6. Con un lápiz marcador permanente, dividir las placas

en cuatro cuadrantes por el lado del agar. Contar el número de colonias

presentes en todos los cuadrantes. Cuenta la otra placa y promedia. Esto

representa la cantidad de bacterias vivas en la muestra de 0,5 mL.

7. Calcula ahora la cantidad de bacterias en la mano, plantea una fórmula

matemática de estimación del total y discútela con tus compañeros.

8. Registra tus resultados, plantea un debate con estas observaciones.


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Desinfección y Antisepsia

Bien lo estableció Ignacio Semmelwies (1818-1865) al observar que el uso de ciertos

agentes químicos para sanitizar las manos podía reducir las tasas de infecciones asociadas a la

atención médica, en tanto que Joseph Lister (1827-1912) demuestra que el tratamiento térmico

aplicado a instrumentales es una medida eficaz para disminuir las infecciones post quirúrgicas. En

esta época, Louis Pasteur (1822-1895) recién está demostrando la presencia de microrganismos en

el ambiente, capaces de producir putrefacción y asociándolos a la ocurrencia de enfermedades

infecciosas.

Queda claro entonces, que la acción de agentes físicos y químicos es útil en la contención

de las enfermedades infecciosas. De esta afirmación se desprenden los conceptos de

DESINFECCION Y ANTISEPSIA.

Llamaremos DESINFECCIÓN a la simple descontaminación de un objeto o superficie de

algo, de la que eliminaremos casi todas las formas vegetativas. Es importante recordar que

pueden existir microrganismos con diversos grados de resistencia a los agentes químicos

empleados, que el efecto de estos dependerá de factores como la concentración, el tiempo de

exposición, la naturaleza química del agente, la temperatura, y finalmente la existencia de

mecanismos de latencia en los microrganismos (esporas bacterianas).

ANTISEPSIA son todos los procedimientos encaminados a reducir al máximo la presencia

de microrganismos sobre los tejidos vivos (piel, algunas mucosas) que están en contacto con el

ambiente, aplicando métodos físicos o químicos. El propósito de la antisepsia es conseguir la

ASEPSIA, o ausencia de microrganismos.

Los métodos físicos o químicos empleados para la desinfección y antisepsia tienen

diferencias fundamentales: el daño estructural (en los métodos físicos) y la toxicidad (en los

métodos químicos). Un antiséptico no debe ser tóxico ni dañar la integridad de los tejidos.

Los efectos de los Desinfectantes y Antisépticos pueden ser de dos tipos:

• Bacteriostáticos: si sólo detienen la proliferación microbiana,

• Bactericidas: si producen la muerte de los microrganismos.

De acuerdo a los efectos observados, podemos clasificar a estos agentes químicos como de ALTO

NIVEL, NIVEL INTERMEDIO O BAJO NIVEL.


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Los microrganismos presentan distintos grados de resistencia a estos agentes, siendo los

más resistentes Priones y los más susceptibles Virus con manto o envoltura.

El efecto de cualquier

antiséptico o desinfectante puede

verse alterado por la presencia de

suciedad o restos orgánicos. Es

imprescindible retirar todo exceso

de suciedad antes de la aplicación.

La persistencia de tierra,

restos de alimentos, sangre, pus,

secreciones puede implicar el

aumento de la concentración o del

tiempo de exposición al agente

químico.

La elección del desinfectante a usar tiene relación con el objeto que nos interesa

tratar. Existe una categorización de los objetos de uso clínico de acuerdo al riesgo de transmitir

una infección mediante su uso.

El efecto desinfectante

deberá ser mayor cuando se aplique a

objetos críticos, al punto de lograr la

esterilización.

Los agentes químicos

Que pueden ser usados con efecto

esterilizante sobre objetos críticos son

por ejemplo:

GLUTARALDEHIDO AL 2%

GAS OXIDO DE ETILENO

PEROXIDO DE HIDROGENO

ACIDO PER ACETICO AL 2%

El uso de los materiales tratados con estos agentes químicos no puede ser

inmediato debido a su elevada toxicidad, por lo que el proceso de preparación considera un

tiempo de disipación.


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El efecto de los agentes químicos sobre los microrganismos:

Los agentes químicos empleados con fines de desinfección y antisepsia, como también los

empleados con fines terapéuticos (antimicrobianos), actúan sobre los micro organismos con la

finalidad de producir una disminución de la carga bacteriana mediante la eliminación de las formas

vegetativas (bactericidas), impidiendo la multiplicación bacteriana (bacteriostáticos) o

definitivamente eliminando toda tipo de forma de vida microbiana (esterilizantes).

El efecto bactericida, bacteriostático o esterilizante dependerá de los siguientes factores:

• Tipo de agente químico empleado:

o Alcoholes: etanol o isopropanol al 70%

o Alquilantes: Formaldehído, óxido de etileno

o Halogenantes: Hipoclorito, Yoduros

o Surfactantes: compuestos de amonio cuaternario, jabones, triclosán.

o Oxidantes: óxido de etileno, peróxido de hidrógeno, ácido peracético.

o Compuestos fenólicos:

Hexaclorofeno, Clorhexidina.

• Concentración y Tiempo de acción:

o La eficacia de un agente químico

aumenta con la concentración y el

tiempo de exposición.

• Naturaleza del microrganismo:

o Los virus sin envoltura son más resistentes que los con envoltura.

o Los micro organismos Gram negativos tienden a ser más resistentes que

los Gram positivos a los agentes químicos,

o Son especialmente resistentes las bacterias que forman endosporas.

o A mayor cantidad de micro organismo, mayor necesidad de concentración

o tiempo de exposición del agente químico.

• Objeto u objetivo de aplicación:

o Los desinfectantes se pueden aplicar sobre objetos o superficies

inanimadas, la concentración y el tiempo de exposición dependerán de la

resistencia al efecto corrosivo.

o Los antisépticos son por definición de baja toxicidad, y se aplican sobre

tejidos vivos (piel y algunas mucosas) en concentraciones bajas y por

tiempo limitado.


20

• Temperatura de aplicación

o En general, los efectos sobre una población microbiana aumenta con la

temperatura

• pH de la solución

o El pH adecuado dependerá de la naturaleza aniónica o catiónica del

agente químico. En general, el efecto del pH se relaciona con la capacidad

de ionización tanto del agente químico como de las envolturas celulares

de los micro organismos, por facilitación del transporte de iones en

solución acuosa a través de las estructuras de envoltura.

• Presencia de sustancias interferentes:

o Los desinfectantes pueden perder su eficacia por contacto con materia

orgánica contaminante: sangre, secreciones, deposiciones, restos de

alimentos, óxidos.

o Los antisépticos también pierden eficacia si se aplican sobre la piel sucia.

Los efectos de estos agentes químicos se verifican sobre las estructuras de las proteínas

funcionales y estructurales de los microrganismos, y sobre los ácidos nucleicos. Lo anterior implica

alteraciones en la función metabólica, en la estructura y permeabilidad de la membrana celular, y

en la replicación del material genético.

De acuerdo a su eficacia,

podemos categorizar a estos

agentes químicos en tres niveles de

acción.

Los agentes de bajo nivel

tienen efecto limitado, y no

garantizan una adecuada

sanitización. Pueden encontrarse al

alcance del público como jabones o

soluciones germicidas de venta

libre.

Los agentes de nivel intermedio tienen mejor efecto, pero no logran la eliminación de

esporas. Se encuentran en este grupo a los alcoholes, los derivados fenólicos, los halogenantes

como el cloro y yodo, y el peróxido de hidrógeno en baja concentración.

Los agentes químicos de alto nivel son muy tóxicos, por lo que no se usan como

antisépticos sino como desinfectantes o esterilizantes dependiendo de su concentración o

toxicidad. En este grupo podemos citar al glutaraldehido, ácido peracético, óxido de etileno,

plasma de peróxido de hidrógeno.


21

Efectos de factores de orden físico sobre los microrganismos

La actividad biológica también puede verse alterada por efecto de factores de orden físico.

La simple acción mecánica de arrastre, la abrasión, la desecación y el efecto de la luz solar actúan

en forma natural sobre los microrganismos.

No obstante lo anterior, la humanidad ha desarrollado tecnologías que permiten manejar

los factores físicos para aprovecharlos con el objeto de descontaminar y esterilizar. En este

sentido, son conocidas las aplicaciones de temperaturas (especialmente calor), presión y

radiaciones (luz ultravioleta de onda corta, radiación gamma).

Los factores de orden físico tienen los siguientes efectos sobre los microrganismos:

1.- Efecto de la temperatura:

El frío por lo general tiene efecto bacteriostático, por lo que muchas bacterias pueden

recuperar su actividad si se les regresa a su temperatura vital óptima. En muchas de las especies

bacterianas se observa alguna capacidad de tolerar el congelamiento, resistiendo a la formación

de cristales de hielo en el citoplasma. Esta capacidad de resistencia aumenta cuando estos

organismos se encuentran en un medio rico en proteínas o carbohidratos.

Por el contrario, los efectos del calor pueden ser bactericidas ya que se verifican sobre las

proteínas estructurales o funcionales de los microrganismos. En la medida que aumentamos la

exposición al calor por sobre los rangos de tolerancia vital de una especie bacteriana, comienza a

ocurrir alteración irreversible de la arquitectura proteica, lo que implica un colapso estructural y

funcional. En las bacterias de importancia médica las formas vegetativas, es decir, las que son

aptas para el metabolismo y reproducción resultan destruidas con la exposición a temperaturas

“Caballeros, yo pudiera señalar a ese líquido [estéril] y decirles: He tomado mi

gota de agua de la inmensidad de la creación, y la he tomado llena de los

elementos convenientes para el desarrollo de seres inferiores. Y espero, observo,

inquiero de ella, suplicándole que comience de nuevo para mí el hermoso

espectáculo de la primera creación. Pero está muda... muda desde el mismo

comienzo de estos experimentos hace varios años; está muda porque la he

mantenido alejada de la única cosa que el hombre no puede producir —de los

gérmenes que se alimentan en el aire— de la vida, porque la vida es un germen y

un germen es vida. Nunca se recobrará la doctrina de la generación espontánea

del golpe mortal de este sencillo experimento.”

Louis Pasteur. 1822Louis Pasteur. 1822Louis Pasteur. 1822Louis Pasteur. 1822----1895189518951895


22

cercanas al punto de ebullición del agua, condición que solo pueden resistir las esporas

bacterianas.

Efecto del aumento de la temperatura sobre una

población bacteriana.

El aumento de la temperatura por sobre el óptimo

necesario para actividad vital (rango térmico)

conduce a un rápido colapso biológico.

Diferentes bacterias a distintas temperaturas:

A través de la evolución las bacterias han desarrollado adaptaciones para la vida a diversas

temperaturas, por lo que podemos clasificarlas como:

• Bacterias mésófilas, si su actividad vital se desarrolla a temperaturas entre 25° y

45°C, lo que incluye a las patógenas para el ser humano.

• Bacterias psicrófilas, si mantienen actividad entre los 0° y 20°C. En este grupo se

encuentran microrganismos capaces de descomponer alimentos durante la

refrigeración. Algunos patógenos mesófilos pueden tolerar este rango de

temperatura (Staphylococcus aureus y Listeria monocytogenes). Un subgrupo

capaz de tolerar temperaturas algo mas altas son denominadas psicrotrofas.

• Bacterias termófilas, si viven entre 50° y 70°C. Un subgrupo denominado

hipertermófilas es capaz de sobrevivir a temperaturas tan altas como 70° a 110°C.

De acuerdo a esta clasificación, cada especie bacteriana es capaz de vivir en un margen de

temperatura denominado RANGO TÉRMICO, que tiene una amplitud cercana a 35°C.

Margen de crecimiento para distintos

grupos bacterianos

En Staphylococcus aureus y Listeria

monocytogenes estos márgenes tienen

mayor amplitud.


23

El tiempo en el que se verifica el efecto letal del calor sobre una población bacteriana

tiene relación inversa con la cantidad de calor aplicada. En otras palabras, para un efecto más

rápido se requiere mayor temperatura.

A este valor de tiempo se le llama TIEMPO DE

REDUCCIÓN DECIMAL (D), y corresponde al tiempo

necesario para dejar solo el 10% de sobrevivientes de

una especie bacteriana al aplicarle un tratamiento

bactericida físico o químico.

En este gráfico, para una especie bacteriana “x”,

se logra dejar el 10% viable en 12 minutos a 60°C. Si se

continúa a la misma temperatura, el 0,1% sobrevive a

los 40 minutos.

Si fijamos la temperatura, el valor D es dependiente de la especie bacteriana: Si tratamos

a una especie bacteriana “x” a 60°C obtenemos un valor D de 12 minutos, si aplico el mismo

tratamiento a la bacteria “y” puedo obtener un valor D diferente.

Esto introduce dos nuevas definiciones:

TIEMPO TÉRMICO MORTAL, que es el tiempo mínimo necesario para inactivar el 100% de

una población bacteriana dada a una temperatura constante.

PUNTO TÉRMICO MORTAL, que es la temperatura mínima necesaria para inactivar

totalmente una población bacteriana en un tiempo fijo de 10 minutos.

Con estos tres conceptos se definen las condiciones ideales para la esterilización mediante

calor, o del tratamiento de alimentos para la máxima reducción de la carga bacteriana sin

alteración de sus propiedades.

Si nos fijamos en el cuadro anterior, existen especies bacterianas que requieren

tratamientos térmicos por sobre la temperatura de ebullición del agua, ya que poseen esporas. La

mejor forma de lograr el efecto de inactivación de estos microrganismos sin alterar los materiales

es combinar calor, agua y presión, en un sistema cerrado y controlado que conocemos como

AUTOCLAVE.


24

La aplicación calor y vapor bajo

presión realizada en el autoclave es uno

de los procedimientos de esterilización

más utilizados en la preparación de

materiales para la medicina, ya que

asegura en forma eficiente la eliminación

de formas vegetativas y de resistencia

(esporas) de todo tipo de microrganismos,

a la vez que destruye virus y priones.

Este proceso es fácil de controlar, es rápido

y eficaz.

Esporas de Bacillus anthracis, Tinción de Gram 1500x

En general, los materiales a tratar mediante autoclavado se exponen durante 15 minutos a

121°C, sin embargo este standard puede variar en función del volumen de materiales a tratar o de

la naturaleza de estos, de modo que siempre se debe considerar el tiempo necesario para que el

núcleo de los paquetes de materiales alcance la exposición necesaria, o para que los agentes

microbianos alcancen el tiempo térmico mortal.

2.- Efectos de las radiaciones:

La radiación es una propagación de energía en forma de ondas electromagnéticas de

distinta longitud. Llamaremos longitud de onda λ a la distancia que hay entre dos puntos máximos

o mínimos de ella (ver figura). De acuerdo a las distintas longitudes de onda de las radiaciones,

estas se agrupan en el ESPECTRO ELECTROMAGNETICO de emisión/absorción.

En este ordenamiento podemos situar en

el extremo de ondas más largas a la

radiación infrarroja caracterizada por la

emisión de calor, y en el

extremo de ondas más cortas a los rayos

cósmicos. Entre este amplio rango de

frecuencias podemos encontrar a la luz

visible, los rayos X y los rayos gamma.


25

Amplitud del espectro electromagnético

La aplicación de calor con fines bactericidas es esencialmente una forma de aplicación de

radiación, no obstante tenemos otras alternativas de aplicaciones bactericidas de las ondas

electromagnéticas, tales como la luz ultravioleta (UV) de onda corta (Luz UVC) y la radiación

gamma.

La cantidad de energía transmitida por la onda es directamente proporcional a su longitud,

y esta cantidad de energía es capaz de producir cambios en los cuerpos que la absorben. De esta

forma, las ondas de baja energía como la luz visible y UV provocan cambios químicos NO

IONIZANTES. En la medida que aumentamos la energía en la radiación esta se hace más

penetrante y los efectos se tornan IONIZANTES, capaces de causar la muerte celular.

La Luz Ultravioleta (UV):

Con una longitud de onda un poco más corta que la luz visible, se sitúa en este espectro a

la luz ultravioleta (UV). Todos hemos sentido los efectos de la luz UV de onda larga UVA cuando

nuestra piel se expone a la luz solar y se broncea; con algo más de energía la luz UVB la exposición

prolongada es capaz de causarnos daño en la piel, y eventualmente alteraciones celulares.

Afortunadamente la atmósfera con su capa de ozono nos protege de los mortales rayos de la luz

UVC que proviene del sol, ya que estos poseen una mayor capacidad de penetración y de daño por

ionización.

Todos los compuestos químicos tienen la propiedad de absorber energía en forma de

alguna determinada longitud de onda relacionada con su estructura molecular. Este principio

permite utilizar a la luz UVC con fines bactericidas debido a que la longitud de onda de esta luz


26

(283 a 200 nm) es coincidente con el máximo de absorción de la molécula de ADN y ARN (260 nm)

y con los máximos de absorción de las proteínas (280 y 230 nm).

Los fotones de alta energía emitidos por una

fuente de luz UVC son capaces de romper enlaces de

las bases nitrogenadas pirimídicas (Citosina C, y Timina

T) del ADN bacteriano, generando FOTOPRODUCTOS

químicos que imposibilitan la correcta replicación o

transcripción de la información genética, por ejemplo,

dímeros anómalos de T-T o C-C.

En las proteínas, estos fotoproductos se originan por la alteración de aminoácidos

aromáticos (Triptofano, fenilalanina, tirosina), o por ruptura de los enlaces peptídicos. Ambos

efectos causan alteraciones de la estructura y funcionalidad proteica.

De esta forma, la energía de los fotones UVC causa efectos mutagénicos secundarios o

efectos letales por inactivación del material genético. A pesar de esto, existen bacterias con la

capacidad de reparar los efectos de la luz UVC mediante mecanismos enzimáticos inducibles.

Aplicaciones de la Luz UVC:

La luz UVC tiene aplicaciones bactericidas eficaces en la esterilización del aire, agua y

superficies, siempre y cuando la dosis de energía que reciben las bacterias sea la adecuada.

Debemos recordar que la cantidad de energía disminuye con respecto al cuadrado de la distancia

de la fuente de emisión, y que la cantidad de energía emitida depende de la potencia de la fuente.

Una lámpara UVC de Hg de 40 W de potencia es eficaz a un metro de distancia, en tiempos de

exposición de segundos, inactivando cerca del 99% de las formas vegetativas bacterianas.

Dosis de energía de Luz UVC para efecto letal en algunos agentes infecciosos

Microorganismo Dosis letal en µW/cm²

Esporas de Bacillus subtilis 22.000

Legionella pneumophyla 12.300

Virus de la Hepatitis A 8.000

Salmonella typhi 7.000

Staphylococcus aureus 6.600

Escherichia coli 6.600

Virus de la Influenza 6.600

Streptococcus sp. 3.800

Podemos instalar una fuente de emisión de luz UVC asociada a sistemas de purificación de

agua, o de purificación de aire filtrado o acondicionado, como medida de barrera para mejorar la

calidad sanitaria del ambiente. Ejemplo de esto es la aplicación de luz UVC para la inactivación de


27

Legionella pneumophila en sistemas de acondicionamiento de aire, ya que este patógeno tiene

como reservorio el agua de condensación que se forma en estos equipos.

La luz UVC es invisible al ojo humano, las

fuentes de emisión UVC se ven iluminadas

con una luz celeste a o “luz parásita” de

mayor λ que corresponde a solo el 2 a 5%

de la emisión.

Por lo anterior, las fuentes de emisión UVC

son peligrosas, capaces de provocar

quemaduras en la piel y daño irreversible

en los ojos.

La Radiación Gamma:

La radiación gamma es un tipo de energía electromagnética caracterizada por la emisión

de fotones producto de la desintegración de elementos radiactivos (isotopos) como Co60 y Cs137.

Esta radiación es muy penetrante debido a su alto nivel de energía, y sus efectos son IONIZANTES.

La radiación gamma realiza su acción mediante el choque de los fotones de alta energía

con los átomos del material que los recibe.

Los efectos de la ionización de la radiación gamma pueden alterar significativamente el

material genético, causando la muerte celular. Estos efectos pueden ser de tres tipos:

• Efecto letal directo: ruptura de enlaces de bases nitrogenadas y entrecruzamiento

de las hebras de ADN. Ocurre con exposición a altas dosis de radiación.

• Efecto letal indirecto, por ionización de las moléculas de agua (radiolisis del agua).

Este efecto libera grandes cantidades de H+ y grupos hidroxilo OH-. Los radicales

OH- pueden combinarse con el ADN o con el oxígeno libre para generar peróxidos

(H2O2) que actúan oxidando los componentes de la estructura bacteriana.

• Efecto mutagénico: causado por dosis menores de radiación, genera alteraciones

en el ordenamiento del ADN bacteriano y originando replicaciones y

transcripciones alteradas.

Los efectos serán mayores dependiendo del aumento de la dosis de radiación. La radiación

absorbida se mide en unidades RADS o Gigaray (Gy). La capacidad de las bacterias para soportar la

radiación puede ser muy variable, pero bastante mayor que la del ser humano. La dosis letal de

radiación para un humano adulto es cercana a los 10 Gy, en tanto que para las bacterias varía

entre 200 Gy y 3000 Gy. Existen especies bacterianas capaces de soportar niveles de radiación de

5000 o más Gy (5000 Gy es 5 kGy).

Equipo de aire acondicionado con trampa de Luz UVC


28

Esterilización:

Como ya hemos visto, existen varios procesos que pueden afectar la viabilidad de los

microrganismos. Podemos distinguir aquellos destinados a disminuir la carga microbiana como lo

son la desinfección o antisepsia si es por métodos químicos, y la pasteurización si es por métodos

físicos mediante tratamiento térmico. La esterilización en cambio tiene efectos letales sobre toda

forma de vida.

Se entiende por esterilización todos los procesos físicos, químicos (o combinaciones de

éstos) que tienen como propósito erradicar toda forma de vida, incluyendo esporas, virus y

priones. La esterilización es esencialmente un concepto radical.

Cualquiera sea el proceso que elijamos para tratar nuestros materiales, debe tener como

requisito la eliminación de las formas más resistentes de vida (ver pgs. 18-23-27), sin alterar la

estructura o las propiedades de los materiales. Por lo tanto, la esterilización es el RESULTADO

FINAL DEL PROCESO, y no la mera exposición a los agentes químicos o físicos. En este proceso se

cuentan además una serie de etapas previas tendientes a asegurar el éxito, tales como

descontaminación, inspección, preparación y empaque de materiales, exposición al proceso,

almacenaje y despacho de estos.

Procesos químicos de esterilización:

Consisten en la aplicación de agentes químicos como gas Oxido de etileno (ETO), vapores

de formaldehido, o gas-plasma de peróxido de hidrógeno asociados a bajas temperaturas (50°a

60°C) en una cámara de tratamiento de control automático. Los objetos a tratar son plásticos con

capacidad de resistir algo de temperatura, látex, gomas o polímeros, o instrumentos sensibles a

altas temperaturas y humedad. Ejemplos de materiales a tratar son: sondas, endoscopios diversos.

Parámetros de esterilización para Gas de ETO:

Temperatura Tiempo una vez alcanzada la temperatura, humedad sobre el 40% y presión del gas entre 450 y 740 mg./lt.

35°C 5 hrs. 55°C 2,5 hrs.

Algunos agentes químicos pueden aplicarse como solución. El glutaraldehido al 2%

aplicado durante 20 a 30 minutos y el ácido peracético al 0.2% durante 15 minutos a 55°C, luego

de enjuagado con agua estéril permite la esterilización de plásticos y gomas termosensibles, y

metales sensibles al calor.


29

Procesos físicos de esterilización:

Estos procesos emplean factores como la exposición a calor o radiaciones.

Destaca en este tipo de procesos el AUTOCLAVADO, tratamiento de materiales resistentes

al calor mediante la exposición a vapor a alta presión. Los materiales que pueden someterse a este

proceso son por ejemplo: ropas, gasas, vendas, plásticos resistentes al calor, instrumental

quirúrgico, vidrio, y algunas soluciones.

El standard de tratamiento es de 15 minutos a 121°C, pero puede variar en función de la

carga de materiales en el autoclave, de la naturaleza de éstos y del tamaño de los paquetes. Un

paquete de gran volumen requiere mayor tiempo de exposición para lograr que el núcleo del

material alcance la temperatura durante el tiempo necesario. Es posible reducir el tiempo de

tratamiento aumentando la temperatura en el proceso. Observa la tabla siguiente, que relaciona

tiempo, temperatura y presión:

Tiempo desde que alcanza temperatura y presión

Temperatura Presión

15 minutos 121°C 1,5 Atm. 10 minutos 126°C 2,0 Atm. 3 minutos 134°C 2,9 Atm.

En la siguiente tabla podrás observar distintas modalidades de procesos de esterilización:

Material

Método de

esterilización

Parámetros de esterilización

Consideraciones

Líquidos Autoclave 134 o 135° C Equipo con ciclo de líquidos Algodones Autoclave 134 o 135° C Artículos de goma o látex Algodón y gasas

Autoclave Autoclave

121°C 134 o 135° C

Siliconas Autoclave 121°C Plásticos Oxido de etileno

Plasma Formaldehído Formaldehído

37° - 55°C 50°C 50 – 60°C

Acero inoxidable Autoclave Estufa por calor seco

134 o 135°C 180°C

Aluminio Autoclave Estufa por calor seco

134 o 135°C 180°C

Maderas Autoclave 134 o 135°C Vidrios Autoclave 134°C Estufa por calor seco 160 – 180°C Aceites y petrolatos

Estufa a calor seco 180°C De preferencia utilizar soluciones estériles de fábrica


30

La esterilización mediante vapor a alta presión es un proceso seguro y rápido, que además

implica menor consumo de energía.

Otra alternativa de tratamiento térmico para lograr la esterilización es la exposición a calor

seco, para lo que se utiliza el equipo comúnmente conocido como PUPINEL, que puede funcionar

mediante convección de aire caliente, sea de tipo gravitatoria o mecánica. En este tipo de equipo,

el standard de aplicación del proceso consiste en elevar la temperatura de la cámara hasta 180°C,

luego un período de exposición mínimo de 30 minutos y finalmente un tiempo de enfriado. Con

todo, este proceso puede tener un ciclo total de unas tres horas y consume gran cantidad de

energía eléctrica. Igualmente, el tiempo de exposición es dependiente de la temperatura:

Temperatura

Tiempo desde que se alcanza la temperatura

180ºC 30 minutos 170ºC 60 minutos

160ºC 120 minutos 150ºC 150 minutos 140ºC 180 minutos

121ºC 360 minutos Los materiales que pueden esterilizarse mediante calor seco son polvos (talco), aceites,

petrolato, vaselina, los que no son aptos para tratamiento en autoclave. Este tipo de tratamiento

daña el templado del acero quirúrgico y puede provocar carbonización en textiles.

Control de los procesos y aseguramiento de calidad:

Desde el punto de vista de la bioseguridad, los procesos de esterilización deben ser sujetos

de certificación. Esta condición implica poder auditar y trazar toda la aplicación del proceso, desde

la recepción de los materiales hasta el usuario final, de modo de poder garantizar la inocuidad de

los materiales sometidos a esterilización.

Para efecto del control del proceso, se aplican INDICADORES DE ESTERILIZACIÓN:

Indicadores Físicos En cada ciclo de Esterilización

Indicadores Químicos En cada paquete a esterilizar. Indicadores Biológicos

1.- Semanal en todos los equipos de esterilización 2.- En todas las cargas que contienen implantes 3.- Después de cada reparación del equipo

Los indicadores físicos son los manómetros, termómetros, higrómetros y registros

emanados de los equipos, y no están a la vista del usuario final de los materiales.


31

Los Indicadores químicos pueden observarse en todos los paquetes de materiales

sometidos a esterilización, deben estar siempre a la vista del usuario quién debe observar el viraje

del indicador a modo de control visual.

Estos indicadores son sustancias que

cambiarán de color cuando se alcance la

temperatura de tratamiento, o la concentración

del agente esterilizante. En ningún caso garantizan

el cumplimiento del proceso completo.

Los indicadores biológicos son la garantía más segura

de la eficacia del proceso, ya que consisten en dispositivos que

contienen bacterias vivas seleccionadas para el control de

esterilización, las que deben resultar inactivadas. El usuario de

materiales estériles no tendrá a la vista este tipo de controles,

pero puede consultar la validación del proceso mediante certificados.

Como conducta segura antes de utilizar un material supuestamente estéril, debemos

observar que el envoltorio (envase) esté siempre indemne, que tenga la fecha de aplicación del

proceso y de vencimiento, y que el viraje de los indicadores químicos sea categórico.

Ernst von Bergmann (1836 -1907)

En 1896, el cirujano alemán Ernst von

Bergmann, creador del concepto de asepsia

quirúrgica, introduce el uso del autoclave,

aparato que utilizó en forma permanente para

aplicar calor bajo presión en el tratamiento de

la ropa para cirugía.


32

Elección del proceso adecuado:

Como hemos visto, existe una gran variedad de procesos posibles para lograr la

esterilización, la elección del más adecuado dependerá del tipo de materiales a tratar, de la

toxicidad residual, de la eficacia del proceso y de la economía de su aplicación. A modo de guía

comparativa puedes observar la siguiente tabla (se excluye la radiación ionizante):

Ventajas y limitaciones de los distintos métodos de esterilización Método Ventajas Limitaciones Autoclave a vapor Ciclos más cortos.

Menor costo de operación. Efectivo frente a la eliminación de priones. No presenta toxicidad para el personal ni para el ambiente. Certificable.

Método no compatible con Material termosensible. No elimina pirógenos. No esteriliza sustancias oleosas ni polvos.

Calor seco Equipamiento de menor costo que el autoclave Facilidad de operación de los equipos

Daño del material por exposición a temperaturas elevadas. Tiempos de exposición prolongados en comparación con la esterilización a vapor. Dificultad en la certificación del método. Costos de operación elevados. No hay información respecto a su efectividad contra priones

Oxido de etileno Permite la esterilización de material termosensible Certificable Buena penetración

Requieren períodos prolongados de proceso y aireación. No es un método efectivo contra priones Tóxico para el personal, pacientes y ambiente

Plasma Baja temperatura. Ciclos de corta duración. No tóxico para las personas ni para el ambiente. No requiere instalaciones especiales

Incompatibilidad con algunos materiales. Controversia respecto a su utilización en artículos con lúmenes largos entre 1 y 2 mt. y angostos (entre 1 y 3mm). No elimina priones

Acido peracético líquido

Rápido Efectivo en la esterilización de endoscopios y laparoscopios Equipo automático estandarizado No contamina al medio ambiente

Sólo puede ser utilizado para material sumergible Esteriliza un solo contenedor por ciclo por lo que no puede ser utilizado para cantidades mayores de material No elimina priones Debe ser utilizado en forma inmediata

Formaldehído Baja temperatura. Ciclos de corta duración. Certificable

Incompatibilidad con algunos materiales. Método no aprobado para su utilización en USA No elimina priones


33

Puedes obtener mayor información en:

www.enfermeraspabellonyesterilizacion.cl/trabajos/plasma .pdf juridico1.minsal.cl/RESOLUCION_1665_01.doc

Ejercicios de Aplicación de Contenidos

1.- Si para el lavado de manos usas un jabón germicida con amonio cuaternario, ¿Qué nivel

de acción germicida tiene?

2.- Dado el uso médico del objeto y su riesgo de transmitir agentes infecciosos, ¿Cómo

clasificas a un termómetro?, ¿Cómo lo desinfectas?

3.- ¿Qué agente químico utilizarías para desinfectar un endoscopio?, ¿Qué nivel de

desinfección debe obtenerse?

4.- Un trabajador agrícola debe someterse a hidratación parenteral urgente. ¿Cuál sería la

secuencia de acciones más correcta al instalar el tratamiento? Nombra los agentes químicos a

usar.

5.- ¿Qué precauciones deben tomarse antes de usar objetos esterilizados con óxido de

etileno?

6.- ¿Qué método de esterilización físico es adecuado aplicar a materiales plásticos

sensibles al calor?

7.- En un evento de intoxicación alimentaria se determinó la presencia de Staphylococcus

aureus en una partida de queso que se mantenía en una vitrina refrigerada de un supermercado.

Si la cadena de frio es adecuada, ¿Cuál puede ser el “generador” o reservorio en este evento?,

¿Qué características especiales tiene Staphylococcus aureus?

8.- Describe por qué razón el tratamiento standard de esterilización por vapor bajo presión

considera una exposición de materiales durante 15 minutos a 121°C y 15 lb de presión.

9.- Explica como la acción de los rayos gamma sobre las moléculas de agua afecta

indirectamente a las bacterias.

10.- Explica cuál sería tu método de elección para la esterilización de ropa quirúrgica de

algodón.


34


Actividad n°3: Aislamiento de bacterias a partir de muestras médicas I.

Objetivos: Practicar la toma de muestra faríngea.

Practicar la metodología de siembra de muestras microbiológicas

en medios de cultivo sólidos.

Reconocer materiales y estrategias de cultivo.

Practicar juego de roles médico – paciente.

Materiales y método: Toma de muestras y siembra de secreción faríngea sobre Agar

Sangre en base Columbia.

Disponer de tórulas estériles para toma de muestras, baja lenguas,

guantes, portaobjetos, placas de agar sangre Columbia.

Formar un grupo de trabajo de cinco alumnos.

Toma de muestras: Explique a su paciente que procedimiento le va a hacer. Use

guantes.

Pídale que abra bien la cavidad bucal y saque la lengua.

Deprima la lengua con un baja lenguas y observe el estado de la

cavidad oro faríngea. Busque sitios con signos inflamatorios o la

presencia de pus, especialmente cerca de las amígdalas.

Mientras mantiene la boca abierta y la lengua deprimida, con una

tórula estéril tome una muestra de secreción faríngea en forma

rápida y precisa, sin dañar a su paciente. El procedimiento puede

ser algo molesto.

Siembra: Disponga de una placa de Agar Sangre Columbia y rote la tórula en

un punto periférico. Luego dibuje una estría sobre el agar con la

misma tórula. Descarte la tórula en un recipiente con solución

clorada. Identifique la siembra con el nombre de su paciente y

luego incube a 35 a 37°C por 24 horas.

Observe el desarrollo de distintas colonias bacterianas, ponga

atención a los efectos del desarrollo bacteriano sobre la sangre.

Examen directo: Este procedimiento es parte integral del examen microbiológico de

la faringe y es de mucha utilidad, ya que le permitirá mediante Tinción de Gram y evaluar

el estado inflamatorio y la presencia de bacterias patógenas. Tome otra muestra faríngea

de acuerdo a lo descrito y colóquela en el centro de un portaobjetos limpio, mediante

rotación suave. Reserve para realizar la actividad n° 7.


35


Actividad n°4: Aislamiento de bacterias a partir de muestras médicas II.

Objetivos: Practicar la metodología de siembra de muestras microbiológicas

en medios de cultivo sólidos.


Practicar juego de roles médico – paciente.

Intentar el diagnóstico del estado de portador nasal de

Staphylococcus aureus.

Materiales y método: Toma de muestras y siembra de secreción nasal sobre Agar Sangre

en base Columbia. Los materiales son los mismos de la actividad

n°3.

Toma de Muestras: Explique a su paciente el procedimiento. Use guantes.

Pida al paciente que incline la cabeza ligeramente hacia atrás.

Con una tórula estéril frote el piso y las paredes de la ventana

nasal. Prepare una lámina para el examen directo.

Siembra: Tome otra muestra nasal y siembre una placa de Agar sangre

Columbia de acuerdo a lo descrito en la actividad n°3. Identifique

con el nombre del paciente y luego incube por 24 horas a 35 –

37°C

Observe el desarrollo de distintas colonias bacterianas, ponga

atención a los efectos del desarrollo bacteriano sobre la sangre,

especialmente aquellas que presentan pigmento dorado y que

causan aclaramiento (hemolisis) alrededor.

Actividad hemolítica (beta hemolisina) de

Staphylococcus aureus sobre Agar sangre Columbia.

Los agares sangre sin otros aditivos son

medios de cultivo nutritivos de uso general, y

permiten el desarrollo de la mayoría de las

bacterias que no tienen requerimientos

nutricionales especiales. Soportan bién el

crecimiento de las bacterias de la microbiota

normal y de la gran mayoría de los patógenos para

el ser humano. Son ejemplos:

Agar sangre en base Columbia

Agar sangre en base Soya – Tripticasa

Agar sangre en base Infusión.


36


Actividad n°5: Aislamiento de bacterias a partir de muestras médicas III.

Objetivos: Practicar la metodología de siembra de muestras de deposiciones

sobre medios de cultivo sólidos.


Observar el desarrollo de enterobacterias y su actividad

metabólica.

Materiales y método: Toma de muestras en medio de transporte y siembra de

deposiciones sobre Agar MacConkey o Agar XLD (Xilosa-Lisina-

Desoxicolato).

Toma de muestras: Use guantes. Tome una muestra de deposiciones con tórula estéril

y luego introdúzcala en un medio de transporte Cary – Blair.

Siembra: Siembre con la tórula un punto periférico sobre Agar MacConkey o

Agar XLD. Vuelva la tórula a su envase.

Prepare una lámina para el examen directo, según lo descrito en la

actividad 3. Cuide de no contaminar.

Esterilice un asa de siembra por incineración. Espere a que se

enfríe y luego realice la siembra SUAVEMENTE de acuerdo a la

figura de la actividad 3.

Identifique con el nombre del paciente e incube 24 horas a 35-

37°C. Después observe el desarrollo de colonias y comente.

Cultivo de Escherichia coli sobre Agar

MacConkey. Las colonias se observan

rosadas por efecto de la fermentación de

la lactosa contenida en el medio de cultivo.

El halo de precipitación que rodea las

colonias se forma por efecto del pH ácido

sobre las sales biliares que contiene la

fórmula.


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Cultivo de Escherichia coli sobre Agar XLD.

Las colonias se observan amarillas por

efecto de la fermentación de la Xilosa,

lactosa y sacarosa. El halo de precipitación

ocurre por acción del pH ácido sobre el

desoxicolato.

Se observan cuatro colonias negras,

productoras de H2S, que pueden

corresponder Proteus sp.

Salmonella typhimurium sobre Agar XLD.

Las colonias se observan negras por la producción de H2S.

Las especies de Salmonella degradan el aminoácido Lisina

(Lisina decarboxilasa), por lo que se produce elevación del

pH y viraje hacia el rojo.

Los Medios de cultivo Agar MacConkey y Agar XLD son selectivos

para enterobacterias, (Gram negativas que habitan en el intestino)

ya que su composición contiene sales biliares que inhiben el desarrollo

de bacterias Gram positivas. El Agar XLD tiene mayor concentración de sales biliares, por lo que su

efecto inhibidor es mayor, y permite una mejor recuperación selectiva de enteropatógenos como

lo son Salmonella sp. y Shigella sp.

Existen muchas fórmulas de medios de cultivo selectivos, la mayoría tiene por objeto

facilitar la recuperación de agentes patógenos por inhibición de la flora acompañante, por lo que

pueden usarse para la siembra primaria, es decir directamente de la muestra.

Algunos ejemplos de medios selectivos son:

Agar TCBS: cultivo de Vibrio cholerae

Agar SS: cultivo de Salmonellas y Shigellas

Agar Thayer Martin: cultivo de Neisseria gonorrhoeae y N. meningitidis

Agar Baird Parker: cultivo de Staphylococcus aureus


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Actividad n°6: Observación macroscópica de un cultivo y aislamiento de cepas.

Objetivos: Observar la morfología colonial.

Observar los efectos del desarrollo bacteriano sobre el medio de cultivo

(bioquímica, acción de hemolisinas).

Apreciar la diversidad de la microbiota y sus diferencias.

Practicar el aislamiento a partir de un cultivo de fase sólida, mediante asa.

Materiales y método: Use sus cultivos de la actividad n°5.

Placas de Agar sangre (cualquier fórmula base)

Asas de siembra.

Bioseguridad: Trabaja con bacterias no identificadas aisladas de humanos, no está

descartada la presencia de patógenos en los cultivos.

No olfatear los cultivos.

Use guantes, mechero encendido.

No exponga los cultivos innecesariamente.

Desarrollo: - Observe atentamente el cultivo y registre las características según la

tabla adjunta.

- Con un lápiz marcador, divida en dos con una línea central una placa de

agar sangre.

- En su cultivo, elija dos colonias diferentes que le parezcan interesantes.

- Con el asa estéril y fría, toque una de ellas y luego siembre un sector del

agar sangre. Esterilice el asa, enfríe, y repita con la otra colonia en el otro

sector. Incubar 24 horas entre 35° y 37°C. Identifique siempre sus cultivos.

Morfología colonial bacteriana


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La observación de la morfología colonial es

el primer paso orientativo a la identificación de

especies bacterianas.

En la medida que el bacteriólogo adquiere

experiencia, esta etapa del cultivo le permite

tomar decisiones respecto de la marcha de

identificación, a la vez que apreciar las

proporciones en las que se desarrollan las

distintas especies, y la carga microbiana de la

muestra.

La presencia de colonias pigmentadas es

orientativa de algunos patógenos como

Staphylococcus aureus, Pseudomonas

aeruginosas, Serratia rubidea y el anaerobio

Prevotella melaninogenica.

La acción de las hemolisinas también es un

índice de mecanismos de acción patógena.

Muchas cepas de Staphylococcus aureus son beta

hemolíticas (Hemolisis total), así como también

Streptococcus pyogenes (Streptococcus beta

hemolítico del grupo B).

La consistencia cremosa nos orienta hacia

levaduras, como Candida albicans. Si la colonia

tiene una consistencia mucosa, con tendencia a

escurrir o a filamentar, podemos estar en

presencia de alguna bacteria capsulada, como

Klebsiella pneumoniae.

Los hongos miceliados producen grandes

colonias filamentosas, con centros pigmentados de verde, negro o café, debido a la presencia de

sus mecanismos de reproducción asexuada (esporas fúngicas). Esta descripción es consistente con

especies de los géneros Penicillium, Aspergillus o Alternaria respectivamente.

MORFOLOGÍA COLONIAL ASPECTO DE LA COLONIA COLONIA 1 COLONIA 2

Tamaño: Grande Mediano Pequeño Superficie: Plana Planoconvexa Convexa Acuminada Umbilicada Papilada Lisa Rugosa Forma: Puntiforme Circular Filamentosa Irregular Rizoide Fusiforme Cerebriforme Borde: redondeado (entero) Ondulado Lobulado Espiculado Filamentoso Rizoide Brillo: Opaco Brillante Consistencia: Húmeda Seca Cremosa Pigmento (Color): Propio Difusible Hemolisinas: Alfa hemolítica Beta hemolítica Gamma hemolítica

(texto guia de laboratorio de microbiología...

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