Manual de prácticas de laboratorio Curso de Microbiología

Tecnología en Gestión Agroindustrial

Facultad de Ciencias Socio Económicas

Unidades Tecnológicas de Santander

2021

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Contenido

Técnicas básicas de Microbiología ...................................................................................................... 4

1. Normas y formatos a tener en cuenta en el laboratorio ............................................................ 4

1.1. Funciones del laboratorista ............................................................................................. 4

1.2. Derechos de los usuarios ................................................................................................. 5

1.3. DEBERES DE LOS USUARIOS ............................................................................................ 6

1.4. DE LOS ESTUDIANTES ...................................................................................................... 6

1.5. DE LOS DOCENTES ........................................................................................................... 7

1.6. NORMAS DE TRABAJO DE OBLIGATORIO CUMPLIMIENTO ................................................. 7

Práctica #1. Introducción al laboratorio: Bioseguridad y materiales .................................................. 9

BIOSEGURIDAD .................................................................................................................................... 9

¿Qué es la Bioseguridad? .............................................................................................................. 10

Tarea 1: Pictograma de Seguridad ................................................................................................ 10

Tarea 2: Diamante de Seguridad ................................................................................................... 10

Tarea 3. Tratamiento de reactivos y desechos ............................................................................. 11

MATERIALES DE LABORATORIO ........................................................................................................ 11

Actividades ........................................................................................................................................ 12

OBJETIVOS ..................................................................................................................................... 13

MATERIALES Y MÉTODOS .............................................................................................................. 13

MATERIALES .............................................................................................................................. 13

MEDIDAS DE MASA ................................................................................................................... 13

MEDIDAS DE VOLUMEN ............................................................................................................ 14

CUESTIONARIO .............................................................................................................................. 14

Práctica #2. Uso y cuidado del microscopio óptico ........................................................................... 16

Objetivos ....................................................................................................................................... 16

Introducción .................................................................................................................................. 16

Pasos para observar la muestra en el microscopio ....................................................................... 18

Materiales ..................................................................................................................................... 20

Procedimiento ............................................................................................................................... 20

Cuestionario .................................................................................................................................. 21

Práctica #3. Esterilización. ................................................................................................................. 22

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Objetivos: ...................................................................................................................................... 22

Introducción: ................................................................................................................................. 22

Materiales y equipos material estéril............................................................................................ 27

Procedimiento preparación de material estéril ............................................................................ 27

Materiales, equipos y reactivos medios ........................................................................................ 28

Procedimiento ............................................................................................................................... 28

Cuestionario .................................................................................................................................. 30

Práctica #4. Preparación de medios de cultivo ................................................................................. 31

Materiales y equipos ..................................................................................................................... 33

Procedimiento ............................................................................................................................... 34

Práctica #5. Tinción ........................................................................................................................... 35

Práctica #6. Aislamiento de MO del suelo ........................................................................................ 36

Objetivos: ...................................................................................................................................... 36

Introducción: ................................................................................................................................. 36

Materiales, equipos y reactivos .................................................................................................... 37

Procedimiento ............................................................................................................................... 38

Cuestionario .................................................................................................................................. 39

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Práctica de Laboratorio de Microbiología Técnicas básicas de Microbiología

1. Normas y formatos a tener en cuenta en el laboratorio

1.1. Funciones del laboratorista Son funciones de los auxiliares, técnicos e ingenieros encargados de los laboratorios de las

Unidades Tecnológicas de Santander, las siguientes:

• Firmar el Paz y Salvo requerido por los estudiantes.

• Ordenar y reubicar los equipos y manuales dentro del laboratorio.

• Facilitar el área física del laboratorio y los implementos para el desarrollo de las prácticas.

• Alistar el laboratorio para dar inicio a las labores académicas.

• Elaborar las normas adecuadas que permitan compartir las responsabilidades con los

docentes, usuarios del laboratorio y el laboratorista.

• Recopilar y unificar los pedidos de las necesidades semestrales de las asignaturas que se

ofrezcan en el laboratorio y remitirlas a la Coordinación o Departamento respectivo para

mantener los materiales necesarios para las prácticas.

• Revisar periódicamente el estado del laboratorio, de los materiales y equipos que en allí se

encuentren, notificando inmediatamente a la Coordinación o Departamento respectivo, en

caso de observar algún deterioro, desperfecto o falta de alguno de ellos.

• Recibir los materiales y equipos que ingresen al laboratorio, firmando el cargo

correspondiente.

• Elaborar un inventario de equipos y materiales existentes en el laboratorio, cada fin de

semestre académico y remitirlo a las instancias respectivas.

• Velar por el cumplimiento de las normas de trabajo de obligatorio cumplimiento y de las

normas de seguridad dentro del laboratorio.

• Mantener el laboratorio aseado, en perfecto estado las herramientas, equipos y módulos de

trabajo, es decir, en óptimas condiciones para realizar las prácticas en forma eficiente.

• Proporcionarle al docente y a los estudiantes de la asignatura, los materiales y el equipo

necesario para la realización de las prácticas respectivas.

• Custodiar los elementos y equipos de los laboratorios.

• Realizar mantenimiento preventivo y correctivo a los equipos existentes en el laboratorio.

• Brindar un eficiente, oportuno y amable servicio a los estudiantes.

• Coordinar y planificar en conjunto con el jefe inmediato el servicio general de los

• laboratorios y/o talleres de los respectivos programas.

• Coordinar y planificar los horarios de los servicios de laboratorios.

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• Reintegrar al almacén general de la institución el equipo, o enseres que del laboratorio sean

dados de baja de acuerdo con la autorización del jefe inmediato.

• Retirar del almacén general los pedidos que para su dependencia se haya hecho.

• Colaborar con la organización de las muestras técnicas y de divulgación que la institución

realice o participe respectivamente.

• Sugerir los cambios y las modificaciones que crea conveniente para el funcionamiento y la

modernización del laboratorio que se tiene a cargo.

• Al finalizar la práctica, se debe verificar que los equipos, estén en perfectas condiciones.

• Responder por las herramientas y equipos del laboratorio a cargo.

• Colaborar en la instalación e implementación de equipos y máquinas adquiridas por la

institución para la actualización de los módulos de trabajo.

• Resolver dudas pertinentes a las prácticas que se estén realizando en ausencia del

docente.

• Las demás funciones que le sean asignadas por el superior inmediato acorde con la naturaleza

del cargo.

1.2. Derechos de los usuarios Son derechos de los usuarios de los laboratorios de las UTS:

• La utilización de los recursos disponibles para préstamo dentro de los horarios

• establecidos.

• El usuario tendrá derecho a solicitar asesoría en el momento que lo requiera y será

• brindada por el auxiliar encargado o por el profesor de la materia.

• El usuario dispondrá del servicio para uso exclusivo de su formación académica.

• Las solicitudes de servicio de soporte técnico o soporte al usuario se harán directamente a la

persona encargada de la atención y registro de estos requerimientos y podrán efectuarse

mediante solicitud verbal de acuerdo con los procedimientos establecidos por el reglamento

del laboratorio respectivo.

• Los equipos y materiales que van a utilizar los docentes y estudiantes deben encontrarse en

perfecto orden y aseo.

• Préstamo de los elementos o equipos necesarios para realizar las practicas del laboratorio.

• Solicitar el buen estado de los elementos, equipos y bancos de trabajo.

• La disponibilidad de los laboratorios en los horarios estipulados.

• Exigir la verificación del funcionamiento de los equipos y elementos solicitados.

• La explicación por parte del docente de la correcta manipulación de los equipos.

• Los estudiantes tienen derecho a la clase práctica, orientada por el docente y el conocimiento

con anterioridad de las prácticas a realizar.

• Recibir un trato cortes según los principios básicos de las relaciones humanas.

• Recibir las advertencias necesarias que le permitan trabajar cumpliendo todas las normas de

obligatorio cumplimiento y de seguridad que disponga cada laboratorio según su reglamento

interno.

• El estudiante para solicitar el préstamo de equipos y elementos dispone de 15 minutos

después del inicio del laboratorio.

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• Para el préstamo de los equipos es necesario utilizar el formato de préstamo que se

encuentra en la fotocopiadora

• Solicitar el permiso correspondiente si tuviera que ausentarse o no asistir, siempre y cuando

sea por una causa justificada.

1.3. DEBERES DE LOS USUARIOS

• Son deberes de los usuarios de los laboratorios de las UTS los siguientes:

• El usuario deberá comprometerse a dar un trato adecuado a los equipos, hardware, software,

muebles y elementos que hagan parte del laboratorio, respetando y acatando las normas

establecidas en el presente reglamento.

• Todo usuario de un laboratorio deberá al momento de solicitar el servicio presentar el

documento que lo acredite como usuario, ya sea carné de estudiante, de empleado de las

UTS, o cedula de ciudadanía cuando se trate de algún tipo de convenio interinstitucional.

• Todo usuario se hace responsable ante las UTS por los daños que se ocasionen a los equipos,

muebles y enceres durante el tiempo de su utilización.

• El usuario recibirá el equipo en perfectas condiciones; si detecta cualquier irregularidad en el

funcionamiento, daño o faltante de algún elemento propio del equipo, deberá reportarlo

inmediatamente antes de hacer uso de este.

• Queda rotundamente prohibido a cualquier usuario utilizar los equipos para prácticas o fines

diferentes a aquellos para los cuales fueron prestados por la institución, haciéndose además

responsable del deterioro de los equipos por uso negligente, así como de cualquier tipo de

lesión en su persona o en terceros que pueda derivarse de estos actos.

• El usuario deberá presentarse a los laboratorios de las UTS vistiendo las ropas adecuadas y

cumpliendo con los requisitos de seguridad industrial necesarios para

realizar la práctica académica en cada laboratorio; la institución y el laboratorio no

asumen responsabilidades por la omisión, desconocimiento o violación de esta regla por

parte de sus usuarios.

1.4. DE LOS ESTUDIANTES

• Dejar en perfecto orden y aseo todos los equipos, materiales, y manuales utilizados en la

práctica.

• Pagar o reponer en caso de pérdida o daño el (los) material(es) y equipo(s) que se

encontraban a su cargo durante la práctica.

• Debe mantener el orden y la disciplina durante la práctica. • Debe hacer un buen uso de los equipos y materiales a su cargo durante las prácticas de

laboratorio.

• Preservar, cuidar y mantener en buen estado el material de enseñanza, instalaciones,

equipos, dotación y bienes de los laboratorios.

• Cumplir con las normas de respeto y convivencia para el logro de una formación

integral.

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• Cumplir con las normas de seguridad del laboratorio que disponga cada laboratorio según su

reglamento interno.

• En caso de no conocer el manejo de los equipos es necesario pedir las instrucciones

pertinentes antes de realizar cualquier conexión y de usarlos.

• Cuidar lo que se conserve bajo su cuidado o a lo cual tenga acceso, así como impedir evitar la

sustracción, destrucción, ocultamiento y utilización indebida de los equipos que se

encuentren en el laboratorio.

• Verificar antes de iniciar una práctica el estado de su puesto de trabajo y del equipo a utilizar

en la experiencia.

• Tratar con respeto, imparcialidad y rectitud a las personas con que tenga relación por razón

del servicio.

• Avisar inmediatamente al asistente, o persona encargada de las salas acerca de las anomalías

que se presenten en los equipos.

• Informar al docente o encargado del laboratorio sobre el mal uso que otros usuarios hagan

de los equipos.

• Acatar las instrucciones de la persona encargada del laboratorio y respetar sus decisiones de

acuerdo con lo dispuesto en este reglamento.

1.5. DE LOS DOCENTES

• Durante la primera práctica deberán dar las indicaciones a los estudiantes, referentes al buen

uso del material y equipos de laboratorio, así como de sus deberes, obligaciones y

cumplimiento de las normas de seguridad dentro del laboratorio.

• Dar las indicaciones necesarias para la realización de las prácticas de laboratorio y la

explicación para su ejecución.

• Durante las prácticas de laboratorio, por ningún motivo deben abandonar a los estudiantes a

su cargo, ni ocupar el tiempo de las prácticas en las actividades ajenas a las mismas.

• Dar la explicación respectiva de la práctica a realizar, así como también la aclaración de las

dudas que tengan los estudiantes.

• Para los laboratorios de Biología y Química los docentes deben efectuar los pedidos de

materiales y reactivos indispensables para la realización de las clases prácticas, ante el

laboratorista encargado.

1.6. NORMAS DE TRABAJO DE OBLIGATORIO CUMPLIMIENTO Se establecen las siguientes normas de estricto cumplimiento:

• Cumplir con el horario de laboratorio establecido, para la realización de las prácticas.

• Está prohibido el ingreso de comidas, bebidas, cigarrillos a los laboratorios.

• Está prohibido el ingreso de estudiantes en pantaloneta, bermuda, sandalias o en chanclas a

los laboratorios.

• Tendrán acceso al laboratorio los estudiantes que se encuentren debidamente matriculados

en el período académico correspondiente.

• Para el inicio de la práctica de laboratorio debe estar presente el docente de la asignatura

quien se hará responsable de la sala.

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• Está prohibido facilitar o propiciar el ingreso al laboratorio de personas no autorizadas.

• En lo posible, el docente y el encargado deben permanecer todo el tiempo en el laboratorio,

durante la realización de las prácticas.

• Quince (15) minutos después de iniciar la práctica de laboratorio no se permite el ingreso de

estudiantes al aula.

• Después de quince (15) minutos de haber comenzado la práctica de laboratorio no se

despachará ninguna lista de pedido de equipos y/o elementos a los estudiantes (seguridad

del laboratorio).

• Quince (15) minutos antes de la hora prevista para la terminación de la práctica de

laboratorio, el estudiante debe devolver los equipos y/o elementos dados en préstamo.

• El material asignado a cada práctica debe permanecer en el mismo lugar. No se debe coger

material destinado a prácticas distintas a la que se está realizando.

• En caso de dudas en el momento de conectar un equipo, se debe preguntar a la persona

indicada, así se evitará el pago innecesario.

• El estudiante debe seguir los pasos establecidos por el docente para la práctica.

• Se permite el uso del laboratorio si está autorizado por el Coordinador del programa o el

laboratorista a cargo.

• Todo estudiante debe estar debidamente preparado para la realización de la práctica.

• La ausencia injustificada de una práctica de laboratorio se calificará con cero, cero (0,0).

• La no presentación del pre-informe y del informe el día de la práctica se calificará con cero

(0.0).

• Cada equipo de trabajo es responsable del material que se le asigne, en caso de pérdida o

daño deberá responder por ello. Antes de empezar con el procedimiento experimental o

utilizar algún aparato, revisar todo el material, y en caso de desconocer su funcionamiento

pregunte al docente o al encargado del laboratorio. La pérdida o deterioro por mal uso de un

elemento, aparato o equipo, se cobra al estudiante responsable. En caso de no encontrarse

un responsable único, el grupo de la práctica correspondiente asumirá la responsabilidad y

cubrirá los costos de reparación o de sustitución del equipo.

• No se permite el traslado de computadores, sillas o de cualquier otro material o equipo que

se encuentre en el laboratorio, sin la debida autorización del funcionario encargado del

mismo.

• Al finalizar la práctica el material y la mesa de trabajo deben dejarse limpios y

ordenados.

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Práctica #1. Introducción al laboratorio: Bioseguridad y materiales

BIOSEGURIDAD De acuerdo con lo estipulado en el Manual de Microbiología General (Reynoso, Magnoli, Barros y

Demo, 2015) el trabajo en el laboratorio de Microbiología debe ser considerado de alto riesgo

debido al manejo de muestras potencialmente contaminadas con patógenos microbianos y de

cultivos de microorganismos obtenidos a partir de dichas muestras. La exposición a este riesgo DEBE

ser minimizada y controlada mediante un plan de bioseguridad. Los riesgos biológicos infecciosos

más comunes en el laboratorio de microbiología incluyen cultivos de microorganismos (bacterias,

micobacterias, hongos, virus y parásitos) en altas concentraciones y otros riesgos como toxinas,

alergenos, productos recombinantes, etc.

Es importante considerar que existen cuatro elementos necesarios para que se inicie una infección:

un huésped susceptible, un agente infeccioso, la concentración de dicho agente infeccioso (dosis

infectante) y una ruta de transmisión. Esta última es la única que puede ser controlada por medio

de normas de bioseguridad y por lo tanto es indispensable brindarle especial atención a las rutas

más comunes de transmisión: oral, respiratoria, percutánea y contacto directo con la piel y/o las

mucosas.

Por lo tanto, es importante que el estudiante

1. Conozca la ubicación de los extinguidores, botiquín, la ducha y la salida de emergencia.

2. NUNCA coma, beba ni fume en el laboratorio.

3. Antes de ingresar al laboratorio es indispensable que tenga su bata

4. No se frote los ojos (ni la cara) cuando las manos están contaminadas con sustancias

químicas. En caso de que las sustancias corrosivas se pongan en contacto con la piel u ojos,

lávese la zona afectada con agua inmediatamente en el lavaojos

5. Siempre lea la ficha de datos de seguridad de los reactivos que se utilizarán en la práctica

ANTES de llegar al laboratorio

6. Evite siempre las bromas y juegos en el laboratorio. Siempre este atento.

7. Evite inhalar profundamente vapores de cualquier material. Si la practica lo requiere no lo

inhale directamente, sino arrastre con la mano los vapores hacia la nariz.

8. Cada estudiante es responsable de la limpieza de su lugar de trabajo y del

material asignado, así como de los equipos (microscopios, balanzas, etc.) que

haya usado.

Procedimiento de laboratorio

1. Revise el material que se le entrega y avise si tiene algún desperfecto

2. NUNCA trabaje sin su docente/supervisor en el laboratorio, ni realice experimentos no

autorizados.

3. Es indispensable etiquetar siempre los reactivos y muestras.

4. Es imprudente calentar o mezclar sustancias cerca de la cara, nunca caliente líquidos en un

recipiente cerrado.

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5. No se deben calentar sustancias en utensilios de vidrio quebrado o de medición (buretas,

probetas graduadas, matraz volumétrico, etc.)

6. Deje que los objetos de vidrio se enfríen suficientemente antes de cogerlos con la mano.

Recuerde que el vidrio caliente no se distingue del frío.

7. Sofoque cualquier principio de incendio con un trapo mojado.

8. Antes de conectar el mechero, asegúrese de que ha cerrado la llave del gas. Apague el

mechero tan pronto termine de usarlo.

9. Lea cuidadosamente el nombre del recipiente de reactivo que va a usar para asegurarse que

es el que se le indica en la práctica y no otro.

10. Si se le derrama algún ácido o cualquier otro reactivo corrosivo, lave con agua suficiente

inmediatamente, la parte afectada.

11. Nunca agregue agua al ácido concentrado. Diluya el ácido lentamente adicionando ácido al

agua con agitación constante. De la misma manera diluya las bases.

12. Nunca mezcle ácido concentrado con base concentrado.

13. Toda reacción en que ocurran olores irritantes, peligrosos o desagradables, debe efectuarse

en la vitrina para gases.

14. Nunca arroje materiales sólidos (papeles, fósforos, vidrios, etc.) en los sumideros o

vertederos. Utilice los recipientes adecuados para ello.

15. Lave muy bien sus manos con agua y jabón al terminar la práctica

¿Qué es la Bioseguridad? Son las normas que se deben tener en cuenta para preservar la vida y la integridad física dentro de

un área específica de trabajo, en este caso el laboratorio de biología.

Tarea 1: Pictograma de Seguridad Investigue que significa cada uno de los pictogramas de seguridad

Tarea 2: Diamante de Seguridad Investigue que significan cada uno de los colores y números que se ponen en un diamante de

seguridad NFPA y cuando se debe utilizar

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Tarea 3. Tratamiento de reactivos y desechos ¿Cuál es la manera correcta de disponer los residuos en el laboratorio? Escriba ejemplos de como

se dispondrían reactivos líquidos, sólidos, gaseosos y de riesgo biológico.

MATERIALES DE LABORATORIO

En el laboratorio se utilizan diferentes tipos de materiales para usos específicos. En la Tabla 1 se

presenta un resumen de estos

Tabla 1. Clasificación del material de laboratorio

CLASIFICACIÓN TIPOS DESCRIPCIÓN

SEGÚN LA NATURALEZA

O COMPOSICIÓN DEL MATERIAL

Vidrio refractario

Usualmente está compuesto por borosilicato de sodio y aluminio. Resiste altas temperaturas, pero algunos ácidos o bases fuertes pueden afectarlo.

Plástico Es irrompible y pesa poco. Algunos resisten altas temperaturas, pero no la llama directa. También se ven afectados por disolventes orgánicos y ácidos fuertes. Teflón: polímero de tetrafluoretileno (resiste 300°C), Polietileno: polímero de etileno inerte a la mayoría de reactivos químicos. Polipropileno: no soporta una fuente de calor directa.

Porcelana Material altamente resistente al calor.

Metal Se usa como soporte o sujetador (gradillas, pinzas, cucharas, espátulas).

SEGÚN EL PESO

Material ligero Se puede trasladar con facilidad.

Material pesado

No es fácil desplazarlo, por lo cual permanece en una sóla posición.

SEGÚN EL TIEMPO DE VIDA ÚTIL

Material fungible

Material con periodos de vida útil más cortos. Por lo tanto requieren ser reemplazados con mayor frecuencia.

– Pipetas graduadas de vidrio (recuperables) – Probetas de plástico o de vidrio (recuperables) – Pipetas Pasteur de vidrio o plástico (desechables) – Gafas, guantes, mascarillas (desechables)

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Material inventariable

Material que no sufre el paso del tiempo de manera tan drástica, lo cual permite que se use por periodos prolongados e incluso ocupando el mismo espacio siempre. Es el material que se incluye en el inventario.

– Balanzas, desecadores, centrífugas – Baños termostatizados, estufas – Duchas de seguridad, fuente lavaojos – Sillas, mesas, armarios, extintores

SEGÚN LA FUNCIÓN Y EL

USO

Volumétrico Sirve para obtener medidas exactas. Se puede clasificar en graduado y aforado.

No volumétrico Mide volúmenes aproximados, pero también sirve para calentar, transportar y disolver.

De uso específico

Tiene funciones muy diversas, variadas y concretas.

De soporte y apoyo

Sirve como elemento auxiliar de sujeción y soporte para otros materiales.

Para medir masas

Se usan para determinar el peso de sustancias

Modificado de: https://www.blinklearning.com

Actividades 1. A continuación, se presentan 5 categorías para clasificar los materiales de laboratorio de

acuerdo con su función. En cada categoría añada al menos 4 imágenes (con su nombre) de

materiales de lab que cumplan con la función especificada en esa categoría:

• Medir volúmenes

• Calentar, mezclar, contener

• Pesar

• Calentar a altas temperaturas

• Sostener

• Separar

• Para el microscopio y biología

2. Complete la siguiente tabla con al menos 4 ejemplos de materiales que pertenezcan a la

clasificación de acuerdo con el tipo de material que están hechos.

Tipo de material Nombre Imagen Función

Vidrio

Plástico

Metal

Madera

Papel

Caucho y corcho

Porcelana

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3. Responda las siguientes preguntas de forma breve (máx 2 lineas, no copiar de internet, sino

con sus palabras)

a. ¿Qué diferencia hay entre el vidrio Pyrex y el vidrio normal?

b. ¿Por qué no es correcto medir un volumen en un vaso de precipitado?

c. ¿Por qué el Erlenmeyer es uno de los materiales preferidos en el lab?

d. ¿Para qué se usa un picnómetro?

4. ¿Qué diferencia hay entre una pipeta pasteur, una pipeta volumétrica, una graduada, una

bureta y una micropipeta? Ponga cada una de las imágenes y explique sus diferencias y

similitudes.

OBJETIVOS

• Identificar el instrumento de medida más apropiado que se debe utilizar al medir un

determinado volumen.

• Adquirir destreza en el uso de la balanza y algunos instrumentos para medir volúmenes.

• Aplicar el tratamiento básico de datos a una serie de medidas experimentales.

MATERIALES Y MÉTODOS

Al inicio de la práctica el docente asignará uno de los siguientes temas a cada uno de los grupos:

tipos de balanzas, cálculo de la media y desviación estándar, precisión y exactitud. Los

estudiantes contarán con media hora para preparar el tema y socializarlo con el resto de sus

compañeros, haciendo uso de algunas de las estrategias de aprendizaje colaborativo descritas en

el capítulo 15.

MATERIALES

LABORATORIO ESTUDIANTES

1 Balanza de brazo triple 2 Vasos de precipitado (50 y 250 mL) 1 Probeta (100 mL) 1 Balón aforado (100 mL) 1 Pipeta (10 mL) 1 Pera Agua destilada

Toallas absorbentes descartables para limpiar el área de trabajo Un objeto pequeño (piedra, pedazo de madera, entre otros)

MEDIDAS DE MASA Se hará un breve repaso sobre el uso de la balanza, sus partes, sus cuidados, el nivel de precisión y

la forma como se usará durante la práctica. A continuación:

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a. Cada grupo deberá ubicarse en el mesón que les corresponde con una balanza. Los

estudiantes deberán evitar ubicarse en medio de corrientes de aire natural o artificial, ya

que esto podría alterar las mediciones.

b. A continuación, repitiendo el proceso de calibrado completo, pesarán en cinco ocasiones

cada uno de los siguientes objetos: una moneda, un vaso de precipitados pequeño y

cualquier objeto que el estudiante desee.

c. Anote sus observaciones en la tabla del punto b del cuestionario.

Nota: en cada pesada use guantes para manipular los objetos; de este modo se evitarán errores

por aumento de peso debido a la grasa o humedad que le pueda quedar adherida al objeto o al

recipiente, cuando se manipula directamente con las manos.

MEDIDAS DE VOLUMEN a. Al inicio de la práctica se realizará un repaso de las cualidades volumétricas de los

instrumentos a utilizar en la práctica. Los estudiantes en grupos deberán acercase a tomar

cada uno de los materiales de medición y deberán ubicarse en su lugar de trabajo.

b. A continuación, ponga un poco de agua del grifo en el vaso de precipitados y registre su

volumen.

c. Transfiera el contenido a una probeta y registre su volumen.

d. Adicionalmente, mida 100 mL de agua en la probeta.

e. Paso seguido, transfiera el contenido a un balón aforado de 100 mL.

f. Mida los siguientes volúmenes con los materiales que considere más convenientes y

transfiéralos a un balón aforado de 100 mL: 10, 30, 52, 7.5 y 0.5 mL.

g. Todos los datos que surjan deberán registrarse en el cuestionario.

CUESTIONARIO

a. Una vez pese los objetos, llene el siguiente cuadro, teniendo en cuenta las normas para determinar el número de cifras significativas.

LECTURAS 1 2 3 4 5 PROMEDIO

(�̅�) 𝝈

RESULTADO

(�̅� ± 𝝈)

Moneda

Vaso

Objeto

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b. Anote sus observaciones tras llevar a cabo las transferencias en los puntos 1.3.3 a – g de la

metodología.

c. Indique los instrumentos que usó para medir los volúmenes en el punto 1.3.3. f de la metodología.

d. Ordene los instrumentos volumétricos en orden ascendente teniendo en cuenta su precisión.

BIBLIOGRAFÍA

Chang R. Química, 7ª ed. México: McGraw-Hill; 2002.

Miller JN, Miller JC. Estadística y quimiometría para química analítica, 4ª ed. Madrid: Prentice-Hall;

1996.

Skoog DA, West DM, Holler FJ, Crouch SR. Fundamentos de química analítica, 8a ed. México:

Thomson Learning; 2005.

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Práctica #2. Uso y cuidado del microscopio óptico

Objetivos Al finalizar esta práctica el alumno será capaz de:

• Reconocer cada una de las partes que componen al microscopio óptico y la función que

cumplen en el equipo

• Desarrollar las habilidades para utilizar de forma correcta el microscopio con las

recomendaciones para lograr una mayor vida útil del equipo

• Enfocar adecuadamente el microscopio con todos sus aumentos y realizar sus reportes.

Introducción El microscopio es una de las herramientas más útiles en Microbiología. Su utilización permite la

observación de los microorganismos y con ella la obtención de datos esenciales para su

identificación, así como la descripción de características morfológicas, de tinción, tamaño y

agrupación; por ello es muy importante saber utilizar éste instrumento y desde luego cuidarlo

adecuadamente.

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Partes del microscopio:

La mayoría de los microscopios tienen los mismos componentes básicos, sin embargo, su

distribución cambia según el modelo y la marca. La mayoría de los microscopios están constituidos

por: La óptica (conjunto de lentes), la mecánica (soporte del sistema óptico) y el sistema de

iluminación.

CUIDADO Y MANEJO DEL MICROSCOPIO

1. Para transportar el microscopio a la mesa de trabajo deberá tomarse del brazo con la mano

derecha y de la base con la mano izquierda y en posición vertical.

2. Sitúe el microscopio a unos 10 cm de la orilla de la mesa de trabajo

3. Antes de usarlo, limpiar perfectamente la fuente de luz del microscopio, parte superior del

condensador, oculares y objetivos con vaho y frotando suavemente con hisopos.

4. No encender la fuente de luz, sino hasta que se vaya a usar.

5. Colocar la muestra sobre la platina y girar el objetivo que se va a usar colocándolo en la

posición correcta mientras que se observa el material. ¡Para cambiar de objetivos utilice la

rosca estirada del revólver, no lo haga tirando de los objetivos!

6. Evitar girar el revólver de los objetivos sin antes levantar el tubo óptico del microscopio.

7. Ver por el ocular y controlar la cantidad de luz adecuada, moviendo el condensador y

diafragma.

8. Para enfocar, bajar el objetivo que se va a usar con el uso del tornillo macrométrico hasta

donde tope, sin forzarlo, luego enfocar primero con el tornillo macrométrico y una vez que

se ha localizado el campo, usar el tornillo micrométrico para enfocar adecuadamente.

9. Recordar que el objetivo 45X es más largo que el de 10X y más todavía que el de inmersión,

por lo que deberá tenerse cuidado, pues si llegan a rozar, la platina los inutiliza

permanentemente.

10. Ajustar el enfoque usando el tornillo micrométrico.

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11. Cuando se use aceite de inmersión: Colocar una sola gota de aceite de inmersión sobre la

preparación. No usar aceite en exceso, ya que daña el cemento de las lentes.

12. Una vez termine asegúrese de limpiar el lente de inmersión, con papel especial para lentes.

Si no se limpia el lente después del uso, queda un residuo pegajoso que reduce la eficiencia

del lente y puede permitir el crecimiento de hongos

13. Cuando ya no se vaya a utilizar el microscopio, o cuando se desee cambiar de muestra, debe

colocarse en el objetivo de menor aumento y con la platina abajo

14. Nunca retire la preparación con el objetivo de inmersión en posición de enfoque

15. Aprenda a mirar por el microscopio con los DOS OJOS ABIERTOS

16. Evite tocar con los dedos los lentes del microscopio

17. Evite usar el microscopio con pestañina, ya que esta se acumula en los oculares reduciendo

su eficacia.

18. Nunca deje placas montadas en el microscopio en posición de observación.

19. Para apagar definitivamente el microscopio: coloque el objetivo de menor aumento en

posición de enfoque, retire la muestra, limpie el objetivo de inmersión con papel especial y

alcohol isopropilico sin frotar el lente; seque de inmediato con otro papel, baje

completamente la platina. Ubique en “cero” la perilla de intensidad de luz, apague el

interruptor de la fuente y desconecte del toma corriente.

Pasos para observar la muestra en el microscopio

19

Contraste

Las coloraciones se utilizan para mejorar el contraste de la muestra con el medio, de tal forma que

puedan observarse más fácilmente. El procedimiento general se describe en la siguiente imagen

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Materiales

Del laboratorio:

- 1 microscopio

- Pinzas.

- Frasco lavador

- Gotero

- 2 portaobjetos

- 2 cubreobjetos

- Aceite de inmersión.

- Placa portaobjeto preparada.

- Papel de arroz.

- Colorante: azul de metileno, safranina, yodo

Estudiantes deben traer de casa

- Papel periódico y tijeras

-Trozo de tela, insecto pequeño, 1 cebolla junca

- Materiales de protección: guantes y bata.

- Materiales de aseo: jabón de manos, toallas

limpiadoras

-Pueden traer también agua estancada, yogur,

una fruta en descomposición, leche, tierra u

alimentos que quieran ver al microscopio

(opcional).

Procedimiento 1. Siguiendo las indicaciones para el manejo del microscopio:

a. Preparación # 1: Prueba de inversión. En un portaobjeto, coloque un pedazo de papel (1 cm.

cuadrado) que tenga impresa una letra (a, e, b, f, g, r, t) agregue una gota de agua destilada

y coloque el cubreobjeto.

b. Ponga la preparación sobre la platina y súbala con el tornillo macrométrico, hasta observar

el objeto a través del lente ocular.

c. Afine la imagen utilizando el tornillo micrométrico.

d. Prueba de Luz: ajuste la intensidad de luz, abra y cierre el diafragma. Dibuje y anote sus

observaciones correspondientes. En una tabla como esta:

Variable Diafragma abierto Diafragma cerrado

Intensidad alta

Intensidad baja

e. Preparación # 2: Repita los procedimientos a partir del inciso a-c pero con un cabello/ tela

o la muestra que desee observar.

f. Preparación # 4: Prueba de Resolución. Con la placa portaobjeto dada por el docente,

agregue una gota de aceite de inmersión y coloque sobre la platina, enfoque con 4x, 10x y

luego cambié al lente de inmersión, ajuste la luz y la imagen.

g. Preparación #5: Prueba de contraste: Tome el epitelio de la cebolla con una pinza (la telita

transparente) con mucho cuidado, sin que se arrugue, y póngala en un portaobjetos que

tiene una gota de agua. Realice 2 preparaciones una sin colorante y otra con una gota del

colorante de su elección. Tape la muestra con el cubreobjetos y observe en el microscopio.

h. Al terminar retire la preparación.

i. Apague la fuente de luz.

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j. Limpie el ocular y los objetivos con papel limpia lentes.

k. Gire el revólver y deje el microscopio en el menor aumento

l. Descienda la platina,

m. Desconecte el microscopio.

n. Ponga la funda correspondiente.

o. Déjelo en la mesa de trabajo

Cuestionario

En la hoja de resultados dibuje y coloree las imágenes observadas en el microscopio

1- ¿Cuáles son los cuidados que se deben tener con el microscopio?

2- ¿Cómo se calcula el poder de resolución?

3- ¿Para qué se utiliza el aceite de inmersión?

4- ¿Cuál son las recomendaciones para obtener las imágenes de mejor calidad?

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Técnicas básicas de Microbiología

Práctica #3. Esterilización.

Objetivos: Al finalizar este ejercicio el alumno será capaz de:

− Explicar el concepto de esterilización y su utilidad en microbiología.

− Preparar correctamente el material que se someterá a esterilización.

− Identificar la mejor técnica para esterilizar los materiales de uso común en el laboratorio de microbiología.

− Comprobar la efectividad del proceso de esterilización.

Introducción: Los microorganismos como los seres vivos son susceptibles a los cambios de condiciones ambientales y en la medida que se han podido adaptar estos cambios, se han distribuido en una diversidad de hábitats incluyendo los de condiciones extremas sobre todo tipo físico y químico. Se han desarrollado y aplicado diversos procesos de desinfección y esterilización para limitar su presencia o eliminarlos. La esterilización se define como “el proceso mediante el cual se eliminan todos los microorganismos (incluyendo formas de resistencia) de un objeto, medio o superficie” y su aplicación garantiza la ausencia de microorganismos en el material y medios de cultivo a ser empleados, mientras que la desinfección es un proceso que solamente elimina formas vegetativas de los microorganismos. Existen diversos métodos de esterilización, entre ellos: calor (seco o húmedo), son los procedimientos de mayor utilización en microbiología. El calor seco desnaturaliza las enzimas y destruye a los microorganismos por oxidación. Por ejemplo, al ponerlos directamente a la flama de un mechero o en un horno a 150º-180ºC durante 2 horas. Estos métodos se aplican principalmente en la esterilización de asa de inoculación y todo tipo de material de vidrio y quirúrgico. Filtración (para sustancias termolábiles y aire), radiaciones y aplicación de gas de óxido de etileno (para jeringas y cajas de plástico). Los procesos con calor húmedo se aplican para esterilizar medios de cultivo, soluciones, y cultivos bacterianos que se desechan, el más recomendable es el autoclave en el que se utiliza vapor de agua a presión para alcanzar temperaturas de 121ºC. El material se deja a esta temperatura durante 15 minutos para asegurarse de la destrucción de endosporas, que son las estructuras bacterianas más resistentes al calor. Cuando se requiere esterilizar diferentes materiales sensibles al calor como las soluciones de vitaminas, aminoácidos, etc. Se esterilizan por filtración en membranas estériles de 0,2 micras de diámetro y para el caso de materiales plásticos es recomendable el uso de gases como óxido de etileno o con radiaciones gamma. Las superficies generalmente se desinfectan con radiaciones U.V,

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o compuestos químicos en forma líquida como: los fenoles, compuestos cuaternarios de amonio (alquildimetil bencilamonio), formaldehído, alcoholes, halógenos y detergentes. Cada uno de estos procedimientos tienen ventajas y desventajas de uso, los sistemas de filtración son muy eficientes y rápidos para la esterilización, pero solo se aplican en pequeños volúmenes. Los fenoles y compuestos cuaternarios de amonio son muy efectivos para la desinfección de superficies, pero son muy corrosivos. Los detergentes y los alcoholes tienen actividad limitada contra esporas bacterianas y algunos virus por lo que solo son desinfectantes.

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Actividad práctica

Materiales y equipos material estéril

- 3 cajas Petri

- 3 tubos de ensayo

- 2 pipetas de 5 mL

- 2 erlenmeyer de 250 mL

- 1 rollo de papel kraft

- 1 rollo de algodón y gasa

- 1 mechero Bunsen o de alcohol

- 1 Probeta de 100 mL

- 1 gradilla

- 1 Autoclave

- 1 horno de aire caliente

- 1 cinta de enmascarar gruesa

- Agua destilada

- Marcador punta fina (Sahrpie)

Procedimiento preparación de material estéril

Dada una lista de materiales y las indicaciones del docente, debe indicar que método de

esterilización es el adecuado enc ada caso y realizar su esterilización. Materiales: cajas petri,

pipetas, erlenmeyer, tubos de ensayo, asas, bajalenguas, gasa, tubos con agua destilada y

una solución de glucosa. Lleve a esterilizar de acuerdo con el agente físico adecuado.

Procedimiento No 1. Uso de horno de aire caliente

- Encienda el horno y prográmelo a 180°C

- Recorte el papel para envolver material de acuerdo con las necesidades

- Tome el material correspondiente y envuelvalos según las instrucciones del

docente, por último colóquele un trozo pequeño de cinta de papel

- Llévelos al horno de aire caliente y espere 2 h

- Finalizado el proceso apague el horno y retire los elementos con unas pinzas o guantes de calor.

Procedimiento No 2. Uso de autoclave

- Abra el autoclave - Llenelo con agua hasta el nivel indicado

- Sobre la rejilla ubique los materiales a esterilizar (recuerde esterilizar de forma

separada los materiales de uso y los de desecho)

- Asegure correctamente el equipo, encienda y controle la temperatura y presión.

Una vez la temperatura llegue a 121 °C, mantenga por 20 min y apague.

- Espere a que se despresurice el equipo y abra cuidadosamente.

- Retire el material.

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Materiales, equipos y reactivos medios

• 1 parrilla con calentamiento y agitación

• 1 Agitador magnético

• Termómetro 130 °C

• 1 mechero Bunsen o de alcohol

• 1 incubadora a 30 °C

• 1 rollo de gasa

• 1 bolsa de algodón

• Cinta de enmascarar

• Papel Parafilm

• Detergente

• Escobillón

• Agua destilada

• Azúcar

• Agar Bacteriológico

• Extracto de levadura (Preparar con anticipación)

Procedimiento Preparación del extracto de levadura

1. Coloque una quinta parte de una libra de levadura (100g) de panadería en una olla de acero.

2. Asegúrese de que ésta tenga tapa para garantizar la eficacia del proceso de extracción. 3. Vierta 100 ml de agua (medio vaso) en la olla de acero, revuelva y cubra la solución con

la tapa. 4. Coloque la olla sobre una estufa y deje que se caliente a fuego medio. 5. Revuelva ligeramente cada 30 min durante 1 hora. 6. Apague la estufa y deje que se enfrié el extracto. 7. Use un colador para obtener el líquido y resérvelo bien cerrado en una botella limpia

para la práctica.

Preparación de los medios de cultivo Disuelva los diferentes ingredientes en 140 ml de agua destilada siguiendo las siguientes composiciones:

Medio sólido

Componente g/L

Azúcar 30

Extracto de levadura 10

Medio líquido

Componente g/L

Agar Bacteriológico 25

Azúcar 30

Extracto de levadura 10

Preparación del material de vidrio y medios de cultivos: 1. Lavar perfectamente las cajas de Petri y pipetas con escobillón y detergente. Enjuagar con abundante agua corriente.

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2. Escurrir el exceso de agua y enjuagar con agua destilada con una frasco lavador por las paredes interiores. Dejar escurrir el material. 3. Una vez seco el material, se procederá a envolver las cajas de Petri y pipetas con papel manila, estraza o aluminio. Para los tubos y matraces se elaborarán tapones de algodón y gasa, procurando que ajusten con holgura, sobre los que finalmente se les colocará un capuchón de papel. Esterilización de materiales y medios de cultivo: 1. Las cajas de Petri y pipetas envueltas se colocan en horno a 150 °C durante 2 horas. Después de sacarlas, dejarlas enfriar y abrir los paquetes únicamente en área aséptica. 2. Los medios de cultivo se esterilizarán en autoclave de acuerdo a las siguientes instrucciones: a. Revisar que el nivel de agua coincida con la marca en el tubo indicador. En caso necesario añadir agua destilada. b. Conectar la autoclave y poner la perilla de control en calentamiento alto. Acomodar los medios y materiales en la canasta de la autoclave y colocarla dentro. c. Cerrar la puerta, apretar las manijas de dos en dos en posición encontrada y esperar a que salga el vapor de agua por el orificio de purgado. Después cerrar este orificio con la válvula de seguridad. d. Dejar que el equipo se caliente hasta alcanzar los 121 °C o 15 Ibs de presión revisando continuamente la escala del manómetro. Una vez alcanzada esta temperatura deberá bajarse el nivel de calentamiento moviendo la perilla de control al nivel medio o bajo. e. Mantener el equipo en estas condiciones durante 15 minutos f. Apagar la autoclave y dejar que baje la presión al valor de "0". Quitar la válvula de seguridad y con la ayuda de guantes de asbesto o un trapo húmedo abrir cuidadosamente la puerta, de adelante hacia atrás para evitar quemaduras por la salida del vapor. Prueba de esterilidad de materiales: 1. Colocar los tubos con agar inclinado y las cajas de Petri en forma invertida en una estufa de incubación ajustada a 30 °C durante 12-24 horas. 2. Revisar los tubos y cajas de Petri para detectar la presencia de contaminantes, por la aparición de turbidez, nata superficial y/o depósito de material en el fondo de los tubos con medio líquido; así como la formación de colonias microbianas en la superficie de medios sólidos. 3. Si no hay contaminación de los medios, se abrirá una de las cajas de Petri de cada medio durante 1 minuto en el laboratorio o zonas accesorias al mismo y se etiquetará como “al aire". 4. La otra caja de cada medio de cultivo se abre durante 30 segundos cerca del mechero y se etiquetará "en área aséptica". 5. La tercera caja se conservará sin abrir y se etiqueta como "control".

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6. Hacer esto por duplicado.

A. Hacer la descripción morfológica de las colonias obtenidas en las cajas con los distintos tratamientos en relación a la caja control.

B. Reportar el crecimiento en forma cualitativa: (-) no hay crecimiento, (+) poco crecimiento, (++) crecimiento regular y (+++) crecimiento abundante. C. Discuta los resultados y determine si la esterilización en el autoclave y horno fue adecuada, así como el manejo de los materiales.

Cuestionario 1. ¿Cuáles son los métodos de esterilización más utilizados en Microbiología? ¿En qué tipo de materiales se aplica cada uno?

2. Explique cuáles son las diferencias entre los procesos de esterilización, desinfección y asepsia. ¿Cómo se relacionan estos procedimientos con la pasteurización?

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Técnicas básicas de Microbiología

Práctica #4. Preparación de medios de cultivo Tomado de Reynoso, et al., 2015. Manual de Microbiología General. 1ed. UniRio editora.

Medio de Cultivo

Es un complejo de sustancias que aportan nutrientes en concentraciones óptimas que permiten

un buen desarrollo de los microorganismos.

Diseño de los medios de cultivo

La composición química de las células refleja cuáles son los principales materiales requeridos para

el crecimiento. El agua representa entre el 80 y 90 % del peso total y es, así, el principal nutriente.

La materia sólida de las células contiene hidrógeno y oxígeno (proveniente del agua), carbono,

nitrógeno, fósforo y azufre. Estos seis elementos se conocen como macronutrientes ya que se

requieren en altas concentraciones (en g/litro) y bajo una forma orgánica o inorgánica, según el

microorganismo. Los elementos como el potasio, magnesio, calcio y hierro deben proporcionarse

en cantidades de mg/litro e incluirse como sales. Los requerimientos de manganeso, cobre, cobalto

y zinc son muy pequeños y están presentes como contaminantes de los componentes principales y

son conocidos como elementos traza.

Dependiendo del tipo de método de cultivo, estos se pueden clasificar en:

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Preparación de medios de cultivo

- La preparación del material de vidrio en el laboratorio microbiológico es de fundamental importancia. Se

lava con detergente y se enjuaga con agua corriente varias veces y agua destilada para eliminar todo

residuo de sustancia orgánica o inorgánica. El recipiente destinado a la preparación de medios debe ser

suficientemente grande para permitir una adecuada homogeneización del medio de cultivo (no agregar

agua más allá de 2/3 de su capacidad).

- En el caso de medios comerciales, se pesa el medio deshidratado y se agrega aproximadamente la mitad

de la cantidad de agua necesaria, se agita para lograr una suspensión homogénea y se añade el agua

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restante. En los medios preparados a partir de sus constituyentes básicos, se debe lograr la disolución

completa de cada uno de ellos con agua destilada, antes de incorporar el siguiente componente.

- Los medios de cultivo sólidos poseen agar como agente solidificante. Su disolución completa se realiza a

baño de María y se visualiza cuando al agitar el medio no se adhiere ninguna partícula a la pared interna

del recipiente y la solución viscosa es homogénea. El agar de buena calidad no altera el pH del medio. Debe

incorporarse después de los demás constituyentes, una vez medido el pH.

- En la preparación de los medios de cultivo debe considerarse que ciertos cationes (calcio y hierro) forman

complejos insolubles con los fosfatos dificultando la observación o cuantificación del desarrollo

microbiano. Este fenómeno se evita con la preparación y esterilización de las soluciones concentradas de

las sales de hierro y calcio y su posterior adición al medio esterilizado y enfriado.

- El pH del medio desciende después de la esterilización por autoclave. Este descenso depende de la

composición del medio, de la temperatura del medio en el momento de la medición y del tratamiento del

medio de cultivo durante su preparación (disolución, esterilización). Es recomendable el uso de un aparato

medidor de pH (peachímetro) o de cintas indicadoras de pH. La corrección del pH se logra por adición al

medio de cultivo de un volumen conocido de una solución de hidróxido de sodio o ácido clorhídrico 1 N o

0,1 N.

Materiales y equipos

Reactivos Lab

Peptona

Glucosa

Agar Agar

Agar sabouraud

NaCl

HCl y NaOH 1M

Agua destilada

Equipos

pHmetro

Plancha de calentamiento y agitación

Balanza analítica

Termómetro de 0 a 100°C

Materiales de laboratorio

1 Espátula

2 Erlenmeyer de 250 mL

Varilla de agitación/ agitadores magnéticos

4 cajas de Petri

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Mechero bunsen

2 vasos deprecipitado de 100 mL

Probeta de 100 mL

Reactivos y materiales estudiantes

Extracto de carne

Extracto de papa

Extracto de zanahoria

Harina de Maíz Papel aluminio y olla a presión Brocha pequeña Algodón, gasa y cinta de enmascarar Sharpie Hisopos (copitos 3) Guantes, bata, tapabocas Material de limpieza

Procedimiento A. Preparación de los extractos en casa

• Extracto de carne: 50g de carne en 100mL de agua de botellón (dejar toda la noche), al día

siguiente hierva por media hora (agregue más agua para conservar el volumen). Enfríelo, fíltrelo

y tráigalo al laboratorio.

• Extracto de papa: 20g de papa en 80 mL de agua, lleve a ebullición conservando la cantidad de

agua, filtre con una gasa y traiga al laboratorio.

• Extracto de zanahoria: tome 10g de zanahoria picada en trozos en 160 mL de agua, cocine hasta

que se ablande, filtre y complete los 200 mL de agua. Traiga al laboratorio.

• Harina de maíz: pesar 10g de harina de maíz y mezclarla con 100 mL de agua, caliente por 1h sin

llegar a ebullición. Filtre con gasa o algodón y traiga al laboratorio.

B. Fórmulas de medios de cultivos a preparar en el laboratorio

Agar zanahoria

Extracto de zanahoria 200 mL

15 g agar

1 L agua

Agar Harina de Maíz

Extracto de maíz 500 mL

15 g Agar

1L agua

Agar Saboureaud pH 5,4 Agar Papa Dextrosa (PDA)

200 mL de extracto de papa

20 g de glucosa

15 g de agar

1000g de agua destilada

pH 5,5

Agar para recuento en placa (PCA)

10g de peptona

2,5 g de extracto de levadura

1g glucosa

15g agar

1000g agua destilada

pH 7

C. Preparación de los medios de cultivo

- Lea atentamente la fórmula del medio que va a preparar y calcule la cantidad de cada uno

de los componentes que va a añadir

- Pese cada uno de los componentes en una balanza digital o analítica sobre papal aluminio

- Coloque cada uno de los componentes en un frasco Erlenmeyer de 250 mL

- Mida 100 mL de agua destilada y agréguela

- Mida el pH y ajústelo de ser necesario con las soluciones de HCl y NaOH (CON MUCHO

CUIDADO)

- Agregue el agar

- Caliente agitando constantemente en una plancha de calentamiento con agitación o de

forma manual

- Esterilice el medio

- Fraccione los medios en las placas de Petri en un ambiente estéril (10-20 mL)

- Tome las muestras de lo que desea incubar (dejar al aire, con un hisopo superficie del lab,

suelo, suela del zapato, un dedo, toser, interior de la boca…)

- Rotule las cajas con fecha, su nombre, y tipo de muestra

- Incubar

Práctica #5. Tinción Pag sgte

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Práctica #6. Aislamiento de MO del suelo

Objetivos:

− Aislar bacterias promotoras de crecimiento PGPR de suelo fértil.

− Utilizar técnicas de dilución

− Preparar medios específicos de crecimiento

− Identificar bacterias por tinción

Introducción:

Las bacterias promotoras del crecimiento vegetal PGPR (Plant Growth Promoting

Rhizobacterium) representan una amplia variedad de bacterias del suelo, que cuando

crecen en asociación con plantas hospederas, estimulan el crecimiento del hospedero. El

término biofertilizante comúnmente se refiere a microorganismos que incrementan la

disponibilidad y toma de nutrientes minerales para las plantas.

El modo de acción de las PGPR puede ser de forma directa ayudando a proveer nutrientes

a la planta o de forma indirecta influyendo positivamente en el crecimiento y morfología de

la raíz o mejorando otras relaciones simbióticas. Muchas PGPR estimulan el crecimiento de

las plantas ayudando al control de organismos patógenos (hongos, bacterias, insectos y

nemátodos). Los mecanismos por los cuales las PGPR aumentan la absorción de nutrientes

se pueden categorizar en cinco: fijación de nitrógeno; incremento de la disponibilidad de

nutrientes en la rizosfera; incrementando el área de superficie de la raíz; incrementando

otras simbiosis del hospedero; combinando los anteriores modos de acción.

Entre los grupos bacterianos que componen estas bacterias están:

a) Familia Pseudomonadaceae: Son bacterias en forma de bastones rectos o curvos, Gram

negativos, móviles por flagelos polares. Son

controladoras de insectos y nemátodos. Son

quimiorganotróficos, no fermentativos, e incapaces de

fijar nitrógeno; algunos pueden transformar nitratos en

NO2 (g) liberándolo a la atmósfera. Son estrictamente

aeróbicos, catalasa positiva y usualmente oxidasa

positiva. Dentro de esta familia también se encuentran

géneros poco benéficos como Burkholderia malleli

(patógeno y fitopatógeno) y Xanthomonas campestri

(fitopatógeno). Figura 1. Hoja infectada por Xanthomonas Campestris

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b) Familia Azotobacteriaceae. Son bacterias capaces de fijar N molecular en un medio libre

de N con una fuente de carbono orgánico. Entre los géneros de importancia se pueden

indicar: Azotobacter (pueden fijar hasta 10 mg de N atmosférico/g carbohidrato

consumido), Azomonas y Beijerinckia.

c) Familia Rhizobiaceae. Son bacterias de forma de bastón, aeróbicas, Gram negativas,

pleomórficas, móviles con flagelo polar o 2 a 6 flagelos peritricos, no esporuladas. Son

quimiorganotroficos, capaces de utilizar muchos carbohidratos. La temperatura òptima

de crecimiento es de 20ºC y en algunas casos es tan baja como 12ºC o tan altas como

44ºC. Muchos son capaces de fijar nitrógeno en asociación simbiótica con plantas

leguminosas. La familia es subdividida en dos grupos los de crecimiento rápido que

corresponden al género Rhizobium y los de crecimiento lento género Bradyrhizobium;

dos géneros recientemente descritos son Azorhizobium y Sinorhizobium. Los géneros de

importancia agronómica son Rhizobium y Agrobacterium.

d) Familia Acetobacteriaceae. Tres géneros: Acetobacter, Gluconoacetobacter y

Frateuria(Aceto=vinagre, bacterion=barra, bacilo) Son Gram negativos o Gram variables,

móviles con flagelo peritrico (Acetobacter) o polar (Gluconobacter, Frateuria) . Son

oxigénicos obligados, generalmente catalasa positivo y tienen actividades oxidativas.

Gluconoacetobacter diazotrophicus puede ser aislado de plantas de café y caña de

azúcar es una bacteria que produce ácido y fija nitrógeno, es aerobio obligatorio, Es un

fijador de nitrógeno en presencia de oxígeno ya que requiere grandes cantidades de ATP

para realizar el proceso. Son endofitos que se asocian con las plantas colonizando sus

tejidos internos, se ha encontrado que promueven el crecimiento vegetal.

e) Género Azospirillum. Estas bacterias son conocidas desde hace mucho tiempo como

PGPR, se encuentran en la rizosfera de muchos pastos y cereales en suelos tropicales.

Son bacterias Gram negativas fijadoras de nitrógeno de vida libre, son móviles y

presentan una gran versatilidad en el metabolismo del carbono y nitrógeno. Ejerce

efecto benéfico en las plantas debido a la fijación biológica de nitrógeno y la producción

de auxinas (fitohormonas que regulan el crecimiento vegetal)

Materiales, equipos y reactivos

• Muestra de tierra

• 2 cajas de petri

• 1 pipeta volumétrica de 1 a 2 mL o goteros

• 6 tubos de ensayo, tapa rosca 10ml

• 1 gradilla

• 3 matraces Erlenmeyer de 250 mL

• Balanza

• 1 mechero Bunsen o de alcohol

• 1 asa bacteriológica

• Cinta de enmascarar

• Agua destilada

• Azúcar

• Agar Bacteriológico

• 1 parrilla de calentamiento

• Vidrio de reloj

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• Probeta

• 1 Varilla de agitación

• Solución salina 0.85% o agua peptonada 0,1%

• Espátula

• Reactivos medio de cultivo

Procedimiento

Preparación de medios de cultivo y soluciones (sujeto a disponibilidad del laboratorio)

Plate count CZAPEK DOX (g/ litro) Cetrimida (g/ litro)

0.5% peptona 0.25% extracto de carne 0.1% glucosa 1.5% agar

Nitrato sódico 2 g Cloruro potásico 0,5 g Sulfato magnésico 0,5 g Sulfato ferroso 0,01 g Fosfato dipotásico 1 g Sacarosa 30 g Agar agar 12 g

Peptona 20 g Cloruro de magnesio 1.4g Sulfato de potasio 10g Agar 13.6 g Cetrimida 0.3g Glicerina 10 mL

1. Lavar todos los materiales de vidrio

2. Preparar 100 mL solución salina al 0,85%

3. Marcar los tubos de ensayo del 1-10

4. Pesar 10 g de suelo

5. Poner 10 g de suelo en el matraz Erlenmeyer

6. Añadir 90 mL de solución salina

7. Agitar vigorosamente con la varilla de agitación durante 3 minutos (10-1)

8. Tomar 1 mL de la solución y ponerlo en 9 mL de agua destilada. Agitar (10-2).

9. Realizar diluciones seriadas hasta 10-7 (Figura 2)

10. Preparar el/los medios de cultivo 100 mL por grupo

11. Poner el medio en la caja de Petri 1

12. Cuando este sólido añadir 0,1 mL de la dilución 10-5, homogeneizar con ayuda del

asa. Dejar secar e incubar

13. En la placa de Petri 2, tomar 1 ml de muestra diluida y después agregarle 20 ml de

medio a la placa de Petri 2.

14. Marcar e incubar.

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Figura 2. Procedimiento para realizar diluciones hasta 10-8

Pasadas 48 h realizar tinción y completar el cuadro:

Muestra Color Forma Tamaño Apariencia

Cuestionario

• Qué importancia tiene la dilución en el procesamiento de las muestras

• Mediante que mecanismos los microorganismos ayudan a recuperar los suelos

• En dónde es posible encontrar los EM