ORGANIZACIÓN DE UN LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA CLÍNICA

Organización del laboratorio:

• Depende del tamaño• Puede ser una sección

dentro del laboratorio de análisis clínicos o un servicio aparte.

• Existe un facultativo/a responsable del servicio y un supervisor/a.

ESTRUCTURA DE UN LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

• Áreas o Secciones Básicas:

Sección de toma de muestras

Sección de recepción y registro de muestras

Sección de siembra de muestras

Sección de medios de cultivo

Área de almacén

• Áreas o Secciones Especializadas:

Sección de Bacteriología Sección de micobacterias

(Separada y restringido el acceso)

Sección de micología Sección de antibióticos

Sección de serología o inmunomicrobiología

Áreas o Secciones Básicas:Sección de toma de muestras

• Para la obtención de muestras de pacientes ambulatorios

• Las muestras de sangre se extraen en el área común de extracciones de los laboratorios

Áreas o Secciones Básicas:Sección de recepción y registro de muestras

• Se registran las muestras asignándoles el número correspondiente.

• Se realiza una primera evaluación, rechazando las que no cumplan los requisitos.

Áreas o Secciones Básicas:Sección de siembra de muestras

• Procesamiento inicial y siembras en diferentes medios de cultivo

• Deben disponer de esquemas claros de procesamiento rutinario de las muestras

Áreas o Secciones Básicas:Sección de medios de cultivo

• Se fabrican los medios de cultivo y reactivos• Se realiza el lavado del material• Se esteriliza el material, medios y productos

contaminados antes de desecharlos (Autoclave)

Áreas o Secciones Básicas:Área de almacén

• Almacén de medios de cultivo• Almacén de reactivos.

Debe disponer de cámara frigorífica y desecadores para los medios y productos que lo requieran.

Áreas o Secciones Especializadas:Sección de Bacteriología

• Se interpretan los cultivos, tinciones y otras técnicas para la identificación de los microorganismos previamente aislados.

• Se realizan las técnicas inmunológicas de diagnóstico rápido (detección de antígenos en las muestras).

Áreas o Secciones Especializadas:Bacteriología (continuación)

La sección de bacteriología se subdivide en las siguientes áreas:

• Urocultivos• Coprocultivos y Parásitos• Exudados y Anaerobios• Hemocultivos

Áreas o Secciones Especializadas:Sección de micobacterias

Básicamente para el aislamiento e identificación de Mycobacterium tuberculosis

Debido al alto riesgo que conlleva el trabajo con micobacterias esta sección debe estar separada de las demás y restringido el acceso a ella.

Áreas o Secciones Especializadas:Sección de antibióticos

• Se realizan las pruebas de sensibilidad antimicrobiana (antibiograma).

Áreas o Secciones Especializadas:Sección de serología o inmunomicrobiología

• Normalmente en espacio aparte, muy automatizado.

• Detección de antígenos y anticuerpos en suero y otras muestras.

Otras secciones (solo en algunos laboratorios especializados):- Virología- Biología molecular

Niveles de seguridad biológicaCuatro niveles:

Nivel 1: Laboratorios de enseñanza. Se trabaja con microorganismos no patógenos y patógenos oportunistas.

Nivel 2: Laboratorios de hospitales o centros de salud de nivel primario. Se trabaja con Microorganismos y muestras de peligrosidad potencial moderada a alta.

Nivel 3: Laboratorios que trabajan con microorganismos y muestras de alto riesgo.

Nivel 4: Solo en laboratorios de experimentación con microorganismos (especialmente virus) de altísimo riesgo o exóticos.

Técnicas Básicas en Microbiología Clínica.

Material específico:• Medios de cultivo• Placas petri• Tubos, pipetas Pasteur, torundas, morteros y bisturís

estériles.• Asas de siembra• Campanas de Durham• Otros como porta y cubreobjetos, cubetas de tinción,

mecheros, etc.

Técnicas Básicas en Microbiología Clínica.Aparataje en el lab. de microbiología:

• Estufas de cultivo (37ºC – Bacterias patógenas).

• Autoclave y horno pasteur.• Baños termostáticos.• Cabinas de seguridad.• Neveras y congeladores.• Microscopios.

Técnicas de pre-tratamiento de muestras

• Centrifugación: Se realiza a todos los líquidos corporales que son habitualmente estériles excepto orina (sangre, LCR, pleural, etc.), sembrando el sedimento.

• Homogeneización de tejidos: en morteros estériles o tubos de fondo cónico y embolo con 1 a 2 ml de caldo nutritivo

• Sembrar mediante una pipeta Pasteur estéril en los medios de cultivo adecuados.

Preparación de extensiones para tinción

• Improntas de tejidos.• Extensiones finas: Para

muestras no sólidas.– Se extiende

homogéneamente una pequeña gota de exudado sobre el porta. (Con asa: Frotis)

– Si la muestra es demasiado espesa: Diluir con solución salina.

Técnicas de siembra de las muestras más comunes

• ORINA: Con asa calibrada (1µl, 5 µ l, etc). Homogeneizar por agitación previamente la orina y confirmar la formación de película en el asa). Sembrar:

Técnicas de siembra de las muestras más comunes

• Siembra de muestras a partir de torundas:– Provienen de exudados faríngeos, óticos,

conjuntivales, endocervicales, uretrales, etc.).– Se aplica técnica de siembra para aislamiento

por agotamiento del asa en placa.

Técnicas de siembra de las muestras más comunes

• TEJIDOS: – Homogeneizar.– Depositar unas gotas con una pipeta Pasteur en los medios

líquidos.– Técnica de aislamiento en los sólidos.

• EXUDADOS: Sembrar directamente.• LÍQUIDOS CORPORALES PREVIAMENTE CENTRIFUGADOS:

Sembrar el sedimento.• CATETERES INTRAVENOSOS: Hacer rotar la punta del

catéter sobre una placa de agar-sangre (técnica de Maki).• ORINA: Homogeneizar invirtiendo el tubo y sembrar.

INTRODUCCIÓN AL ANÁLISIS BACTERIOLÓGICO

• Recolección, transporte y conservación de las muestras.

• Exámen macroscópico.• Exámen microscópico.• Cultivo y aislamiento.• Identificación bioquímica y susceptibilidad a

los antimicrobianos.• Inoculación en animales de experimentación.• Pruebas serológicas complementarias.

Recolección, transporte y conservación de las muestras.

• Tomar la muestra antes de la administración de antimicrobianos.

• Tomar del sitio más probable de hallar el microorganismo infeccioso con mínima contaminación externa.

• En estadío agudo de la enfermedad.• Cantidad suficiente para que permita un análisis completo.• Recoger en recipientes estériles.• Entrega de inmediato al laboratorio.• Acompañada de datos clínicos suficientes.• Se puede usar medio de transporte para conservar viabilidad de

los microorganismos (Medio Stuart).

Exámen macroscópico• Aspecto, color, olor, pH, densidad, contenido

de proteínas, etc.• Brindan información adicional de utilidad para

la evaluación integral de la muestra en estudio.

Exámen microscópico• Se busca el agente etiológico por microscopía óptica.• Exámen en fresco: Gota de la muestra, diluída si es necesario,

entre porta y cubre-objetos.• Exámen con técnicas de coloración: Extendido con cantidad

reducida del material en estudio, sobre un porta-objetos y una vez seco se lo fija con calor o metanol.

En base a la observación microscópica se pueden seleccionar los medios de cultivo y las técnicas a emplear para la identificación del microorganismo.

Tinciones• Son técnicas que permiten observar microorganismos en función de

la capacidad de los mismos para retener o no determinadas sustancias colorantes, lo que depende de la carga de la célula y del colorante. Los colorantes pueden ser de distintos tipos:

• Catiónicos: Son sustancias que tienen carga positiva. Penetran en el interior de las células y las tiñen. Ejemplos: azul de metileno, cristal violeta, safranina.

• Aniónicos:Con carga negativa. No penetran en el interior celular, de modo que no tiñen las células, sino el entorno. En este caso se habla de tinción negativa. Ejemplos: eosina, nigrosina.

• Liposolubles. Se mezclan con los lípidos celulares y los tiñen. Ejemplo: negro sudán.

Las tinciones pueden ser:• Simples: Utilizan un solo colorante. Se basan en el hecho de que

las células tienen una composición química diferente a la de su entorno, de modo que ambos se comportan de forma diferente frente a un colorante. El colorante tiñe las células (azul de metileno, safranina) o no (nigrosina).

• Diferenciales: Se basan en el hecho de que distintos tipos de células tienen diferente composición química, y por lo tanto no reaccionan de igual forma frente a una tinción, lo que permite clasificar los microorganismos en diferentes grupos, según su capacidad de tinción. Tinción de Gram y la de ácido-alcohol resistencia (de Ziehl-Neelsen). Estas utilizan más de un colorante.

• Selectivas: Se basan en el hecho de que distintas estructuras celulares tienen diferente composición química, de modo que se tiñen selectivamente con ciertos colorantes. Ej: tinción de esporas, de flagelos, de paredes celulares, de corpúsculos metacromáticos. Pueden utilizarse uno o más colorantes.

Ejemplo de tinción simple positiva Azul de metileno (Tinción positiva). Permite teñir el interior celular. Tiñe

microorganismos procarióticos (vivos o muertos). Los eucarióticos sólo se tiñen si están muertos. Algunas estructuras, como los corpúsculos metacromáticos, se tiñen más intensamente con este colorante que el resto de la célula.

Procedimiento:1. Extensión: poner una gota de agua en el portaobjetos y extender en ella

la muestra (Escherichia y Bacillus ) utilizando el asa de siembra.2. Fijación: pasar el portaobjetos varias veces por encima de la llama del

mechero de alcohol, sin permitir que llegue a hervir, hasta que se seque.

3. Añadir Azul de metileno y esperar 2 minutos.4. Lavar con agua.5. Secar.6. Observar primero con el objetivo 40×; luego se añade aceite de

inmersión y se observa con el objetivo 100×.

Ejemplo de tinción simple negativaNigrosina (Tinción negativa). Se trata de un colorante aniónico, que

no penetra en el interior celular. Proporciona una visión de la forma y el tamaño celulares al observarse los microorganismos brillantes sobre un fondo oscuro.

Procedimiento:1. Colocar una gota de Nigrosina sobre uno de los extremos del

portaobjetos.2. Extender la muestra (Escherichia y Bacillus) en la gota con el asa de

siembra.3. Realizar un frotis: con un segundo portaobjetos se extiende la

muestra de modo que cubra toda la superficie del primero.4. Secar al aire.5. Observar (primero 40× y luego 100× con aceite de inmersión).

Ejemplo de tinción selectivaTinción de endosporas. Las bacterias de los géneros Bacillus y

Clostridium se caracterizan porque forman endosporas. Estas son formas de resistencia que garantizan la supervivencia de la especie en situaciones adversas (agotamiento de nutrientes, cambios de temperatura, acumulación de metabolitos tóxicos...). Estas estructuras, que contienen una copia completa del genoma, se desarrollan en el interior de la célula bacteriana y cuando la célula muere y se lisa la endospora queda libre. Germinarán cuando las condiciones ambientales vuelvan a ser favorables. Algunas enfermedades muy conocidas son producidas por especies de los géneros Clostridium [ej. C. tetani (tétanos), C. perfringens (gangrena gaseosa) y C. botulinum (botulismo)] y Bacillus [ej. B. anthracis (antrax)].

Procedimiento: Método de Wirz.1. Extensión (B. megaterium).2. Desecación y fijación por calor. Cubrir con papel de filtro y teñir con

Verde malaquita. Pasarlo por encima de la llama del mechero para que haya emisión de vapores. Cuando dejen de salir vapores volver a pasar la muestra por encima de la llama, volviendo a empapar el papel con colorante si es necesario. Repetir hasta 10 minutos.

4. Retirar el papel y lavar con agua.5. Teñir con fucsina durante 3 minutos.6. Lavar con agua.7. Secar.8. Observar (100×). Se observan las esporas verdes y las formas

vegetativas rojas.

Método de Moeller: Acido crómico 5%-5min. Fucsina fenicada 10 min. Alcohol ácido 20-30 seg. Azul de metileno 5 min. Esporas rojas y formas vegetativas azules.

Tinciones diferenciales.Tinción de Gram: De gran importancia en Microbiología porque

permite diferenciar dos grandes grupos de bacterias (Gram+ y Gram-), según se comporten ante esta tinción.

Fundamento: radica en la diferente estructura de la pared celular de ambos grupos:

• bacterias Gram+ : tienen una gruesa capa de peptidoglicano en su pared.• bacterias Gram- : tienen una capa de peptidoglicano más fina y una capa

lipopolisacarídica externa. Luego de fijar con calor se efectúa la tinción con el primer colorante (Cristal

violeta, 1 min-30 seg), se lava con agua y se cubre con Lugol 1 min. Se lava con agua y luego se decolora 30 seg con etanol-acetona que arrastrará al colorante sólo en las Gram (-), mientras que en las Gram (+) el colorante queda retenido y las células permanecerán VIOLETAS. Las células Gram (-) se teñirán después con un colorante de contraste (fucsina diluída, 3 min) para que puedan observarse de color ROSA.

Gram(-)

Tinción de ácido-alcohol resistencia (Ziehl-Neelsen):

• Se basa en que ciertos microorganismos resisten la decoloración con alcohol ácido si han sido previamente teñidos con fucsina fenicada. Una vez realizada la decoloración con esta mezcla se utiliza un colorante de contraste (azul de metileno) para poder observar las células sensibles a la decoloración con alcohol ácido.

• Son microorganismos ácido-alcohol resistentes las micobacterias, debido a la composición de su pared celular (tiene ácidos micólicos). Esta tinción tiene interés desde el punto de vista del diagnóstico clínico puesto que algunos microorganismos patógenos son ácido-alcohol resistentes, tales como Mycobacterimum tuberculosis (tuberculosis) o M. leprae (lepra).

Las micobacterias se ven Rojas y el resto azul.

Procedimiento:

1. Extensión (Mycobacterium phlei y Micrococcus luteus).2. Desecación y fijación al calor.3. Teñir con Fucsina fenicada con Ziehl-Neelsen y pasarlo por encima de la

llama del mechero para que haya emisión de vapores. Cuando dejen de salir vapores volver a pasar la muestra por encima de la llama, volviendo a empapar el papel con colorante si es necesario. Repetir hasta 10 minutos.

4. Añadir ácido-alcohol y esperar 30 segundos.5. Lavar con agua.6. Añadir azul de metileno (colorante de contraste) y esperar 6 minutos.8. Lavar con agua.9. Secar.10. Observar (100×).

Otro tipo de tinciones• May Grunwald Giemsa: Solución de eosina y azul de metileno

disueltas en metanol. Sirve para detectar microorganismos intracelulares. Núcleos azules (acidófilos) y citoplasmas (basófilos) rosas. Bacterias azules.

• Tinción de flagelos: Muy dificil de captarlos. Se forma un precipitado de nitrato de plata alrededor del flagelo y de esta manera lo engrosa.

• Tinción de cápsula: Muy difícil teñirlas. Lo mejor es teñir el fondo y que el germen resalte la cápsula sin teñir. Método de Antony: cápsulas azules y microorganismo azul-violeta oscuro. Método de burri: Fondo negro, microorganismo rojo y la cápsula como un halo blanco que lo rodea.

Cultivo• Medios de cultivos que sirven para el desarrollo, aislamiento e identificación de

los microorganismos ya que la mayoría de las bacterias patógenas pueden cultivarse artificialmente.

• Medios de cultivo usados normalmente: Líquidos, semisólidos y sólidos.• Se necesitan otros factores importantes para el cultivo: la tº (35-37ºC) y la

presión de oxígeno o de dióxido de carbono.• La mayor parte de las bacterias causales de infecciones humanas son: Aerobias,

anaerobias facultativas y en menor grado anaerobias estrictas (jarra con sales de Bicarbonato de sodio, borhidruro de sodio, agua y catalizador paladio o Tubo tapado y calentado).

• Los microorganismos pueden ser QUIMIÓTROFOS (heterótrofos: Fuente de C de comp. orgánicos o autótrofos: CO2), los que usan una fuente de energía química. FOTÓTROFOS (heterótrofos: Fuente de C de comp. orgánicos o autótrofos: CO2), los que usan una fuente de energía lumínica.

QUIMIOHETERÓTROFOS: Animales, mayoría de los hongos, protozoos y bacterias (aceptor final de e-: O2) Aerobios. Aceptores no O2: Fermentadores (compuesto orgánico), Streptococcus. Anaerobios (compuestos inorgánicos), Clostridium.

Medios de cultivo• Fuente de energía apropiada (H de C, aunque también se usan para

pruebas de identificación bioquímica ). Ojo esterilización!• Minerales.• Factores de crecimiento que son incapaces de sintetizar por sí

mismos.• Factores estimulantes.• pH adecuado: 6,8-7,6• En general son isotónicos.• Proteínas (fuente de N y a veces de C). Aa: sólo en medios para

pruebas de identificación bioquímica.• Indicadores de pH (Rojo fenol). Ojo inhibidores!• Agentes gelificantes para medios sólidos (Agar). Cada bacteria tiene necesidades de crecimiento diferentes a otras

y eso se aprovecha para fabricar medios de cultivo con distinta composición y así aislar determinados patógenos.

GENERALES:

Los medios generales son medios ricos que permiten el crecimiento de la gran mayoría de los microorganismos. Se utilizan en la siembra primaria de las muestras clínicas para recuperar a casi cualquier agente patógeno. Uno de los medios generales más utilizados en el laboratorio es el agar sangre.

Medios químicamente definidos

Al preparar el cultivo microbiano se debe tener en cuenta que hay que añadir al medio una fuente de energía así como de C, N, S, P y cualquier factor necesario para el crecimiento que el microorganismo sea incapaz de sintetizar. Un medio químicamente definido es aquel del que se conoce la composición química exacta.

Los microorganismos que necesitan muchos factores de crecimiento se denominan EXIGENTES: Lactobacillus.Un medio definido químicamente mucho más sencillo es el que requiere para el crecimiento E. Coli, una bacteria menos exigente.

Medios complejosLa mayoría de las bacterias heterotróficas y los hongos se cultivan de forma rutinaria en medios complejos cuya composición química exacta VARÍA ligeramente de un lote a otro. Éstos medios están formados por nutrientes como extracto de levadura, de carne o de vegetales, o por digeridos de proteínas de éstas u otras fuentes.

Las necesidades de energía, C,N y S de los microorganismos en crecimiento están ampliamente cubiertas por las proteínas.Si este tipo de medio esta en forma líquida se denomina CALDO NUTRITIVO y cuando se le añade agar se llama AGAR NUTRITIVO.

Medios Mínimos

Medio que representa en su composición la base mínima de nutrientes capaz de permitir el desarrollo de los microorganismos en estudio.

Medios SelectivosSe utilizan para inhibir el crecimiento de bacterias no deseadas y facilitar el

de las que se buscan. Por ejemplo el agar de sulfuro de bismuto se utiliza para aislar de las heces la bacteria Gram negativa de la fiebre tifoidea, Salmonella

typhi.Los colorantes como el verde brillante inhiben selectivamente a las bacterias Gram positivas y éste colorante es la base del medio denominado agar verde

brillante utilizado para el aislamiento de Salmonella.Existen dos factores importantes de cultivo selectivo para un determinado

organismo: A) Las condiciones de cultivo deben ser FAVORABLES al organismo que se

quiere enriquecer.B) El medio debe hacerse lo más DESFAVORABLE posible para el desarrollo

de los otros organismos.

* Enriquecimiento: se basa en una libre competencia entre diferentes organismos en medio líquido. Si se inocula en un medio selectivo líquido una variedad de organismos y se incuba bajo determinadas condiciones aquellos microorganismos para los que el ambiente sea más favorable crecerán más que los otros y finalmente serán predominantes. Un ejemplo de este medio es el caldo de tioglicolato (aerobios estrictos, anaerobios facultativos y anaerobios estrictos).

* Técnica de aislamiento directo: se emplean en medios sólidos, de esta forma se evita la competencia entre los diferentes tipos microbianos; la dispersión de los organismos sobre el medio elimina en gran parte una competencia por los nutrientes y por eso las bacterias que crecen lentamente son capaces de producir colonias en el mismo ambiente que las que crecen rápidamente. Por lo tanto, esta técnica aísla el número máximo de tipos de microorganismos que son capaces de crecer en determinadas condiciones.

Medios Selectivos

Medio DiferencialLos medios diferenciales hacen más fácil la distinción de las colonias de los microorganismos buscados respecto de otras colonias que crecen en la misma placa. Suelen identificarse casi siempre de acuerdo a la cromogénesis.El agar McConkey es un medio sólido que permite el crecimiento de bacilos Gram negativos fermentadores y no fermentadores de lactosa. Los primeros adoptan una coloración rosada que los diferencia de los segundos. Los medios diferenciales además pueden poner de manifiesto mezclas y contaminaciones en las placas de cultivo.

Tipo de medio AplicaciónQuímicamente definido Cultivo de quimioautótrofos,

fotoautótrofos y para ensayos microbiológicos.

Complejos Para la mayoría de los microorganismos quimioheterótrofos

Reductor Para anaerobios estrictos

Selectivo Inhibe el crecimiento de microorganismos indeseables, favorece el de los buscados

Diferencial Permite distinguir las colonias de los microorganismos buscados de las de otros.

Enriquecimiento Similar a los selectivos, pero diseñados para aumentar el número de los microorganismos buscados hasta niveles detectables.

General Permite el crecimiento de cualquier tipo de bacteria.

Medios deshidratados o liofilizados: Son medios que se comercializan tal cual y una vez en el laboratorio deben ser preparados adicionando la cantidad de agua correspondiente en condiciones totalmente asépticas y se llevan a pH si es necesario.

Medios ya preparados: Elaborados por las casas comerciales presentando un determinado control de calidad y características específicas adecuadas a cada tipo de cultivo.

Medios sólidos en placa Petri: Son medios sólidos que ocupan una superficie lo suficientemente grande como para poder visualizar perfectamente las colonias microbianas.

Clasificación de medios de cultivo según su presentación

Medios sólidos en tubo: Corresponden a tubos con agar inclinado (pico de flauta) y solidificado con el fin de aumentar la superficie donde se va a producir el crecimiento microbiano una vez sembrado. Son útiles para observar el crecimiento aerobio microbiano si se ha sembrado por estría, el crecimiento anaerobio microbiano si se ha sembrado por picadura (anaerobiosis facultativa) y para la conservación de cepas.

Medios líquidos en tubo: No permiten visualizar colonias sino que sirven para realizar pruebas bioquímicas o para aumentar la concentración del microorganismos inoculado. Estos medios no contienen agar.

Medios semisólidos en tubo: Se siembran por picadura y se utilizan en ciertas pruebas bioquímicas como la prueba de la movilidad, la prueba de oxidación-fermentación.

Medios de doble fase en frasco o tubo: Constituidos por una fase sólida y otra líquida. Suelen contener obturadores de caucho manteniendo completamente aislado el medio.

Medios de cultivo más utilizados en el laboratorio

* El agar sangre y el agar chocolate son los medios más frecuentemente empleados en el laboratorio. Son medios generales en los que crecen la mayor parte de las bacterias patógenas. Constan de un medio base de nutrientes, agar y sangre de caballo o carnero que constituye un suplemento nutricional para el cultivo. La única diferencia entre ambos es que en el agar chocolate la sangre está hemolizada de modo que todos los factores nutricionales, tanto extra como intraeritrocitarios están a disposición de los microorganismos. Por eso el agar chocolate puede considerarse como de enriquecimiento en relación con el agar sangre. Haemophylus influenzae es un bacilo Gram negativo exigente que necesita de factores intraeritrocitarios para crecer y atmósfera rica en CO2. No crece en agar sangre y si en agar chocolate incubado en alta concentración de CO2.

* En los laboratorios de microbiología se utilizan también medios líquidos sobre todo de enriquecimiento. Recuperan microorganismos exigentes en sus requerimientos e inóculos bajos en las muestras clínicas. Los medios de tioglicolato y tripticasa de soja son los más comunes.* El agar McConkey es el medio selectivo para bacilos Gram negativos más frecuentemente utilizado . * Otros medios selectivos son el manitol salado, caldo selenito, el agar Campylosel para Campylobacter y Helicobacter, medio CIN para Yersinia, etc. Los medios de Sabouraud específicos para hongos también pueden considerarse como selectivos porque suelen inhibir el crecimiento bacteriano.* El medio de Schaedler es un medio sólido muy enriquecido que se utiliza para el cultivo de microorganismos anaerobios.* Los medios de Mueller-Hinton con y sin sangre son los estandarizados en la realización de pruebas de antibiograma.

Existen muchos otros medios de cultivo, la mayoría específicos para el aislamiento de microorganismos en particular y por tanto con uso más restringido :

-Agar lactosado con púrpura de bromocresol: Compuesta fundamentalmente por lactosa y púrpura de bromocresol. Se emplea para el aislamiento de coliformes (enterobacterias lactosa positiva que provoca el viraje del púrpura de bromocresol a amarillo).-Medio base Bordet-Gengou: Compuesta por cloruro sódico y peptona fundamentalmente sirve para el aislamiento de Bordetella pertussis (tos ferina) que forman colonias parecidas a gotitas de mercurio. - Medio Chapman o Sal-Manitol: Compuesta fundamentalmente por rojo fenol, D-manitol y concentraciones altas de cloruro sódico. Sirve para el aislamiento de especies del género Staphylococcus.- Medio para Hemophillus (Agar chocolate polyvitex): Compuesto por agar chocolate Polyvitex. Se utiliza para el aislamiento y estudio del Género Haemophyllus.

- Agar sangre o medio agar Columbia: Su principal compuesto es la sangre de cordero. Es un medio adecuado para el aislamiento de estreptococos y pneumococos .-Agar desoxicolato citrato : Sus componentes principales son el desoxicolato sódico y el citrato ya que van a inhibir los gérmenes Gram+ y ciertos Gram – sirviendo de aislante de enterobacterias patógenas (colonias transparentes, rojas, naranjas rojizas o amarillas).

- Medio agar DCLS (desoxicolato-citrato-lactosa-sacarosa): Los compuestos principales son el tiosulfato sódico, el desoxicolato sódico y el citrato. Sirve para aislar salmonella, shigella (transparente rosáceas) y vibrio (colonias rojas). - Medio de agar Endo: Sus compuestos principales son la lactosa y la fucsina básica. Sirve para el aislamiento de coliformes (colonias incoloras de bacterias gram- lactosa-) y de enterobacterias (rosas o rosadas lactosa +).

- Medio MacConckey: Los principales compuestos son las sales biliares y el cristal violeta, ya que se ocupan de inhibir a los gérmenes Gram+. Sirve para el aislamiento e identificación de enterobacterias. En este medio nos pueden salir colonias rojas o rosadas (E.coli), incoloras (Salmonella, Shigella y Pseudomonas), rosadas y mucosas (Enterobacter aerogenes).

-Medio Loeffler: Sirve para la determinación del bacilo diftérico (Corynebacterium diptheriae) ya que a las 24 horas aparece una superficie blanquecina.

-Medio Mueller Hinton: Se les suele añadir una mezcla de VCN (Vancomicina, Colimicina, Nistatina) para inhibir el crecimiento de los microorganismos que no sean meningococos o gonococos. Sirve como ya hemos dicho para el aislamiento de Neisserias y para la realización de antibiograma.Además, también se utiliza para la determinación de Haemophilus Influenzae.

-Medio agar nutritivo: Es para cultivo de gérmenes en general por lo que sus compuestos están habilitados para todo tipo de microorganismos.

- Medio caldo F-Selenito: Su compuesto principal es el selenito sódico que sirve de alimento para el aislamiento de Salmonella inhibiendo la enterobacteria que están abundantes en las heces.

-Medio agar S-S: Los componentes principales son la lactosa (crea colonias rojas o rosadas), el tiosulfato sódico y el citrato férrico (precipitado negro + en SH2, Salmonella) y las sales biliares que inhibirán a todos los microorganismos Gram +. Cuando no reacciona nada y aparecen unas colonias incoloras deberemos saber que son Shigellas.- Medio agar verde brillante: Los compuestos fundamentales son la lactosa, la sacarosa (positivas en microorganismos no Salmonella de color verdoso) y el rojo fenol (vira a rojizo o rosa con la presencia de Salmonella). Sirve para el aislamiento de la Salmonella, excepto Salmonella typhi y Salmonella paratyphi.- Medio Agar XLD (agar xilosa, lisina, dexicolato): Los compuestos principales son la L-lisina, el rojo fenol, el tiosulfato sódico, el citrato de hierro y azúcares (lactosa, glucosa y xilosa). Sirve para aislar enterobacterias patógenas. Para hacer la lectura hay que seguir los siguientes criterios: * La descarboxilación de la lisina: colonias rojas característico de Shigella. * Fermentación de azúcares: Colonias amarillas tipos de Escherichia, Citrobacter, Serratia, Proteus, Enterobacter y Klebsiella. * Producción de SH2 (debido a tiosulfato sódico y citrato férrico): colonias negras típico en Salmonella SH2 +, Proteus y Edwardsiella.

- Medio Castañeda: Contiene sustancias inhibidoras de la posible actividad bactericida. Sirve para la identificación de Brucella, Vibrios y Pasteurella en sangre (presencia de turbidez, hemólisis y gas).

- Medio Löwensteins-Jensen: Sus componentes principales son la fécula de patata (sirve como enriquecimiento del medio específico para micobacterias) y verde malaquita o rojo congo (inhiben el crecimiento de la mayor parte de las bacterias). Sirve para el cultivo de Mycobacterium tuberculosis y otras Mycobacterias.

- Medio Sabouraud: Su compuesto principal es la glucosa que está en altas concentraciones lo que impide el crecimiento bacteriano. Sirve para el aislamiento e identificación de hongos que suelen tener un aspecto algodonoso.

- Medio Agar TCBS: las colonias sacarolíticas se visualizan como colonias amarillas por la acidificación. Sospecha del V. Cholerae. Las colonias no sacarolíticas se visualizan como colonias verdes.Las bacterias productoras de gas sulfhídrico se visualizan con centro negro. Éstas últimas como las no fermentadoras de sacarosa no son importantes en la búsqueda del V. Cholerae.

-Medio de Thayer - Martin Modificado: medio enriquecido ideado para el desarrollo selectivo de N. Gonorrhoeae y N. Meningitidis (microorganismos con marcada exigencias nutricionales), a partir de muestras clínicas con flora bacteriana mixta.

-Medio Agar Cetrimida: medio utilizado para el aislamiento selectivo de Pseudomonas Aeruginosa y de otras especies del género.

- Medio Agar Soya Tripticasa (TSA): Es para cultivo de gérmenes en general por lo que sus compuestos están habilitados para todo tipo de microorganismos. (Ejemplo: E. Coli).

-Medio de agar Levine (EMB: Eosina Azul de Metileno): medio selectivo diferencial de aislamiento para bacilos Gram negativos de la familia enterobacterias, que permiten distinguir las bacterias fermentadoras, no fermentadoras y fermentadoras tardías de la lactosa. Los colorantes EMB inhiben el desarrollo de algunas bacterias Gram positivas y además precipitan a pH ácido cuando desarrollan en él bacterias que utilizan la lactosa produciendo ennegrecimiento de las colonias.

Identificación bioquímica y sensibilidad a los antimicrobianos• Identificación: Por medio de características

macro y microscópicas de las colonias, propiedades bioquímicas basadas en el metabolismo particular bacteriano, reacciones inmunológicas y pruebas de sensibilidad a los antibióticos (Antibiogramas).

1) Obtener un cultivo puro. 2) Examen microscópico de células vivas para determinar la forma y

del frotis teñido se observa la coloración de Gram. También es importante determinar la agrupación y la presencia de esporas y otras características morfológicas de interés.

3) Determinar las características nutricionales (en general se desprenden de los métodos empleados en el aislamiento y cultivo anteriores)

4) Realización de pruebas bioquímicas primarias: Gram, morfología, catalasa, oxidasa, fermentación de glucosa,

esporas, crecimiento en aerobiosis y anaerobiosis y movilidad. 5) Realización de pruebas secundarias y terciarias a efectos de llegar

a la especie. Estas dependerán del género o familia determinado. (ej: producción de pigmentos, producción de indol a partir de triptofano, producción de coagulasa, de fenilalanina deaminasa, etc.)

A los efectos de realizar identificaciones más rápidas, o cuando las pruebas bioquímicas no son concluyentes, se recurre al uso de antisueros específicos. Los antígenos bacterianos pueden ser capsulares, somáticos (O) que corresponden al lipopolisacárido de la pared de los Gram negativos, flagelares (H), y los antisueros se identifican con esas letras y el número o letra del antígeno correspondiente. En una primera identificación se usan sueros polivalentes y para la caracterización serológica se usan sueros monovalentes dentro de cada tipo de antígeno. Existen en el comercio antisueros para caracterización de: Salmonella, Shigella, E.coli, Haemophilus, etc. También se pueden utilizar métodos de cromatografía gaseosa para identificar productos metabólicos, en particular para la identificación de bacterias anaerobias no esporuladas como: Bacteroides, Fusobacterium, etc

Serotipo

Cocos Gram +• Micrococcaceae Micrococcus spp Staphylococcus S. aureus S. epidermidis S. saprophyticus S. haemolyticus

• Cocos Gram + catalasa - Streptococcus S. pyogenes (grupo A) S. agalacteae (grupo B) Estreptococos gupos C y G S. pneumoniae Estreptococos del gupo viridans S. bovis Enterococcus E. feacalis E. faecium

• Neisseria N. gonorrhoeae N. meningitidis • Aerobios estrictos. Crecen mejor en atmósfera con 2-8% CO2.

• Oxidasa y catalasa positivos.• Producen pigmentos carotenoides.• Tienen altos requerimientos nutricionales. Medios complejos.• Se presentan en pareja, tétradas o grupos mayores. • Aspecto arriñonado.• Pueden encontrarse en el interior de neutrófilos.• Habita mucosas de animales de sangre caliente, incluído el

hombre.• No se encuentran en vida libre.

Cocos Gram -

Bacilos Gram +• Bacillus B. anthracis B. cereus B. subtilis B. micoides

• Clostridium C. perfringens C. botulinum C. tetani C. difficile C. septicum

Bacilo de gran tamaño, aparece solo o en cadenas, aerobio, catalasa + y productor de endosporas

Anaerobios obligados, forman endosporas, aspecto de palillo de tambor, catalasa –Ampliamente distribuidos. Causan enfermedad por factor desencadenante y la patogenicidad dada por toxinas.

Bacilos Gram -• Enterobacterias Salmonella S. typhi Shigella S. disenteriae Escherichia coli E. coli Yersinia Y. pestis Y. bubónica Y. enterolítica Citrobacter C. freundii Klebsiella K. pneumoniae Enterobacter E. cloacae Serratia S. marcescens S. liquefaciens Proteae Proteus P. mirabillis P. vulgaris Morganella M. morganii • Anaerobios facultativos(Haemophilus, Gardnerella, Aeromonas, Vibrio)

• Aerobios y microaerófilos (Pseudomonas, Legionella, Brucella, Bordetella, Campylobacter)