manual de prácticas de laboratorio microbiología

8/20/2019 Manual de Prácticas de Laboratorio Microbiología

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UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS

FACULTAD DE INGENIERÍAESCUELA REGIONAL DE INGENIERIA SANITARIA

Y RECURSOS HIDRÁULICOSLABORATORIO DE QUÍMICA Y MICROBIOLOGÍASANITARIA

MANUAL DE PRACTICAS DELABORATORIO

MICROBIOLOGIA DEL AGUA

CATEDRÁTICO:

ING. M. SC. ZENON MUCH SANTOS


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PRACTIC A No.1

O BJETIVO S

1 Observar e iden tificar el equipo más utilizado en el Laboratorio de Microbiolo gía.

2. Discu tir cada u na de las partes c on que co nsta el microscopio, sus cuid ados yfunci onamiento.

E QUIPO MÁS UTILI ZADO EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOG ÍA:

T ubo d !"#$o %o! C# d P'() A" #" d I!o %u*#%+,!T #-,! d Ro"%#

B#*#!#" /(#!# '#(+#"

A /+'#do(" d V+d(+ o B#*#!#" #!#*)'+%#"

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Bo'**# d V#! Do(! -#(# (%o*%%+,! d u"'(#" d # /u# ! *#/o"3


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I!%ub#d o(# C# -#!# d Ab"o(%+,!

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P#-* 5+*'(o bob# d V#%+o

Mb(#!# d 5+*'(#%+,! M%6(o b u!"!

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MICROSCOPIO

USO DEL MICROSCOPIO

1. El microscopio deberá estar colocado sobre un escritorio o una mesa apropiada.

2. on su base !acia adelante. La plataforma o platina debe estar en posici"n !orizontal.

7. Los oculares y los ob#etivos deberán ser cuidadosamente limpiados antes de empezar ausar el microscopio. Este tipo de operaci"n se !ará con un tipo de papel especial $lens

paper%. Los lentes ob#etivos no deben ser removidos de la pieza llamada revolver, a menos

que sea necesario !acer una limpia más efectiva. Lo cual la realizará un e&perto.

8. 'ara limpiar el lente de inmersi"n, con ob#eto de remover el aceite de inmersi"n se frotacon papel de lentes !umedecidos con &ilol.

9. 'ara empezar a !acer uso del microscopio, coloque el tubo con los oculares y ob#etivos,empleando en esta operaci"n el tornillo macro(m)tricos, a una distancia normal correcta

$más o menos *+mm% de la plataforma.

. La iluminaci"n del ob#eto a observar, se lleva a cabo por a#ustes del espe#o con respecto ala naturaleza de la fuente de luz $sea natural o artificial%, esta operaci"n debe !acerse de

manera cuidadosa para la obtenci"n de buenos resultados.

;. -i el condensador se encuentra equipado al microscopio, debe usarse siempre el espe#oplano, si el microscopio no posee condensador deberá usarse el espe#o c"ncavo con el

ob#eto de obtener una iluminaci"n más intensa.


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CUIDADO DEL MICROSCOPIO

1. uando se efectu) preparaciones en fresco prote#a los lentes del microscopio conlaminillas o cubre ob#etos, colocándolas sobre el material que esta en la lamina.

2. uando termine sus observaciones microsc"picas, proceda a la limpieza de los lentes,tanto oculares como ob#etivos, por medio de papel para lentes. El lente de inmersi"n

límpielo con papel de lentes !umedecido con &ilol.

7. uando guarde o transporte el microscopio de un lugar a otro s3rgetelo con las dos manos,una en el brazo del microscopio y la otra en la uni"n de la base o de ser posible

transp"rtelo en su ca#a.

8. 4uarde el microscopio siempre libre de polvo.

9. 1unca use alco!ol para limpiar las partes laqueadas del microscopio, pues este act3acomo solvente de lacas.

. -i se realizan observaciones con los ob#etivos secos, usar el espe#o c"ncavo y ba#ar el

condensador.

;. uando se !agan observaciones con los ob#etivos de inmersi"n, asegurarse de que elob#etivo sea el correcto. -i se emplea otro, el aceite puede desprender el lente. En las

observaciones por inmersi"n utilice el espe#o plano y suba el condensador !asta tocar la

parte inferior del portaob#etos.


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PRACTICA No. 2

E?AMEN MICROSCOPICO DE UNA PREPARACI@N EN 5RESCO

OBJETIVOS

*. 5acer uso del microscopio en forma correcta y como lo indica la practica 1o. *.

6. 5acer observaciones sobre el arreglo, forma, tama2o, movilidad de varias clases

de microorganismos que se encuentran tanto en la parte superficial como en el

sedimento de la infusi"n que !ay.

MATERIAL REQUERIDO:

*. Laminas de microscopio $portaob#etos%

6. ubreob#etos de microscopio.7. Micro pipeta.. 0gua estancada.8. Microscopio.+. 9ilol.

:. Lens 'aper.

PROCEDIMIENTO

*. aliente ligeramente un lado de la lámina por medio de una llama de lámpara de

alco!ol o mec!ero bunsen, con ob#eto de remover grasa si )sta estuviera presente.

6. oloque la lámina con el lado flameado para arriba, sobre la mesa limpia.

7. 'or medio de una micro pipeta, recoger una peque2a cantidad de la superficie de

la sustancia liquida de la infusi"n que !ay y coloque una gota con todo cuidado en

una lámina limpia de microscopio.

. Enfoque con el ob#etivo de menor potencia.

8. Despu)s de enfocado, por medio del revolver observe con un ob#etivo de mayor

potencia.

+. E&amine el material con ob#eto de encontrar microorganismos tales como

bacterias, infusorios, algas etc.

:. ;epita los pasos anteriores, usando una gota de sedimento de la infusi"n que !ay.


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PRACTICA No. 7

TINCIONES BACTERIANAS

GENERALIDADES

=res características básicas de los microorganismos !acen necesarios el empleo de t)cnicas

especiales en al investigaci"n microbiol"gica.

a% -u tama2o diminuto.

b% La aparente ausencia de diferencias individuales.c% -u amplia distribuci"n en la naturaleza.

Durante el procedimiento se usan siempre t)cnicas as)pticas $ausencia de microorganismos%,

estos m)todos son adecuados para prevenir la contaminaci"n del medio de los microorganismos.

El procedimiento más corriente para estudiar la morfología bacteriana consiste en el e&amen de unfrotis que, previa fi#aci"n se ti2e con alg3n colorante y se e&amina despu)s microsc"picamente con

el ob#etivo de inmersi"n.

Debe e&tenderse el material con ob#eto de formar una película delgada y obtener así una sola capa

de bacterias perfectamente separadas sobre el portaob#etos. on esta preparaci"n previa, pueden

distinguirse perfectamente c)lulas aisladas ya que, de otra forma los microorganismos se

aglomeran en masas s"lidas impenetrables a la luz.

Es vital la tinci"n pues, de lo contrario, la diminuta c)lula bacteriana en su estado natural permitirá

el paso de cantidad e&cesiva de luz y apenas se distinguiría en un campo brillantemente iluminado,

si se redu#era la luz, se apreciaría como una espícula grisácea sobre fondo gris.

Las c)lulas toman la tinci"n total o parcialmente, de acuerdo con una reacci"n química entrealguna sustancia celular y el colorante o bien, su superficie queda te2ida por un mecanismo eatracci"n. Entre otras palabras, las propiedades tinto(riales de una c)lula depende de sucomposici"n química y las diferencias en sus reacciones de coloraci"n constituyen índicesimportantes para diferenciar unas bacterias de otras.

La coloraci"n simple de un frotis o t)cnica de tinci"n simple nos revela la forma, tama2o y arreglode las c)lulas te2idas por la aplicaci"n directa de un solo colorante. -in embargo, es posibleconseguir mayor informaci"n a cerca de la morfología y composici"n química de las bacterias atrav)s del uso de t)cnicas de tinci"n diferenciales. Estas t)cnicas llevan consigo el tratamiento delfrotis con una serie de reactivos. La apariencia de las c)lulas despu)s de este tratamiento nospermite distinguir entre dos tipos diferentes de bacterias como base en el colorante que retienen.

OBJETIVOS

*. Mostrar la manera de preparar un frote bacteriano y su tinci"n por medio de la

t)cnica de coloraciones simples, utilizando fucsina fenificada y azul de metileno.

6. Determinar las características morfol"gicas de las bacterias.

TINCION DE CARBOL5UCINA

MATERIAL REQUERIDO:

*. >n tubo de cultivo con agar nutritivo de 6 !oras de incubaci"n de esc!eric!ia oli.

6. >n tubo de cultivo con agar nutritivo de 6 !oras de incubaci"n de ?acillus -ubtilis.7. >n tubo de cultivo con agar nutritivo de 6 !oras de incubaci"n de -tap!ylococcus

pyogenes.. Laminas de Microscopio.8. 0sa bacteriol"gica.+. -oluci"n diluida decarbolfuc!ina.:. Microscopio.


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PROCEDIMIENTO

*. aliente ligeramente un lado de la lámina por medio de una llama de lámpara de

alco!ol o mec!ero bunsen, con ob#eto de remover grasa si esta estuviera presente.

6. oloque la lámina con el lado flameado para arriba, sobre la mesa limpia.

7. aliente el asa bacteriol"gica al ro#o vivo para destruir los microorganismos

contaminantes que se encuentren ad!eridos a la superficie.

. 'or medio de un gotero coloque una gota de agua destilada est)ril, en el centro de

la lámina.

8. on la mano izquierda tome un tubo de cultivo de esc!eric!ia oli, remueva el

tap"n de algod"n por medio del dedo peque2o de la mano derec!o y con los dedos

pulgar e índice, sostenga el asa bacteriol"gica la cual fue previamente esterilizada.

:. @lamee la boca del tuvo de cultivo, r"telo y reco#a una cantidad mínima del

crecimiento bacteriano.

+. @lamee nuevamente la boca del tubo, ci)rrelo con el tap"n de algod"n y col"quelo

en la gradilla.


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1. E&amine el frote al microscopio usando el procedimiento del lente de inmersi"n. 3

*:. 'roceda !acer dibu#os de lo que observe en el microscopio, poniendo particular

atenci"n al tama2o y forma.

esc!eric!ia oli -tap!ylococcus 0ureus ?acillus -ubtilis

( 'rocedimiento de 0ceite de nversi"n.

*. 0plique una gota de aceite en la preparaci"n.

6. oloque la preparaci"n en la platina.7. -uba el condensador.. oloque el ob#etivo de inmersi"n en su posici"n.8. >sando el tornillo macro m)trico, mueva el ob#etivo de inmersi"n lentamente

!asta que el lente toque el aceite de la preparaci"n. En ese momento brillara laluz y se distinguirá el esp)cimen.

+. >tilizando el tornillo microm)trico !aga el a#uste fino para observar nítidamente

el esp)cimen.

TINCION DE AZUL DE METILENO

MATERIAL REQUERIDO:

*. =ubo de cultivo con agar nutritivo de Esc!eric!ia oli.

6. =ubo de cultivo con agar nutritivo de ?acillus -ubtilis.7. Laminas de microscopio.. 0sa ?acteriol"gica.8. -oluci"n colorante de azul de metileno.

PROCEDIMIENTO:

*. -iga las mismas instrucciones empleadas en la práctica anterior, en lo que se

refiere a la preparaci"n de frotes y fi#aci"n de los mismos.

6. ubra el frote previamente fi#ado con soluci"n azul de metileno, por 8 minutos.7. Lave la lamina con agua del grifo y d)#ela secar al aire.

. Observe al microscopio por el m)todo de inmersi"n.8. 'rocede a dibu#ar lo observado.

Esc!eric!ia oli ?acillus -ubtilis


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TINCI@N DE GRAM

La coloraci"n de gran es probablemente la tinci"n más importante en ?acteriología,es una coloraci"n compuesta y deferencial, dividiendo a las bacterias en dos grandesgrupos, dependiendo de que retengan el colorante original $soluci"n de cristal violeta% o lopierda cuando este colorante es tratado con soluci"n de lugol y lavado con alco!ol acetona

o alco!ol a A8

o

.Los organismos que retienen el cristal violeta se denominan bacterias gram

positivas y las que pierden el colorante original pero se ti2en con el colorante de contraste

$fucsina o safranina%. -on llamadas bacterias gramnegativas.

Este colorante es un valor considerable en la identificaci"n de las bacterias y su

clasificaci"n.

E&isten microorganismos variables al gram, conviene por lo tanto !acer el frote con

cultivos #"venes. -i apareciera dentro de la c)lula una parte sin te2ir, puede tratarse de

endosporas que no toman fácilmente los colores.

MATERIAL REQUERIDO:

*. >n tubo de cultivo con agar nutritivo de 6 !oras, de incubaci"n de Esc!eric!ia oli.

6. >n tubo de cultivo con agar nutritivo de 6 !oras, de incubaci"n de ?acillus -ubtilis.7. Láminas limpias y desengrasadas de microscopio.. 0sa ?acteriol"gica.8. Lámpara de alco!ol " mec!ero bunsen.+. -oluci"n de cristal violeta.:. -oluci"n de Lugol.


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PRACTICA No. 9

MOR5OLOGÍA DE LEVADURA EN CRECIMIENTO

GENERALIDADES:

Las levaduras lo mismo que los mo!os, son !ongos, pero se distinguen de los demásporqu) su forma dominante es unicelular. -on diferentes de las algas porque no realizanfotosíntesisG tampoco son protozoos, puesto que no tienen una pared celular rígida. on facilidadse diferencian de la mayor parte de las bacterias por su tama2o relativamente grande y sumorfología.

La mayor parte de las levaduras de uso industrial son miembros de g)nero-acc!aromyces. Las c)lulas son redondas, ovales o alargadas. Este g)nero incluye a-acc!aromyces erevisiae, conocida generalmente como levadura de panadero o del cervecero.

0lgunas de la misma especie son empleadas en medicina y otros para fermentaci"n del az3car para obtener alco!oles.

-acc!aromyces erevisiae se produce por gemaci"n, fisi"n, combinaci"n de gemaci"n y

fisi"n y por formaci"n de esporas ase&uales. La reproducci"n se&ual no se !a observado. Laascospora $saco de esporas% contiene una a cuatro esporas redondeadas.

Las levaduras están compuestas porH apsulas, pared celular, membrana citoplasmática,

componentes del protoplasma, n3cleo, mitocondrias y vacuolas.

MATERIAL REQUERIDO:

*. >n tubo de caldo glucosado con -. ervisiae.

6. 'ortaob#etos.7. ubreob#etos.

PROCEDIMIENTO:

*. oloque dos o tres lupas de caldo glucosado con -. ervisiae en un portaob#etos yc3bralo cuidadosamente.

6. Enfoque con el ob#etivo de menor potencia, mueva el revolver y enfoque con el ob#etivoseco de mayor potencia.7. E&amine las c)lulas de levaduras cuidadosamente.. 1ote la presencia de nucl)olos, vacuolas, gránulos, pared celular, etc.

PRACTICA No. MOR5OLOGÍA DE LOS MOOS MÁS COMUNES

GENERALIDADES:

Los mo!os que com3nmente se encentran son del genero Mucur, ;!izopus 4eotric!um,

epa!lot!ecium condida, 0spergillus, 'enicillum, cladosporium y 0lternaria.

Las especies de mo!os son difíciles de remover del medio de cultivo sin causar da2o a la

forma de estos, de tal manera que se debe de tener cuidado e&tremo, para un monta#e cuidadoso

al observarlos al microscopio.

El agua no debe usarse para el monta#e fluido microscopio, porque esta se evapora

prontamente produciendo deformaciones de las !ifas por el efecto de osmosis y causa que arias

partes del !ongo se ad!ieren y se observen como una masa uniforme. =ales preparaciones no son

satisfactorias para observaciones microsc"picas.

>na t)cnica de monta#e, fluido satisfactoria es conocida como o!'#& ! *#%'o!o* estasoluci"n no causa deformaci"n celular y no se evapora, permitiendo que las preparaciones sean

permanentes, un colorante como el azul de algod"n puede ser agregado al lactofenol para colorear

las estructuras del mo!o.

En una preparaci"n !ec!a de esta manera las !ifas deben ser e&aminadas para ver si !ay

tabiques, estructuras de las esporas y otras partes de los mo!os que son determinantes.


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MATERIAL REQUERIDO:

*. Mo!os procedentes de diferentes materiales, frutas, vegetales, madera, pan etc.

6. Láminas limpias de microscopio.7. ubreob#etos.. -oluci"n de Lactofenol.8. Mec!ero.+. Microscopio.

PROCEDIMIENTO:

*. oloque dos o tres lupas de una soluci"n de lactofenol en el centro de una lámina demicroscopio limpia.

6. ;emueva una peque2a porci"n del mo!o del material contaminado y col"quela en lasoluci"n de lactofenol colocada en la lámina.7. uidadosamente por medio de unas agu#as de disecci"n e&tienda y separe el material!umedeci)ndolo en la soluci"n de lactofenol.. ubra la preparaci"n con el cubreob#etos teniendo cuidado que al !acerlo no quedeburbu#as de aire.

8. Enfoque con el ob#etivo de menor aumento y traspase al de mayor aumento.

PRACTICA No. ;ESPORAS EN LAS BACTERIAS

Las esporas son cuerpos que se producen en el interior de algunos g)neros de bacterias,

son formas de resistencia cuando el medio que se desarrolla la bacteria es adverso. La formaci"n

de esporas se presenta solamente en las bacterias en forma de bacilo.

El proceso de esporulaci"n se efect3a despu)s de la de la fase de crecimiento logarítmico.

MATERIAL REQUERIDO:

*. ultivo de ?acillus subtilis de :6 !oras de incubaci"n.

6. -oluci"n de 5ucIer, cristal violeta con o&alato de amonio.7. -oluci"n acuosa de verde malaquita al 8J.. -oluci"n acuosa de safranina al .8J8. Láminas limpias.+. Microscopio.

PROCEDIMIENTO:

MF'odo d u%(:

*. 'repare un frote de bacillus subtilis de :6 !oras de incubaci"n.

6. -eque el frote colocando la lámina a una distancia prudencial arriba de la llama delmec!ero y fí#elo por el calor.7. ubra el frote con la soluci"n de cristal de violeta y o&alato de amonio durante un $*%minuto.. Lave la preparaci"n con agua de grifo y s)quela al aire.8. E&amine por medio del ob#etivo de inmersi"n.+. Las c)lulas vegetativas aparecen p3rpuras y las esporas no se colorean.


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MF'odo d S%6#( $ 5u*'o!:

*. 'repare un frote de bacillus subtilis de :6 !oras de incubaci"n.

6. -eque el frote colocando la lámina a una distancia prudencial arriba de la llama delmec!ero y fí#elo por el calor.7. ubra el frote con una soluci"n acuosa al 8J de verde malaquita, d)#ela actuar de 7 a+ segundosG caliente la preparaci"n en la llama del mec!ero durante 7 segundos.. Lave la preparaci"n con agua de grifo durante 7 segundos.8. ubra el frote con una soluci"n acuosa de safranina al .8J durante 7 segundos.+. Lave la preparaci"n con agua de grifo, s)quela al aire.:. Las esporas se ti2en de verde y las c)lulas bacterianas de ro#o.

PRACTICA No. <SIEMBRA EN TUBOS DE CULTIVO

CULTIVOS AEROBIOS

Karios m)todos se !an empleado para el cultivo de microorganismos aerobios oanaerobios facultativos. 4eneralmente se emplean dos medios básicosH el caldo nutritivo y el agar nutritivo.

La t)cnica para la siembra de los medios mencionados anteriormente se efect3an por tres

procedimientosH

-iembra en profundidad en agar nutritivo.

-iembra en agar inclinado.-iembra en caldo nutritivo.

MATERIAL REQUERIDO:

*. >n tubo de ?acillus subtilis, uno de -. ervisiae y uno de 0spergillus.

6. >na agu#a y asa de noculaci"n.7. 7 tubos de agar nutritivo.. 7 tubos de agar nutritivo inclinado.8. 7 tubos de caldo nutritivo.+. Mec!ero.


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P ROCEDI MIENTO:

T F%!+%#" d "+b( # ! -(ou !d+d#d o -o( -+%#d u(#:

1. Esterilice la agu#a de inoculaci"n a la lla ma y enfríe la en uno s segundos.2. =ome el tubo de cultivo de ?. -ubtilis, c erca de la llama del mec!ero, remueva el tap"nde algod"n, rote la boc a del tubo en la llam a para evitar contaminaciones.

7. ntroduzca la agu#a de inocula ci"n y e&tr ayendo un poco de material de cultivo.8. ;ote nuevamente la boca de l tubo y col"quele el tap"n de algod"n y p"ngase en lagradilla.9. =ome el t ubo de ag ar nutritivo, remueva el tap"n, rote la bo ca del tub o en la lla ma paraevi tar contaminaciones.. Dntroduzc a la agu#a de inocula ci"n directamente y atravesan do el agar !asta to car casiel fondo del t ubo, sáqu elo lentam ente.;. @lamee nu evamente el tubo e n movimie nto de rota ci"n, col" quele tap"n.


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T F%!+%# d %u*'+0o ! %#*do !u'(+'+0o:

1. -iga los m ismos procedimient os que se describen en las t)c nicas anteriores.2. De cultivos en agar inclinado de ?. - ubtillis, -. ervisiae y 0sperg illus, realice unasie mbra en c aldo nutritivo.7. omo el agar nutriti vo se encu entra en u n medio s"lido, teng a la preca uci"n de agitar elasa vigorosamente en el medio de cultivo líquido para desp render el material con los

mic roorganis mos ad!eridos a la l upa del asa.8. 'roceda nuevamente a incu barlos a las mismas temper aturas durante los mismosperiodos de i ncubaci"n, que en las anterior es siembra s.9. Observar si !ubo c recimiento o no, por la forma ci"n de precipitado en el caso de lalev adura y en las bacterias turbid ez.

R ESULTA DOS:

1. E&aminar y observa r el tipo y caracterís ticas de crecimiento de cada una de la s cepas

en los diferentes modos de siembra en las p lacas y tubos.2. onsignar las obser vaciones en forma tabular.

CEP A 5ORMA ELEVAC ION COLOR CONSIST ENCIAABC

5O RMAS H ELEVACI ONES DE COLONIA S BACTE RIANAS


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PRACTICA No. =CULTIVOS EN AGAR PARA OBSERVACI@N DE COLONIAS GIGANTES

DE LEVADURAS H MOOS

GENERALIDADES:

El cultivo de colonias gigantes es un medio de informaci"n muy 3til en la identificaci"n de

levaduras y mo!os.

-e observará la forma de la colonia, el color, el aspecto, levantamiento, desarrollo, etc.

MATERIAL REQUERIDO:

*. >n erlenmeyer est)ril de *8 a 6 ml. provisto de tap"n de algod"n.

6. >n tubo de agar maltosado o de&trosado.7. >n tubo de cultivo de levadura.

. >n tubo de cultivo e mo!o.8. 0sa bacteriol"gica.

PROCEDIMIENTO:

*. -e licua el tubo de cultivo de agar maltosado o de&trosado.

6. En esta forma se agrega a u erlenmeyer est)ril siguiendo una t)cnica as)ptica.7. -e de#a que se solidifique formando una capa !orizontal en el fondo del erlenmeyer, seespera 6 minutos o se coloca en una refrigeradora para un enfriamiento rápido. -e toma el tubo con un cultivo de levadura, se flamea la boca y se e&trae el tap"n dealgod"n.8. -iguiendo una t)cnica as)ptica por medio del asa previamente flameada, se e&trae un

poco de material del tubo de cultivo, se flamea nuevamente la boca del tubo, se tapa y secoloca en la gradilla.+. -e toma el erlenmeyer, se flamea la boca del frasco quitando previamente el tap"n dealgod"n, se introduce el asa con el material y se siembra tocando con el asa el centro delerleneyer a manera de depositar el material.:. -e saca el asa, se flamea la boca del erlenmeyer, se tapa y se cubre con un cuadro depapel Iraft y se anuda el cuello del frasco con un cordel.

COE5ICIENTE 5ENOLICO

GENERALIDADES:

El coeficiente fenolico, se define como la e&presi"n aritm)tica de la capacidad de unagente químico para destruir microorganismos identificados, tales como -almonella, typ!osa o-tap!ylococcus aureus, estableciendo comparaciones con el efecto producido por el fenol puro$ácido fenico%, actuando ba#o las mismas condiciones normales. -uele abreviarse este t)rmino conlas iníciales @.

uando se !ace menci"n del coeficiente fenolico, deberá nombrarse el microorganismoque se uso en la prueba, por e#emplo, si en la prueba se uso -. 0ureus, el resultado final debe de

e&presarse, como el coeficiente fenolico del -tap!ylococcus aureus.

El coeficiente fenolico de un desinfectante comercial se establece a menudo en su mismo

envase.

@ debe usarse en pruebas químicas similares a las del fenol y ba#o circunstancias

id)nticas.


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OBJETIVO:

1. 0plicar el procedimiento del @ a un desinfectante dado y así establecer el @ de esta sustancias problemas.

MATERIAL REQUERIDO:

*. >n tubo de cultivo de caldo nutritivo de 6 !oras de incubaci"n de -tap!ylococcusaureus.

6. 6+ tubos de caldo nutritivo est)ril.7. *7 tubos de cultivo est)ril.. >n frasco conteniendo agua est)ril.

8. 'ipetas est)riles de * cm7.

+. 'ipetas est)riles de * cm7.

:. Lupa de inoculaci"n de mm de diámetro. .


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1=. 0note las observaciones en los siguientes cuadros, informe sobre la presencia decrecimiento por medio del signo $% y la ausencia por medio del signo $(%.

D+*u%+,! 9 +!u'o" 1> +!u'o"

1:9>1:>1:;>1:1:=>

1:1>>

D+*u%+,! 9 +!u'o" 1> +!u'o"1:19>1:1;91:2>>

1:2291:29>1:2;91:7>>

2>. Determine el coeficiente fenolico con respecto al -tap!ylocuccus aureus, de unasoluci"n de cresol, dividiendo la diluci"n más alta del desinfectante en que destruy" el

microorganismo de prueba en * minutos, pero no en 8 por la diluci"n de fenol que en

iguales condiciones destruy" el -. aureus.

PRACTICA No. 11

ACCI@N BACTERICIDA DEL CLORO H SUS DERIVADOS

GENERALIDADES:

El cloro y sus derivados, de concentraciones y tiempos de contacto adecuados, destruyen

caso todas las bacterias presentes en el agua, por lo que tiene un amplio uso de purificaci"n del

agua, tanto en la forma de cloro gaseoso o líquido, así como en la de sus derivados tales como los

!ipocloritos y cloroaminas, los cuales son de amplio uso en esta campo de ngeniería -anitaria.

MATERIAL REQUERIDO:

*. >na muestra de agua cruda muy contaminada.

6. Diez tubos de cultivo grandes.7. Diez frascos conteniendo diferente concentraciones de cloroH .*, .6, .7, ., .8, .+,.:, .


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n pedazo de algod"n.7. ordel.. >n palillo de fosforo " un clip.

8. @rascos de 'ire& de *68 cm7 de capacidad.

+. 'ipetas graduadas de * cm

7

.:. 'ipetas graduadas de *cm7.


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P(-#(#%+,! -#(# *# "'(+*+#%+,! d *#" %#" P'(+:

*. Las ca#as 'etri deben encontrarse en perfectas condiciones de limpieza.

6. -e recortan cuadrados de papel Iraft de 7cm.7. -e procede a envolverlas ca#as de acuerdo a las indicaciones del instructor, esta

operaci"n tiene por ob#eto conservar las ca#as en condiciones de esterilidad.

P(o%d++!'o -#(# *# "'(+*+#%+,! -#(# * #'(+#* d 0+d(+o:

=odo el material preparado de acuerdo a las indicaciones anteriores, se procede a

esterilizar de la siguiente maneraH

'or el m)todo de calor seco, el cual se efect3a en !ornos el)ctricos a una temperatura de

*:F por una $*% !ora.

PREGUNTAS:

*. Nu) otro material se puede usar en lugar de papel Iraft y qu) características deben

reunirP

6. 0ctualmente N"mo se esterilizan las ca#as de petri y las pipetasP7. NDe los procedimientos de esterilizaci"n cual resulta más eficazP

PRACTICA No. 17PREPARACI@N DE MEDIOS DE CULTIVO PARA EL ANALISIS

BACTERIOLOGICO DEL AGUA

GENERALIDADES:

Los medios de cultivo poseen una composici"n química definida, dise2ada para el cultivode tipos específicos de bacterias conocidas. En la mayoría de los laboratorios, los medios decultivo son sint)ticos, actualmente se están usando ciertos materiales crudos como peptonas,e&tracto de carne y e&tracto de levadura, !aciendo posible obtener un medio de cultivo que !aceposible el desarrollo de gran variedad de bacterias y otros microorganismos de manera rápida yeficaz.

Los medios de cultivo más conocidos son el caldo lactosado y el agar nutritivo.

4eneralmente se usa el agar nutritivo cuando se desea un agente solidificante.

MATERIAL REQUERIDO:

*. *8 tubos sin reborde de vidrio pyre& de 66 & *:8 mm.

6. 7 tubos peque2os, del tipo Dur!am o fermentaci"n.7. 7 tubos sin borde, de vidrio pyre& de *< & *8 mm.. vasos de precipitar o frascos Erlenmeyer, de vidrio pyre& de 8 ml. de capacidad.

8. 8 pipetas de *cm7.

+. 6 gradillas de metal, para tubos de cultivo.:. * varilla de vidrio.


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PROCEDIMIENTO:

P(-#(#%+,! d* d+o d %u*'+0o d %#*do *#%'o"#do dob* $ "+-*:

*. 'ese las cantidades en gramos de caldo lactosado des!idratado, en doble y simpleconcentraci"n, de acuerdo a las indicaciones del instructor, col"queles tanto laconcentraci"n doble como la simple en vasos de precipitar.6. 0gregue la cantidad de agua destilada que se2ale el instructor, mezcle el medio y agitecon una varilla !asta completar la disoluci"n.

7. 'or medio de una pipeta de *cm7. oloque cantidades de *cm

7 de caldo lactosado doble

en cada uno de los 8 tubos de vidrio de $66&*:8mm%, se2alados para este prop"sito.

. 'or medio de una pipeta de *cm7. oloque cantidades de *cm7 de caldo lactosadosimple en cada uno de los tubos restantes de vidrio de $66&*:8mm%, se2alados para esteprop"sito.8. oloque un tubo Dur!am o fermentaci"n en posici"n invertida $con la boca !acia aba#o%en cada uno de los *8 tubos de caldo lactosado.+. ;ecorte un pedazo de algod"n y enr"llelo de acuerdo a las indicaciones del instructor y

col"quelo a manera de tap"n al tubo que contiene medio de cultivo.

P(-#(#%+,! d* d+o d %u*'+0o d 0(d b(+**#!' %o! b+*+" d bu$:

*. 'ese la cantidad en gramos de caldo verde brillante des!idratado de acuerdo a lasindicaciones del instructor y col"quelo en un vaso de precipitar de 8cm

7.

6. 0gr)guele agua destilada de acuerdo a la cantidad que indique el instructor, mezcle yagite con una varilla, !asta la disoluci"n del medio.

7. on una pipeta de *cm7 coloque cantidades de *cm

7 de verde brillante en cada uno

de los *8 tubos de vidrio de $*


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PRACTICA No. 18CAPTACI@N DE MUESTRAS DE AGUA PARA EL ANALISIS

BACTERIOL@GICO DE AGUA CRUDA TRATADA

GENERALIDADES:

-e debe obrar con el me#or criterio en la selecci"n de un m)todo de muestreo, y tal

selecci"n depende primordialmente de las instalaciones disponibles en el laboratorio. >nos cuantos

factores que deben tomare en consideraci"n para la toma de muestras sonH

a% El carácter de los e&ámenes de laboratorio que se tiene que verificar.

b% El uso " aplicaci"n que se !aga de los resultados de las pruebas o análisis.c% La naturaleza del agua muestreada y variaci"n de sus características durante el periodo de

muestreo.d% La variaci"n de gasto !idráulico durante el periodo de muestreo.

'ara los e&ámenes ordinarios de aguas químicos o físicos, la muestra debe recolectarse en un

frasco limpio de cristal $preferentemente esterilizado%, con tap"n de cristal, o en un frasco de

plástico. El volumen de la muestra depende de las pruebas que se deban verificar.

'ara tomar una muestra de un pozo, se debe bombear por un tiempo suficiente para que la

muestra que se tome sea representativa del agua profunda que alimenta el pozo.

Las aguas de lagunas, lagos y embalses se encuentran con frecuencia, e&puestas acondiciones variables, resultantes de causas naturales, como los cambios estacionales lluvias,vientos y las corrientes internas. 'or lo general, las variaciones no son tan rápidas ni tan ampliascomo las que se observan en las aguas corrientes. En general una sola muestra puede ser representativa pero si e&isten condiciones cambiantes, se debe tomar varias muestras en lugaresdiferentes. -e debe tomar en cuenta que en los lagos la composici"n del agua puede variar con laprofundidad.

4ran parte de los muestreos se realizan en la misma planta potabilizadora. Este es el puntol"gico para el muestreo, en particular si el agua cruda se tiene que tratar y almacenar para su

distribuci"n. La frecuencia del muestreo depende del tipo de planta y del tratamiento que se aplica.

'ara la recolecci"n de muestras bacteriol"gicas deben seleccionarse en zonas e&teriormente

limpias y en condiciones sanitarias. -ea que la muestra se destine para e&ámenes bacteriol"gicos

o químicos, debe e#ercerse particular cuidado para asegurarse que es representativa del caudal de

distribuci"n y que se e&cluyan del frasco a las sustancias e&tra2as.

-i se necesita !acer un análisis físico(químico es suficiente una muestra de un gal"n de vidrioo polietileno $materiales bacteriol"gicamente inertes%. -i es un análisis microbiol"gico debe

contarse con frascos de vidrio, previamente esterilizado con un mínimo de capacidad de *cm7 de

capacidad más un peque2o espacio para aire.

OBJETIVOS:

'roporcionar las recomendaciones necesarias para la captaci"n de muestras, ya que el

buen resultado del análisis químico y microbiol"gico, depende muc!o de ello.

MATERIAL REQUERIDO:

*. @rascos pyre& de *68cm7.

6. 4alones de vidrio o de polietileno.7. 5ielera para transportar muestras.. Etiquetas.

8. =erm"metro.


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PROCEDIMIENTO:

C#-'#%+,! d u"'(#" d #/u# d u! /(+o:

*. La muestra se captará de uno de los grifos de los filtros de la planta.

6. Encienda el mec!ero de alco!ol.7. 'roceda a flamear alrededor de la boca del grifo para destruir las bacterias del grifo, las

cuales serían a#enas al contenido bacteriano de la muestra.. 0bra el grifo y de#e correr el agua !asta que su temperatura llegue a ser constante e igual a

la que se sabe e&iste en los acueductos de distribuci"n de una zona geográfica particular.8. Mientras el agua corre, des!aga el lazo que su#eta la capuc!a del papel al frasco, retírelo

con todo y tap"n, elimine la trilla de papel colocada entre el tap"n y la boca del frasco,flamee con la llama del mec!ero, todo reborde de la boca del frasco !aciendo girar elfrasco tal como lo indica el instructor.

+. =ome la muestra de agua de#ando un amplio espacio de aire en el frasco para facilitar la!omogenizaci"n.

:. @lamee nuevamente la boca del frasco y las superficies de contacto del tap"n y ci)rrelo.0, para la distribuci"n y abastecimiento de agua a las diferentes zonas de laciudad capital.

u) indican las normas de la -O y los reglamentos nacionales sobre el dise2o de

programas de muestreo y la frecuencia de la toma de muestras.


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PRACTICA No. 19MICROBIOLOGIA DEL AGUA

TECNICA DE LOS TUBOS MULTIPLES DE 5ERMENTACION

OBJETIVOS:

*. Determinaci"n de bacterias intestinales que indiquen contaminaci"n con aguas negras y el

consiguiente peligro de la desimanaci"n de enfermedades ent)ricas, para establecer la

calidad sanitaria del agua.

6. dentificaci"n de bacterias del grupo coliforme fecalH Esc!eric!ia coli y Enterobarcter

0erogenes.

GENERALIDADES:

El grupo coliformes incluye todas las bacterias aerobias o anaerobias facultativas,

gramnegativas, no esporagenas que fermentan la lactosa con formaci"n de gas dentro de las <!oras a una temperatura de 78F.

Las pruebas normales para la demostraci"n del grupo coliforme se puede llevar a cabo por la t)cnica de tubos m3ltiples de fermentaci"n que incluye la prueba presuntiva, pruebaconfirmativa y prueba completa o por el m)todo de membranas de filtraci"n. ada t)cnica se

aplica dentro de sus limitaciones específicas.-e !a demostrado que a3n despu)s de la agitaci"n de la muestra es muy irregular la

distribuci"n de las bacterias en el aguaG es perfectamente posible dividir un volumen de agua enporciones y encontrar, despu)s del ensayo, que es nulo el n3mero de organismos en una porci"no, cuando menos, inferior a la media aritm)tica que se basa en el e&amen del volumen total deagua. =ambi)n es bastante probable que la proliferaci"n de un tubo de fermentaci"n sea elresultado de la multiplicaci"n, no de uno, sino de varios organismos. 0 pesar de esto es másconveniente considerar que el desarrollo se debe a un individuo aislado.

Los resultados del e&amen de tubos y diluciones m3ltiples se e&presan en t)rminos delQn3mero más probableR. Este t)rmino es una estimaci"n que se basa en ciertas formulas deprobabilidad.

La e&actitud de una prueba aislada depende del n3mero de tubos que se empleen. -econsiguen datos más satisfactorios cuando en la porci"n más grande que se estudie se tiene gasen algunos o en todos los tubos y cuando en la menor, no !ay gas en ninguno o lo !ay en muypoco de ellos.

El valor num)rico de la estimaci"n del contenido bacteriano se fi#a principalmente, por aquella diluci"n que muestre tanto tubos positivos como negativos. La e&actitud que se puedeesperar de los resultados depende en especial, del n3mero de porciones de la diluci"n crítica.

1o se debe permitir que se confunda con un mero e#ercicio estadístico el inter)s crecienteen la precisi"n de la t)cnica de tubos m3ltiples y la e&presi"n de los resultados como 1M' puesson un medio para estimar la densidad coliforme de un agua y por lo tanto para establecer sucalidad sanitaria. La me#or valoraci"n de tal calidad depende de la interpretaci"n de los resultadosde la t)cnica de tubos m3ltiples o de otros m)todos, posiblemente más precisos, así como de todoslos informes que se !ayan obtenido por reconocimientos previos o practicas similares.

uando se e&aminan aguas de calidad potable es necesario usar un mínimo de cincotubos de fermentaci"n del medio presuntivo que se esco#a y que cada tubo contenga *cm

7 o

*cm7 de la muestra de agua.En el e&amen de otras aguas que se presuma que son de calidad potable es básico la

inoculaci"n de cuando menos cinco tubos de cada diluci"n para conseguir una precisi"n aceptabley un informe razonablemente satisfactorio, en ning3n caso se debe emplear menos de tres tubosde cada diluci"n.

PRUEBA PRESUNTIVA:

MATERIAL REQUERIDO:*. Muestra de agua.

6. Mec!ero de alco!ol.

7. 'ipetas graduadas est)riles de *cm7 y *cm

7.

. =ubos est)riles con agua peptonada para diluci"n.8. =ubos con caldo lactosado.


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PROCEDIMIENTO:

*. 0note en la !o#a de informe de datos, tales comoH fec!a, !ora, sitio, etc.

6. Observe y anote los caracteres generales de aspecto y substancias en suspensi"n, elsabor y el olor que se observará al final de la siembra de la muestra.

7. oloque los tubos de caldo lactosado en la gradilla, en el orden siguiente.

1#. 5+*#: 9 tubos de caldo lactosado doble.2#. 5+*#: 9 tubos de caldo lactosado simple.7. 5+*#: 8 tubos de caldo lactosado simple.

. Encienda el mec!ero de alco!ol.

8. 0gite vigorosamente el frasco de muestra por 68 veces.+. Elimine el cordel y capuc!a de papel del frasco que contiene la muestra.:. Observe cuidadosamente las indicaciones que dará el instructor, sobre la manera de

manipular el frasco de la muestra y la correcta posici"n de la pipeta de *cm7 en la mano

del operador.


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+. De cada tubo que presente fermentaci"n se toma material y se traspasa a los todos decaldo de verde brillante, siguiendo siempre la t)cnica de flameo al abrir y cerrar los tubos,en cada traspaso el asa debe flamearse !asta ro#o, para evitar de esta manera lacontaminaci"n ine&acta de los tubos al confirmar.

:. Despu)s de la siembra del verde brillante, se incuban todos los tubos a confirmar en la

incubadora a una temperatura de 78,F durante < !oras.

INTERPRETACI@N DE RESULTADOS:

Co-u'o d* E.C. $ d* 0(d b(+**#!' -o( * !K(o 4" -(ob#b*:

*. Los tubos de E.. " Kerde ?rillante que presenten fermentaci"n $desprendimiento gaseoso%,

despu)s de 6 a < !oras, son considerados confirmativos positivos.

6. -e anotará el n3mero de tubos confirmativos positivos procedentes de las siguientes

siembras *, *, .*cm7 en su respectivo orden y se busca en la tabla ad#unta el n3mero

más probable que corresponda a la serie del n3mero anotado. E&-*o: -e obtuvieron lossiguientes resultados confirmativosH

En la siembra de *,cm7 7 tubos L

En la siembra de *,cm

7

. tubos LEn la siembra de ,*cm7 8 tubos L

E* !K(o # bu"%#( "()# 789 u #* bu"%#( ! *# '#b*# !o" d#(4 u! ("u*'#do d 8>

NMP -o( 1>>%7 d *# u"'(#.

7. 0note su respectivo resultado, en la !o#a de informe proporcionada por el instructor.

PRUEBA COMPLETA:

MATERIAL REQUERIDO:

*. =ubos de fermentaci"n de E.. y Kerde ?rillante positivos.

6. =ubos con medio de agar nutritivo inclinado.7. Mec!ero.. 0sa de siembra.8. olorantes y reactivos para coloraci"n de 4ram.+. Microscopio.

PROCEDIMIENTO:

*. 'or medio de el asa de, se toma una lupa de los tubos de fermentaci"n y siembra en el tuboconteniendo el medio de agar nutritivo inclinado $ver practica 1o. < =)cnica de siembra enagar inclinado%.

6. ncubar los tubos de agar nutritivo en la incubadora a 78F durante 6 !oras.

7. Luego de las 6 !oras de incubaci"n observar el crecimiento de bacterias en los tubos deagar inclinado.

. ;ealizar una tinci"n de 4ram.

PREGUNTAS:

*. N'or qu) se considera a la Esc!eric!ia oli como un indicador de contaminaci"nP y

Nu) son los coliformesP

6. La presencia de E. oli, prueba la fermentaci"n de la lactosa con producci"n de acido y

gas. E&plique este proceso.

7. N"mo se pueden diferenciar los miembros del grupo coliformeP

. Mencione varias razones por los cuales los procedimientos rutinarios de laboratorio paa

determinar la potabilidad del agua se !acen en presencia o ausencia de coliformes mas

que de algunos microorganismos pat"genos específicos, como salmonella typ!imurium.

INVESTIGACI@N:

E&plique estadística y microbiol"gicamente como el 1M' proporciona informaci"n sobre la

calidad del agua, indicando el límite de confianza que se tiene y la curva característica.


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PRACTICA No. 19

MEMBRANAS DE 5ILTRACION EN EL CONTROL DE CALIDAD DEL AGUA DEPLANTAS INDUSTRIALES

MATERIAL REQUERIDO:

*. Membrana de filtraci"n, cuadriculadas, tipo 50 y de :mm. de diámetro.

6. 0lmo!adillas y co#inetes est)riles.7. a#as de petri plásticas y est)riles.. >nidad de filtraci"n.8. ?omba el)ctrica, para fuente de vacio.

+. 'ipetas est)riles, graduadas de *cm7.

:. 'ipetas est)riles, graduadas de *cm7.


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*6. 'rueba verificada $o comprobada%

a. -eleccionar la membrana de filtraci"n que tenga varias colonias coliformes, típicas

aisladas y no coliformes.

b. >sando una t)cnica as)ptica, con ayuda de la agu#a de inoculaci"n aísle una coloniacoliforme típica y otra que no sea típica y transfi)rala a un tubo de ro#o fenol o caldolactosado.

c. nc3bese los tubos de caldo a 78F durante 6 !oras.d. Lea y apunte los resultados de la siguiente forma H

C*#0 R"u*'#do"

> recimiento nulo, no !ubo cambio de cloraci"n en el medio.A 0cido $el medio se torna amarillo% pero !ay ausencia de gas en el

tubo de fermentaci"n.AB 0cido $el medio se torna amarillo% y presencia de gas en tubos de

fermentaci"n.

17. 0note los resultados en la siguiente !o#aH

E?AMEN BACTERIOLOGICO POR EL METODO DE MEMBRANASDE 5ILTRACION

Mu"'(# d:5%6# ! u u %#-'#d# *# u"'(#:o(#:Lu/#(:

5u!':P("o!# u %#-'o *# u"'(#:5%6# u d+o -(+!%+-+o * #!:

CARACTERISTICAS ORIGINALES

Co*o(: A"-%'o:Su"'#!%+#" ! "u"-!"+,!:

INVESTIGACI@N DEL GRUPO COLI5ORME:

I!%ub#%+,! # 79C.

No. d Md+o Vo*. d *# Co*o!+#" !o Co*+o(" T+-o db(#!# S*%'+0o Mu"'(# Co*+o(" -o( 1>>%7 I!%ub#%+,!5+*'(#!'

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manual de prácticas de laboratorio microbiología

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