Dr William Vega E.

Recolección de las muestras en las mejores condiciones de esterilidadDebe ser tomada en cantidad suficiente dependiente del sitio de la

lesión (heridas, esputos, lavados bronquiales, secreciones, escamas etc.) y calidad.

Conocer la hora de obtención, Medios de transporte (sv /u , ótica), Tiempo de transporte al laboratorio, etc.Uso de medios de cultivos directos (ulcera corneales)

La microscopía directa es una herramienta antigua y útil del micólogo clínico. La microscópia directa orienta la técnica de cultivo: medios, temperatura, tiempo de incubación, precauciones especiales de bioseguridad La microscópia directa, puede establecer una orientación diagnóstica presuntiva, y en ocasiones definitiva.Los hongos tardan en desarrollar las estructuras conidiógenas. Una muestra clínica correctamente tomada es el medio más simple y rápido de detectar una infección fúngica.Su negatividad interpreta los aislamientos como contaminantes.

La escasez de la muestra es, la única razón para no efectuar la observación microscópica directa.En pocos minutos informar al clínico y permite el inicio temprano de una terapia antifúngica, Es uno de los factores esenciales en el pronóstico de las micosis en los inmunodeprimidos.En algunos casos, el diagnóstico microscópico puede ser la única evidencia de infección fúngicaDetecta patógenos enigmáticos no cultivables

Rhinosporidium seeberi, Lacazia loboi, Pneumocystis jirovecii.

El examen microscópico directo proporciona un diagnóstico definitivo si se observan elementos fúngicos patognomónicos: cápsula de Cryptococcus neoformans, células muriformes en cromoblastomicosis, levaduras pequeñas intracelulares de H. capsulatum, quistes típicos de Pneumocystis jiroveci, levaduras con brotes de base ancha de B. dermatitidis levaduras con gemación multipolar en rueda de timón de

Paracoccidiodes brasiliensis esférulas de Coccidiodes immitis hifas anchas no septadas de zygomicetos

• Un examen directo negativo nunca descarta una infección fúngica. La sensibilidad de la técnica puede estar entre 10³-105 elementos

fúngicos por ml y puede depender del lugar anatómico, tipo de paciente, tinción y experiencia del observador.

• La presencia de falsos positivos: (gotas de grasa, restos celulares, etc.), puede minimizarse con un segundo examen o con la experiencia del observador.

• Posee una relativamente baja sensibilidad diagnóstica. • En la mayoría de los casos, no es posible identificar la especie

fúngica. • No permite la realización de estudios de sensibilidad a los

antifúngicos.

TÉCNICAS DIAGNÓSTICASTÉCNICAS DIAGNÓSTICAS

Observación microscópica directo (OMD)

Entre lamina y laminilla, Solo la muestra

KOH al 20%, Calcoflúor, Tinta china, Tinta Parker, etc.

Profesional capacitado

En fresco KOH KOH + Tinta Parker negra KOH + blanco calcofluor Tinta china (Cryptococcus neoformans)

Tinciones KOH + Tinta Parker negra, KOH + blanco

calcofluor (uso general) Giemsa o wrigth: micetoma, histoplasmosis,

coccidioidomicosis, neumocitosis, , otras micosis cutáneas con exudado o pus

Azul de Toluidina O: neumocistosis PAS: micetoma, coccidioidomicosis, onicomicosis Grocott: neumocistosis Fontana Masson: neumocistosis Inmunofluorescencia: neumocistosis

a. Células, con o sin gemas, de varios tamaños y formas, posiblemente sean Candida spp. u hongos dimórficos.

b. Células de pared gruesa, generalmente con una gema de base amplia, podrían corresponder a B. dermatitidis.

c. Células de pared delgada con gemación múltiple rodeando a la célula madre, sean P. brasiliensis.

d. Células rodeadas de una cápsula grande, probablemente corresponden a C. neoformans. e. Células pequeñas, de gemación simple observadas en tinciones especiales, posiblemente son H. capsulatum. f. Células con pseudohifas: Candida spp., Geotrichum spp., o

Trichosporon spp. Las dos últimas pueden mostrar artrosporas.

g. Células redondas de pared gruesa de varios tamaños, algunas de las cuales (las más grandes) pueden contener esporas podrían tratarse de esférulas de: Coccidioides immitis. Sin embargo, Rhinosporidium seeberi también puede

mostrar esférulas grandes y endosporas. h. Células gemantes de paredes gruesas acompañadas o no de pseudohifas, pueden corresponder a Malassezia.

Cuando la lesión es característica de pitiriasis, este es el procedimiento correcto para realizar el diagnóstico

a. Hifas no septadas, de pared gruesa, algunas de las cuales pueden mostrar ramificaciones en 90°: Rhizopus spp., Mucor spp., Absidia spp.

b. Hifas septadas, ramificadas, algunas en V, con o sin cabezas de Aspergillus, posiblemente correspondan a Aspergillus spp.

c. Hifas septadas, pigmentadas (marrones oscuras) con o sin cuerpos esféricos, pueden pertenecer a hongos dematiáceos.

d. Racimos de pared gruesa y oscura, con apariencia de gemas, posiblemente pertenezcan a un agente de cromomicosis.

e. Fragmentos de hifas con o sin levaduras probablemente correspondan a dermatofitos o a Malassezia complex.

a b

c d

e

Muestras de piel y anexos: A) Pelos 1. Presencia de nódulos:

a) Negros y duros: Micelio pigmentado con ascosporas fusiformes. Piedra negra (Piedraia hortai).

b) Blancos y blandos: Pseudomicelio artrosporado y células gemantes. Piedra blanca (Trichosporon spp.).

2. Ausencia de nódulos: Presencia de artroconidios según la disposición del micelio y talla de esporas: a) Endotrix (Trichophyton spp.) b) Ectotrix (Microsporum spp. y Trichophyton spp.).

B) Uñas:

1. Pseudohifas y levaduras (Candida spp.)

2. Hifas: a) Hialinas:

• Bordes paralelos: Dermatofitos (Trichophyton spp., Microsporum spp. y Epidermophyton spp.)

• Bordes irregulares: No dermatofitos (Scopulariopsis spp., Aspergillus spp., Fusarium spp., etc.).

b) Pigmentadas (Scytalidium spp)

C) Escamas de piel

1. Hifas cortas, curvas y acúmulos de levaduras (Malassezia spp.).

2. Hifas hialinas: Dermatofitos.

3. Hifas pigmentadas (Scytalidium, Exophiala werneckii).

4. Pseudohifas y levaduras: a) Hialinas (Candida spp.). b) Pigmentadas (Exophiala werneckii).

Muestras de exudados, biopsias, etc Hifas y pseudohifas sin levaduras Hifas y pseudohifas con levaduras Sólo estructuras redondeadas

Células gemantes sin formar cadenas Células formando cadenas Células levaduriformes con septos en un plano Células levaduriformes con septos en dos planos

Presencia de esférulas

Muestras de exudados, biopsias, etc.

1. Hifas y pseudohifas sin levaduras: a) Hifas con septos:

• Hialohifomicosis: Filamentos hialinos : Aspergillus spp., Fusarium spp., Paecilomyces spp., Pseudoallescheria spp., etc.

• Feohifomicosis: Micelio pigmentado : Cladosporium spp., Exophiala spp., Phialophora spp., etc.

b) Hifas sin septos o muy infrecuentes: Zigomicetos: Absidia spp., Mucor spp., Rhizopus spp., etc.

2. Hifas y pseudomicelio con levaduras: Candida spp., Trichosporon spp., Blastoschizomyces spp., etc.

3. Sólo estructuras redondeadas:

a) Células gemantes sin formar cadenas: • Diámetro de 2-5 μm: H. capsulatum var. capsulatum, • Diámetro > 5 μm:

- Cuello estrecho entre célula madre e hija: Cryptococcus neoformans Paracoccidioides brasiliensis Histoplasma capsulatum var. duboisii

- Cuello o base de gemación ancha: Blastomyces dermatitidis

b) Células formando cadenas: Lacazia loboi

c) Células levaduriformes con septos en un plano: Penicillium marneffei.

d) Células levaduriformes con septos en dos planos: Con paredes pigmentadas formando cuerpos escleróticos o

células fumagoides (Fonsecaea spp., Cladosporium spp., Phialophora spp., etc.).

e) Presencia de esférulas: • Con endosporas: Coccidioides immitis, Rhinosporidium seeberi.

Prototheca spp. • Sin endosporas: Emmonsia parva.

Permite clarificar todo tipo de muestras clínicas con abundantes células y restos celulares y observar la morfología y la pigmentación fúngica.

El efecto clarificador del KOH puede demorar desde 10 min hasta horas, en el caso de las muestras de uñas, y puede reducirse calentando ligeramente la preparación.

Se suelen utilizar dos concentraciones, una más fuerte del 20-30% para uñas, y del 10% para el resto de muestras.

Los inconvenientes de las soluciones de KOH son: puede crear unos artefactos que pueden parecerse a los

hongos el carácter corrosivo del KOH en el equipo y la facilidad de aparición, con el tiempo, de cristales que

dificultan la observación.

La observación de filamentos con bordes paralelos y artroconidias es altamente sugerente de una infección por dermatofitos.

Permite iniciar un tratamiento precoz que deberá confirmarse tras conocer los resultados del cultivo.

La observacion de hifas tortuosas o conidios redondeados orienta hacia mohos no dermatofitos.

La observacion de levaduras y pseudohifas orienta a una etiología candidiásica.

La observacion conjuntamente de estructuras levaduriformes redondeadas y micelios (“albóndigas con espaguetis”). Orientan al diagnóstico de pitiriasis versicolor

KOH + blanco calcofluor

Fluorescencia inespecífica o quimiofluorescencia, que marca de modo general las estructuras fúngicas : naranja de acridina, rojo Congo y agentes blanqueantes),

Flourescencia específica o inmunofluorescencia que permite la identificación específica de ciertos hongos al conjugar un anticuerpo específico (poli o monoclonal) con un fluorocromo (isocianato).

Las más utilizadas son la Tinta China y la Nigrosina. Pone de manifiesto la cápsula de C. neoformans. La cápsula aparece como un halo claro y nítido en torno a una

levadura redonda contra un fondo negro. Puede aparecer problemas con esta tecnica cuando C. neoformans

carecen de cápsula y confundirse con numerosos artefactos: hematíes, burbujas de aire, leucocitos, partículas de talco y

gotas de grasa La cantidad de tinta no debe ser ni excesiva ni escasa, ya que, en

ambos casos, el riesgo de artefactos se incrementa. La técnica es muy rápida y sencilla, Sensibilidad es del 50% en los pacientes no-VIH y del 70-88% en

los pacientes VIH con meningitis criptocócica.

a b c

d e f

Es el método de tinción más usado en los Laboratorios de Microbiología. No se utiliza habitualmente para la tinción de hongos. La observación de fragmentos de hifas tabicadas Gram-negativas y ocasionalmente ramificadas en ángulo agudo (45 º) es altamente sugestiva de colonización del árbol respiratorio por un hongo filamentoso. Esta técnica es poco sensible, Se recomienda realizar una observación a menor aumento (x400) para detectar dichos fragmentos. Es poco específica ya que hongos filamentosos diferentes de Aspergillus (Pseudoallescheria boydii , Fusarium spp. ,Penicillium marneffei) pueden presentar un aspecto similar

Técnica que solo permite observar claramente las levaduras del Género Candida ya que toman el colorante Violeta fácilmente.Otros hongos no se tiñen, por el contrario dejan un espacio vacío que no permite diferenciar la estructura fúngica.Se utiliza para observar muy bien los Actinomycetales

Siempre confirmar la identificación por cultivo en los medios micológicos adecuados.

En las candidiasis superficiales: levaduras, pseudohifas y filamentos.

La infección invasora por C. albicans en preparaciones histológicas teñidas con PAS o Plata metenamina:

una mezcla de levaduras, pseudohifas e hifas en el tejido, Solo células levaduriformes sugiere C. glabrata.

Aumenta la sensibilidad con la utilización de fluorocromos: Blanco de Calcoflúor, Blankophor P y Rojo Congo.

Histoplasma capsulatum intracelulares (macrófagos)

a. Levaduras encapsuladas de C.neoformans b,c,d. Levaduras multibrotantes de P. brasiliensis.. Coloración de Grocott

ab

c d

Es sugestiva de aspergilosis en muestras respiratorias y en preparaciones histológicas la observación de: fragmentos de hifas paralelas, tabicadas y ramificadas en ángulo agudo

Las muestras clínicas del tracto respiratorio más frecuentes son los esputos

Mayor rentabilidad diagnóstica son las obtenidas mediante fibrobroncoscopia, como el LBA

El examen microscópico se utiliza para detectar las formas tróficas y quistes de P. jirovecii habitualmente en muestras respiratorias.

Es importante tener en cuenta que el esputo debe ser inducido. Incluso en el esputo inducido, muchas veces no se consigue

apreciar este microorganismo, Debe realizarse un lavado broncoalveolar (LBA) si se sospecha

una neumonía por P. jiroveci