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Tlamati Sabiduría, Volumen 7 Número Especial2(2016)
4° Encuentro de Jóvenes Investigadores – CONACYT 11° Coloquio de Jóvenes Talentos en la Investigación
Acapulco, Guerrero 21, 21 y 23 de septiembre 2016
Memorias
Aislamiento y caracterización de metabolitos secundarios de la especie
medicinal Tournefortia hirsutissima.
José Trinidad Escalera Abarca (Becario)
Universidad Autónoma de Guerrero
Unidad Académica de Ciencias Naturales
Programa de Verano Delfín
Área en la que participa: II Biología y Química
Dra. Laura Patricia Álvarez Berber (Asesor)
Profesor- Investigador de la Universidad Autónoma del Estado de Morelos
Resumen
Ha habido un notable resurgimiento del interés en la investigación de productos naturales en la
última década, debido a las propiedades curativas que presentan los metabolitos secundarios de
éstas (John M. Walker, 2006, “Aislamiento de productos naturales” Coleraine, Irlanda del Norte,
Reino Unido.pag.28). El aislamiento de estos metabolitos es parte fundamental en su estudio, éste
se lleva a cabo por distintas técnicas cromatográficas tanto analítica como preparativa. En el
presente trabajo se utilizó como material vegetal hojas y tallos de Tournefortia hirsutissima del
cual se extrajeron 5 fracciones primarias. Se trabajó con la fracción ETh3 para conseguir
fracciones menos complejas por medio de CC y posteriormente se utilizó la misma técnica con
las subfracciones con mayor cantidad en gramos de extracto y las más puras se mandaron a RMN
para su caracterización. Se lograron identificar algunas estructuras contenidas en T. hirsutissima,
donde la cromatografía analítica jugó un papel muy relevante debido al análisis que
proporcionaba, fueron utilizados mezclas de disolventes como fase móvil en forma de gradiente,
la cromatografía en capa fina preparativa (CPP) también fue utilizada al igual que la técnica
espectroscópica de Resonancia Magnética Nuclear (RMN).
Tlamati Sabiduría Volumen 7Número Especial 2 (2016)
Palabras Clave: Tournefortia hirsutissima, metabolitos secundarios, cromatografía, Resonancia
Magnética Nuclear.
Introducción
Los productos naturales son pequeñas moléculas orgánicas, que también son
frecuentemente llamados metabolitos secundarios y son producidos por diversos organismos
vivos. Los metabolitos secundarias comprenden una variedad de diversos compuestos químicos a
menudo específicos para una especie en particular, que no son estrictamente indispensables para
la supervivencia. No obstante, existe un creciente interés en su estudio, ya que representan un
formidable depósito potencialmente útil para los nuevos medicamentos.
Las plantas son matrices complejas, que producen una amplia gama de metabolitos
secundarios con distintos grupos funcionales y polaridades (Walker, 2006)
La especie Tournefortia hirsutissima pertenece a la familia Boraginaceae. Se le conoce
por los nombres comunes de hierba rasposa y tlalchicinol. Es una planta arbustiva con hojas
alternas con asperezas que se aprecian al tacto. Esta especie se utiliza con fines medicinales
destacando los siguientes: para rozaduras de los bebes, cicatrizante, para la inflamación del riñón
y diabetes.
Una muestra de la decocción de los tallos de T. hirsutissima disminuyó el pico
hiperglucémico de conejos administrados con glucosa (Alarcon-Aguilara, Roman-Ramos, Perez-
Gutierrez, Aguilar-Contreras, Contreras-Weber y Flores-Saenz, 1998). Los extractos de n-hexano
y diclorometano de las hojas y tallos de esta especie resultó inhibir el edema en oreja de ratón
inducido por TPA (resultados no publicados, obtenidos por el grupo de investigación dirigido por
la Investigadora Laura Patricia Álvarez Berber).
Dentro del género Tournefortia se han aislado alcaloides, flavonas, triterpenoides y
cinamatos (Yun-Lian, Yu-Ling Yueh-Hsiung, Yi-Hung y Ming-Shi 1999). Sin embargo, hasta la
fecha no hay información sobre el aislamiento y la caracterización de la estructura química de los
metabolitos secundarios de T. hirsutissima.
En la estancia de verano se trabajo con una fracción de extractos de tallo y hoja de T.
hirsutissima, para aislar y caracterizar metabolitos secundarios utilizando métodos
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cromatográficos y de RMN. Esta investigación permitirá en futuros ensayos identificar a los
metabolitos secundarios con actividad antiinflamatoria.
Materiales y Métodos
1. Procedimientos generales
Para el fraccionamiento del extracto y fracciones se utilizó la cromatografía en columna
(CC) con gel de sílice marca Merck Kieselgel (70 - 230 y 230 - 400 mesh) como la fase
estacionaria. La cromatografía en capa fina (CCF) se utilizó para el análisis de extractos y
fracciones y se emplearon placas de aluminio silical60 ALUGRAM® Sil G/UV254 marca
Macherey - Nagel. Se utilizó el revelador sulfato cérico al 1% en ácido sulfúrico 2N para revelar
las placas de CCF. Para la cromatografía en placa preparativa se utilizaron cromatoplacas
preparativas de 20 x 20 cm RP-18 F254s, marca MERCK.
Para la eliminación del disolvente, se utilizó un rotaevaporador marca BUCHI modelo
B100 (ver la ilustración de en medio de la figura 1).
Los espectros de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) fueron obtenidos en un
espectrómetro Varian Unity Inova de 400 MHz (ilustración de la izquierda de la figura 1) a 25
°C, con Sonda de detección directa para 1H y
13C. Los desplazamientos químicos son presentados
como valores δ y se referenciaron a la resonancia de protón del disolvente (CDCl3 a 7.26 ppm).
Se utilizó el sistema acoplado Cromatografía de Gases-Espectrometría de Masas (CG -
EM), que consta de un cromatógrafo de gases marca Agilent modelo 6890 plus, acoplado a un
detector de masas marca Agilent modelo 5973N, con ionización por Impacto electrónico. Se
utilizó la columna capilar HP-5MS (5% fenil-metilpolixiloxano).
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Figura 1: Fotografías de algunos de los equipos y materiales utilizados
2. Obtención del Material vegetal
La especie medicinal Tournefortia hirsutissima fue recolectada por el M. C. Israel Hurtado en el
municipio de Yautepec, Morelos el 1 de julio del 2015. La planta fue autentificada en el herbario
HUMO de la Universidad Autónoma del Estado de Morelos.
3. Obtención de los extractos
La planta se secó a temperatura ambiente bajo la sombra. Posteriormente, las hojas y tallos se
pulverizaron por separado en un molino. Cada parte de la planta se sometió a un proceso de
extracción mediante maceración a temperatura ambiente. Las maceraciones se llevaron a cabo
con n-hexano y diclorometano en orden ascendente de la polaridad. Estas se realizaron durante 24
horas por triplicado. Finalmente las soluciones obtenidas se concentraron a presión reducida
mediante un rotaevaporador a menos de 40 °C.
4. Separación y aislamiento
4.1 Fraccionamiento de los extractos de T. hirsutissima
A partir de 358 gr de tallo seco se obtuvieron 446 y 904 mg de extractos de n-hexano y
diclorometano respectivamente. De la hoja (625 gr de material seco) se obtuvieron 8.32 y 7.72 gr
de los extractos de n-hexano y diclorometano respectivamente. Los extractos anteriores se
reunieron de acuerdo a un análisis por CCF. A esta muestra se le denomino extracto de T.
hirsutissima (ETh). La muestra ETh (15.7 gr) se fracciono en un embudo Büchner, utilizando 400
gr de gel de sílice (230 – 400 mesh) como la fase estacionaria y mezclas de n-hexano – Acetato
de etilo como la fase móvil con incremento sucesivo de la polaridad hasta finalizar con 100%
Acetato de etilo. Las fracciones colectadas se reunieron para obtener 5 fracciones diferentes
(ETh1 – Eth5) de acuerdo con la CCF.
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Figura 2: Elusión de las fracciones por CCF.
4.2 Separación de la fracción ETh3
La fracción ETh3 (1.8 gr) se adsorbió en 2.36 g de gel de sílice (70 – 230 mesh) y se
sometió a cromatografía en columna abierta. La columna se montó en el orden descrito; 30 g de
gel de sílice (70 - 230 mesh), 0.5 g de carbón activado, 30 g de gel de sílice (70 - 230 mesh) y
finalmente 0.5 g de carbón activado. El carbón activado se utilizó con el fin de eliminar los
pigmentos. La elución de la fracción se llevó a cabo con mezclas n-hexano - acetona con aumento
gradual de la polaridad hasta finalizar con 100% acetona.
Figura 3: Fracciones obtenidas a partir de ETh3
Se obtuvieron cien fracciones de 50mL, las cuales fueron agrupadas en catorce
subfracciones diferentes (ver tabla 1) de acuerdo a las características obtenidas en CCF. Las
fracciones obtenidas fueron concentradas a presión reducida mediante un rotaevaporador.
Tabla 1. Fraccionamiento de ETh3
Sistema de elución % Fracciones
obtenidas
Fracciones
reunidas
Clave Peso en mg
Hexano-acetona (99-1) 1-5 1-2 16-1 74
Hexano-acetona (98-2) 6-10 3 16-2 6
Hexano-acetona (97-3) 11-23 4-8 16-3 11
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4.3-
Análisis de la
subfracción 16-
5
La subfracción 16-5 (Ver tabla 1) resultó ser la más abundante de la separación de la
fracción ETh3, por lo cual se decidió analizar por el sistema acoplado CG – EM.
4.4- Análisis de la fracción 16-8
De las 15 subfracciones obtenidas de la fracción ETh3, la fracción 16-8 presento el mayor
grado de pureza y se analizó mediante Resonancia Magnética Nuclear.
5.-Separación de las fracciones 16-5 y 16-6
Las fracciones 16-5 y 16-6 debido a su parecido se reunieron y fueron absorbidas en 1.28
g de sílice ya que juntas pesaron 775 mg, se introdujeron en la columna. La elución en columna se
inició en n-hexano y mezclas n-hexano: acetona en ciclos variados de fracciones de 15 mL
aumentando la polaridad de acuerdo a las características observadas en CCF.
La columna se montó con 30 g de sílice (63-200 mesh).Al reunir las fracciones se
obtuvieron un total de 150 que se reunieron hasta un total de 12 de las cuales la 20-2 fue separada
ya que presentó el mayor grado de pureza (véase tabla 2).
Tabla 2. Separación cromatográfica de las fracciones 16-5 y 16-6
Hexano-acetona (96-4) 24-28 9-14 16-4 18
Hexano-acetona (95-5) 29-32 15-16 16-5 524
Hexano-acetona (94-6) 33-38 17 16-6 251
Hexano-acetona (93-7) 39-44 18-20 16-7 273
Hexano-acetona (92-8) 45-50 21-24 16-8 91
Hexano-acetona (91-9) 51-56 25-28 16-9 67
Hexano-acetona (88-12) 57-61 29-32 16-10 56
Hexano-acetona (87-13) 62-66 33-34 16-11 18
Hexano-acetona (86-14) 67-71 35-39 16-12 85
Hexano-acetona (85-15) 72-76 40-71 16-13 139
Hexano-acetona (80-20) 77-86 72-86 16-14 74
Acetona (100) 87-100 87-100 16-15 25
Peso total 1.71g
Sistema de elución % Fracciones
obtenidas
Fracciones
reunidas
Clave Peso en gramos
Hexano (100) 1-10 1-26 20-1 6
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6.-
Separación de
la fracción 20-
2
La fracción 20-2 pesaba 700 mg y fue absorbida en 1.4 g de sílice. La columna fue eluida
en n-hexano y mezclas n-hexano: AcOEt en ciclos variados de fracciones de 15 mL en forma de
gradiente. Se agregó 40g de sílice (fase normal de 230-400 mesh). Las fracciones obtenidas
fueron monitoreadas por CCF. Se obtuvieron un total de 250 fracciones dando un total de 15
fracciones reunidas (véase tabla 3). La fracción 23-12 presentó el mayor grado de pureza.
Tabla 3. Separación de 20-2
Hexano-acetona (99-1) 11-17 27-35 20-2 658
Hexano-acetona (98-2) 18-23 36-37 20-3 26
Hexano-acetona (97-3) 24-42 38-48 20-4 30
Hexano-acetona (96-4) 43-49 49-62 20-5 9
Hexano-acetona (95-5) 50-55 63-77 20-6 13
Hexano-acetona (94-6) 56-62 78-91 20-7 8
Hexano-acetona (93-7) 63-68 92-104 20-8 7
Hexano-acetona (92-8) 69-75 105-134 20-9 6
Hexano-acetona (91-9) 76-82 135-136 20-10 7
Hexano-acetona (90-10) 83-88 137-149 20-11 5
Hexano-acetona (89-11) 89-95 150 20-12 6
Hexano-acetona (88-12) 96-101 Peso total 770
Hexano-acetona (87-13) 102-107
Hexano-acetona (86-14) 108-114
Hexano-acetona (85-15) 115-120
Hexano-acetona (84-16) 121-126
Hexano-acetona (83-17) 127-133
AcOEt (100) 134-150
Sistema de elución % Fracciones
obtenidas
Fracciones
reunidas
Clave Peso en mg
Hexano (100) 1-74 1-4 23-1 3
Hexano-AcOEt (99-1) 75-129 5-9 23-2 0
Hexano- AcOEt (98-2) 130-241 10-21 23-3 9
AcOEt (100) 242-250 22-40 23-4 51
41-86 23-5 9
87-88 23-6 6
89-95 23-7 300
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7.-
Separación y
caracterización de la fracción 23-12
La fracción 23-12 se sometió a CCF para saber si se podía separar analíticamente, lo cual
resultó positivo con el sistema 99-1 benceno-AcOEt, posteriormente se utilizó el método de
cromatografía en placa preparativa para intentar separarlos.
En la cromatografía por placa preparativa se utilizaron cromatoplacas preparativas de 20 x
20 cm como fase estacionaria y como fase móvil mezcla de disolventes orgánicos (95-5 n-
hexano:AcOEt y 50 ml de Benceno). La cromatoplaca fue eluida una vez en ese sistema y tres
veces con 95-5 n-hexano: AcOEt.
Figura 4: Elusión de la subfracción 23-12 por cromatografía en capa fina
preparativa
La placa fue revelada en la orilla con sulfato cérico al 1% en ácido sulfúrico 2N.Fué
observada y marcada en lámpara UV. La franja de sílice que contiene el producto puro fue
96-99 23-8 86
100-141 23-9 47
142-163 23-10 16
164-195 23-11 37
196-216 23-12 32
217-223 23-13 2
224-230 23-14 0
231-250 23-15 47
Peso total 685
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removida de la cromatoplaca y colocada en matraces erlenmeyer. Se realizaron 4 lavados con
diclorometano con un periodo de 15 minutos de agitación entre ellos. Los extractos obtenidos
fueron concentrados en un rotavapor a presión reducida. Se plaquearon las concentraciones
obtenidas.
Resultados
Análisis de la subfracción 16-5
La subfracción 16-5 (Ver tabla 1) resultó ser la más abundante de la separación de la
fracción ETh3 al obtener 524 mg, por lo cual se decidió analizar por el sistema acoplado CG –
EM. El cromatograma (ver figura 5) presentó 3 componentes principales con tiempos de
retención 19.12, 25.68 y 31.49 min. La comparación de los espectros de masas de estos
componentes con los de la biblioteca sugiere la presencia de hexadecanoato de metilo y oxido de
escualeno para los picos con tiempo de retención de 19.12 y 31.49 minutos. El pico con tiempo
de retención de 25.68 minutos resulto ser el di(2-etilhexil) ftalato.
Figura 5: Cromatograma de gases de la fracción 16-5
Análisis de la subfracción 16-8
La subfracción 16-8 se analizó por CCF con un sistema 90% hexano – 10% AcOEt y se
reveló con sulfato cérico al 1% en ácido sulfúrico 2N. Se observó una sola mancha (figura 6) la
cual no absorbió en UV.
10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
1800000
Time-->
Abundance
TIC: 16LA53.D
18.31
19.12
20.76
20.83
21.03
25.68
31.49
34.59 39.37
45.97
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Figura 5: Espectro de RMN-1H de la subfracción 16-5
En concordancia con estos resultados se decidió analizar la subfracción 16-8 por RMN-1H
(Figura 5). El espectro muestra señales de metilos a campo alto (1.60 y 1.68 ppm); metilenos
entre 2.15-1.94 ppm; señal base oxigeno alrededor de 4.1 ppm; protones vinílicos entre 5.2 y 5.05
ppm. Las señales anteriores sugieren la presencia de un compuesto tipo terpeno. Se propone que
la estructura química del componente contenido en la fracción 16-8 es el óxido de escualeno.
Discusión y conclusiones
La subfracción 16-5 presentó por CG-EM 3 componentes principales, el componente con
tiempo de retención de 25.68 min resulto ser el di-(2-etilhexil) ftalato, un componente utilizado
en la manufactura de contenedores plásticos. Es muy probable que dicho componente provenga
de la garrafa donde se almacena el n-hexano en el laboratorio. Los otros dos componentes
corresponden al hexadecanoato de metilo y al oxido de escualeno (fig. 7). El óxido de escualeno,
es un precursor que da lugar a numerosos esqueletos de triterpenos tetra y pentaciclicos como son
el hopeno, diplopterol, tetrahymanol, lanosterol, cicloartenol y β-amirina.
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Figura 7. Oxido de escualeno
Por lo tanto se espera que algunas de las fracciones o subfracciones del extracto ETh
pueda contener algún tipo de estos compuestos.
El análisis por RMN-1H de la fracción 16-8, sugirió la presencia de un compuesto tipo
triterpeno; se propuso que dicho triterpeno corresponde al oxido de escualeno por una
comparación por CCF de las fracciones 16-5 (que contiene al oxido de escualeno) y 16-8 (figura
6). El análisis por RMN de la fracción 16-8 sugiere un compuesto tipo triterpeno como el óxido
de escualeno.
Figura 6: Comparación entre las subfracciones 16-5 y 16-8 por CCF
Agradecimientos
En esta estancia, obtuve nuevos conocimientos, los cuales me serán de gran utilidad para
mi formación académica, por lo que agradezco:
En primer lugar al programa Delfín, por permitirme participar como joven investigador
en el XXI Verano de la Investigación Científica y Tecnológica del Pacífico 2016.
Al CONACYT por permitirme participar en el cuarto encuentro de jóvenes
investigadores.
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También a la Universidad Autónoma de Guerrero por apoyarme con los trámites
correspondientes para obtener este logro. Así mismo a la investigadora, Dra. Laura Patricia
Álvarez Berber, por aceptar ser la coordinadora del proyecto que desempeñe durante la estancia.
Al igual que al M. C. Israel Hurtado Díaz por ser el autor y aceptar ser asesor de este
proyecto “Aislamiento y caracterización de metabolitos secundarios de la especie medicinal
Tournefortia hirsutissima” que se llevó a cabo en el Centro de Investigaciones Químicas (CIQ),
de la UAEM. A la M. C. Silvia Marquina Bahena quien fungió como asesora y mostro interés
para obtener un trabajo adecuado. Así mismo a las compañeras Q. I. Isis Aidan Yatziri Ventura
Salazar y M. C. Maritza Leonor Maldonado que me explicaron los procesos necesarios durante
este proyecto.
Por ultimo agradezco a mis padres por el apoyo incondicional que me brindaron durante
toda la estancia.
Referencias
Adolfo Andrade-Cetto , Cristina Revilla-Monsalve y Helmut Wiedenfeld, 2007
Alarcon-Aguilara, Roman-Ramos, Perez-Gutierrez, Aguilar-Contreras, Contreras-Weber y
Flores-Saenz, 1998
Cheryl A Lans, 2006
John M. Walker, 2006, “Aislamiento de productos naturales” Coleraine, Irlanda del Norte, Reino
Unido.pag.28
Jose P. Llongueras, Saraswathy Nair ,Dayana, Salas-Leiva • Andrea y E. Schwarzbach 2012
Marc Gottschling, Nadja Diane, Hartmut H. Hilger y Maximilian Weigend, 2004
Nadja Diane, Harald Forther, y Hartmut H. Hilger, 1999
Yun-Lian Yu-Ling Tsai, Yueh-Hsiung Kuo, Yi-Hung Liu, y Ming-Shi Shiao, 1999