memorias evaluación de mutaciones de lphn3 …tlamati.uagro.mx/t7e2/613.pdf · 4° encuentro de...

Tlamati Sabiduría, Volumen 7 Número Especial 2 (2016)

1

4° Encuentro de Jóvenes Investigadores – CONACYT 11° Coloquio de Jóvenes Talentos en la Investigación

Acapulco, Guerrero 21, 21 y 23 de septiembre 2016

Memorias

Evaluación de mutaciones de Lphn3 asociadas con cáncer en procesos de

adhesión celular mediado por sus ligandos endógenos.

Isamar Piza Sosa (Becaria)

Universidad Autónoma de Guerrero

Unidad Académica de Ciencias Naturales

Programa de Verano UAGro

[email protected]

Área en la que participa: III Medicina y Ciencias de la Salud

Dr. Antony Boucard Jr. (Asesor-Investigador)

Profesor-Investigador del Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto

Politécnico Nacional (CINVESTAV-IPN).

[email protected]

Resumen.

Las Latrofilinas (Lphn) son moléculas de adhesión celular que son parte de la familia de GPCR de adhesión

y se expresan tres isoformas diferentes en diversos tejidos. El papel de Lphn en procesos de adhesión se

ejemplificó principalmente en la estabilidad de las redes neuronales a través de la sinapsis. Sin embargo, la

función de Lphn en otros tejidos sigue siendo una incógnita. En cuanto a la función de Latrofilinas ha venido

de la identificación de ligandos endógenos con la que Lphn puede formar complejos intercelulares. Se cree

que estas interacciones tienen lugar entre Lphn y sus ligandos a través de sus respectivos dominios

extracelulares. Las mutaciones en el dominio GAIN de Lphn3 se han asociado con diversos tejidos que

presentan un fenotipo canceroso. Estas mutaciones son K561N, A760G, D798H, S810L y E811Q. Dado

que los cambios en la adhesión celular es distintivo de la carcinogénesis, hemos tratado de investigar los

efectos de estas mutaciones en la expresión de Lphn3, sobre el perfil de adherencia con respecto a su ligando

engógeno Teneurina 2. El perfil de expresión de las diferentes proteínas de Lphn3 se evaluó con la

transfección de células de mamífero con el ADNc de mutantes de Lphn3 e inmunodetección en ensayos de

Western Blot. Estos ensayos dieron como resultado la observación de que todos los mutantes que se

expresan en diferentes niveles, que la Lphn3 silvestre. Por otra parte, mostraron un patrón diferente de la

proteólisis en el sitio de GPS. Por último, el perfil de adhesión se verificó mediante la realización de ensayos

de agregación celular en los cuales no se observó ningún defecto para cualquiera de los mutantes en

comparación con la LPHN3 silvestre. Estos datos sugirieron que aunque las mutaciones de cáncer afectan

los niveles de expresión de Lphn3 estos cambios no interfieren con las funciones de adhesión.



2

Palabras Clave: Receptores acoplado a proteinas G, Latrofilinas, Cancer, Adhesion celular, Neuronas,

Sinapsis.

Introducción

En el cerebro, las neuronas forman redes para comunicarse entre sí a través de la formación

de sinapsis, estas son uniones intracelulares que permiten la transferencia de información

transneuronal (1,2). La expresión de moléculas de adhesión dentro de estos compartimentos

asegura la correcta yuxtaposición y proporciona estabilidad a las conexiones neuronales. Las

latrofilinas son moléculas de adhesión que fueron identificadas como receptores de α-latrotoxina,

una neurotóxina del veneno de la araña viuda negra, y también como partes integrales de las

sinapsis neuronales (5,6). Existen tres isoformas de latrofilina (Lphn1, Lphn2, y Lphn3), Lphn1 y

Lphn3 se expresan mayoritariamente en el cerebro, y la expresión de Lphn2 es de manera ubicua

en otros tejidos (7). También Lphn3 se expresa en una proporción menor en tejidos como el

corazón, placenta, páncreas, riñones y testículos (8,9).Las Lphns forman parte de la familia de

receptores de adhesión acoplados a proteínas (aGPCRs), y están constituidos por un extremo

carboxilo intracelular, siete pases transmembranales y un compartimento N-terminal extracelular

integrado por el dominio olfactomedina, un dominio rico en serina/treonina, un dominio de unión

a hormona, y un dominio GAIN (GPCR-Autoproteolysis Inducing) (3,4).

El dominio GAIN comprende 320 residuos, y en él se encuentra un sitio de incisión conocido como

GPS, el cual constituye el punto de proteólisis del receptor. Esta secuencia se encuentra en todos

los miembros de la familia de los aGPCR, y curiosamente, gran parte de las mutaciones en este

dominio se expresan en enfermedades como el cáncer, por lo que el descubrimiento de ligandos

endógenos para el dominio GAIN constituirá un avance importante en el campo de la investigación

del cáncer relacionado con esta familia de moléculas de adhesión (10). Se han descrito tres ligandos

endógenos para Lphn: neurexinas (NRXNs) (17), teneurinas (TEN) (11) y FLRTs (12). Las TEN

son glucoproteínas transmembranales de tipo II, que contienen una secuencia corta N-terminal, una

región transmembranal única y una secuencia larga extracelular que cuenta con múltiples

repeticiones similares a EGF, una región de cisteínas conservadas y repeticiones únicas YD (13).

Los vertebrados poseen cuatro diferentes genes (TEN1, 2, 3 y 4) (14). FLRTs también son una

familia de moléculas de la superficie celular codificadas por tres genes (FLRT1, FLRT2, y

FLRT3). FLRTs se expresan ampliamente en todos los tejidos (15,16), y se componen de 10

repeticiones ricas en leucina extracelular, un dominio de fibronectina de tipo III, un TMR, y una

cola citoplásmica. FLRTs estaban implicados en la señalización de FGF (16), y la adhesión celular

durante el desarrollo (17). Las NRXNs son proteínas transmembranales tipo I pre-sinápticas. En

humanos, existen tres genes que dan lugar a dos isoformas principales: NRXNα y NRXNβ (18).

La interacción de NRXNs con neuroliginas, moléculas de adhesión postsinapticas, es esencial para

el funcionamiento y la especificidad de la sinapsis (19).

Puesto que Lphn3 es un aGPCR, el objetivo de este proyecto fue evaluar el efecto de las

mutaciones K561N, A760G, D798H, S810L y E811Q reportadas previamente en pacientes con

cáncer, en la adhesión celular, utilizando como ligando para Lphn3 a TEN2.

Tlamati Sabiduría Volumen 7 Número Especial 2 (2016)

Materiales y Métodos

Bacterias competentes.

Incubamos una colonia de bacterias DH5α en 5 ml de medio SOB (10 mM MgSO4) a 37°C.

Después de 16 horas adicionamos 0.5 ml de cultivo en 50 ml de medio SOB (10 mM MgSO4) el

cual fue incubado a 37°C en agitación constante hasta alcanzar una densidad óptica de 550. El

cultivo fue enfriado en hielo-agua y centrifugado a 4000 rpm durante 12 minutos a 4°C. La pastilla

bacteriana obtenida fue resuspendida en 16 ml de Buffer RF1 frío e incubada por 15 minutos en

hielo-agua. Se realizó una segunda centrifugación respetando los parámetros antes descritos y se

decantó el sobrenadante. Las bacterias fueron resuspendidas en 4 ml de Buffer RF2 frío e incubadas

durante 15 minutos en baño de hielo-agua. Finalmente se realizaron alícuotas de 200 µl en tubos

eppendorf y fueron almacenadas a 70°C.

Transformación de bacterias competentes.

200 µl de bacterias competentes DH5α fueron mezcladas con 10 ng de DNA plasmídico.

La mezcla fue incubada por 30 minutos en hielo y sucesivamente por 90 segundos a 42°C en baño

maría. Se volvió a incubar en hielo durante 2 minutos y se agregó 800 µl de medio SOB. La

suspensión final fue incubada a 37°C durante 45 minutos en agitación constante. Del volumen final

de la suspensión bacteriana, se sembraron 200 µl en cajas de medio LB con ampicilina.

Extracción de Ácidos nucleicos (Midipreparción)

Bacterias DH5α transformadas fueron cultivadas en 50 ml de medio LB por 16 horas a

37°C. El cultivo fue centrifugado a 7000 rpm por 20 minutos. La pastilla bacteriana fue

resuspendida en 2 ml de solución I fría, a la cual también se le agregó 300 µl de solución de

lisozima (10 ng/ ml en Tris Cl 10 mM pH 8.0). Consecutivamente se adicionó 4 ml de solución II

y se incubó durante 10 minutos a Tamb. 4 ml de CH3CL3 y 2 ml de solución III fría fueron agregados

posteriormente, incubando la mezcla total en hielo por 10 minutos. La mezcla fue centrifugada a

4000 rpm por 15 minutos a 4°C. Se recuperó la fase acuosa (contiene el DNA plasmídico) y se le

adicionó 0.6 veces de isopropanol respecto el volumen obtenido. Incubamos durante 10 minutos a

Tamb, y centrifugamos a 5000 rpm por 15 minutos a 4°C. La pastilla de ácidos nucleicos obtenida

fue lavada con etanol al 70% y disuelta en 300 µl de Buffer TE.

Purificación de DNA.

Se adicionó 300 µl de LiCl 5M a los ácidos nucleicos extraídos. La mezcla fue centrifugada

a 10000 rpm por 10 min a 4 °C. Al sobrenadante recuperado se le agregó un volumen equivalente



4

de isopropanol. Se centrifugo nuevamente a 10000 rpm por 10 min a Tamb y se decantó el

sobrenadante. La pastilla obtenida fue lavada con etanol al 70% a Tamb y disuelta en 500 µl de

buffer TE pH 8 + RNasa pancreática. Se incubó por 30 min a Tamb y después se agregaron 500 µl

de NaCl 1.6M + PEG 8000 al 13%. La mezcla fue centrifugada a 13000 rpm por 5 min a 4 °C y la

pastilla obtenida fue disuelta en 400 µl de buffer TE pH 8. Consecutivamente se adicionó 400 µl

de fenol y se centrifugó a 13000 rpm por 5 min. La fase acuosa fue separada de la orgánica para

agregarle 200 µl de fenol y 200 µl de cloroformo. Se realizó una segunda centrifugación, se separó

la fase acuosa y se le adicionó 400 µl de cloroformo. Una tercera centrifugación fue realizada para

recuperar la fase acuosa a la cual se le adicionó 100 µl de acetato de amonio 10 M. Posteriormente

se agregó 1 ml de etanol absoluto, se incubó por 10 min a Tamb y centrifugó a 13000 rpm por 5 min

a 4 °C. El ADN obtenido fue lavado con 200 µl de etanol frio al 70% y disuelto en 100 µl de buffer

TE pH 8. Finalmente se cuantificó en el equipo nanodrop 2000 de Thermo SCIENTIFIC.

Transfección con Polietilenimina (PEI).

Realizamos transfecciones transitorias en placas de seis pozos utilizando PEI como medio

para la introducción de plásmidos.En un tubo eppendorf se agregaron 420 µl de medio DMEM no

suplementado, posteriormente 7 µg de ADN plasmídico y finalmente 35 µl de PEI, esto constituye

el complejo ADN-PEI. Este complejo se mantuvo en una relación de 5 μl de PEI [1mg/ml] y 6 μl

de DMEM no suplementado por cada μg de ADN. Una vez formado el complejo se incubó a

temperatura ambiente por 30 min. Pasado este tiempo, se agregó nuevamente medio DMEM no

suplementado hasta completar 1 ml. Se removió el medio de las células a transfectar y el complejo

fue agregado gota a gota en cada pozo. Las células con el complejo fueron incubadas por 30 min

en un ambiente de CO2 al 5 % a 37 °C. Finalmente, se agregó gota a gota 1 ml de medio DMEM

suplementado al 20 % con SFB. Después de 24 horas se removió el medio de las células y se

agregaron 2 ml de medio DMEM suplementado al 10% con SFB.

Extracción de proteínas totales y de membrana

Los cultivos celulares fueron lavados con PBS y almacenados a -70°C por 30 minutos,

después fueron incubados por 30 segundos a 37°C en baño de agua y su posterior tratamiento se

llevó a cabo en agua-hielo. Para la extracción de proteínas totales, se adicionó a cada pozo 200 µl

de buffer de carga 1X y las células fueron removidas con un escraper. Para la extracción de

proteínas de membrana se adicionó 1 ml de PBS frío con BSA+ inhibidor de proteasas, las células

fueron removidas con un escraper y centrifugadas por 5 minutos a 5000 rpm a 4 ˚C. La pastilla

que contiene la fracción membranal, fue solubilizada en Buffer IP frío (1% tritón X-100, 2mM

CaCl2, 2Mm MgCl2, 150mM NaCl, 0.1Mm EDTA, inhibidores de proteasas1X), e incubada por

2 horas a 4°C en rotación suave. Finalmente se centrifugó por 30 minutos a 15000 rpm a 4°C,

recuperando el sobrenadante y almacenándolo a -70°C. Las proteínas extraídas fueron calentadas

a 37˚C por 30 minutos para su análisis por electroforesis.


Western Blot

Las muestras fueron analizadas en geles de poliacrilamida al 8%. Después de la

electroforesis fueron transferidas a membranas de nitrocelulosa (BIO-RAD). La membrana fue

bloqueada con leche al 5% en TBST 1X durante 2 horas. Después de cada incubación fueron

lavadas 3 veces con TBST al 1X por 10 minutos cada una. Para la detección de las proteínas

utilizamos el anticuerpo primario Anti-HA de ratón a una dilución 1:1000 en TBST 1X+BSA al

3%, y al anticuerpo secundario IRDye® 800CW de burro de LI-COR a una dilución de 1:15000 en

TBST 1X+BSA al 3%. Para el revelado de las membranas se utilizó el sistema de imagen

Odyssey® Fc de LI-COR.

Ensayos de agregación celular

Células HEK293T fueron transfectadas por el método de PEI con los plásmidos que

expresaban a Lphn3 y sus diferentes mutantes y también con teneurina 2. Las células fueron lavadas

con PBS y removidas con 500 µl de solución PBS+EGTA+ DNasa. Las resuspensiones se

realizaron utilizando pipetas pasteur siliconizadas. En un tubo eppendorf se agregaron 100 µl de

Lphn3 o alguna de las mutantes (receptor) y 100 µl de teneurina 2 (ligando). Posterior a esto se

agregó 300 µl de solución incubadora (DMEM que contiene 50 mM de HEPES-NaOH (pH 7.4), 10 %

de SFB, 10 mM de CaCl2 y 10 mM de MgCl2) obteniendo un volumen final de 500 µl. la mezcla final

se incubo por 2 horas a Tamb en rotación suave. Después de este tiempo las muestras fueron

analizadas por microscopia de epifluorescencia y los agregados fueron analizados con el programa

imageJ.

Resultados

Identificación de plásmidos por endonucleasas

Las construcciones plasmídicas que contienen las mutantes K561N, A760G, D798H,

S810L y E811Q en la secuencia del dominio GAIN de Lphn3 fueron generadas previamente en el

laboratorio (Fig. 1A). Evaluamos por endonucleasas el tamaño de cada uno de los plásmidos

utilizando enzimas que recocieran un sitio de restricción dentro de la secuencia de Lphn3. Las

enzimas utilizadas fueron EcoR V y Xba I. El patrón de digestión generado fueron dos fragmentos,

uno de 2,679 bp y otro de 6,406 bp para todos los plásmidos. La suma de ambos corresponde al

tamaño total del plásmido (9,085 pb) (Fig. 1B). El vector de expresión utilizado para todas las

construcciones fue pCMV.



6

Efecto de las mutaciones K561N, A760G, D798H, S810L y E811Q en la expresión del receptor

Lphn3

Las mutantes de Lphn3 fueron expresadas en la línea celular HEK293T y marcadas con la

etiqueta HA para su procesamiento por western blot (Fig.1A). La detección de las proteínas se

realizó utilizando dos anticuerpos: 1) acoplado a peroxidasa de rábano (HRP) (Fig. 2A) y 2)

Figura 1. Mutaciones de Lphn3 en cáncer. A) Estructura del receptor Lphn3 con los

diferentes dominios que integran su porción extracelular. Mutaciones en el dominio GAIN

reportadas en pacientes con cáncer que fueron evaluadas en este estudio. B) Gel de agarosa

al 1% que muestra la digestión de los plásmidos de Lphn3 silvestre y de las cinco mutantes

con las enzimas EcoR V y Xba I. Las flechas indican los fragmentos con los tamaños

esperados C (circular), D (digerido).

1A.

1B.

5


acoplado al compuesto IRDye 800CW (Fig.2B). Observamos una banda de 180 kDa que

corresponde al peso total de Lphn3 y otra de 60 kDa que representa la porción carboxilo del

receptor cuando es auto-proteolizado. Interesantemente observamos dos bandas de

aproximadamente 60 kDa, nosotros suponemos que esto es consecuencia de la adición de

glicosilaciones en la porción carboxilo de Lhn3. La cantidad de proteínas fue calculada por

densitometría utilizando el equipo Odyssey Fc de LI-COR y los valores son mostrados en la tabla

1.

Observamos que las mutantes K561N, A760G, D798H y S810L favorecieron la expresión

total del receptor respecto a los valores obtenidos de Lphn3 silvestre (Fig.2D). Por su parte las

mutantes D798H y E811Q presentaron una mayor cantidad de la versión de 60 kDa respecto al

receptor completo, por lo que se podría pensar que este cambio de aminoácidos favorece la auto

proteólisis de Lphn3 (Fig.2C). Es importante mencionar que la mutación E811Q es la más cercana

al sitio GPS del dominio GAIN, y es la que muestra un efecto más evidente en la proteólisis del

receptor.

Figura 2. Efecto de las mutaciones en cáncer sobre la expresión de Lphn3. Células HEK293T fueron transfectadas con las

construcciones de Lphn3 silvestre y las diferentes mutantes. Todas presentaron una etiqueta HA para su detección. La extracción

proteica fue total utilizando 200 µl de buffer de carga. A. y B. Detección de proteínas por quimioluminiscencia y fluorescencia.

La banda de 180 kDa representa el peso total del Lphn3, la banda de 60 kDa es producto del efecto de auto proteólisis que sufre

el receptor. C. Cuantificación de la eficiencia del corte GPS en LPHN3 y sus mutantes. La grafica muestra la versión total y

escindida del receptor. D. Cuantificación de la expresión total de LPHN3 y sus mutantes. La cuantificación se hizo por

densitometría tomando los valores obtenidos de Lphn3 como control.

180 kDa

60 kDa

M

200

66.2

kDa

200

66.2

kDa

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

LPHN3 A760G D798H E811Q K561N S810L

NIV

ELES

TO

TALE

S D

E EX

PR

ESIÓ

NA. B.

C. D.

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

LPHN3 A760G D798H E811Q K561N S810L

EFIC

IEN

CIA

DEL

CO

RTE

GP

S

180 kDa 60 kDa

7



8

Ensayos de agregación de LPHN3 y sus mutantes en procesos de adhesión celular.

Lphn3 es una molécula de adhesión que ha sido relacionada con procesos de estabilidad y

conectividad neuronal. Estos procesos requieren de la formación de interacciones proteína-proteína

altamente estable. Uno de los ligandos reportados para Lphn3 es la molécula de adhesión teneurina

2. En el 2012 Boucard y colaboradores reportaron que las interacciones Lphn3- ten 2 son altamente

estables que permiten la formación de agregados celulares. Tomando en cuenta lo anterior,

mediante ensayos de agregación celular evaluamos el posible efecto de las mutaciones puntuales

reportadas en cáncer de Lphn3 en la adhesión célula - célula. Para ello co-transfectamos a Lphn3,

K561N, A760G, D798H, S810L y E811Q con eGFP, y a teneurina 2 con DsRed. Realizamos

combinaciones de células que expresaran al receptor (Lphn3) y a su ligando (Ten2), para que la

interacción receptor–ligando promoviera la formación de agregados celulares. Observamos la

formación de agregados celulares con todas las mutantes de Lphn3 al estar en contacto con células

que expresaban a Ten2 (Fig. 3A-G). Las mutantes A760G, D798H, S810L y E811Q presentaron

un aumento en los índices de agregación respecto al receptor silvestre de Lphn3 (Fig. 3H).

Lphn3 A760G D798H E811Q K561N S810L

180 kDa 0.689 0.944 0.772 0.427 0.713 0.628

60 kDa 0.728 1.03 1.07 0.876 0.832 0.848

Tabla 1. Cuantificación proteica de Lphn3 y sus mutantes. La cuantificación se

realizó por densitometría utilizando el sistema de Odyssey de LI-COR. Se

seleccionaron las dos bandas de 60 kDa como única banda para su cuantificación.


A

B

C

D

E

F

G

DsR

ed-e

GFP

Lp

hn

3

Lph

n3

A76

0G

Lph

n3

D79

8H

Lph

n3

E81

1Q

Lph

n3

K56

1N

Lph

n3

S810

L

0 10 20 30 40 50 60

S810L

K561N

E811Q

D798H

A760G

Lphn3

CONTROL

Índice de agregación (%) con Teneurina 2

H.

Figura 3. Efecto de las mutantes de Lphn3 en la adhesión celular. A-G. Ensayos de agregación con células

HEK293T en donde se aprecia la formación de agregados entre Lphn3 y las mutantes K561N, A760G, D798H,

S810L y E811Q con Ten2. H. Grafica de barras que muestra los porcentajes de agregación celular de cada pareja

receptor-ligando analizada.

9



10

Discusión y conclusiones

Este proyecto tuvo como propósito evaluar las mutaciones de LPHN3 que están asociadas con

cáncer mediante procesos de adhesión celular mediado por sus ligandos endógenos. Se pretendió

examinar por medio de ensayos de agregación si se presentaba adhesión celular entre el ligando

endógenos de LPHN3 que es Teneurina-2 con las mutantes de LPHN3.

De los resultados obtenidos en esta investigación, se puede deducir que la unión de latrofilina-3

con teneurina 2 puede mediar la unión célula-célula, en células que presentan estas proteínas en su

superficie estas se reconocer y así poder formar agregados. Los ensayos de agregación detectan el

establecimiento de interacción celular. Se llegó a la conclusión de que existe una alta afinidad de

latrofilina-3 y teneurina-2, que son capaces de poder formar uniones intracelulares.

Agradecimientos

Por medio de esta estancia, pude obtener mejores conocimiento y aprendí más técnicas de

laboratorio. Quiero agradecer al verano UAGro por permitirme participar como joven investigador

para el cuarto encuentro de jóvenes investigadores-CONACYT. Quiero agradecer al Dr. Antony

Boucard por aceptarme en el laboratorio de Biología Celular y poder llevar a cabo este proyecto de

investigación, también agradezco a Monserrat Ávila Zozoya que fungió como mi asesora para que

este proyecto se pudiera llevar acabo en tiempo y forma. El proyecto fue financiado con los

recursos de una convocatoria de Ciencia Basica de SEP-CONACyT #221568 y con recursos

federales del CINVESTAV-IPN (otorgados al Doctor Antony Boucard.

Referencias

Benson D. L.,Huntley G. W. (2012) Synapse adhesion: a dynamic equilibrium conferring stability and

flexibility. Curr.Opin. Neurobiol. 22, 397–404.

Missler M., Südhof T. C., Biederer T. (2012) Synaptic cell adhesion. Cold Spring Harbor Perspect.

Biol. 4, a005694.

Sugita S., Ichtchenko K., Khvotchev M., Südhof T. C. (1998) α-Latrotoxin receptor CIRL/latrophilin

1 (CL1) defines an unusual family of ubiquitous G-protein-linked receptors. G-protein coupling not

required for triggering exocytosis. J. Biol. Chem. 273, 32715–32724.

Araç D., Boucard A. A., Bolliger M. F., Nguyen J., Soltis S. M., Südhof T. C., Brunger A. T.

(2012) A novel evolutionarily conserved domain of cell-adhesion GPCRs mediates

autoproteolysis. EMBO J. 31, 1364–1378.

Krasnoperov V. G.,Bittner M. A., Beavis R., Kuang Y., Salnikow K. V., Chepurny O. G.,Little A.

R., Plotnikov A. N., Wu D., Holz R. W., Petrenko A. G. (1997) α-Latrotoxin stimulates exocytosis by

the interaction with a neuronal G protein-coupled receptor. Neuron 18,925–937.


Lelianova V. G., Davletov B. A., Sterling A., Rahman M. A., Grishin E. V., Totty N. F.,Ushkaryov Y.

A. (1997) α-Latrotoxin receptor, latrophilin, is a novel member of the secretin family of G protein-

coupled receptors. J. Biol. Chem. 272, 21504–21508.

Sugita S., Ichtchenko K., Khvotchev M., Südhof T. C. (1998) α-Latrotoxin receptor CIRL/latrophilin

1 (CL1) defines an unusual family of ubiquitous G-protein-linked receptors. G-protein coupling not

required for triggering exocytosis. J. Biol. Chem. 273, 32715–32724.

Ichtchenko K, Bittner MA, Krasnoperov V, Little AR, Chepurny O, Holz RW, Petrenko AG. A novel

ubiquitously expressed alphalatrotoxin receptor is a member of the CIRL family of G-proteincoupled

receptors. J Biol Chem 1999; 274: 5491–8.

Lang J, Ushkaryov Y, Grasso A, Wollheim CB. Ca2+-independent insulin exocytosis induced by

alpha-latrotoxin requires latrophilin, a G protein-coupled receptor. EMBO J 1998; 17: 648–57.

Kan Z, Jaiswal BS, Stinson J, Janakiraman V, Bhatt D, Stern HM, Yue P, Haverty PM, Bourgon R,

Zheng J, Moorhead M, Chaudhuri S, Tomsho LP, Peters BA, Pujara K, Cordes S, Davis DP, Carlton

VE, Yuan W, Li L, Wang W, Eigenbrot C, Kaminker JS, Eberhard DA, Waring P, Schuster SC,

Modrusan Z, Zhang Z, Stokoe D, de Sauvage FJ, Faham M, Seshagiri S. Diverse somatic mutation

patterns and pathway alterations in human cancers. Nature 2010; 466: 869–73.

Silva J. P., Lelianova V. G., Ermolyuk Y. S., Vysokov N., Hitchen P.

G., Berninghausen O.,Rahman M. A., Zangrandi A., Fidalgo S., Tonevitsky A.

G., Dell A., Volynski K. E., Ushkaryov Y. A.(2011) Latrophilin 1 and its endogenous ligand

Lasso/teneurin-2 form a high affinity transsynaptic receptor pair with signaling capabilities. Proc. Natl.

Acad. Sci. U.S.A. 108,12113–12118.

O'Sullivan M. L., de Wit J., Savas J. N., Comoletti D., Otto-Hitt S., Yates J. R. 3rd., Ghosh A.

(2012) FLRT proteins are endogenous latrophilin ligands and regulate excitatory synapse

development. Neuron 73, 903–910.

Oohashi T., Zhou X. H., Feng K., Richter B., Mörgelin M., Perez M. T., Su W. D.,Chiquet-

Ehrismann R., Rauch U., Fässler R. (1999) Mouse ten-m/Odz is a new family of dimeric type II

transmembrane proteins expressed in many tissues. J. Cell Biol. 145,563–577.

Boucard AA, Maxeiner S, Sudhof TC. Latrophilins function as heterophilic cell-adhesion molecules

by binding to teneurins: regulation by alternative splicing. J Biol Chem 2014; 289:387–402.

Lacy S. E., Bönnemann C. G.,Buzney E. A., Kunkel L. M. (1999) Identification of FLRT1, FLRT2,

and FLRT3: a novel family of transmembrane leucine-rich repeat proteins.Genomics 62, 417–426.

Böttcher R. T., Pollet N., Delius H., Niehrs C. (2004) the transmembrane protein XFLRT3 forms a

complex with FGF receptors and promotes FGF signalling. Nat. Cell Biol. 6, 38–44.

Maretto S.,Müller P. S., Aricescu A. R., Cho K. W., Bikoff E. K., Robertson E. J. (2008)Ventral

closure, headfold fusion and definitive endoderm migration defects in mouse embryos lacking the

fibronectin leucine-rich transmembrane protein FLRT3. Dev. Biol.318, 184–193.

Ushkaryov, Y. A., A. G. Petrenko, M. Geppert, and T. C. Südhof. 1992. “Neurexins: Synaptic Cell Surface

Proteins Related to the Alpha-Latrotoxin Receptor and Laminin.” Science (New York, N.Y.) 257 (5066):

50–56.

Tsetsenis, Theodoros, Antony A. Boucard, Demet Araç, Axel T. Brunger, and Thomas C. Südhof. 2014.

“Direct Visualization of Trans-Synaptic Neurexin-Neuroligin Interactions during Synapse Formation.” The

11



12

Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience 34 (45): 15083–96.

doi:10.1523/JNEUROSCI.0348-14.2014.

memorias evaluación de mutaciones de lphn3 …tlamati.uagro.mx/t7e2/613.pdf · 4° encuentro de...

Documents