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Tlamati Sabiduría, Volumen 7 Número Especial 2 (2016)

4° Encuentro de Jóvenes Investigadores – CONACYT 11° Coloquio de Jóvenes Talentos en la Investigación

Acapulco, Guerrero 21, 21 y 23 de septiembre 2016 Memorias

Mutagenesis inducida por antibioticos y especies reactivas del oxigeno en una

cepa de Pseudomonas aeruginosa .

Roberto Adame Gómez (Becario) Facultad de Ciencias Químico Biológicas

Programa de Verano UAGro [email protected]

Área en la que participa: Medicina y ciencias de la salud

Dr. Arturo Ramírez Peralta (Asesor) Profesor-Investigador de la Facultad de Ciencias

Químico Biológicas [email protected]

Resumen

La multiresistencia a antibióticos se genera por la exposición y adaptación a través de mutaciones aleatorias en el genoma de Pseudomonas aeruginosa, por lo cual en este estudio se determinaron los cambios fenotípicos en el perfil metabólico y factores de virulencia inducido por múgatenos en una cepa de P. aeruginosa, estos múgatenos pueden estar en contacto con esta cepa debido a que son utilizados como antibióticos o antisépticos para el control de este microorganismo; si estos múgatenos son capaces de inducir mutaciones podría explicar parte de la variedad de cepas que circulan clínicamente. En este estudio se obtuvieron 9 mutantes de P. aeruginosa utilizando tres múgatenos [rifampicina, ciproflaxino y peroxido de hidrogeno (H2O2)] en distintas concentraciones, una vez obtenidas las clonas se les realizo la determinación de lipasas, proteasas, producción de pigmento en medio de cultivo, cuntificacion de pioverdina, piocianina, biofilm por métodos espectrofotometría, resistencia a ampicilina por Kirby Bauer y una prueba de adherencia a superficies. Obteniendo que las clonas presentaron patrones diferenciales de expresión de piocianina, pioverdina y biofilm con respecto a la cepa de origen, e incluso la expresión cambia entre las clonas expuetas al mismo mutageno. La resistencia a ampicilina se conservó en todas las clonas y la producción de lipasas y proteasas fue atenuada en las clonas a exención de una. En conclusión la exposición a antibióticos y peróxido de hidrogeno generan cambios fenotípicos en la expresión de factores de virulencia en P. aeruginosa, y esto puede originar una mayor clonalidad de cepas circulantes en una población.

Palabras Clave: P. aeruginosa, Mutaciones, Biofilm, Rifampicina, H2O2


Acapulco, Guerrero 21, 22 y 23 de septiembre 2016

Introducción

Pseudomonas aeruginosa es un microorganismo que se encuentra ubicuamente en el

ambiente, puede encontrarse en suelos y agua; contaminado alimentos y como un patógeno

oportunista en el ser humano, causando infecciones del aparato respiratorio y urinario, heridas,

bacteremia entre otros (Chugani and Greenberg 2007; Mena and Gerba 2009; Murray 2008).

Además, tiene una alta prevalencia como un microorganismo intrahospitalario y resistencia a

antibióticos.

Se han descrito múltiples factores de virulencia en P. aeruginosa que favorece el proceso

de colonización e infeccioso, como la presencia de adhesinas y flagelos unipolares, hemolisinas,

β-lactamasas, formación de biofilm, secreción de fosfolipasa C y proteasas, enterotoxina A,

exoenzima S y T. También produce pioverdina, piocianina y piorrubina; pigmentos que ayudan a

catalizar peróxido de hidrogeno o superóxido (Murray 2008; Forbes et al., 2004). La regulación

para la expresión conjunta de estos factores de virulencia de P. aeruginosa está basado en sistema

Quorum Sensing (Rutherford y Bassler, 2012) y la multiresistencia a antibióticos se genera por la

exposición y adaptación a través de mutaciones aleatorias en su genoma (Forbes et al., 2004).

En el presente estudio se determinaron los cambios fenotípicos en el perfil metabólico y

factores de virulencia inducido por múgatenos en una cepa de P. aeruginosa, estos múgatenos

pueden estar en contacto con esta cepa debido a que son utilizados como antibioticos o antisepticos

para el control de este microorganismo; si estos mutagenos son capaces de inducir mutaciones

podria explicar parte de la variedad de cepas que circulan clinicamente. .

Materiales y Métodos

Recuperación de la cepa bacteriana. La cepa de Pseudomonas aeruginosa es un

aislamiento recuperado a partir de mosto utilizado en la elaboración de vino artesanal. La cepa

permanece en el cepario del Laboratorio de Investigación de Patometabolismo Microbiano de la

Universidad Autónoma de Guerrero con número de control E205. La recuperación de la cepa se

realizó por resiembra en agar Mueller Hinton y se confirmaron las características de aislamiento

primario: oxidasa positiva, morfología rizoide, producción de pigmentos.

Mutagénesis inducida por antibióticos. La cepa E205 fue inoculada a partir de la resiembra

original en caldo infusión cerebro corazón (BHI) e incubada por 24 horas a 37˚C. A partir de este

cultivo, se inoculo 100 ul en caldos con las siguientes concentraciones de los antibióticos

rifampicina y ciprofloxacino: 0.05 mg, 0.075 mg y 0.125 mg. Los caldos fueron incubados por 30

Tlamati Sabiduría Volumen 7 Número Especial 2 (2016)

minutos para permitir la siguiente generación bacteriana. Para la inactivacion del antibiótico, este

fue diluido tomando 15 ul de cada cultivo y resuspendiéndolo en 1.5 ml de Caldo BHI. Tomando

100 ul para sembrar en agar Mueller Hinton por estria en ‘V’

Mutagenesis inducida por estrés oxidativo. La cepa E205 fue inoculada a partir de la

resiembra original en caldo infusión cerebro corazón (BHI) e incubada por 24 horas a 37˚C. A

partir de este cultivo, se transfieren 100 ul a una solucion de peroxido de hidrogeno al 3% en Tris

5mM en un volumen final de 1ml. La reaccion fue detenida en los tiempos 4’, 8’ y 12’; para detener

la reaccion se traspaso 15 ul de la mezcla a 1.5ml de caldo BHI Tris 5mM y se dejo incubado por

10 minutos. Al termino, se tomaron 100 ul y se resembraron en agar Mueller Hinton por estria en

‘V’.

Perfil bioquimico. Las cepas fueron inoculadas por estria cruzada en los medios: agar

nutritivo al 10% de yema de huevo para evidenciar la degradacion de lipidos a partir de la enzima

lipasa, agar nutritivo al 5% de leche el cual permite la determinacion de proteasas capaces de

degradar la caseina de la leche.

Resistencia a ampicilina. De un cultivo de 24 horas, se ajusta a escala de McFarland de 0.5

en solucion salina y se sembraron en agar Mueller Hinton con hisopo por estria en ‘V’. Despues

en condiciones de asepsia se coloca un disco de 10 ug de Ampicilina (Oxoid). El crecimiento es

incubado a 18hrs a 35˚C, la lectura se realizo midiendo el diametro de los discos y utilizando como

referencia los valores publicados por el CLSI.

Produccion de pigmentos. Para evidenciar cualitativamente esta caracteristica, las cepas se

sembraron en agar Mueller Hinton por estria cruzada, cuidando que el grosor de la caja fuera el

mismo y que de la estria se obtuvieran colonias aisladas despues de la incubacion a 24 hrs a 37˚C.

En el caso del metodo cuantitativo, las cepas se sembraron en caldo BHI y fueron incubadas por

48 hrs a 37˚C, al termino del periodo de incubacion, se recuperaron 700 ul de los sobrenadantes a

los cuales se les agrego 700 ul de cloroformo para la extraccion de piocianina, los tubos fueron

centrifugados a 3500 rpm por 5 minutos para obtener tanto la fase acuosa como la organica; la fase

acuosa fue utilizada para la determinacion de pioverdina la cual se realizo en microplaca de ELISA

con lectura a 460 nm. De la fase organica, se acidifico con HCl 0.2 N y esta se centrifugo por 5

minutos a 3500 rpm, de las dos fases obtenidas, se recupero la fase acuosa la cual fue utilizada para



la determinacion de piocianina de la misma manera que pioverdina, solo cambiando la longitud de

onda a 520 nm.

Produccion de biofilm. Las cepas fueron sembradas en 3 ml de caldo de BHI e incubadas a

37˚C por 48 horas. El crecimiento fue retirado y el tubo fue lavado tres veces con solucion salina

fisiologica y despues teñido con cristal violeta durante 10 minutos, despues el colorante es retirado

seguido de tres lavados con solucion salina. Por ultimo, se agrega un mililitro de etanol absoluto y

la cantidad del colorante desprendido del tubo es proporcional a la cantidad de biofilm. El etanol

absoluto fue leido en microplaca de ELISA a 500 nm.

Adherencia a superficies. En un caja de petri, se colocó un portaobjeetos en condiciones de

esterilidad, y a este se le colocaron 50 ul de caldo BHI, despues fue inoculado con una colonia de

las cepas de interes e incubado a 37˚C durante 24 hrs. Al termino de la incubacion, los portaobjetos

fueron lavados con solucion salina y teñidos con tincion de Gram. Se realizaron las lecturas a

microscopio optico a objetivo de inmersion. Se revisaron 10 campos y se tomaron fotos de campos

representativos de cada cepa utilizada.

Analisis estadistico. Los datos de pioverdina, piocianina y biofilm fueron ajustados en base

al crecimiento de las cepas. Los datos en las figuras se presentan con media y desviacion estandar.

Debido a que se contemplan nueve grupos de estudio, la comparacion de desviacion estandar se

hizo por la prueba estadistica ANOVA. Resultados menores a p= 0.05 se consideran como

estadisticamente significativos.

Resultados

Del 27 de Junio al 5 de agosto, se utilizaron tres mutagenos; dos de ellos antibioticos,

rifampicina y ciprofloxacino; y un agente oxidante, peroxido de hidrogeno; para generar

mutaciones aleatorias en una cepa de Pseudomonas aeruginosa; obteniendose ocho subclonas, de

las cuales cuatro fueron a partir de rifampicina (E205.1, E205.2, E205.3, E205.4), dos de

ciprofloxacino (E205.5, E205.6) y dos con peroxido de hidrogeno (E205.7, E205.8).

De acuerdo a las caracteristicas metabolicas, las subclonas son distintas, debido a que solo

la cepa original (E205) y la subclona obtenida de peroxido de hidrogeno (E205.7) son proteoliticas

y lipoliticas (cuadro 1). En cuanto a resistencia a penicilina, tanto la cepa original y las subclonas

muestran resistencia a ampicilina.


Cuadro 1. Perfil bioquimico y de resistencia a ampicilina de las cepas de Pseudomonas aeruginosa de este estudio

Cepa 205 205.1 205.2 205.3 205.4 205.5 205.6 205.7 205.8 Lipasas a) + - - - - - - + - Proteasas b) + - - - - - - + - Resistencia a ampicilina c)

R R R R R R R R R

Fuente: Elaboracion propia. a) agar nutritivo al 10% de yema de huevo, b) agar nutritivo al 5% de leche, c) Kirbu Bauer

Una de las caracteristicas de selección de la subclonas fue la perdida del pigmento, por lo

cual al termino de la generacion de mutantes, se observó la produccion del pigmento difusible en

agar, donde se pierde el pigmento en la ultima subclona [Figura 1 j), E205.8]; ademas, la

morfologia entre la cepa y las subclonas cambia; observandose una morfologia rizoide en la cepa

original y en tres de las subclonas obtenidas con rifampicina [Figura 1 b) E205, c) E205.1, d)

E205.2, f) E205.4], y en ultima subclona obtenido con peroxido de hidrogeno, la morfologia

colonial fue puntiforme [Figura 1 j), E205.8]. Debido a que hay una diferencia entre la cepa y las

subclonas en la produccion de pigmentos que se ve reflejado en el color del medio, se realizo la

extraccion y se cuantifico pioverdina y piocianina, identificadose que que la subclona obtenida de

rifampicina fue la que produce una mayor cantidad de pigmentos tanto de pioverdina y piocianina,

incluso que la cepa original [Figura 1a)]. Tambien, se comprueba que la ultima subclona es la

menor productora de biofilm, caracteristica previamente evidenciada en placa [Figura 1j),

E205.8]. Por ultimo, se destaca que hay diferentes patrones de expresion de piocianina y pioverdina

en las subclonas con respecto a la cepa orginal [Figura 1a), p=0.01]



Figura 1. Expresión cualitativa y cuantitativa de pigmentos en mutantes de P. aeruginosa. . a) muestra la cuantificación mediante un método espectrofotometrico, pioverdina de color verde (460nm) y piocianina de color azul (520 nm).La evaluación de la presencia de pigmentos se realizó en agar Mueller Hinton; b) cepa 205, c-f) clonas mutadas con rifampicina, g-h) con ciproflaxino y i-j) peróxido de hidrogeno


Otra caracteristica importante a evaluar fue la produccion de biofilm, evidenciandose que

la produccion de biofilm es mayor en las ultimas subclonas obtenidas para los tratamientos con

antibioticos [Figura 2a)], incluso se observa que estas producen una mayor cantidad de biofilm

con respecto a la cepa original (p= 0.0032). El primer paso en la produccion de biofilm, es la

adherencia a superficies por lo cual se realizo una prueba de adherencia de cada cepa en cristal, en

cl cual se comportan de la misma manera a la produccion de biofilm, las subclonas que producen

mayor cantidad de biofilm se agregan con mayor facilidad y por lo tanto se identifica mayor

cantidad de celulas en el cristal [Figura 2c) E.2051, d) E205.2, e) E205.3, h) E205.6].



Figura 2. Producción de biofilm y capacidad de adherencia de mutantes de P. aeruginosa. a) muestra la cuantificación de biofilm de cultivos de la clonas en caldo BHI durante 48 h y lectura a 500 nm. La adherencia a superficie se observa en objetivo de inmersión con tinción Gram, en b) cepa 205, c-f) clonas mutadas con rifampicina, g-h) con ciproflaxino y i-j) peróxido de hidrogeno.


Discusión y conclusiones

Las mutaciones inducidas son aquellas provocadas por previa alteración experimental del

ADN, sea directamente, o indirectamente, por agentes físicos o químicos denominados mutágenos

(UNNE, 2016). En este estudio se realizaron exposiciones a tres múgatenos consecutivamente a

una cepa de P. aeruginosa, dos antibióticos (rifampicina y ciproflaxino) y un agente oxidante

(H2O2); para inducir mutaciones.

La rifampicina es un antibiótico de amplio espectro (Wehrli 1983) actuando sobre una

subunidad conservada del gen rpoB que codifica para la ARN polimerasa (RNAP), por coniguiente

se inhibe la síntesis de ARN (Villain et al., 2007).Este antibiótico fue el primero en utilizarse,

generando un cambio de morfología colonial, volviendo más irregular y rizoide la colonia y

después a una colonia circular de las clonas de P. aeruginosa (Figura 1 C)-F)) en contraste la

morfología colonial circular y con borde regular en la clonas tratadas con ciprofloxacino. Se ha

descrito que la resistencia a rifampicina es a costo de diversos cambios estructurales en P.

aeruginosa (Hall et al., 2011), Escherichia coli (Jin y Gross, 1989 ), Mycobacterium tuberculosis

(Gagneux et al., 2006) y Staphylococcus aureus (Wichelhaus et al., 2002).Pero no tan solo se

pueden producir estos cambios, la resistencia a antibióticos conferida por mutaciones

cromosómicas se expresan en términos de tasas de crecimiento reducidas, capacidad competitiva,

y la virulencia de las mutantes resistentes en comparación con los fenotipos de su antepasados

sensibles a antibióticos en ausencia de antibióticos; en este caso las mutantes con ambos

antibióticos muestran distintos patrones de expresión de piociniana y pioverdina en relación con

la cepa de origen e incluso entre las propias clonas, también la reducción de lipasa y proteasas.

Se ha evidenciado como el ciprofloxacino favorece la disgregación de Biofilm, afectando la

motilidad y expresión de factores de virulencia (Parul et al., 2016). En este caso la producción de

biofilm muestra un comportamiento similar al de pioverdina y piocianina, y los resultados de

biofilm coincide con la prueba de agregación a cristal, es importante recordar que la primera etapa

de formación de biofilm es la agregación a alguna superficie; esta etapa se lleva a cabo por las

adhesinas presentes en la membrana bacteriana (Giaouris et al., 2015), por los cual las clonas que

en este estudio no fueron capaces de adherirse son las que tiene valores menores en la prueba de

biofilm, esto como producto de una mutación en el genoma de P. aeruginosa.



Estas mutaciones también se pueden desarrollar in vivo, en el proceso infeccioso, por

ejemplo en la fibrosis quística la hipermutación facilita los cambios de las características

fenotípicos y clonales de P. aeruginosa para la adaptación al ambiente (Hogardt et al., 2007; Mena

et al., 2008). He incluso se ha estudiado el impacto en la producción de factores de virulencia del

ácido salicílico en plantas infectadas por P. aeruginosa, encontrado que este es capaz de disminuir

la agregación bacteriana y la producción de piocianina (Prithiviraj et al., 2005) por lo cual se puede

comprobar que las mutaciones inducidas pueden suceder en la naturaleza.

La misma evolución bacteriana requiere de tasas de mutación que permitan la adaptación

a través de la variación de secuencias y al mismo tiempo preservación de la integridad del genoma.

La amplia conservación de múltiples procesos de reparación de errores en el ADN a través de

todos ámbitos de la vida indica una preferencia por los bajos índices de mutación (Sniegowski et

al., 2000; De Visser, 2002). Dentro de estos procesos se encuentra los que se encargan de la

eliminación de los mutagenos en el medio, entre estos se encuentra la superoxido dismutasa y

catalasa; P. aeruginosa es una bacteria productora de catalasa mediante el gen katA, esta catalasa

actúa en el medio extracelular (In et al., 2016) por lo cual la bacteria asegura una mayor integridad.

Sin embargo, en el presente estudia las clonas que tiene un mayor cambio fenotipo en morfología

colonial y la mayor atenuación de factores de virulencia se obtuvieron al exponerlas al peróxido de

hidrogeno. El H2O2 genera especies reactivas de oxigeno las que generan en el ADN mutaciones y

carcinogénesis, hay pérdida de expresión o síntesis de una proteína por daño a un gen específico,

modificaciones oxidativas de las bases, delecciones, fragmentaciones, interacciones estables ADN-

proteínas, reordenamientos cromosómicos y desmetilación de citosinas del ADN que activan

genes(Venereo 2002); por lo cual en esta situación se necesita de un sistema de reparación por

escisión, ya que estas mutaciones se consideran letales para la bacteria.

En conclusión la exposición a antibióticos y peróxido de hidrogeno generan cambios

fenotípicos en la expresión de factores de virulencia en P. aeruginosa, y esto puede originar una

mayor clonalidad de cepas circulantes en una población.

Agradecimientos

Agradezco a la Dirección General de Posgrado e Investigación de la Universidad

Autónoma de Guerrero por permitir realizar esta estancia de instigación a través de la creación y


difusión del programa “Verano de investigacion UAGro” para la vinculación e integración de sus

jóvenes universitarios en el arduo e increíble proceso de la investigación científica. También

agradezco al Concejo Nacional de Ciencia y Tecnología por el apoyo económico para la realización

de esta estancia, así como al Dr. Arturo Ramírez Peralta por su apoyo y consejos durante este

proceso.

Referencias

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