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Tlamati Sabiduría, Volumen 7 Número Especial 2 (2016)

4° Encuentro de Jóvenes Investigadores – CONACYT 11° Coloquio de Jóvenes Talentos en la Investigación

Acapulco, Guerrero 21, 21 y 23 de septiembre 2016 Memorias

Evaluación de tres métodos coproparasitoscópicos para la recuperación de

Blastocystis spp.

Cruz Hernández Ana Bella Facultad de Ciencias Químico Biológicas, UAGro

Programa: Verano UAGro [email protected]

Área: III Medicina y ciencias de la salud

Dra. Elvia Rodríguez Bataz Profesora-investigadora FCQB, UAGro

[email protected] Resumen

Blastocystis spp., es un parásito controversial, con respecto a su patogenicidad, taxonomía y variada morfología, esta última dificulta su identificación en heces al ser un organismo pleomórfico. El objetivo de este trabajo es evaluar tres métodos coproparasitoscópicos en la recuperación e identificación de Blastocystis spp. Se procesaron 80 muestras de heces por tres métodos, directo, uno de concentración mixto, Faust modificado (NCLI) y cultivo en medio de Barret, este último usado como método confirmatorio. Para evaluar la validez de los métodos se estimó sensibilidad, especificidad, valor predictivo y razón de verosimilitud. El medio de Barret, recuperó el mayor número de muestras positivas a Blastocystis spp (43/80, 53.8%), seguido del método de Faust modificado [en película (28/80, 35%) y sedimento (39/80, 48.5%)] y el método Directo (27 /80, 33.8%). Al evaluar los métodos, Faust modificado presenta una mayor sensibilidad y especificidad sobre el método directo y es eficaz en la recuperación de Blastocystis spp., el procedimiento no afecta la morfología del parásito, observando con mayor frecuencia la forma de cuerpo central (vacuolar). El método Directo presenta desventaja en muestras con baja carga parasitaria, mayor cantidad de detritos y usar un pequeño tamaño de la muestra (0.2g). El cultivo en medio de Barret es un método fácil y económico, con la desventaja del tiempo de lectura (24 - 48hr). Es conveniente en el diagnóstico de Blastocystis spp., y otros parásitos intestinales los métodos de concentración mixto como el Faust modificado, para una mayor recuperación de muestras positivas.

Palabras claves: Blastocystis spp., evaluación, Faust modificado, método directo, medio de Barret.


Acapulco, Guerrero 21, 22 y 23 de septiembre 2016

Introducción Las enfermedades parasitarias intestinales constituyen una de las infecciones más

comunes a nivel mundial y de mayor prevalencia, excediendo el 5% en países industrializados y en un 30-70% en los países en desarrollo (Panunzio RAP, Fuentes MBJ, Villaroel RFT, Pirela SEM, Ávila L, Morelo-Zambrano T, Nuñez HMC,… 2014). Se estiman 3.500 millones de personas afectadas por diversas especies de parásitos y 450 millones de casos, con mayor frecuencia en niños (Tedesco, Camacaro, Morales, Amaya, Blanco y Devera, 2012).

Los países en desarrollo por sus condiciones climáticas e higiénico-sanitarias, presentan prevalencias altas comparado con los países desarrollados (Zapata y Rojas-Cruz, 2012). Uno de los parásitos que en los últimos años, presenta un incremento en su frecuencia es Blastocystis sp, lo que sugiere que es un parásito emergente, cuya distribución mundial es justificada principalmente por el hecho que puede ser observado tanto en pacientes sintomáticos como asintomáticos (Panunzio et al., 2014), Blastocystis es un protozoo intestinal que ha presentado dificultades en su taxonomía, con características muy particulares, pertenece al reino Chromista, único organismo parásito de humanos y otros hospederos, la terminología trofozoíto y quiste usadas en los protozoarios no es aplicable, se recomienda “forma observada”, es un parásito pleomórfico, con una amplia variabilidad morfológica, la de cuerpo central (2-200 µm) (incorrectamente llamada vacuolar), mayormente encontrada en muestras de heces, ameboide, granular, multivacuolar y la forma infectante (2-5µm) (no usar el término quiste) siendo estas dos últimas las que inducen a errores en el diagnóstico, una de las grandes dificultades en la identificación de Blastocystis spp., está dada por la gran variedad de morfologías que presenta este microorganismo (Kozubsky y Archelli, 2010; Devera, 2015). Su transmisión, se ha demostrado por la ingesta de la forma infectante (quistes) en alimentos y agua contaminadas por material fecal de animales o personas infectadas, contacto con animales, condiciones de vida, como acceso a red de drenaje, agua potable, poca higiene personal y escolaridad (Amaya, Trejo y Morales, 2015; Tedesco et al., 2012), provocando con frecuencia síntomas como diarrea, dolor abdominal, flatulencia, vómito, estreñimiento, fatiga, colitis, náuseas, distensión abdominal, anorexia, abdomen agudo en niños, proctosigmoiditis hemorrágica, hipoalbunemia, edema generalizado o anasarca, urticaria crónica y prurito palmoplantar y algunos estudios asocian a este parásito con el síndrome de colon irritable y la enfermedad inflamatoria de colon (Zapata y Rojas-Cruz, 2012).

En la actualidad se le considera un patógeno intestinal que necesita ser diagnosticado, informado y tratado, la cuantificación y el identificar la forma predominante es importante, a mayor cantidad generalmente hay sintomatología y algunos morfotipos se asocian más a sintomatologías que otros (Devera, 2015). Los métodos empleados para su diagnóstico comúnmente utilizados como el coproparasitoscópico directo es rápido y fácil de realizar, no es costoso y se ha convertido en una técnica universal, sin embargo, es poco sensible, de un 30-65%, dependiendo de la institución, para aumentar la probabilidad de recuperación de parásitos en heces, se prefiere someter una muestra fecal a una o más técnicas coproparasitoscópicas de concentración, sobre todo cuando la concentración parasitaria es baja (Aquino, Vargas, López, Neri y Bernal, 2012) o se recurre a su cultivo como método confirmatorio. Motivados por lo

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anteriormente descrito, se realizó un estudio para evaluar tres métodos coproparasitoscópicos en la recuperación e identificación de Blastocystis spp.. Materiales y Métodos

Se recolectaron muestras de heces, para la búsqueda del parásito Blastocystis spp., estas fueron revisadas por tres técnicas coproparasitoscópicas.

Método directo. Este utiliza 0.2 g de heces y una gota de lugol o solución salina, sobre un portaobjeto, se homogeniza y se coloca un cubreobjetos y se lee a 10 y 40X.

Método de concentración Mixto (flotación y sedimentación), propuesto por la CLSI (Clinical and Laboratory Standard Institute) o también llamado Faust modificado, emplea un gramo de heces y se homogeniza con nueve ml de solución salina, se filtra y lo que se recupera se centrifuga a 500 g por 10 minutos, se decanta y se resuspende en sulfato de zinc (densidad 1.18), hasta un centímetro antes de la boca del tubo de ensayo y centrifugar durante un minuto a 500 g, colocar el tubo en una gradilla y añadir sulfato de zinc hasta la boca del tubo, para formar un menisco tomar la película y llevar a un portaobjetos con una gota de lugol, colocando un cubreobjetos y observado a 10 y 40X, decantar y tomar del sedimento, agregar una gota de lugol en un portaobjetos y colocar la muestra, homogeneizar y colocar un cubreobjetos, leer a 10 y 40X.

Cultivo en medio de Barret. Por último se sembró en medio de Barret, usado como método confirmatorio en la recuperación de Blastocystis spp., método fácil de realizar al usar suero humano y solución salina y se incuba durante 24 horas, para hacer la lectura en busca de formas del parásito.

Análisis de datos. Los resultados obtenidos por las tres técnicas se capturaron en una plantilla elaborada en el software estadístico SPSS v. 21, calculando las frecuencias por cada una de las técnicas, se tomaron como muestras positivas, cuando fueron observadas formas parásitas en el medio de Barret y positiva al método directo o método de Faust modificado. La validación de los métodos diagnósticos se realizó calculando sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo y valor predictivo negativo y la razón de verosimilitud. Resultados

Se procesaron 80 muestras de heces para la recuperación de Blastocystis spp., está varía por cada método empleado, es así que con el método Directo es de 56.25% (45/80), Faust modificada observando película 55% (44/80), en sedimento 66.25% (53/80), todas las muestras fueron sembradas en cultivo en medio de Barret (Fig. 1).

Comparando los resultados anteriores (Método Directo y Faust modificado) con el obtenido en cultivo en medio de Barret, usado en el estudio como método confirmatorio, observamos resultados falsos positivos y falsos negativos en ambas técnicas (Tablas 1-3).



Validando los métodos empleados con el método cultivo en medio de Barret considerado

como el más sensible (estándar de oro), el método de Faust modificado leyendo sedimento presentó la mayor sensibilidad (90.7%), especificidad (62.2%), valor predictivo positivo (73.6%)

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Fig. 1 Muestras positivas por los distintos métodos empleados para la recuperación de Blastocystis spp..

Fig. 2 Comparación de la recuperación e identificación de Blastocystis spp., por los métodos empleados. Mostrando los verdaderos positivos por cada una de las técnicas (gris oscuro) y los negativos (gris claro).


y valor predictivo negativo, (85.2%) así como una razón de verosimilitud positiva (2.368). (Tablas 1-3)

Cultivo de Barret Estadísticos

Directo Positivo n %

Negativo n %

Total n %

Directo %

Positivo Negativo

27 33.75 16 20.0 43 53.75

18 22.5 19 23.75 37 46.25

45 56.25 35 43.75 80 100

S: E: VPP: VPN: RV+: RV-:

62.8 53.4 60.0 54.28 1.265 0.745

Total

S: Sensibilidad E: Especificidad VPP: Valor predictivo positivo VPN: Valor predictivo negativo RV+: Valor de verosimilitud positivo RV-: Valor de verosimilitud negativo Medio de Barret usado como estándar de oro


Faust película

Positivo n %

Negativo n %

Total n %

Faust película %

Positivo Negativo

28 35.0 15 18.75 43 53.75

16 20.0 21 26.25 37 46.25

44 55.0 36 45.0 80 100


65.1 56.8 63.6 58.3 1.477 0.625

Total

S: Sensibilidad E: Especificidad VPP: valor predictivo positivo VPN: valor predictivo negativo RV+: Valor de verosimilitud positivo RV-: Valor de verosimilitud negativo Cultivo de Barret; como estándar de oro

Tabla 1. Validación del Método Directo en la recuperación de Blastocystis spp..

Tabla 2. Validación del método de Faust modificado (película) en la recuperación de Blastocystis spp..



Tabla 3: Comparación del métodos de Faust modificado (sedimento) y el cultivo de Barret como método confirmatorio en la recuperación de Blastocystis spp.


Faust sedimento

Positivo n %

Negativo n %

Total n %

Faust sedimento %

Positivo Negativo Total

39 48.75 4 5.0 43 53.75

14 17.5 23 28.75 37 46.25

53 66.25 27 33.75 80 100


90.7 62.2 73.6 85.2 2.368 0.16

S: Sensibilidad E: Especificidad VPP: Valor predictivo positivo VPN: Valor predictivo negativo RV+: Valor de verosimilitud positivo RV-: Valor de verosimilitud negativo Cultivo de Barret; como estándar de oro

La recuperación de las formas de Blastocystis spp., es mayor por cultivo de Barret (53.8%) seguido de la observación en el método de Faust sedimento (48.75%) y menor en método de Faust película (35%) y el método Directo (33.8%) (Fig. 3).

Fig. 3 Frecuencia de la recuperación de Blastocystis spp., de los tres métodos empleados, ajustados con el cultivo de Barret para cada una de ellas.


En las muestras se observaron diferentes morfologías de Blastocystis spp., la forma de cuerpo central (vacuolar) en las lecturas por el método Directo en fresco y el método de Faust modificado en película y sedimento. En el cultivo de Barret, con mayor frecuencia la forma granular, seguida de la multivacuolar y la forma ameboide (Fig. 4).

El empleo de tinta china en el cultivo de Barret se observa con mayor calidad la estructura

de Blastocystis spp., esta no entra a la estructura del parásito por lo que resalta la morfología interna del parásito en un fondo oscuro (Fig. 4).

Discusión y conclusiones Blastocystis spp., en la actualidad se le considera un patógeno intestinal que necesita ser

diagnosticado, informado y tratado, la identificación y cuantificación es importante, así como la morfología del parásito, una mayor carga parasitaria es asociado a sintomatologías y algunos morfotipos se asocian más a sintomatologías que otros (Devera, 2015). La recuperación e identificación de Blastocystis spp., es considerada difícil, por el método y por la variada morfología que presenta. El uso de métodos rápidos y sencillos resaltando su bajo costo y tiempo de preparación, son los que terminan ejecutándose (Aquino, Vargas, López, Neri y Bernal, 2012), sacrificando su eficacia.

La recuperación e identificación fue mayor por el método de cultivo en medio de Barret, seguido de Faust modificado y Directo en fresco. El método Directo en fresco, presenta ventajas

Fig. 4 Variantes morfológicas de Blastocystis spp. a 40X, (A) en mitosis, (B) forma granular, (C) forma avacuolar, carece de vacuolas en su citoplasma, (D) forma multivacuolar contiene vacuolas de diferentes tamaños en su interior, (E) forma de cuerpo central, es esférica y presenta una vacuola que ocupa la mayor parte del citoplasma y ( F) la vacuolar presenta una estructura central que ocupa más de la mitad de la célula, así como la de cuerpo central G) y la forma ameboide (H) de tamaño variable y con estructura irregular. Figuras A-D, G y H formas obtenidas de cultivo, observadas con tinta china, Figuras E y F por Método Directo observadas con lugol.



(facilidad y rapidez) no permite reconocer formas parasitarias de menor tamaño, la muestra es muy sucia y cargada de residuos, y se señala por diferentes autores que es efectiva cuando la parasitosis es abundante (Cardona y Bedoya, 2013; Ortigoza, Cruz, Hernández, Castañeda, Castro y Gonzáles, 2011; Aquino et al., 2012).

El método de Faust modificado, método de concentración mixto al leer película y sedimento propuesto por la NCLI, es un método que dentro de sus desventajas está el mayor tiempo en el proceso y costo, sin embargo, son más las ventajas, la muestra se fija con formol y protege de alguna contaminación, recupera un mayor número de formas parásitas al leer película y sedimento, en película la muestra es limpia y facilita la identificación de formas parasitas, en sedimento se recuperan formas más pesadas.

El método de cultivo en medio de Barret, su desventaja es el tiempo para la lectura, pues se requiere de 24 a 48 horas para llevarlo a cabo, su ventaja es que si la muestra es positiva, aun con muy pocas formas parásitas, al reproducirse, se encuentra una mayor cantidad.

Evaluando los métodos, Faust modificado es más eficaz que el método Directo. Faust modificado presentó mayor sensibilidad y especificidad por encima del método directo, con una mayor recuperación en sedimento (48.75%) comparado con la lectura de película (35%), así como una razón de verosimilitud positiva de 2.36, en términos de que realmente este positiva la muestra y el valor predictivo negativo, 0.16 indicando la certeza de ser negativa.

Algunas investigaciones han considerado que los métodos de concentración en la recuperación de Blastocystis spp., presenta la desventaja en la deformación de su estructura por el empleo de la centrifuga, el estudio no mostró este problema, coincidiendo con lo reportado por Aquino et al. (2012), la recuperación de parásitos como lo es Blastocystis spp., fue mayor por el método de Faust mixto o modificado, permite hacer una concentración de la muestra, elevando la probabilidad de encontrar formas parasitarias, evitando confusión; el uso de solución salina en lugar de agua, el tiempo de centrifugación y el empleo de sulfato de zinc así como la cantidad de lavados de la muestra, han mejorado este método lo que permite obtener una muestra más limpia que el método directo, mejorando el reconocimiento de parásitos. Comparando los métodos utilizados con el método cultivo en medio de Barret (estándar de oro) este mostró una excelente recuperación 53.75%, la mayor de los tres empleados. La concentración parasitaria se multiplica y por lo tanto la observación y su identificación es más fácil, reconociendo las formas características de Blastocystis spp., las cuales coinciden con las reportadas en otros trabajos (Ortigoza, et al., 2011; Guzmán, Vethencourt, Galindo, Chacón, Wagner y Nessi, 2008; Kozubsky y Archelli, 2010), las formas granular, multivacuolar, en división y ameboide fue observada en el cultivo en medio de Barret así como la forma infectante, el uso de tinta china, permite un mayor contraste para observar la morfología interna. El cultivo de Barret es una herramienta importante en el diagnóstico, es fácil de preparar, no requiere de reactivos costosos, por lo que es accesible a diferencia de otros medios de cultivo empleados con el mismo propósito (Devera, Jaimes, Yánez, Amaya, Blanco, Ixora y Mata, 2013; Ortigoza et al., 2011). Recomendando su uso, al facilitar la identificación, en muestras con escasas formas, donde no hay certeza de su presencia, o cuando no se está familiarizado con todas las formas que presenta Blastocystis spp., y para el seguimiento post tratamiento de la blastocystosis.


El método de Faust modificado presenta la mayor eficacia en la recuperación de

Blastocystis spp., comparada con el método Directo. El cultivo en medio de Barret, es un medio fácil, no costoso en la recuperación e identificación de Blastocystis spp..

Agradecimientos

Agradezco a los responsables del Laboratorio de investigación en Parasitología de la Facultad de Ciencias Químico Biológicas por su apoyo, y en especial a la Dra. Elvia Rodríguez Bataz, asesora del trabajo por sus comentarios y sugerencias para mejorar el presente trabajo.

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