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Tlamati Sabiduría, Volumen 7 Número Especial 2 (2016)

4° Encuentro de Jóvenes Investigadores – CONACYT 11° Coloquio de Jóvenes Talentos en la Investigación

Acapulco, Guerrero 21, 21 y 23 de septiembre 2016

Memorias

Generación de precursores neurales a partir de fuentes alternas:

determinación de marcadores del linaje neural.

Claudia Isabel Ramírez Vélez (Becario)

Unidad Académica de Ciencias Naturales UaGro

Verano UaGro

Correo: [email protected]

Área III: Medicina y Ciencias de la Salud

Dr. Jesús Santa Olalla Tapia (Asesor-Investigador)

Profesor- Investigador Titular A, TC del

Laboratorio de Biología de Células Troncales de la Facultad de Medicina UAEM

[email protected]

Resumen

La medicina regenerativa es un campo interdisciplinario de investigación y aplicaciones clínicas,

el cual se centra en la reparación, sustitución o regeneración de las células, tejidos u órganos, para

restaurar funciones biológicas alteradas por diversas causas, incluyendo malformaciones

congénitas, enfermedades o traumatismos (Manson et al., 2008). Lo atractivo de la terapia celular

se deriva del hecho de que las células introducidas puedan ser manipuladas ex vivo, tanto a nivel

celular como molecular, para hacerlas más eficientes durante la recuperación de la función perdida

(Ball et al.,2000), donde las células precursoras pueden ser empleadas para generar fenotipos útiles.

La importancia de utilizar células troncales o células precursoras adultas, recae en el hecho de que

se obtienen con facilidad, pueden ser autólogas, tienen la capacidad de proliferar por tiempos

prolongados y diferenciar hacia los diferentes fenotipos celulares de los tejidos dañados, así es

posible, que, con su proliferación extensa, se genere la cantidad de células necesaria para la

recuperación funcional. En este contexto, el presente proyecto propone el empleo de queratinocitos

humanos para la generación de precursores neurales por eventos de plasticidad para el posible

empleo de enfermedades neurodegenerativas. Siendo estas alteraciones una de las principales

causas de morbi y mortalidad a nivel mundial, no existiendo tratamiento que repare el daño.

Palabras Clave: Medicina Regenerativa, Terapia Celular, Células troncales, Plasticidad,

Queratinocitos, Precursores Neuronales.



Introducción

Las enfermedades neurodegenerativas se caracterizan por provocar un deterioro

neurológico progresivo, que se acompaña de una disminución de la funcionalidad e independencia

personal, y que en fases avanzadas comportará una reestructuración familiar porque aparece la

necesidad de un cuidador principal (Abril et al,.2004). Además de que los tratamientos de hoy en

día son muy costosos, no todas las personas tienen acceso a ese tipo de tratamientos y ponen la

integridad y salud del paciente.

Las enfermedades neurodegenerativas más comunes son la enfermedad de Alzheimer (EA)

y la enfermedad de Parkinson (EP), la EA es la enfermedad neurodegenerativa más frecuente,

afectando aproximadamente a 15 millones de personas en todo el mundo, la EP es la segunda

enfermedad neurodegenerativa más común después de la enfermedad de Alzheimer, con una

prevalencia de 1 a 2% en personas mayores de 65 años (Ramirez,2008). México registra un rápido

avance de las enfermedades neurodegenerativas (Crónica, 2016), el especialista de la Universidad

de Guadalajara, doctor Carlos Beas Zárate mencionó que; “La incidencia de enfermedades

neurodegenerativas ha sido mayor; lo que hace 20 años se pensaba que era exclusivo de la raza

anglosajona ahora está en nuestro país” (Universidad de Guadalajara, 2014).

La terapia celular es un procedimiento terapéutico que involucra la transferencia de

poblaciones celulares a un individuo hospedero, con la finalidad de corregir algún defecto o

introducir nuevas funciones en este.

Actualmente las células introducidas pueden ser manipuladas ex vivo a nivel celular y

molecular, y hacerlas más eficientes en la restitución de una función deficiente por la pérdida de

células (Peredo, 2015). Una opción serían las células troncales que se ha demostrado su utilidad y

capacidad de proliferar exitosamente y son participes de diferentes tratamientos de múltiples

enfermedades, entre las que destacan las enfermedades neurodegenerativas.

Las enfermedades neurodegenerativas se caracterizan por provocar un deterioro

neurológico progresivo, que se acompaña de una disminución de la funcionalidad e independencia

personal, y que en fases avanzadas comportará una reestructuración familiar porque aparece la

necesidad de un cuidador principal (Abril et al,.2004). Además de que los tratamientos de hoy en

día son muy costosos, no todas las personas tienen acceso a ese tipo de tratamientos y ponen la

integridad y salud del paciente.

Las células troncales se definen como una población indiferenciada, capaz de autor

renovarse, es decir dar origen a células idénticas a sí mismas, con el mismo potencial a diferenciar,

tienen la capacidad de proliferar extensamente y generar todos los tipos celulares presentes en un

tejido (Acevedo et al.,2011).

Además de que presentan la característica de ser pluripotentes, es decir, dan origen a los

diferentes tipos celulares originados de las tres capas germinativas (endodermo, mesodermo y

ectodermo), en cada una de estas capas germinativas es posible identificar células troncales

comprometidas para cada uno de los tejidos que se generan, las cuales tienen a su cargo la

capacidad de dar origen a los fenotipos terminales. (McDonald et al. 1999; D. C. Wu et al. 2007).

Tlamati Sabiduría Volumen 7 Número Especial 2 (2016)

En este contexto se creía que su capacidad de diferenciación era un proceso irreversible, es

decir las células se iban diferenciando a un tipo de linaje especifico. Este hecho implicaba que, si

se buscaba una fuente celular para terapia celular, esta solo podía provenir de células que originaran

el tejido de interés, por ejemplo, las células troncales neuronales solo generarían exclusivamente

neuronas.

Recientes estudios han demostrado que las células troncales poseen una propiedad

denominada plasticidad, que se define como la capacidad que posee una célula dentro de un linaje

especifico, para generar células de otro linaje de origen embrionario distinto. Esta capacidad,

permite nuevas estrategias terapéuticas, debido a que ya no es forzoso que la fuente celular

provenga de un tejido al cual es difícil de acceder (Peredo, 2015)

Las células troncales epidermales, en este caso los queratinocitos, son capaces de generar

distintos tipos celulares in vitro por medio de eventos de plasticidad (Bickenbach & Stern 2005),

por lo tanto estas células podrían ayudar a generar tejidos de difícil acceso, como lo es el tejido

neural, lo que facilitaría su utilización en terapia celular para tratar enfermedades

neurodegenerativas. La piel presenta las mejores características para la obtención y propagación

de células, entre las que destaca la ausencia de problemas éticos, mal diferenciación, o de respuesta

inmune al paciente, por tratarse de un trasplanté autologo. Es por eso que el objetivo de este

presente trabajo fue evaluar y demostrar que es posible generar precursores neuronales de vías

celulares alternas en este caso, queratinocitos.

Materiales y Métodos

Descongelamiento de crioviales con queratinocitos humanos

Se descongelo la línea celular de Queratinocitos obtenidos anteriormente de una biopsia de

prepucio humano, este procedimiento se llevó a cabo en condiciones estrictas de esterilización.

Primero el criovial con células fue suspendido en baño maría a 37° C por 3 minutos para

descongelar, posteriormente se llevó a la campana de flujo laminar previamente esterilizada y

lavada con agua destilada y Etanol al 70%.

Se realizó un lavado del criovial en donde se congelaron las células con 1 ml de medio de

cultivo ideal para queratinocitos, se lavó el criovial con aproximadamente 700 ul y la tapa con una

aproximado de 300 ul pasando el medio con células al tubo Falcón de 15 ml después del enjuague,

para garantizar que se han pasado todas las células. El tubo se centrifugo a 400 G por 5 minutos

(en centrifuga SIGMA 3-18K), se retiró el sobrenadante por aspiración con una pipeta Pasteur

estéril cuidando de no jalar el pellet (pastilla celular), se agregó 1ml de medio ideal para

queratinocitos, se enjuagó la pastilla con el medio.

Para estimar la viabilidad, en un tubo de micro centrifuga de 0.6 ml se agregó 10 ul de azul

de Tripano 0.4% y 10 ul de células resuspendidas. Se colocó 10 ul de la mezcla anterior en el borde

de la cámara de Neubauer cuidadosamente para que se llene por capilaridad. Se colocó la cámara

en la platina del microscopio invertido, se retiró el filtro verde, y se observó la preparación con el

objetivo 10X.



Se procedió a contar las células con un contador manual, se obtiene el total de células de

los 5 cuadrantes (cuadro central delimitado por líneas triples, constituido por 4 x 4 cuadros, y los

cuatro cuadrantes ubicados en los vértices del cuadro central), se identificaron las células vivas que

se ven refrigerantes ya que su membrana se encontraba integra y las muertas azules, por disrrupción

de membrana.

Cultivo celular

De acuerdo a los cálculos obtenidos se tomaron 428 ml de células que se suspendieron en

4 cajas para cultivó de células de 10 centímetros de diámetro (55 cm²), en 7 ml de medio. Se mueve

la caja de manera que el medio toque todas las direcciones para lograr una distribución homogénea

de células. La viabilidad de estas células fue de 95 %, y se sembró 500,000 células en cada caja.

Las cajas fueron llevadas al microscopio invertido y se observó la homogeneidad de la distribución.

Las células se incubaron a 37° C en una atmosfera de CO2 al 5 %

Subcultivo de queratinocitos

Una vez alcanzada la confluencia de 80 % se procedió a hacer un subcultivo, el primer paso

consiste en retirar el medio de la caja(s), teniendo cuidado de no desprender o dañar la monocapa,

posteriormente se colocó en la caja Petri tripsina al 0.25% distribuyendo a toda la caja de manera

que llegue a todas las células y se incuba durante 3 min. Una vez pasado el tiempo se observaron

en el microscopio para asegurar el desprendimiento de las células de la caja, se inactiva la tripsina

agregando medio de inactivación (DMEM, + 10% SFB), disgregando 30 veces para asegurar que

la monocapa de células se separe, una vez hecho el lavado se pasó el contenido de las cajas a tubos

Falcón de 15 ml para centrifugar, se enjuagaron las cajas con 1ml de medio para asegurar el

máximo desprendimiento de células, se transfiere el resto del medio al tubo de centrifuga y se

centrifuga a 400g en la centrífuga Sigma 3-18k durante 5 minutos, terminado esto, quedaron dos

fases, una fase acuosa y otra con el pellet, retirar el sobrenadante, cuidando de no tomar el pellet

(pastilla celular). Se resuspendió en 3 ml de medio epidermal, homogenizando con la pipeta unas

10 veces, para asegurar la máxima homogeneidad de células, y se procede nuevamente a hacer

conteo celular con azul de Tripano en la cámara de Neubaeur.

Se sembró en cajas de cultivo con 7 ml de medio epidermal, se mezcló el medio con las

células para lograr una distribución homogénea de las mismas. Se inclina la caja 5 veces en las 4

direcciones (frente, atrás, derecha e izquierda). Se observan en microscopio para asegurarse de que

la distribución de células sea homogénea. Se incubó a 37º C en una atmósfera de CO2 al 5% durante

el tiempo requerido para alcanzar una confluencia entre el 80% y 90% (cuatro días,

aproximadamente).

Generación de precursores neurales a partir de queratinocitos humanos

El protocolo de inducción neural consiste en dos etapas. La primera etapa (7 días de

cultivo), pretende generar agregados celulares, y en la segunda etapa (20 días de cultivo), obtención

de precursores neurales.


Etapa 1: Generación de agregados celulares

Una vez que las células alcanzaron el 90% de confluencia, se procedió a cultivar los

queratinocitos en medio de diferenciación neural 1 (DMEM/F-12 con 17.5 mM de glucosa, 20

ng/ml EGF, 40ng/ml de bFGF y 1% B27) durante 7 días, para generar agregados celulares.

Se sembraron tres cajas con queratinocitos. Dos con medio diferenciación 1 y una caja con

medio de propagación UDMM-Queras (control negativo), en cada caja se sembraron un total de 1

millón de células, y se incubó a 37º C en una atmósfera de CO2 al 5%. Se realizó cambio de medio

cada tercer día. Al finalizar el tiempo de cultivo, una caja fue lisada para la extracción de ARN y

la otra se empleó para continuar el proceso de inducción (etapa 2).

Etapa 2: Generación de precursores neurales

Previamente las cajas donde se cultivaron las células, fueron tratadas con Laminina (durante

2 horas), para permitir la adherencia.

Una vez culmina la etapa de inducción uno, las células fueron disgregadas con tripsina y

sembradas en Medio de Inducción Neural 2 (DMEM F12 suplementado con B27 y 1% SFB (Suero

Fetal Bovino) durante 20 días.

Caracterización Molecular de precursores neurales mediante PCR-RT.

El laboratorio de Biología de las células Troncales, cuenta con un banco de oligonucleótidos

(diseñados en el programa, OLIGO6), de los cuales se eligió trabajar con oligonucleótidos para

Nestina y NeuroD como biomarcadores del linaje neural.

Tabla 1. Oligonucleótidos utilizados y su correspondiente secuencia, sentido y anti sentido.

OLIGO SENTIDO ANTISENTIDO

Neuro D CCC TTC TTT GAA AGC CCT CTG ACT AAA TGG TGA AAC TGG CGT GCC TCT

Nestina CAT CTG ACC AGG GAA GAG GTG AT CTC CTC CTG CTC GCT CTC TAC TTT

Fuente: Laboratorio de Biología de Células Troncales, UAEM.

Una vez elegidos los oligonucleótidos, se buscó en la página virtual “Human Protein Atlas” las

líneas celulares que expresan los genes de interés para emplearlos como controles positivos y

estandarizar las condiciones eficientes de PCR-RT. Seleccionando la línea celular como lo indica

en la siguiente tabla.

Tabla 2. Línea celular que expresan los genes de interés. Se seleccionó la línea celular SH-

SY5Y, la cual expresan preferentemente los genes a evaluar. Las barras moradas muestran la

expresión de ARN para cada línea, calculado como valores FPKM (fragmentos por kilobase

mapeada).



Factor de

Transcripción

Línea

celular

Resumen de la línea celular

Nestina SH-SY5Y Línea celular de neuroblastoma

metastásico

NeuroD SH-SY5Y Línea celular de neuroblastoma

metastásico

Fuente: The Human Protein Atlas

Estandarización del PCR-RT para biomarcador.

Con el fin de estandarizar el PCR-RT del factor de transcripción NeuroD y Nestina se

cultivó la línea celular SH-SY5Y (ATCC CRL-2266), la cual fue propagada durante 15 días y se

les llevó a cabo la extracción de ARN, posteriormente se evalúo la calidad del ARN, mediante

pruebas de pureza e integridad. La primera corresponde en evaluar la posible contaminación con

ADN mediante un PCR y observando la amplificación del gen constitutivo GAPDH y la medición

del índice de las absorbancias 260nm/280nm, tomando como punto de corte 1.8. La segunda prueba

corresponde a la integridad del ARN mediante un gel de urea-ácido cítrico al 2%.

Previamente las células (SH-SY5Y) fueron lisadas al día de cultivo 4 (85% de confluencia)

por un tratamiento de trizol, adicionando 1ml de trizol por cada 5x10⁶ de células.

Purificación de ARNm

A partir del lisado con Trizol, se procede a la obtención y purificación de ARNm, siguiendo

el protocolo de purificación de RNA. Las muestras se dejaron descongelar 5 minutos a temperatura

ambiente, una vez descongeladas se procedió a añadir Cloroformo (J.T. Baker No. Cat. 9175-03)

de acuerdo al volumen de trizol usado se añadió 200 ul por cada mililitro de Trizol, se agito

vigorosamente para asegurar la homogenización del cloroformo y el trizol, y se dejó reposar 3

minutos a temperatura ambiente, no en hielo, el cloroformo tiene la propiedad de separar el ARN

de la fase orgánica que contiene proteínas y otros contaminantes.

Las muestras se centrifugaron a 12 000 G durante 15 minutos a una temperatura de 4°C en

la centrifuga LW Científica Prism R refrigerada, una vez transcurrido el tiempo la muestra se

separó en tres fases, una fase acuosa, fase orgánica y una interfase blanca que contiene el ADN, se

toma solamente la fase acuosa que contiene el ARN cuidando de no aspirar la interfase blanca y se

pasa a un tubo de microcentrífuga (aproximadamente 500 ul), una vez obtenida la fase acuosa se

añadieron 500 ul de Alcohol Isopropílico ( J.T Baker No.Cat. 9084-03) al 100% a los tubos con la

fase acuosa y se vortexeo 10 segundos para una óptima homogenización, se incuban por 10 minutos

a temperatura ambiente y se vuelve a centrifugar a 12 000 durante 10 minutos a la misma

temperatura (4° C), se obtiene un pellet que contiene el ARN, se decanta el sobrenadante cuidando

de no retirar el pellet y se coloca en papel absorbente los tubos de manera invertida, se seca el


exceso de solución con un hisopo de algodón estéril cuidando de no llegar al pellet, y los tubos se

pasan a hielo. Se añade 1 ml de etanol al 70 % frío ( -20° C) para lavar la pastilla, se vortexea 10

segundos, y se centrifuga a 7 500 G durante 5 minutos a la misma temperatura. Igualmente se

decanta el sobrenadante y se repite los pasos de secado anteriores. Los tubos se dejaron secar al

aire, cubriendo con papel parafilm el tubo realizando tres perforaciones en el con aguja estéril, y

se colocaron en una incubadora de crecimiento bacteriano durante 10 minutos.

Transcurrido el tiempo se resuspendieron en 150 ul de agua inyectable, y se vortexearon

durante dos pulsos de 30 segundos. Una vez suspendidas se pasaron al refrigerador de -20 ° C.

Se hizo un tratamiento con DNasa para eliminar los posibles residuos de ADN en nuestras

muestras de RNA, a cada una de las muestras se le añadió 15 ul de Buffer de Reacción 10x para

DNasa 1 (Thermo Science) y 3 ul de DNasa 1 (Thermo Science No. Cat. EN0521), estos parámetros

de volumen se siguieron de acuerdo al volumen empleado de agua inyectable, las muestras se

vortexearon durante 10 segundos y se incubaron a 37°C durante 1 hora en una incubadora de

crecimiento bacteriano.

El proceso de extracción se repitió para una óptima eliminación de materia orgánica y restos

de ADN, añadiendo 1ml de Trizol al RNA. Al terminar el proceso se resuspendió la pastilla de

RNA en 50 ul de agua inyectable. Al termino de este proceso se realizó una PCR para comprobar

que no existiera residuos de ADN genómico.

Una vez comprobado que el ARN es puro, se cuantifica la absorbancia a 260 nm y 280 nm

para estimar la cantidad y pureza de RNA, de acuerdo al protocolo de uso del espectrofotómetro

Biodrop. Los resultados se encuentran en la siguiente tabla

Tabla 3. Resultados de la cuantificación de las muestras de RNA

Muestras A 260/230 A260/280 Concentración

ug/ul

1 1.112 1.842 0.175 ug/ul

2 0.243 1.852 0.196 ug/ul

3 2.244 1.774 0.244 ug/ul

Fuente: Elaboración propia

Síntesis de ADNc

Para la síntesis de ADN complementario a partir de RNA, se programó el baño seco a 65°

C, y se hicieron los cálculos para saber cuánto ARN debemos tomar para tener 3 ug (en este caso

son 3 ul debido que se hicieron 3 reacciones por muestra), esto de acuerdo a los resultados de la

cuantificación de las muestras y se llevó a 30 ul de agua de agua inyectable, los volúmenes se

muestran a continuación en la tabla 2.



Tabla 4. Volumen de RNA y agua inyectable para la desnaturalización del RNA

Muestras

Queratinocitos

Volumen de RNA Volumen de Agua

Inyectable

1 17.2 ul 12.8 ul

2 15.3 ul 14.7 ul

3 12.0 ul 18 ul

Fuente: Elaboración propia

Se colocó en un tubo de 0.6 ml la cantidad de agua calculada, y se agregó la cantidad de

RNA correspondiente al cálculo, y se calentó a 65 °C por 5 minutos para desnaturalizar el RNA.

Mientras se calienta el ARN se colocaron los reactivos para la mezcla general excepto la

Transcriptasa Reversa M-MLV en el tubo de microcentrífuga de 1.5 ml. La mezcla se vortexeo por

10 segundos y se centrifugó en la minifuga durante 10 segundos. Se colocó el volumen requerido

de la Transcriptasa Reversa, se vortexeo y centrifugo por 10 segundos.

Los tubos con RNA se sacaron del baño seco, se vortexearon y se centrifugaron para bajar

la condensación de la tapa y se colocaron en hielo, se agregó 60 ul de la mezcla general a los tubos,

se vortexeo y se centrifugo por 10 segundos. Las muestras se incubaron a 37 ° C durante una hora.

Al término de la incubación se tomaron 3 ul de la reacción y se procedió a realizar una PCR para

comprobar calidad e integridad.

Estandarización de la PCR (Reacción en cadena de la polimerasa)

Posteriormente, se prosiguió con la optimización de la amplificación de los genes NeuroD

y Nestina mediante la estandarización de la concentración de MgCl2 y de la temperatura de

apareamiento, con la finalidad de encontrar la condición que tenga una mayor amplificación del

gen, y sin la presencia o la menor cantidad de artefactos (especificidad y dímeros de primer).

Para llevar a cabo esta optimización se realizó de manera simultánea una curva de

temperatura que partía de 54 a 68°C (54, 54.3, 55, 56.1, 57.7, 59.7, 62, 64.1, 65.6, 66.9, 67.6, 68)

y de 4 concentración de MgCl2 (0.5, 1, 1.5 2, 2.5, 3, 3.5 y 4 Mm).

Resultados

Cultivo de Queratinocitos

El rendimiento celular fue de 2,840,000 células del descongelamiento del criovial con una

viabilidad del 85 %. Se realizó un registro fotográfico en donde se monitoreo desde CP (Cultivo

Primario) a P-3 para evaluar si existen cambios morfológicos y capacidad proliferativa durante la

propagación de queratinocitos (Fig. 1). Los resultados indican que en el CP hay por lo menos 2

poblaciones celulares ya que existe heterogeneidad morfológica. I de células con soma alargado,

con prolongaciones apicales y núcleo oval y morfología II células con soma redondo, con gran

citoplasma y núcleo circular (Fig. 2). En el P-1 aún se observan los 2 tipos de morfologías, siendo

el primer tipo el que predomina (Células con soma alargado). Posterior a este pase es decir el P-2


y P-3, ya no se observan células con soma redondo. Por lo tanto, el medio epidermal favorece el

crecimiento de una población.

Figura 1. Figura 2.

Se observó un aumento en el número de células conforme avanzan los pases, es decir, en el

pase 1 se obtuvieron alrededor de 4,396,000 células por caja, en el P-2 5,984,000 células por caja

y para el P-3 6,404,500 células por caja. (Fig.3) se mantuvo una vialidad mayor al 90% de los

casos, por lo tanto, los datos son confiables y no tienen relación con muerte celular o efecto en la

manipulación.

Figura 3. Grafica de Rendimiento celular y Viabilidad durante la propagación de

queratinocitos humanos.

Diferenciación de Queratinocitos

Las células fueron monitoreadas a lo largo del procedimiento de diferenciación, obteniendo

evidencia fotográfica de cada una de las etapas, en donde se observó cambio morfológico durante

el proceso.

0

2,000,000

4,000,000

6,000,000

8,000,000

CP P1 P2 P3

No

. de

célu

las

Pase

Rendimiento celular

0.00%

50.00%

100.00%

AIS CP P1 P2 P3

%

Pase

Viabilidad



Etapa 1:

En la etapa uno podemos observar los cambios morfológicos de acuerdo a la comparación

de morfologías con Queratinocitos en medio de propagación epidermal (control negativo) (Fig.5),

podemos observar a partir del primer día de siembra la generación de las agregadas celulares

flotantes, mostrando morfología oval y delimitada. (Fig.4).

A)

B)

Figura 4. Generación de precursores neurales. A) Diferenciación de Queratinocitos a las 24

de horas de siembra, se pueden observar las agregadas celulares de forma ovalada y delimitada. B)

Queratinocitos en medio de propagación UDMM-Queras.

Etapa 2:

Una vez culminado el periodo de incubación (7 días) con medio de diferenciación neural 1,

los agregados fueron obtenidos y disgregados con tripsina para la obtención de células individuales.

y resembradas en cajas previamente tratadas con Laminina a una densidad de 120,000 células en

cajas de 55 cm² con medio de Diferenciación Neural 2.

A partir de las 24 horas, se observó adherencia de las células. En el día 5 de cultivo, se

observó cambios morfológicos de las células, en donde se aprecian células con soma alargado y

prolongaciones muy extensas similares a neuronas como se muestra en la figura 6.


Figura 6. Se observan las células observadas a 10x,20x y 40x en el microscopio invertido,

se observan las células con prologaciones y ya adheridas a la caja similares a neuronas.

Estandarización del PCR-RT para biomarcador.

El cultivo celular de la línea SH-SY5Y las cuales se observaron el crecimiento y se dejaron

propagar durante un mes (Fig.7).

Figura 7. Línea celular SH-SY5Y.

Se lisaron estas células con trizol y se purifico el ARN, en la figura 8 se observan los geles

de agarosa y se comprueba que no se encuentra rastros de ADN al no mostrarse producto de

amplificación, además de que se realizó un gel de urea ácido cítrico para comprobar la integridad

y el tamaño del ARN.



Figura 8. Gel de agarosa que muestra la pureza del ARN al no mostrar productos de

amplificación, se utilizó como control positivo GAPDH, se muestra también el gel de urea que

muestra la integridad y el tamaño.

Síntesis de DNA

La integridad y calidad se observó en el gel de agarosa (Fig. 9) donde se observa

amplificación a partir del ciclo 20 y con más producto de amplificación en el ciclo 40, lo que

comprueba que es un cDNA de buena calidad además que no ha dímeros de primer lo cual nos dice

que hay un buen pegado de iniciadores.

Figura 9. ADN complementario de la línea celular SH-SY5Y, con sus respectivos controles

positivo y negativo.


Estandarización de la PCR (Reacción en cadena de la polimerasa)

De acuerdo a los resultados de las PCR, en el caso de Nestina, la mejor condición fue en

0.5 a 68 °C y 1.0 a 68°C, de acuerdo con la figura 10, donde se muestra la curva de Mg y el producto

de amplificación que fue de 459 pb

Por el tiempo reducido de la estancia de investigación no se pudo realizar la evaluación

molecular de los marcadores NeuroD y Nestina de las células inducidas a la diferenciación.

Discusión y conclusiones

El presente trabajo me permitió evaluar y propagar una línea celular de Queratinocitos,

además de diferenciarlos hacia un linaje diferente y expresar precursores del linaje neural, lo cual

es muy importante ya que su aplicación en terapia celular. También aplique la técnica de reacción

en cadena de la polimerasa, electroforesis en gel de agarosa, urea y síntesis de ARN y purificación

de ADN complementario para su aplicación en PCR. De acuerdo con los objetivos planteados en

el presente trabajo, la generación de precursores neuronales fue posible gracias a la propagación

de Queratinocitos y la línea celular SH-SY5Y , además de que comprueba que el uso de

Queratinocitos, además de su fácil manejo y propagación, reúnen grandes características para

inducirlos no solo al linaje neural, sino también en la terapia de otras enfermedades como la

Diabetes, esto también abre las probabilidades de usar otro tipos de células como lo son los

Figura 10. Curva de

concentración de Mg, se observa

como el producto de amplificacion

conforme la concetracion de Mg

sube.



fibroblastos que también forman parte de la piel. Es muy importante recalcar que el desarrollo de

este trabajo, abre próximas investigaciones y avances en la aplicación de la terapia celular

Agradecimientos

Antes que nada, quiero agradecer a la Universidad Autónoma de Guerrero por haberme

proporcionado los recursos necesarios para que esta estancia fuese posible, también por alentar a

los jóvenes estudiantes de buscar nuevas maneras de aumentar su conocimiento y abrir puertas en

varios lugares del estado y del país. También quiero agradecer al Dr. Jesús Santa Olalla Tapia por

haberme aceptado en su laboratorio y proporcionarme el material necesario para la realización de

este proyecto, también agradecerle su confianza, y por compartir su conocimiento conmigo, me

llevo una gran experiencia científica, gracias. Agradezco también el asesoramiento del estudiante

de maestría, Biol. Joel Esquivel Estudillo por su ayuda, asesoramiento y por compartir su

conocimiento conmigo, además de su ayuda proporcionada para la realización de este trabajo,

también agradezco la ayuda de mis compañeros de estancia, Karina Pellat, Naolly Barradas, Salma

Muñoz y Jesús Quevedo, nos ayudamos mutuamente en nuestros diferentes trabajos, gracias por

esta experiencia científica.

Referencias

Abril, M.A, Tico, N. y Garreta, R. (2004). Enfermedades Neurodegenerativas. Rehabilitacion.

38(6):318-24. Madrid, España

Acevedo, J., Ángeles, J., Rodríguez, V. y Santa-Olalla, P. (2011). Células troncales neuronales en

Pelayo, R., Santa Olalla, J. y Velasco, I. Células troncales y medicina regenerativa. México,

Universidad Autónoma de México, 94 p.

Ball, E., Lister, J., y Law, P. (2000). Hematopoietic stem cell therapy. Churchill-Livingstone,

Philadelphia, USA, 757.

Bickenbach, J.R. y Stern, M.M. (2005). Plasticity of Epidermal Stem Cells Survival in Various

Environments Identification of Epidermal Stem. Stem Cell Reviews, pp.71-77.

Figueroa, A. (2008). Registra México rápido avance de males neurodegenerativos. Crónica.

Obtenido de: http://www.cronica.com.mx/notas/2008/352231.html

Manson, C. y Dunnill, P. (2008). A brief definition of regenerative medicine. Regenerative

medicine. 3:1-5.

McDonald, J.W., Liu, X.Z., Qu, Y., Liu, S., Mickey, S.K., Turetsky, D., Gottlieb, D.I y Choi D.W.

(1999). Transplanted embryonic stem cells survive, differentiate and promote recovery in injured

rat spinal cord. Nature Medicine, 5(12), pp.1410-1412.

Peredo, N.R.S. (2015). Evaluación del potencial de diferenciación neuronal de células precursoras

obtenidas a partir de epidermis. Tesis de licenciatura, Facultad de Ciencias Bioquímica y Biología

Molecular, Universidad Autónoma del Estado de Morelos, 107 p.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Liu%20XZ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=10581084

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Qu%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=10581084

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Liu%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=10581084

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Mickey%20SK%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=10581084

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Turetsky%20D%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=10581084

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Gottlieb%20DI%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=10581084

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Choi%20DW%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=10581084


Ramírez M., María del Carmen; (2008). ¿Qué sabe Ud. acerca de ......? las enfermedades

neurodegenerativas? Revista Mexicana de Ciencias Farmacéuticas, Julio-septiembre, 71-73.

The Human Protein Atlas. (2016, Julio). Obtenido de: http://www.proteinatlas.org/

Universidad de Guadalajara. (2014). Adictivo alimenticio aumenta enfermedades

neurodegenerativas y obesidad. Obtenido de: http://www.udg.mx/es/noticia/aditivo-alimenticio-

aumenta-enfermedades-neurodegenerativas-y-obesidad

generación de precursores neurales a partir de fuentes ...tlamati.uagro.mx/t7e2/618.pdf ·...

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