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Tlamati Sabiduría, Volumen 7 Número Especial 2 (2016)
4° Encuentro de Jóvenes Investigadores – CONACYT 11° Coloquio de Jóvenes Talentos en la Investigación
Acapulco, Guerrero 21, 21 y 23 de septiembre 2016
Memorias
Caracterización y expresión génica del transcrito de la citrato sintasa 2
(LvCitSyn2) del camarón blanco Litopenaeus vannamei
Liliana González Sierra (Becario)
Universidad Autónoma de Guerrero
Facultad de Ciencias Químico Biológicas
Programa de Verano Delfín
Área en la que participa: II Biología y Química
Dra. Adriana Muhlia Almazán y Jesús Alberto León Ruiz (Asesores)
Investigador en el Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo (CONACYT)
Resumen
La citrato sintasa es una enzima que se encuentra en los organismos eucariontes y procariontes
que llevan a cabo la ruta metabólica del ciclo de Krebs. Esta enzima clasificada como una
acyltransferasa (EC 2.3.3.1.) cataliza la condensación de acetil-CoA y oxalacetato para formar
citrato, y es la única enzima en el ciclo que puede catalizar la formación de un enlace carbono-
carbono. En las células eucariotas, la citrato sintasa se encuentra casi exclusivamente en la
mitocondria, es sintetizada por ribosomas citoplasmáticos y transportada a la matriz mitocondrial
que es donde se localiza en su forma activa. A pesar del papel esencial que esta enzima juega en
el metabolismo de los organismos, en la actualidad se han realizado escasos estudios en los
crustáceos donde la información acerca de la función mitocondrial de estos organismos es aún
limitada, incluyendo a las especies de gran importancia económica en la pesquería y la
acuacultura como el camarón blanco del Pacífico Litopenaeus vannamei. Con base en lo anterior,
el objetivo de este trabajo fue identificar y caracterizar el transcrito de la citrato sintasa 2
(LvCitSyn2) mitocondrial del camarón blanco, así como evaluar su expresión génica de manera
cualitativa en los diferentes tejidos del mismo.
Palabras Clave: Citrato sintasa, mitocondria, Litopenaeus vannamei.
4° Encuentro de Jóvenes Investigadores – CONACYT 11° Coloquio de Jóvenes Talentos en la Investigación
Acapulco, Guerrero 21, 22 y 23 de septiembre 2016
Introducción
El camarón blanco del Pacífico Litopenaeus vannamei es la especie de peneido mas
cultivada en la actualidad, se distribuye desde la costa Norte del Pacífico Mexicano, América
Central y América del Sur, hasta el sur de Perú, en las zonas donde las temperaturas del agua son
normalmente > 20 ° C durante todo el año (Funge-Smith y Briggs, 2003). A pesar de la gran
importancia económica que esta especie tiene en la pesquería y la acuacultura, en la actualidad se
han realizado escasos estudios sobre la función mitocondrial de los crustáceos incluyendo a las
especies de importancia económica como el camarón.
Las mitocondrias son organelos celulares presentes en las células eucariotas. Su estructura
consta de una membrana externa, una membrana interna, un espacio intermembranal y una matriz
mitocondrial en donde se ubica el ADN y los ribosomas mitocondriales, así mismo, es en la
matriz donde toman lugar esenciales vías metabólicas del metabolismo energético, como el Ciclo
de Krebs y la ß-oxidación (Sánchez y Arboleda, 2008).
Las funciones principales de las mitocondrias incluyen la obtención de energía a través de
la síntesis de ATP mediante la fosforilación oxidativa, la degradación de biomoléculas, inducción
de la apoptosis y regulación del calcio intracelular; también se favorece la proliferación celular en
función de la cantidad de sustrato que penetra en la mitocondria, así como por la activación o
inhibición de diferentes enzimas mediante la cual la célula regula su producción de energía
(Gamero de Luna y Gamero Estévez 2012).
La citrato sintasa es una enzima que se encuentra en los organismos eucariontes y
procariontes que llevan a cabo la ruta metabólica del ciclo de Krebs y participa de manera activa
para asegurar la producción de intermediarios y productos requeridos por la célula para que ésta
se mantenga en un estado estable. Se sabe que el flujo de los átomos de carbono del piruvato
proveniente de la glucólisis al ciclo de Krebs está bajo regulación estricta en dos puntos: 1) la
conversión de piruvato a acetil-CoA, y 2) la entrada de acetil-CoA al ciclo de Krebs a través de la
reacción catalizada por la citrato sintasa que resulta una enzima esencial para los organismos
(Wiegand y Remington, 1986).
En 2014, Ghafari et al., reportaron el transcriptoma del músculo de L. vannamei; a partir
de dicho transcriptoma se realizó un análisis bioinformático y se sugirió la existencia de dos
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transcritos codificantes de isoformas de la citrato sintasa los cuales no han sido propiamente
caracterizados y a los que se les denominó LvCitSyn2 y LvCitSynX, siendo la LvCitSyn2 el
transcrito de interés para el presente proyecto. Con base en lo anterior, la presencia del transcrito
que codifica para la LvCitSyn2 fue confirmada en el camarón blanco L. vannamei.
El primer paso del estudio fue aprender las técnicas básicas de la biología molecular, se
diseñaron oligonucleótidos específicos para amplificar el transcrito LvCitSyn2, se amplificó por
PCR y se confirmó su identidad. Posteriormente se evaluó su expresión génica en varios tejidos
del camarón.
Hipótesis
El transcriptoma del camarón blanco Litopenaeus vannamei cuenta con un transcrito que
codifica a una citrato sintasa que contiene las características conservadas de estas enzimas y esta
expresada de manera ubicua en todos los tejidos evaluados del camarón.
Materiales y Métodos
1. Búsqueda, identificación y diseño de oligonucleótidos de LvCitSyn2
Se realizó una búsqueda en la base de datos del transcriptoma Litopenaeus vannamei,
reportada por Ghafari et al., (2014). Posteriormente utilizando las secuencias encontradas de la
LvCitSyn2 putativa se diseñaron oligonucleótidos específicos (sentido y antisentido) utilizando el
software Primer3 para amplificar dicho transcrito.
2. Disección de tejidos del camarón y aislamiento de ARN total
Se realizó la disección de tejidos de un organismo adulto de la especie de Litopenaeus
vannamei. Se disectaron de manera individual el pedúnculo ocular, hepatopáncreas, corazón,
músculo, pleópodos y branquias.
El ARN total de cada uno de los tejidos y órganos disectados se aisló utilizando el método
del fenol-cloroformo cuyo fundamento se encuentra en la metodología descrita por Chomczynski
y Sacchi en el 1987.
El ARN aislado total se cuantificó en un espectrofotómetro Nanodrop ND-1000,
utilizando el programa ND-1000 V3.5.2, utilizando a su vez la relación 260/280 nm para
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determinar su pureza. Posteriormente, se evaluó la integridad mediante un análisis de
electroforético en geles de agarosa al 2% teñido con Sybr-Safe, en condiciones nativas. La
electroforesis se realizó en una cámara Mini-Sub Cell GT, con buffer TAE 1X a 70 volts. El gel
se reveló en un fotodocumentador Gel Doc™ EZ System (BioRad).
3. Síntesis de ADNc y amplificación por PCR de LvCitSyn2
Una vez que se obtuvo el ARN total integro se procedió a realizar una RT-PCR para
sintetizar ADN complementario (ADNc) utilizando el kit GoScriptTM
Reverse Transcription
System (ProMega). Se utilizó el volumen equivalente a 5 g de ARN total como templado para la
síntesis de ADNc. La retrotranscripción se llevó a cabo en 2 pasos; el primer paso se realizó
utilizando 1 L de Oligo (dT) (0.5 g/L), el volumen correspondiente a 5 g y aforando a un
volumen final de 5 L con agua tratada con dietilpirocarbonato (DEPC) para después incubar la
mezcla a 70 °C durante 5 min y después enfriar en hielo a 4 °C hasta agregar la mezcla de
retrotranscripción. Posteriormente, se adicionaron 4 L de buffer de reacción 5x, 4 L de MgCl2
(25mM), 1L de PCR nucleotide Mix, 1 L de recombinant RNAsin® ribonuclease y 1 L de
GoScript™ Reverse Transcriptase, aforando a un volumen final de 15 L con agua DEPC. La
reacción se incubó a 25 °C durante 5 min y después a 42 °C por 1 h. Finalmente, se inactivo la
transcriptasa reversa incubando la reacción a 70 °C por 15 min. Una vez sintetizado el ADNc se
calculó la concentración teórica obteniéndose una concentración final de 250 ng/uL.
El ADNc de hepatopáncreas se utilizó como templado para la amplificación por PCR del
transcrito LvCitSyn2. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo utilizando el volumen
correspondiente a 250 ng de ADNc, 1 L de cada oligonucleótido específico (sentido y
antisentido), 2.5 L de Coral load PCR buffer, 12.5 L de Taq PCR Master Mix ® (Qiagen) y
aforando a un volumen final de 25 L con agua Milli-Q (Millipore). Las reacciones se llevaron a
cabo en un termociclador C1000 TouchTM
(Bio-Rad). Las condiciones de amplificación fueron
las siguientes: 1 ciclo de 95°C por 2 min, 40 ciclos 95° C por 35 seg, 55° C por 30 seg, 72° C por
40 seg, seguidos por 1 ciclo de 72°C por 10 min. Los productos de PCR fueron visualizados en
geles de agarosa al 1.5 % teñidos con Sybr-Safe (Invitrogen).
Los productos de PCR exitosamente amplificados se purificaron utilizando columnas de
silica GFX con el kit Nucleospin Gel and PCR Clean-up (Macherel y Nagel) siguiendo las
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especificaciones del fabricante. Posteriormente los productos obtenidos se mandaron a secuenciar
al Laboratorio de Sistemática y Evolución Molecular de la Universidad de Arizona.
4. Expresión del transcrito de la LvCitSyn2 en diferentes tejidos del camarón
El ARN total previamente aislado de los diferentes tejidos del camarón se utilizó como
templado para la síntesis de ADNc para cada muestra de acuerdo a la metodología anteriormente
descrita. Una vez obtenidos los ADNc de todos los tejidos, se evaluó la expresión por tejidos de
manera cualitativa amplificando un producto de 387 pb utilizando los oligonucleótidos
CitSyn2Fw2 y CitSyn2Rv2. Los productos de PCR se visualizaron en un gel de agarosa al 1.5%
teñido con Sybr-Safe (Invitrogen).
5. Reconstrucción de la filogenia de LvCitSyn2
Para la construcción de las relaciones filogenéticas se utilizó la secuencia deducida del
transcrito de LvCitSyn2 y varias secuencias disponibles en el GenBank de especies incluyendo las
siguientes secuencias: Tribolium castaneum (XP_970124.1), Bombyx mori (XP_004929851.1),
Homo sapiens (AAC25560.1), Dendroctonus ponderosae (ENN74802.1), Harpegnathos saltator
(XP_011144055.1), Solenopsis invicta (XP_011171933.1), Aedes aegypti (XP_001656210.1),
Musca domestica (XP_005177340.1), Culex quinquefasciatus (XP_001870133.1), Bos taurus
(XP_010803417.1), Drosophila melanogaster (ACU32620.1), Saccharomyces cerevisiae
(EGA84955.1), Mus musculus (NP_080720.1), Rattus norvegicus (NP_570111.1), Zootermopsis
nevadensis (KDR22581.1), Daphnia pulex (EFX90150.1), Strongylocentrotus purpuratus
(XP_003725039.1), Danio rerio (AAI66040.1), Apis mellifera (XP_393545.2) y el método
utilizado corresponde al Neighbor-Joining, Taylor -Thornton Matrix, utilizando 1000 réplicas.
Resultados
1. Diseño de oligonucleótidos de LvCitSyn2
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En el transcriptoma analizado se identificaron dos ESTs (Expressed Sequence Tags) los
cuales presentaban porcentajes de identidad >70% con otras secuencias reportadas e etiquetadas
como citrato sintasa 2. A partir de estos 2 ESTs se construyó una secuencia consenso alineando
ambas secuencias con el algoritmo en línea Clustal Ω. A partir de esta secuencia consenso, se
diseñaron oligonucleótidos específicos para amplificar la citrato sintasa del camarón (Tabla 1).
2. Aislamiento del ARN total del camarón
En la Figura 1 se muestran las subunidades 28S y 18S del ARN ribosomal de las muestras
de ARN total aislado de branquias, hepatopáncreas y pleópodos. La presencia de estas bandas
sugiere que el ARN aislado se encuentra íntegro y por lo tanto es viable para utilizar como
templado en la reacción de retrotranscripción.
Oligonucleótidos Longitud Tm Secuencia 5’- 3’
CitSyn2Fw2 18 pb 52.6° C TCA GAG AGC AAA TTC GCC
CitSyn2Rv2 18 pb 54.3° C TCC GAT CGT AGC TTG GTG
CitSyn2Rv3 19 pb 53.6° C AAA TTC TCG CTG GCA AGT G
Tabla 1. Oligonucleótidos específicos diseñados para la amplificación del
transcrito LvCitSyn2 del camarón blanco.
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3. Amplificación por PCR de LvCitSyn2
Los amplicones logrados por PCR utilizando los oligonucleótidos diseñados para
LvCitSyn2 generaron dos productos de 387 pb y 522 pb, respectivamente que se muestran en la
figura 2. Ambos productos amplificados se secuenciaron logrando la secuencia consenso que se
muestra en la figura 5.
4. Expresión de LvCitSyn2 en los diferentes tejidos del camarón
La figura 3 muestra la expresión ubicua de un fragmento de 387 pb consistente con el
tamaño de amplicon esperado de la LvCitSyn2.
Figura 1. Gel de agarosa al 2% donde se observan las bandas del 28 y 18S del ARNr del
ARN total aislado de branquias (BR), hepatopáncreas (HP) y pleópodos (PL) de L. vannamei.
Figura 2. Gel de agarosa al 1.5 %. A) Producto de PCR con peso molecular de 387 pb obtenido
con los oligonucleótidos CitSyn2Fw2 y Rv2. B) Producto de PCR con peso molecular de 522 pb
obtenido con los oligonucleótidos CitSyn2Fw2 y Rv3.
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5. Análisis de la secuencia de LvCitSyn2 del camarón blanco L. vannamei
La figura 4 muestra el alineamiento múltiple que fue realizado con las secuencias logradas
de CitSyn2Fw2Rv2, CitSynFw2Rv3 y la secuencia consenso.
Figura 3. Gel de agarosa al 1.5 % donde se muestra la expresión de la citrato sintasa en
diferentes tejidos de L. vannamei. Br: Branquias; Co: Corazón; CN: Cordón Nervioso; Hp:
Hepatopáncreas; M: Musculo; PO: Pedúnculo Ocular.
Figura 4. Alineamiento múltiple de la LvCitSyn2 del camarón blanco L.
vannamei.
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Después de ser analizado correctamente, se obtuvo la nueva secuencia que se muestra en
la figura 5, que demuestra que efectivamente se confirmó una parte de la región codificante del
transcrito de la LvCitSyn2 del camarón blanco.
Utilizando la secuencia nucleotídica resultante, se obtuvo la secuencia deducida de
aminoácidos mediante el software bioinformático ExPASy Translate Tool
(http://web.expasy.org/translate/), y la proteína resultante fue analizada. La figura 6, muestra el
Figura 6. Secuencias con alineamientos significativos con relación a la citrato sintasa 2 del
camarón blanco.
Figura 5. Secuencia consenso lograda de los dos amplicones de 387 pb y 522 pb de la
LvCitSyn2 del camarón blanco L. vannamei.
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resultado obtenido del algoritmo Blast P, que confirma la identidad de la secuencia deducida de
aminoácidos como la citrato sintasa 2 del camarón blanco.
6. Relaciones filogenéticas de la región confirmada de LvCitSyn2
La figura 7 muestra la secuencia parcial deducida de aminoácidos de LvCitSyn2 del
camarón blanco, misma que fue utilizada para analizar las relaciones filogenéticas de la proteína
con las de otras especies de invertebrados y vertebrados.
La figura 8 muestra el cladograma de LvCitSyn2, donde podemos observar que los clados
están organizados en especies de vertebrados e invertebrados y Litopenaeus vannamei se
encuentra en uno de los clados de especies de invertebrados del grupo artrópodo.
Discusión y conclusiones
Figura 7. Secuencia deducida de aminoácidos de LvCitSyn2.
Figura 8. Árbol filogenético de especies que tienen relación con la secuencia de LvCitSyn2 del
camarón blanco. Obtenido con el método de Neighbor-Joining (Jones-Taylor Thornton Model).
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Los resultados de este estudio confirman la identidad de un transcrito amplificado del
hepatopáncreas del camarón, que guarda hasta un 89 % de identidad con las citrato sintasas de
otras especies de invertebrados como los insectos. Aunque esta es la primer secuencia confirmada
de una citrato sintasa del camarón, se sugiere que existen dos isoformas de la citrato sintasa
mitocondriales en el camarón blanco LvCitSyn2 y LvCitSynX.
Con base a los resultados se deduce que la isoforma LvCitSyn2 es la que se expresa de
manera ubicua en el camarón blanco, pues el papel de la enzima es central para que se lleve a
cabo el ciclo de Krebs, la cadena respiratoria y la fosforilación oxidativa, cuyo producto final es
la síntesis de ATP, molécula energética vital para que la célula pueda mantener sus funciones.
Se recomienda continuar con la secuenciación y estudio de la segunda isoforma
encontrada en el transcriptoma del camarón, la LvCitSynX y realizar la expresión del transcito
para compararla con la de LvCitSyn2 y poder así inferir sobre los mecanismos que regulan la
expresión de ambos transcritos.
Agradecimientos
El presente trabajo de investigación fue realizado bajo la supervisión de la Dra. Adriana
Muhlia Almazán y Jesús León Ruiz a quienes me gustaría expresar mi más profundo
agradecimiento, por hacer posible la realización de este proyecto, además de agradecer su
paciencia, tiempo y dedicación para que esto saliera de manera exitosa.
Agradezco al programa Delfín, por permitirme participar como joven investigador en el
XXI Verano de la Investigación Científica y Tecnológica del Pacífico 2016.
A mis padres por enseñarme a seguir aprendiendo todos los días sin importar las
circunstancias y el tiempo, por su apoyo incondicional.
A la Universidad Autónoma de Guerrero por apoyarme con los trámites correspondientes
para obtener este logro.
A Erick Armenta por brindarme su amistad y también por compartirme de sus
conocimientos.
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Agradezco profundamente a todo el equipo que integra el laboratorio de Bioenergética y
Genetica Molecular del CIAD por su apoyo y su amistad.
A Dios, por brindarme la oportunidad de vivir, por permitirme disfrutar cada momento de
mi vida y guiarme por el camino que ha trazado para mí, por ser mi apoyo, mi luz y camino.
Referencias
1. Funge-Smith, S. and Briggs M. (2003). The introduction of Penaeus vannamei and P stylirostris
into the Asia-Pacific region. International Mechanisms for the Control and Responsible Use of
Alien Species in Aquatic Ecosystems, 26–29 August 2003, Jinghong, Xishuangbanna, People's
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2. Ghaffari Noushin, Sanchez-Flores Alejandro, Doan Ryan et al., (2014). Novel
transcriptome assembly and improved annotation of the whiteleg shrimp (Litopenaeus
vannamei), a dominant crustacean in global seafood mariculture. DOI:
10.1038/srep07081
3. Gamero de Luna & Gamero Estévez (2012). Enfermedades mitocondriales, Med fam Andal Vol.
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4. Wiegand Georg & J. Remington Stephen (1986). Citrate synthase: Structure, Control, and
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5. Sánchez Ruth & Arboleda Gonzalo (2008). Mitocondria y muerte celular, ISSN:1794-
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6. Chomczynski Piotr & Sacchi Nicoletta, (1987). The single-step method of RNA isolation
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