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Tlamati Sabiduría, Volumen 7 Número Especial 2 (2016)
4° Encuentro de Jóvenes Investigadores – CONACYT 11° Coloquio de Jóvenes Talentos en la Investigación
Acapulco, Guerrero 21, 21 y 23 de septiembre 2016
Memorias
Expresión de marcadores de células Natural Killer en lesiones del
Sistema Nervioso Central asociadas a infección por Mycobacterium
tuberculosis.
Jorge Erick Espiritu Cantú (Becario)
Universidad Autónoma de Guerrero
Facultad de Ciencias Químico Biológicas
Programa de Verano Delfín
Área en la que participa: III Medicina y Salud
Dr. Citlaltepetl Salinas Lara (Asesor)
Investigador Médico S.N.I. 1
Médico Especialista Adscrito Dpto. de Neuropatología
Resumen
La tuberculosis es una enfermedad infecciosa, sistémica, crónica y una de las principales causas de
mortalidad a nivel mundial. Se estima que un tercio de la población mundial se encuentra infectada
por el bacilo Mycobacterium tuberculosis. La mortalidad varía de acuerdo con la forma de la
tuberculosis y del estado inmunológico del paciente. En la mayoría de los casos es pulmonar, pero
por cuestiones inmunológicas se pude diseminar a otros órganos y/o sistemas, determinándose
como tuberculosis extra pulmonar. La Tuberculosis del sistema nervioso central (SNC) es una de
las formas extra pulmonares poco común (5%), sin embargo se le atribuye mayor grado de
mortalidad. Las células NK actúan como un componente del sistema inmune innato, ya que son
uno de los primeros efectores en sitios de inflamación con capacidad citotóxica y por sus
capacidades de producción de citoquinas participan en el desarrollo de una respuesta inmune
adaptativa potente. La biología de las células NK sigue pendiente de estudio en las enfermedades
neurológicas especialmente en tuberculosis del SNC, aunque hay argumentos en otros trabajos de
investigación que indican que los factores específicos del cerebro podrían modular la función de
las células NK y viceversa. El presente trabajo es un estudio longitudinal, experimental,
prospectivo y comparativo. Se llevó a cabo en dos fases: 1) Tejidos humanos (autopsias)
provenientes de pacientes que cursaron con tuberculosis del SNC para caracterizar la presencia y
el reclutamiento de células NK hacia el tejido nervioso. 2) En dos grupos de ratones macho cepa
Balb/c de 6 a 8 semanas, los cuales serán infectados con la cepa Mycobacterium tuberculosis
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Acapulco, Guerrero 21, 22 y 23 de septiembre 2016
H37Rv por vía intracraneal. La diferencia del primer grupo con el segundo es que este último serán
tratados previamente con anticuerpo anti-asialo-GM1 para depletar células NK, en ambos se
analizará su sobrevida y las características histopatológicas del parénquima cerebral.
Palabras Clave: Mycobacterium tuberculosis, Tuberculosis del SNC, células NK
Introducción
La tuberculosis es una enfermedad infecciosa, sistémica, crónica y una de las principales
causas de mortalidad a nivel mundial. Se estima que un tercio de la población mundial se encuentra
infectada por Mycobacterium tuberculosis. En el 2014, 9.6 millones de personas enfermaron de
tuberculosis y 1,5 millones murieron por esta enfermedad, de las cuales 456,000 eran personas con
infección por VIH. Los individuos inmunodeprimidos son altamente susceptibles. (Álvarez, et al.,
2009)
La epidemiología de la enfermedad cambió, de manera radical, principalmente en zonas
geográficas marginadas de África, Asia y América, después de la aparición del SIDA, ante
programas antituberculosos deficientes y la resistencia creciente de Mycobacterium a los fármacos
de elección. En el 2014 más del 95% de las muertes por tuberculosis ocurrieron en países de
ingresos bajos y medianos, esta enfermedad es una de las cinco causas principales de muerte en las
mujeres entre los 15 y los 44 años, en dicho año un millón de niños enfermaron de tuberculosis y
140 000 murieron. (Salud, 2016)
De acuerdo con información del Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiológica (SiNaVE),
México registra cada año unos 15 mil casos nuevos de tuberculosis pulmonar y alrededor de 2 mil
defunciones, principalmente en el occidente y Golfo de México y con menor incidencia en los
estados del Centro de la Republica. Además de lo anterior, se ha identificado una mayor asociación
con Diabetes Mellitus, Desnutrición y Adicciones, principalmente el Alcoholismo, lo cual ha
agravado el perfil de la tuberculosis. (Uribarren Berrueta, 2015)
La mortalidad varía de acuerdo con la forma de la tuberculosis y al estado inmunológico
del paciente. Esta enfermedad responde al tratamiento estándar, con una tasa de curación mayor al
95%, en pacientes con tuberculosis multirresistente es del 50 al 80% (en 2014 se calculó que 480
000 personas desarrollaron tuberculosis multirresistente a nivel mundial). Menos del 30% de los
inmunocompetentes logran la curación y más del 50% mueren dentro de los primeros cinco años
del diagnóstico. En pacientes inmunocomprometidos con tuberculosis altamente resistente la
mortalidad es del 90%. En la mayoría de los casos la tuberculosis es pulmonar, pero por cuestiones
inmunológicas se pude diseminar a otros órganos y/o sistemas, determinándose como tuberculosis
extra pulmonar. La Tuberculosis del sistema nervioso central (SNC) es una de las formas extra
pulmonares poco común que representa el 5% de los casos, sin embargo se le atribuye mayor grado
de mortalidad. (Álvarez, et al., 2009)
La meta de los Objetivos de Desarrollo del Milenio que pretendía detener y empezar a
reducir la epidemia de tuberculosis para 2015 se ha cumplido a nivel mundial. La incidencia de
esta enfermedad, que desde 2000 ha disminuido por término medio en un 1,5% anual, se sitúa ahora
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un 18% por debajo del nivel correspondiente a ese año. La tasa de mortalidad por tuberculosis
disminuyó un 47% entre 1990 y 2015. Se calcula que entre 2000 y 2014 se salvaron 43 millones
de vidas mediante el diagnóstico y el tratamiento de la tuberculosis. Acabar para 2030 con la
epidemia de tuberculosis es una de las metas relacionadas con la salud, incluida en los Objetivos
de Desarrollo Sostenible adoptados en fecha reciente. (Salud, 2016)
Tuberculosis del Sistema Nervioso Central
La Tuberculosis del sistema nervioso central (SNC) pude afectar el cerebro, médula espinal,
nervios craneales y espinales, meninges, cráneo y columna vertebral. (Martínez, 2010) Es una
enfermedad grave, a menudo fatal que afecta principalmente a niños pequeños. Esta enfermedad
es difícil de diagnosticar y tratar; el tratamiento incluye cuatro medicamentos, desarrollados hace
más de 30 años, y sólo previene la muerte o discapacidad en menos de la mitad de los pacientes.
(A. Be, et al., 2015)
Existen dos formas principales de la tuberculosis del SNC, la meningitis que representa el
0,5-1% de la enfermedad tuberculosa y los tuberculomas intracraneales, a nivel mundial desarrollan
un 40% de los tumores cerebrales. (A. Be, et al., 2015)
M. tuberculosis es frecuentemente resistente a diversos medicamentos poniendo en peligro
el retorno a una era de mayor mortalidad. La resistencia a múltiples fármacos (MDR) por
Mycobacterium tuberculosis está en aumento, y aproximadamente el 4,8% de los nuevos casos de
tuberculosis en todo el mundo se deben a cepas multi-resistentes, lo que representa 489,139
pacientes anualmente. El tratamiento de la MDR-TB especialmente en los individuos coinfectados
por VIH es mucho más compleja que en el caso de organismos totalmente susceptibles a fármacos,
ya que se asocia con un mayor costo del tratamiento y períodos de tratamiento más largos. Además,
estos casos muestran una peor evolución de los pacientes y la tasa de mortalidad es más alta. (A.
Be, et al., 2015)
Los datos patológicos principales de la tuberculosis en SNC son: 1) exudado inflamatorio
meníngeo; 2) vasculitis de arterias pequeñas y de gran tamaño; 3) trastornos en el flujo de LCR. El
exudado denso en las meninges basales bloquea las cisternas de la fosa interpeduncular y menos
frecuentemente los agujeros de Luschka y Magendie lo cual produce hidrocefalia. (Martínez, 2010)
El SNC está protegido desde el sistema circulatorio sistémico por la barrera
hematoencefálica (BHE). Esta barrera se compone principalmente por células endoteliales
microvasculares del cerebro humano, que están estrechamente unidas. La porción basal de estas
células endoteliales están soportadas de procesos intercalados de astrocitos, pericitos, microglia,
neuronas y de matriz extracelular. El transporte paracelular está limitado por la presencia de
uniones estrechas entre las células endoteliales, mientras que el movimiento transcelular está
restringido por la relativa escasez de vesículas endocíticas. (A. Be, et al., 2015)
Estas propiedades hacen que la barrera sea impermeable a muchas moléculas grandes,
hidrófilas y agentes patógenos circulantes. Otra barrera protectora del SNC es la barrera que se
encuentra entre la sangre y el líquido cefalorraquídeo (CSF), que proporciona la separación espacial
entre el sistema circulatorio y el CSF a nivel de los plexos coroideos. Las células de la barrera
sangre-CSF tienen propiedades similares a las de la BHE, con uniones estrechas mejoradas y una
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regulación más estricta de transcitosis. A pesar de esta buena integridad de la barrera, hay una serie
de patógenos bacterianos y virales capaces de atravesar la BHE, causando meningitis/encefalitis.
(A. Be, et al., 2015)
Gran parte de los conocimientos actuales sobre la patogénesis de la tuberculosis del SNC y
la meningitis posteriores proviene del minucioso trabajo de Arnold Rich y Howard McCordock,
quienes mostraron en autopsias que la mayoría de los pacientes con meningitis tuberculosa
muestran un foco caseoso en el parénquima cerebral o las meninges. Rich postula que estos focos,
también denominados como "focos de Rich", se desarrollan alrededor bacterias depositadas en las
meninges y parénquima cerebral durante la fase inicial bacterémica. Mucho más tarde, la ruptura
de estos focos permiten la difusión de los bacilos en el espacio subaracnoideo, causando meningitis
inflamatoria difusa. (A. Be, et al., 2015) (Martínez, 2010)
En teoría, M. tuberculosis puede cruzar la barrera hematoencefálica como un organismo
libre (extracelular) o por medio de monocitos / neutrófilos infectados (intracelular). Aunque la
última hipótesis parece atractiva, se sabe que el tráfico celular está severamente restringido en el
SNC antes de la invasión por el patógeno ofensor. (A. Be, et al., 2015)
La inoculación intravenosa de M. tuberculosis o M. bovis en conejillos de indias y conejos
ha demostrado que producen invasión en el SNC como se evidencia por la formación de
tuberculomas en su parénquima cerebral. Además, un informe de la utilización de ratones
deficientes de moléculas de adhesión leucocitaria CD18 -/-, sugiere que las micobacterias libres
pueden atravesar la BHE independiente de los leucocitos o macrófagos. (A. Be, et al., 2015)
Finalmente, no está claro si después de invadir el SNC, M. tuberculosis reside
principalmente dentro del parénquima del cerebro, la pared de los vasos, o las células endoteliales
que revisten la microvasculatura. La vasculitis significativa asociada con la tuberculosis de SNC y
la robusta invasión de células endoteliales humanas observados in vitro sugieren que M.
tuberculosis reside, al menos inicialmente, en las células endoteliales que revisten la
microvasculatura. (A. Be, et al., 2015)
Respuesta inmune a nivel de Sistema Nervioso Central
La propagación de M. tuberculosis en el espacio subaracnoideo después de la rotura de un
foco de Rich desencadena una respuesta robusta de células T inflamatorias. Los estudios de los
niveles de citoquinas en LCR en pacientes con meningitis tuberculosa han encontrado niveles
elevados de TNF-α e IFN-γ. La manifestación clínica de tuberculosis en SNC es principalmente
una consecuencia de la inflamación que se desarrolla en respuesta a M. tuberculosis. (A. Be, et al.,
2015)
El parénquima cerebral se encuentra dentro de un microambiente único distinto al resto del
organismo. Aunque comúnmente se hace referencia como "inmunológicamente privilegiado", la
reactividad inmune en el parénquima cerebral puede definirse mejor como “selectiva” y
“modificada”, lo que significa que la respuesta inmune a la presencia de antígeno extraño es
relativamente limitada. Tal característica es esencial con el fin de limitar el daño inflamatorio
dentro de un órgano indispensable y mínimamente regenerativo como el cerebro. La reactividad
inmune selectiva y modificada dentro del parénquima es mediada por un número de células
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diferentes y factores fisiológicos. La presentación del antígeno dentro del parénquima es muy
limitada, ya que la presencia de células dendríticas es muy restringido y hay un bajo nivel de
expresión de moléculas del MHC de clase II en el cerebro humano intacto. (A. Be, et al., 2015)
Además, la microglía, los macrófagos del cerebro, exhiben capacidades relativamente
pobres como presentadoras de antígenos y tienden a inducir la apoptosis de células efectoras en
lugar de la proliferación. El acceso de los linfocitos sistémicos al parénquima está limitado tanto
por la BHE así como los factores solubles y de la superficie celular. Las neuronas dependen de la
conversión de las células T en células T reguladoras Foxp3 + para la supresión de la inflamación.
La reactividad inmune selectiva/modificada dentro del parénquima cerebral podría explicar por
qué la meningitis inflamatoria no se establece inmediatamente después de la tuberculosis
diseminada. Rich y McCordock observaron que la meningitis inflamatoria ocurrió a menudo
muchos meses después de la incidencia de la enfermedad activa. (A. Be, et al., 2015)
La idea de que M. tuberculosis se puede ocultar en el SNC durante meses o años es
intrigante. Una revisión de 100 autopsias de pacientes con tuberculosis generalizada, se realizó
entre 1937-1959, lo cual reveló que el 54% de los pacientes tenían evidencia de meningitis y focos
caseosos del SNC que pueden haber sido las fuentes probables de una diseminación hematógena.
Aunque la meningitis tuberculosa con aparición tardía puede ocurrir en adultos y niños mayores,
en los niños pequeños la meningitis es probable que sea concurrente con la tuberculosis miliar,
como parte de la tuberculosis primaria. (A. Be, et al., 2015)
Células Natural Killer
Las células Natural Killer (NK) se describen originalmente como linfocitos granulares
grandes, los cuales presentan dos grandes funciones en respuesta inmune como efectora de
citotoxicidad y productora de citoquinas. (A. Be, et al., 2015)
Las NK son jugadores importantes en la inmunidad contra los patógenos y las neoplasias
(han sido inicialmente considerada como asesinos no específicos). Actúan como un componente
del sistema inmune innato, ya que son uno de los primeros efectores en los sitios de inflamación.
Pero también a través de sus capacidades de producción de citoquinas, las células NK participan
en el desarrollo de una respuesta inmune adaptativa potente. Por otra parte, se encontró que las
células NK pueden ayudar en la maduración de células dendríticas (DC) y la polarización de las
células T, aunque también pueden prevenir y limitar las respuestas inmunes a través de matanza de
APCs y células linfoides. (Poli, et al., 2016)
En consonancia con su función como centinelas innatas, las células NK están muy
extendidas en los tejidos linfoides y no linfoides. En la mayoría de los tejidos, las células NK
representan una fracción menor del total de linfocitos (2% en el bazo de ratón, 10% en el pulmón
del ratón y del 2% al 18% en la sangre periférica humana).
En los seres humanos, las células NK se pueden subdividir en diferentes poblaciones
basadas en la expresión relativa de marcadores de superficie CD56 y CD16. Las células NK se
pueden dividir en CD56dim y CD56 bright, que difieren en sus propiedades funcionales. Alrededor
del 90% de las células NK en sangre periférica y bazo son CD56dimCD16 + y expresan perforina.
Estas células NK CD56dim son citotóxicas y producen IFN-γ después de la interacción de su
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ligando con los receptores de la superficie celular de las células tumorales. En contraste, la mayoría
de las células NK en los ganglios linfáticos y las amígdalas son CD56brightCD16- y carecen de
perforina. Estas células producen fácilmente citoquinas tales como IFN-γ en respuesta a la
estimulación con interleucina IL-12, IL-15 e IL-18. (Poli, et al., 2016)
La intensidad y la calidad citotóxica de las células NK y las respuestas de citocinas
dependen del microambiente de citoquinas, así como en las interacciones con otras células del
sistema inmune, como las células T, células dendríticas (DC) y macrófagos. IFN de tipo I, IL-12,
IL-18 e IL-15 son potentes activadores de la función efectora de las células NK. También es bien
sabido que la IL-2 promueve la proliferación de células NK, la citotoxicidad y, en cierta medida,
la secreción de citoquinas. (Poli, et al., 2016) En la exposición in vitro de las células NK a ligandos
de TLR induce la producción de IFN-γ y mejora la citotoxicidad. Sin embargo, este proceso es más
eficaz cuando las células accesorias están presentes en el medio ambiente de las células NK, lo que
sugiere que el papel de TLRs en células NK puede ser indirecto in vivo. Las células NK también
expresan el receptor de baja afinidad Fc CD16, lo que les permite detectar las células diana
recubiertas de anticuerpos y para ejercer la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos
(ADCC). (Poli, et al., 2016)
La biología de las células NK sigue pendiente de estudio en las enfermedades neurológicas,
aunque hay argumentos para pensar que los factores específicos del cerebro podrían modular la
función de las células NK y viceversa. (Poli, et al., 2016)
En una investigación reciente Poli y sus colaboradores (Poli, et al., 2016) verificaron el
reclutamiento de células NK en el cerebro sano y patológico, donde demostraron que en
condiciones patológicas, la integridad de la BHE puede ser perturbadora, llegando a ser permisiva
para la entrada de las células inflamatorias, entre ellas las células NK, las cuales se vieron
reclutadas para el SNC en varias condiciones patológicas como en infecciones por virus, bacterias
y parásitos, en tumores cerebrales, enfermedades neurodegenerativas, daño vascular agudo y
traumático, así como en trastornos mentales. Determinando que la respuesta inmune por medio de
las NK pude ser beneficioso o perjudicial dependiendo del agente infeccioso.
Aunque la posible vigilancia inmune del SNC por las células NK es todavía enigmática, su
infiltración en una patología cerebral está más caracterizada. No obstante, su modo de entrada en
el SNC y las moléculas que conducen a este fenómeno son poco conocidos. Se cree que este
reclutamiento podría ser coordinado por células residentes del SNC, tales como microglia,
astrocitos y neuronas, que secretan quimiocinas implicadas en la migración de las células NK, tales
como CCL2, CXCL10, y CX3CL1. (Martínez, 2010)
Por otra parte, hay muchas preguntas sin respuesta, y el futuro desafío es delinear la
influencia precisa de las células NK en la patología del SNC, así como la caracterización de las
células NK cerebrales residentes, que hasta ahora han sido poco estudiadas. Por lo tanto, no se
entiende bien si las células NK del cerebro son el origen o la consecuencia de una patogénesis del
SNC. Algunas evidencias sugieren que las células NK pueden controlar la inflamación y
autoinmunidad del SNC por su capacidad para matar microglia autorreactiva o proinflamatoria.
Alternativamente, la respuesta de células NK en el SNC después de la infección puede ser
perjudicial. (Poli, et al., 2016)
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Materiales y Métodos
Se realizara un estudio longitudinal, experimental, prospectivo y comparativo. El trabajo se
llevará a cabo en el Departamento de Neuropatología del Instituto Nacional de Neurología y
Neurocirugía “Manuel Velasco Suárez”. Para el cumplimiento de los objetivos previamente
planteados el presente proyecto de investigación se realizará en dos fases:
a) la primera fase será realizada utilizando tejidos humanos provenientes de pacientes que
cursaron con tuberculosis del SNC los cuales se obtendrán del registro de autopsias del
Departamento de Neuropatología. Para caracterizar la presencia y el reclutamiento de
células NK hacia el tejido nervioso durante la infección por Mycobacterium tuberculosis,
dichos tejidos serán procesados por inmunohistoquímica con anticuerpos contra el
marcador de superficie NKp46.
b) la segunda fase se llevará a cabo en ratones macho cepa Balb/c de 6 a 8 semanas, los cuales
serán infectados con Mycobacterium tuberculosis por vía intracraneal. Un grupo de
animales serán sacrificados en los días 1, 3, 7, 14, 21, 28 y 60 postinfección para obtener
tejido cerebral que será analizado por inmunohistoquímica con anticuerpos contra el
antígeno CD49b con el objetivo de caracterizar la cinética de reclutamiento de células NK
hacia el SNC. Adicionalmente, otro grupo de ratones serán tratados previamente con
anticuerpo anti-asialo-GM1 para depletar células NK. Posteriormente serán infectados con
la bacteria por vía intracraneal y se analizará su sobrevida y las características
histopatológicas del parénquima cerebral para compararlos con los resultados obtenidos de
animales sin depleción con anticuerpos.
Descripción de procedimientos experimentales
Cultivo de Mycobacterium tuberculosis
Para este estudio se empleará la cepa Mycobacterium tuberculosis H37Rv la cual será
obtenida del Laboratorio de Patología Experimental del Instituto Nacional de Nutrición y Ciencias
Médicas “Salvador Zubirán”. Las bacterias serán puestas en botellas de cultivo en medio líquido
Middlebrook 7H9 (DifcoTMMiddlebrook 7H9 Broth) suplementado con glicerol, cloruro de sodio,
albúmina, catalasa y dextrosa (BBLTM Middlebrook ADC Enrichment) e incubadas en agitación
media (100-150 rpm) a 35-37 ºC bajo condiciones de CO2 al 10% durante 21 a 28 días según las
especificaciones del fabricante. El crecimiento de las bacterias será vigilado con densitometría
hasta alcanzar una densidad de 600nm en espectrofotómetro, momento en el cual serán cosechadas
y suspendidas en PBS suplementado con polisorbato 80 al 0.05% (Tween 80, Sigma-Aldrich) con
perlas de vidrio bajo agitación. La suspensión será centrifugada por 1 minuto para remover cúmulos
de bacilos y se realizará conteo de bacterias del sobrenadante con tinción de Ziehl-Nielsen para
luego diluir la suspensión en PBS hasta obtener alicuotas de 100 μl cuyo contenido de bacterias
sea de 2.5 x 105 de acuerdo al protocolo de Hernández PR y sus colaboradores. (Hernández PR
2004, 2010) Dichas alicuotas serán congeladas a -70ºC hasta que sean utilizadas previa verificación
de su viabilidad.
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Modelo murino de tuberculosis del Sistema Nervioso Central
Los ratones serán anestesiados por inhalación de isoflurano y se infectaran por vía
intracerebral con una alícuota de 2.5 x 105 Unidades Formadores de Colonias (UFC) de
Mycobacterium tuberculosis H37Rv en 100 μl de PBS. Para inocular bacterias cerca o en la cisterna
magna, se utilizará un cadáver de ratón para determinar una ubicación de punción estandarizada.
También se determinará la longitud estándar de la aguja para alcanzar el espacio subaracnoideo y
se utilizara un mecanismo de parada para prevenir exceder la aguja. Después comprobaremos
histológicamente el sitio de inoculación. Un grupo de animales será tratado con inyección
intraperitoneal de 100L de anticuerpo anti-asialo-GM1 en los días -1, 0, 1, 3, 7, 11, 22, 28, 33,
44, 55 y 60 postinfección para depletar células NK y comparar la patología y la sobrevida de dichos
animales con las de animales no depletados.
Análisis histopatológico y determinación de marcadores de superficie de células NK en tejido
cerebral
Los tejidos cerebrales provenientes de autopsias de pacientes que murieron por tuberculosis
del SNC y aquellos obtenidos de ratones infectados por vía intracraneal con la bacteria serán fijados
en formaldehido al 4% e incluídos en parafina previa deshidratación con alcoholes en
concentraciones crecientes (100%, 96%, 90% y 80%) y xilol para obtener cortes de 3 a 5 μm con
el micrótomo. Para el análisis histopatológico los tejidos serán teñidos con hematoxilina y eosina
y observados al microscopio óptico, mientras que para determinar la presencia de células NK los
cortes serán montados en portaobjetos cubiertos con poli-L-lisina, desparafinizados y rehidratados.
Posteriormente se realizará la recuperación antigénica mediante calor y buffer de citratos y se
bloqueará la actividad de la peroxidasa endógena con una solución de H202. Los tejidos serán
incubados con los anticuerpos monoclonales anti-NKp46 y anti-CD49b durante una noche y
después se utilizará el siste de avidina-biotina-peroxidasa para revelar los sitios de unión antígeno-
anticuerpo.
Resultados
Debido al corto lapso de estancia solo se desarrolló la primer parte de la metodología, es
decir que solo se trabajó con la realización de las inmunohistoquímicas de las diferentes autopsias
provenientes de pacientes que cursaron con tuberculosis del SNC. Se trabajó con un control
positivo para tener en claro las características morfológicas que desarrollaría la unión antígeno-
anticuerpo en los diferentes tejidos (Figura 1).
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Figura 1: Control Positivo con anticuerpo anti factor de crecimiento endotelial vascular (VEFG) en ojo de rata.
Aumento 400X Fuente: Elaboración propia.
Los resultados que se obtuvieron en la realización de las inmunohistoquímicas en tejido
cerebral con anticuerpo anti CD56 fueron Negativos (Figura 2), sin embargo esto no confirma que
las Células NK no se infiltren el SNC como parte de la respuesta inmune innata y/o adaptativa ante
una infección por Mycobacterium tuberculosis.
Figura 2: Tejido Neuronal con anticuerpo anti CD56. Negativo para células NK. Aumento: 400X. Fuente: Elaboración
propia.
Así mismo se esclareció que hay diversas células del SNC que desempeñan un papel
inmunológico ante una infección como la microglia, astrocitos, pericitos y neuronas (Figura 3).
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Figura 3: Tejido Neuronal con anticuerpo anti CD56. Negativo, solo hay presencia de neuronas Aumento: 400X.
Fuente: Elaboración propia.
Cabe mencionar que el trabajo sigue en curso, por lo cual los resultados obtenidos hasta el
momento pueden mejorar. Para obtener resultados satisfactorios se empleará una mejor
estandarización de las diferentes técnicas empleadas.
Discusión y conclusiones
La realización del presente trabajo pretende confirmar que las células NK participan en la
respuesta inmune ante la infección por Mycobacterium tuberculosis a nivel del SNC y que son
parte esencial para controlar la proliferación bacteriana minimizando la severidad de la lesión
neuronal, debido a que las células NK juegan un papel importante en otras enfermedades
infecciosas siendo uno de los primeros efectores en los sitios de inflamación y también participan
en el desarrollo de respuestas adaptativas gracias a sus capacidades de producción de citoquinas.
En base a los resultados obtenidos hasta el momento, no se puede confirmar la presencia de
las Células NK a nivel del SNC y de la gran actividad que tienen como parte de una respuesta
inmune innata y/o adaptativa ante este tipo de infección. Se considera que dichos resultados se
deben a un mal empleamiento de la técnica, es decir que hizo falta más tiempo para poder
estandarizarla, ya que por ende es muy difícil encontrar células en buen estado, en tejido (autopsias)
con mucho tiempo de almacenamiento. Así mismo se le atribuye la diferencia de sensibilidad que
tienen los diferentes anticuerpos empleados para detectar las células presentes en la variedad de
tejidos.
Debido a que el trabajo sigue en curso, se está tratando de estandarizar de una mejor manera
la técnica con el fin de obtener resultados satisfactorios, lo cual podría ser con la implementación
de anticuerpos contra el marcador de superficie NKp46 y con anticuerpos contra el antígeno CD49b
con el objetivo de caracterizar la cinética de reclutamiento de células NK hacia el SNC con mayor
precisión ya que estos dos anticuerpos son más específicos de la pared celular de dichas células y
así determinar con exactitud la presencia de las células NK y de la gran importancia que tienen ya
que estas células constituyen un buen candidato para dirigir terapias encaminadas a mejorar la
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respuesta inmune contra el bacilo, disminuír la morbilidad y mortalidad de la tuberculosis del SNC
y aumentar la eficacia de las vacunas, las cuales hasta el momento no han logrado proteger a la
población de esta devastadora enfermedad.
Agradecimientos
En primer lugar agradezco a Dios el permitirme vida para poder realizar este tipo de estancia
en la ciudad, así como también al Dr. Citlaltepetl Salinas Lara por darme la confianza y abrirme
las puertas del área de Neuropatología del Instituto Nacional de Neurología y Neurocirugía
“Manuel Velasco Suárez”. Me siento muy feliz por haber sido parte de un trabajo de ámbito
profesional científico, que sin duda alguna sé que me ayudará mucho para mi formación académica
que aún realizo, así mismo estoy agradecido infinitamente con los diferentes doctores y alumnos
de dicha área, en especial con el M.C. José Alberto Choreño Parra y con la M.C. Nayeli Martínez
Zúñiga por ser mis guías y brindarme parte de su valioso tiempo para que pudiera llevar a cabo la
realización de este trabajo, haciéndome conocer diferentes técnicas de demanda científica y por
transmitirme varios de sus conocimientos teóricos-prácticos para poder entender de la mejor
manera como se labora en dicha institución y con qué finalidad, bajo los requerimientos necesarios
y esenciales para obtener resultados de buena calidad.
Este tipo de investigación me permitirá reforzar e integrar conocimientos, habilidades,
destrezas y valores que me aran crecer con una mejor calidad en el ámbito personal y profesional,
sin duda alguna trate con excelentes personas que me hicieron formar parte de un buen equipo de
trabajo.
Gracias a personas como ustedes y a los diversos programas de salud que convocan este
tipo de estancias de investigación, abemos jóvenes que cumplen una diversidad de metas para ser
parte y conllevar a una serie de nuevos conocimientos que serán de gran utilidad a generaciones
científicas futuras.
Referencias
A. Be, N., Sik Kim, K., R. Bishai, W. & K. Jain, S., 2015. Pathogenesis of Central Nervous System
Tuberculosis. HHS Public Access, 2(9), pp. 94-105.
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