proyecto microbiologÍa

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS

ESCUELA DE BIOQUIMICA

MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL

AISLAMIENTO, SELECCIÓN, PRODUCCION DE BIOMASA Y PRESERVACIÓN DE CEPAS

ACIDOLÁCTICAS A PARTIR DE RESIDUOS DEL CAFETO

Diciembre, 2009

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS

ESCUELA DE BIOQUIMICA Y FARMACIA Carrera Alimentos

Microbiología Industrial

INDICE

INDICE ................................................................................................................................... 2 TEMA: .................................................................................................................................... 4

AISLAMIENTO, SELECCIÓN, PRODUCCION DE BIOMASA Y PRESERVACIÓN DE CEPAS ACIDOLÁCTICAS A PARTIR DE RESIDUOS DEL CAFETO. ....................................................................................... 4

PROBLEMÁTICA ................................................................................................................. 4 ANTECEDENTES ................................................................................................................ 4 JUSTIFICACIÓN. ................................................................................................................. 5 OBJETIVOS .......................................................................................................................... 5

OBJETIVO GENERAL ................................................................................................... 5 OBJETIVOS ESPECIFICOS ......................................................................................... 5

MARCO TEÓRICO .............................................................................................................. 6 Bacterias ácido lácticas ............................................................................................... 7 Clasificación ................................................................................................................... 8 Géneros principales de las bacterias del ácido láctico. ..................................... 8 Bacterias ácido lácticas (pectinolíticas). ................................................................ 8 Fórmula maestra del bio-proceso ............................................................................. 9 Fermentación Láctica ................................................................................................... 9

MARCO METODOLOGICO ............................................................................................. 10 MUESTREO ................................................................................................................... 10 REQUERIMIENTOS PARA EL CRECIMIENTO DE BAL. .................................... 10 SELECCIÓN DE UN MEDIO DE CULTIVO PARA BAL ........................................ 10 MEDIO MINIMAL LÍQUIDO ......................................................................................... 11 MEDIO MINIMAL + AGAR .......................................................................................... 11

AISLAMIENTO, SELECCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS EN ENSILAJES DE MUCILAGO DEL CAFÉ ........................................... 12

Paso 1 (Preparación del ensilado del mucilago) ................................................. 12 Paso 2 (Aislamiento en medio minimal) ................................................................ 12 Paso 3 (Aislamiento y enriquecimiento de BAL) ................................................ 12 Paso 4 (Selección de cepas BAL) ........................................................................... 13 Paso 5 (Caracterización de las cepas BAL) ......................................................... 13

PRODUCCION DE BIOMASA Y ACIDO LACTICO ..................................................... 13 Paso 1 (Propagación y cultivo de cepas BAL) .................................................... 13 Paso 2 (Determinación de biomasa y acido láctico) .......................................... 14

PRESERVACION DE LOS MICROORGANISMOS ..................................................... 14 FACTIBILIDAD ................................................................................................................... 14 MARCO EXPERIMENTAL ............................................................................................... 16 BIBLIOGRAFIA: ................................................................................................................. 18




GRUPO DE TRABAJO

GRUPO DE TRABAJO

PROFECIONALISTA Nombre Blanca Estela Bravo Grado Académico Dr. en Microbiología Institución Universidad Central del Ecuador

Facultad de Ciencias Químicas Actividades Directora del proyecto

ESTUDIANTES Nombre • Andagana Edgar

• Erazo José Luis • Pilco Christian • Mayra Vasconez

Nivel Académico Estudiantes Programa Académico Microbiología IndustrialInstitución Universidad Central del Ecuador

Facultad de Ciencias Químicas Actividades Especificas Aislamiento, Selección y Conservación de

Bacterias LAB a partir del Mucilago de Café




TEMA: AISLAMIENTO, SELECCIÓN, PRODUCCION DE BIOMASA Y PRESERVACIÓN DE CEPAS ACIDOLÁCTICAS A PARTIR DE

RESIDUOS DEL CAFETO.

PROBLEMÁTICA

En la industria cafetera por cada kilo de cereza de café el 20% es aprovechado y el 80% son desechos; de estos el 45% es pulpa, 40% es cascara y 15 % es mucilago (1), siendo este último desechado por medio de lavado a fuentes acuíferas (vertientes, riachuelos…etc.). El impacto ambiental que produce el mucilago se debe a que la micro flora que se desarrolla en este consume el oxígeno disuelto del agua causando asfixia a la flora y fauna de los ríos.1

ANTECEDENTES

Estudios realizados en la Universidad Nacional de Colombia-Sede Medellín, se aprovecha el mucilago como materia prima en la producción de acido láctico, mediante una hidrólisis enzimática y fermentación simultánea de mucílago de café, utilizando una cepa liofilizada de Lactobacillus bulgaricus. 2 Se realizó un estudio en el Departamento de Ingeniería Bioquímica, Universidad del Zulia. Venezuela. Sobre el aprovechamiento del mucilago de café, desecho generado en la industrialización del café. Como alternativa de procesamiento se siguió la fermentación anaeróbica. Las condiciones óptimas del ensilaje fueron: 80 % de humedad, pH: 3.6, ácidos grasos (g/100 g de materia seca); acético = 3.31; propiónico = 0.49; iso-butírico = no detectado; n-butirico = 0.41; isovalérico: no detectado; valérico: no detectado; y ácido láctico: 2.56. Lo que nos demuestra que si es factible la obtención de acido láctico a partir del mucilago de café En la universidad de Costa Rica Facultad de Agronomía aislaron, seleccionaron y caracterizaron bacterias acido lácticas en ensilaje de soya, este estudio se fundamenta en la fermentación acido láctica en condiciones anaeróbicas de la soya a la cual se adiciono melaza por el bajo contenido de

1 http://www.enziclean.com/articulos/tratamiento_biologico_de_la_pulpa_de_cafe.html 2 http://www.revistas.unal.edu.co/index.php/dyna/article/viewFile/10254/10772

http://www.revistas.unal.edu.co/index.php/dyna/article/viewFile/10254/10772




carbohidratos, siendo esta técnica útil en el proceso de ensilaje, selección e identificación de BAL del mucilago del café.

JUSTIFICACIÓN.

El cultivo, producción, comercialización, industrialización y exportación del café, constituyen un sector relevante en la economía del país La producción de café en el ecuador actualmente corresponde a 200.000 sacos de 60 kg por día generando por cada saco de café 36kg de sustancias de desecho de esto el 15% corresponde a mucilago. Es por esto que es importante considerar la contaminación que causan la pulpa y el mucílago, consumiendo grandes cantidades de agua (2m3 por fanega de café) en el proceso, originando un impacto ambiental ya que la microflora que se desarrollan en el mucilago y la pulpa consume el oxígeno disuelto del agua causando asfixia a la flora y la fauna de los ríos. Por lo expuesto anteriormente, una alternativa para evitar este impacto ambiental es aplicar procedimiento biotecnológicos aislando bacterias fermentadoras (acido lácticas) productoras de acido láctico a partir de los residuos del café, dichos microorganismos pueden ser capaces de aumentar la concentración y el rendimiento del acido láctico por vía biotecnológica abaratando costos y dando una posible solución a la problemática ambiental que causa los desechos orgánicos del café. 3

OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL

Aislar, seleccionar, producir biomasa y preservar cepas acido lácticas para la degradación del mucilago del café.

OBJETIVOS ESPECIFICOS

1. Recolectar el mucilago de café proveniente de la Finca Don Benito Quevedo para el posterior aislamiento

2. Tratar químicamente al mucilago de café mediante hidrólisis ácida para la despolimerización y eliminación de compuestos tóxicos.

3 http://www.sica.gov.ec/cadenas/cafe/docs/historia_cafe.html

http://www.cedeco.or.cr/documentos/Caracterizacion%20del%20cafe.pdf




3. Seleccionar el medio de cultivo más adecuado para el crecimiento óptimo de las microorganismos degradadores de mucilago de café.

4. Aislar cepas acido lácticas utilizando el medio de cultivo adecuado.

5. Evaluar y elegir la mejor cepa productora de acido láctico mediante

pruebas cinéticas de crecimiento.

6. Realizar pruebas bioquímicas para la identificación de género y especie con mayor velocidad de transformación

7. Preservar las cepas puras mediante técnica de criopreservación

MARCO TEÓRICO

Mucilago De Café4

El mucílago es un subproducto en el procesamiento de café (previo al lavado) obtenido en el despulpado, Luego de esto ocurre una fermentación con el fin de eliminar los residuos de pulpa en las semillas de café, esta fermentación puede ser natural con varios microorganismos. En estudios realizados sobre la fermentación de café en los que se han aislado mohos, levaduras, varias especies de bacterias lácticas, coliformes y otras bacterias gran negativas; los mismos que proceden del suelo o de la superficie del fruto.

El mucílago está constituido por una capa gruesa de tejido esponjoso de un espesor que rodea los 0.4 a 2.0 mm. Con una composición de 15% de sólidos (hidrogel coloidal insoluble en agua) estos sólidos tienen 80% de ácidos pécticos y 20% de azúcar.

Al estar el mucilago compuesto en su mayoría por sustancias pécticas; los microorganismos responsables de la descomposición de este deben ser capaces de producir pectinasas: En la fermentación ocurre un descenso en el pH de 5.4-6.4 a 3.7

4 Doyle Michael, P.(2001) .Microbiología de los Alimentos Fundamentos y fronteras. Zaragoza. Acribia. (Págs. 684, 685)Belitz H. D, Grosch W.(1997).Química de Alimentos. Zaragoza. Acribia (págs. 1011-1023) http://es.wikipedia.org/wiki/Fermentaci%C3%B3n_l%C3%A1ctica http://tegra.lasalle.edu.co/dspace/bitstream/10185/1222/1/13961076.pdf http://www.eis.uva.es/~biopolimeros/alberto/acido_lactico.htm http://tegra.lasalle.edu.co/dspace/bitstream/10185/1222/1/13961076.pdf




Composición química (%) del mucílago del fruto del café

Composición mucílago en peso seco Sustancias pécticas totales 35.8

Azúcares totales medios 45.8 Azúcares reductores 30

Azúcares no reductores 20 Celulosa= cenizas 17%

Pectinas.-

Estas son abundantes en el reino vegetal, se las puede obtener de las pieles de cítricos, están formadas de restos de ácido α-D-galacturónico unidos por enlaces 1-4; la cadena posee restos de L ramnosa y pequeñas cantidades de D- galactanos, L-arabinanos y arabino galactanos unidos en enlaces covalentes a galacturonano. Los grupos carboxilo de los restos galacturónicos están esterificados en diferente proporción con el metanol y los grupos OH de las porciones 2y 3 pueden estar acetilados en pequeña cantidad.

Pectina

Bacterias ácido lácticas Las bacterias lácticas son anaerobias facultativas, Gram positivas, ácido tolerantes, sus rangos de pH son entre 4.8 y 9.6, no forman esporas, son inmóviles, pueden ser cocos o bacilos, y asociados todos por sus características metabólicas y fisiológicas comunes, generalmente se encuentran en plantas y productos lácteos en descomposición produciendo ácido láctico como producto metabólico final de la fermentación de carbohidratos. Los medios de cultivo para bacterias lácticas incluyen fuentes de carbohidratos, siendo que la mayoría de estas especies son incapaces de aprovechar la respiración celular.



Microbiología Industrial Clasificación

Las especies de bacterias lácticas pueden ser subdivididas es tres grupos de acuerdo con Kandler y Weiss (1984):

Grupo I. Homofermentadores obligados:

Fermentan Hexosas por la vía EMP pero son incapaces de fermentar pentosas.

Glucosa + 2 ADP + 2 Pi --> 2 ácido láctico + 2 ATP.

Grupo II. Heterofermentadores facultativos:

Fermentan hexosas por la vía EMP, sin embargo poseen una fosfocetolasa inducible que les permite pentosas a lactato y acetato.

Glucosa + ADP + Pi --> Ac. Láctico + etanol + CO2 + ATP

Grupo III. Heterofermentadores obligados:

Fermentan las hexosas hacia ácido láctico, CO2 y etanol (o ácido acético). Las pentosas son transformadas hacia ácido láctico y acético.

Géneros principales de las bacterias del ácido láctico.

Genero Morfología celular Tipo de fermentación Lactococcus Cocos en cadenas homo Leuconostoc Cocos hetero Pediococcus Cocos homo Lactobacillus Bacilos homo/hetero

Streptococcus Cocos en cadenas homo Bacterias ácido lácticas (pectinolíticas). Por ser el mucilago de café rico en compuestos pécticos, las bacterias aisladas son capaces de producir pectinasas que les permite degradar las pectinas a compuestos más simples y utilizarlos como fuente de carbono. Estas bacterias son anaerobias.

CARACTERÍSTICAS Habitad Superficie del fruto de café, suelo Grupo trófico Quimioheterótrofos Subdivisión Osmotrófos Fuente de carbono y energía Pectina , compuestos pecticos, azúcares Grupos aceptores de electrones NAD+,ácido pirúvico Aceptor final de electrones Ácido pirúvico



Microbiología Industrial Fórmula maestra del bio-proceso

Fermentación Láctica Es un proceso anaeróbico, en el que la glucosa es el sustrato y ácido láctico el producto final; este proceso lo realizan bacterias acido lácticas, hongos y los tejidos animales. La necesidad de la célula de generar una molécula de NAD+ para consumo energético, hace que se produzca la fermentación. En la glucolisis se oxida la glucosa a ácido pirúvico (tres átomos de carbono), obteniendo dos moléculas de ATP, este proceso necesita de dos moléculas de NAD+ (aceptores de electrones) y luego se reducen a NADH; para que se produzca la glucolisis se necesita una re-oxidación por lo que se ceden 2 electrones de las moléculas de NADH al ácido pirúvico obteniendo ácido láctico.




MARCO METODOLOGICO MUESTREO

Antes de recolectar las muestras con las que se va a trabajar, primero se debe filtrar el mucilago ya que contiene sólidos suspendidos provenientes de los restos de pulpa, endospermo pergamino y otras impurezas que salen del desmucilaginador mecánico. Los filtrados se recolectan en bolsas plásticas.5

REQUERIMIENTOS PARA EL CRECIMIENTO DE BAL.

Las BAL son microorganismos con una limitada capacidad biosintética, por lo tanto requieren factores de crecimiento complejos como: contenido reducido de oxígeno, concentración de CO2 de 10 %, inhibidores como el acetato de talio o sodio y el acido ascórbico, Vitaminas del grupo B, purinas, pirimidinas y aminoácidos. Como carecen de porfirinas y citocromos, no realizan fosforilación por transporte de electrones, reciben energía por fosforilación a nivel sustrato. Producen energía únicamente por fermentación.6

SELECCIÓN DE UN MEDIO DE CULTIVO PARA BAL El medio de cultivo comercial para el aislamiento será medio Rogosa que es específico para BAL.7

COMPOSICIÓN EN g/l FUENTE

Peptona 10.0 Nitrógeno

Extracto de carne 8.0 Nitrógeno

Extracto de levadura 4.0 Nitrógeno

D-Glucosa 20.0 Carbono

Acetato sódico 5.0 Carbono

5 http://www.revistas.unal.edu.co/index.php/dyna/article/viewFile/10254/10772 6 http://www.agro.unlpam.edu.ar/catedras-pdf/BACTERIAS-LACTICAS.pdf 7 http://www.joseacortes.com/microbiologia/buscamedios/ficha.php?nombre=MRS Fermentación, Caldo ;

http://www.joseacortes.com/microbiologia/buscamedios/ficha.php?nombre=MRS, Agar stanier Metodosde la microbiología Libro: Microbiología Industrial: Los Microorganismos De Interés Industrial De Leveau, Jacques Y Bouix, pag 316-320




Citrato triamónico 2.0 Carbono

Sulfato magnésico 0.2 Azufre

Sulfato manganoso 0.05 Azufre

Agar-agar 17.0

Aditivos Polisorbato 80 1 ml/l

Inhibidor

Cantidad a disolver en g/l de medio 66

MEDIO MINIMAL LÍQUIDO


Peptona 10.0 Nitrógeno K2HPO4 1,73 Sales KH2PO4 0,68 Sales Pectina8 7.0 Carbono

Sulfato magnésico 0.2 Sales

Sulfato manganoso 0.05 Sales

pH 4.5 – 5.5 Inhibidor

Cantidad a disolver en g/l de medio 19.66

MEDIO MINIMAL + AGAR


Peptona 10.0 Nitrógeno

K2HPO4 1,73 Sales

KH2PO4 0,68 Sales

8 Pectina proveniente del Mucilago de café




Pectina1 20.0 Carbono

Glucosa 5.0 Carbono

Sulfato magnésico 0.2 Azufre

Sulfato manganoso 0.05 Azufre

Agar-agar 17.0

pH 4.5 – 5.5 9 Inhibidor

Cantidad a disolver en g/l de medio 54.66

AISLAMIENTO, SELECCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS EN ENSILAJES DE MUCILAGO DEL CAFÉ

Paso 1 (Preparación del ensilado del mucilago)

Antes de prepara el ensilado el mucilago debe ser filtrada para eliminar todas las impurezas que sean posibles luego se lleva a un recipiente el cual se cubre totalmente, de tal forma que se estimuló el crecimiento de bacterias anaeróbicas, así como también la producción de ácidos, las condiciones para la fermentación debe estar una temperatura de 29 – 31 ºC, pH 4.5 – 5.5 durante 24 horas hasta su posterior muestreo microbiológico.10

Paso 2 (Aislamiento en medio minimal)

Se toma 10 g de ensilado de mucilago y se coloco en 90 ml de agua de peptona, se coge un inoculo de 0.1 ml y se sembró en cajas petri inoculo en caldo minimal luego se paso a medio minimal con agar dejar incubar por 3 días a pH 4.5-5.5

Paso 3 (Aislamiento y enriquecimiento de BAL)

Se toma las cepas mas representativas y se paso a caldo MRS luego coger 10 g de caldo se coloco en 90 ml de agua de peptona, se coge un inoculo de 0.1 ml y se sembró en cajas petri con Agar selectivo para cepas BAL (Rogosa) a un pH de 4.5 – 5.5 (para bajar el pH se puede utilizar ácidos orgánicos) a este

9 pH bajo inhibe crecimiento de microorganismos patógenos 10http://www.olade.org.ec/biocombustibles/Documents/ponencias/ponencias%20pdf/Sesion%204%20-%20Nelson_Rodriguez%20-%20Colombia.pdf




pH el crecimiento de BAL es optimo, se incuba a 30ºC durante 72 horas con atmosferas enriquecidas de CO2.11

Paso 4 (Selección de cepas BAL)

Luego del aislamiento se tomara las cepas más representativas (cepas que más se desarrollaron) y se inocularon en el medio de cultivo Rogosa con diferentes rangos de pH (3.0 – 3.5 – 4.5 – 5.0 – 6.0) para determinar cuál es más resistente y por lo tanto la que mas producción de acido láctico va a tener, se incuban a 30ºC durante 72 horas con atmosferas enriquecidas de CO2. Observar cual de las cepas crece en menor tiempo y que cantidad de colonias produce.12

Paso 5 (Caracterización de las cepas BAL)

Las colonias seleccionadas se pasa a caldo Rogosa para que se desarrollen a 30 ºC por 72 horas luego se hacen pruebas bioquímicas coloración gram (+), no formadores de esporas, no reducen nitratos, no producen catalasa. Se observa al microscopio (morfología) bastones alargados. Los generos básicos que comprenden las LAB son Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactococus, Streptococcus.13

PRODUCCION DE BIOMASA Y ACIDO LACTICO

Paso 1 (Propagación y cultivo de cepas BAL)

En la propagación se va a utilizar como sustrato el mucilago del café el cual es hidrolizado con pectinazas (Enzima pectinolítica 1 ml/L, Temperatura 75°C por 1 hora) para la desnaturalización de carbohidratos insolubles como sustancias pectinicas en azucares reductores como glucosa ayudando a las bacterias que degraden con mayor velocidad al mucilago. Se coloca 10 ml de mucilago hidrolizado en un tubo de ensayo, se inocula con las cepas seleccionadas y se incuba a 30 ºC durante 72 horas con atmosferas modificas con CO214

11 http://www.allbusiness.com/central-america/costa-rica/180681-1.html 12 Libro: Métodos de la microbiología Stanley, 1998 “ aislamiento y selección” pag 20-21 13 http://tegra.lasalle.edu.co/dspace/bitstream/10185/1222/1/13961076.pdf “2.7 aislamiento de bacterias acido lácticas” 14 http://www.revistas.unal.edu.co/index.php/dyna/article/viewFile/10254/10772



Microbiología Industrial Paso 2 (Determinación de biomasa y acido láctico)

Luego de la propagación se pasa la muestra a través de un erlenmeyer‐kitasato sobre el que se ha colocado un filtro de membrana de 0.22 mm de tamaño de poro y se lleva a un horno a 80ºC hasta obtener peso constante. Debido a que el ácido láctico es soluble en agua utilizamos el filtrado para su detección mediante polarimetría mediante análisis de regresión de las distintas concentraciones.15

PRESERVACION DE LOS MICROORGANISMOS Cada una de las cepas seleccionadas se inoculada en tubos de ensayo con caldo Rogosa luego se pasa a Agar Rogosa se siembra por estriado por toda la caja se incuba por 72 horas y corta en círculos pequeños se pasa a un criovial glicerol al 20% y 3 ml de caldo Rogosa y se almacenó congeladas a -70ºC 16

FACTIBILIDAD Para aislar bacterias BAL, cálculos de las cantidades que se van a utilizar en la realización de la práctica, estos cálculos son para la determinación por bacteria Medios Bacterias Acido Lácticas

Medios Preparación Cantidad Costo frasco 500g en dólares

Costo por análisis en dólares ml gramos

*Mucilago ---------- 500 ------ Desechos no tiene costo

0

Agua de peptona tamponada

0.1g/ 100ml 100 0.1 46 0.01

Caldo Rogosa 21g / 1000ml 50 1.1 107.18 0.25

Agar Rogosa 66g/ 1000ml 60 3.96 200.00 1.60

* De 1kg de café 149 g mucilago 1 kg café 1.23 $

15http://74.125.93.132/search?q=cache%3AwlI4eHExOfQJ%3Adarwin.bio.ucm.es%2Frevistas%2Findex.php%2Freduca-biologia%2Farticle%2Fview%2F32%2F58+Dise%C3%B1o+de+pr%C3%A1cticas+virtuales+para+la+ense%C3%B1anza+de+Microbiol%C3%B3gica+Industrial+pdf&hl=es&gl=ec 16 Libro: Microbiología Industrial: Los Microorganismos De Interés Industrial De Leveau, Jacques Y Bouix, pag 316-320




Materiales Materiales unidades Cantidad Costo por

unidad en dólares

Costo total dólares

Erlenmeyers 250 ml 5 3 15

Pipetas 10 ml 2 3 6 Pipetas 0.1 ml 3 2.50 7.50

Cajas petri --------- 4 0.15 0.60 Tubos de ensayo 15 ml 5 0.25 1.25

Papel filtro -------- 1 0.25 0.25 Crio vial 5 ml 1 1 1




MARCO EXPERIMENTAL

AISLAMIENTO, SELECCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE BACTERIAS

ÁCIDO LÁCTICAS EN ENSILAJES DE MUCILAGO DEL CAFÉ




HIDRÓLISIS DEL MUCILAGO




BIBLIOGRAFIA:

1. http://www.enziclean.com/articulos/tratamiento_biologico_de_la_pulpa_de_cafe.

2. http://www.revistas.unal.edu.co/index.php/dyna/article/viewFile/10254/10772

3. http://www.sica.gov.ec/cadenas/cafe/docs/historia_cafe.html

4. http://www.cedeco.or.cr/documentos/Caracterizacion%20del%20cafe.pdf

5. http://www.mideplan.go.cr/sinades/PUBLICACIONES/cambioactitud/Articulo

%20Caso%20del% 20Cafe.html

6. http://redalyc.uaemex.mx/redalyc/pdf/724/72450109.pdf

7. http://www.invdes.com.mx/anteriores/Febrero2002/htm/cafe.html

8. http://www.eis.uva.es/~biopolimeros/alberto/acido_lactico.htm

9. http://www.scielo.org.ve/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S079872692009000200004&lng=es&nrm=iso

10. http://www.ugr.es/~ri/anteriores/dial03/d28-3.htm

11. http://www.radiolaprimerisima.com/noticias/resumen/39032

12. http://www.agro.unlpam.edu.ar/catedras-pdf/BACTERIAS-LACTICAS.pdf

13. Agrinter, Agris. Utilización de Subproductos del Café en la alimentación

animal y otras aplicaciones agrícolas e Industriales. Biblioteca Orton IICA/CATIE. Turrialba Costa Rica 1974, paginas 16 – 17

14. http://www.olade.org.ec/biocombustibles/Documents/ponencias/ponencias%

2pdf/Sesion%204%2 0%20Nelson_Rodriguez%20%20Colombia.pdf