práctica nro 5 diagnóstico de las micosis sistemicas

8/17/2019 Práctica Nro 5 Diagnóstico de Las Micosis Sistemicas

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P r á c t i c a n ú m e r o 5 : D i a g n ó

s t i c o d e l a s M i c o s i s S i s t é m i c a s

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PRÁCTICA NRO 5: DIAGNÓSTICO DE LAS MICOSIS SISTÉMICAS

OBJETIVOS:

Al finalizar la práctica el estudiante estará en la capacidad de:

Establecer las diferencias macroscópicas y microscópicas de los

diferentes agentes de micosis sistémicas.

Interpretar las pruebas inmunológicas empleadas para el diagnóstico

de las micosis sistémicas.

HISTOPLASMOSIS:

Producida por el hongo dimórfico Histoplasma capsulatum, con sus dosvariedades: H. capsulatum var. capsulatum e H. capsulatum var. duboisii . La

primera produce micosis sistémica en el hombre y animales, es endémica en

Ámerica del Norte, Central y del Sur; mientras que la variedad duboisii está

limitada a África Central.

H. capsulatum var capsulatum habita en suelos con alto contenido de

nitrógeno, asociado con excremento de pájaros y murciélagos, penetra al

organismo por vía inhalatoria. La primoinfección es pulmonar pudiendo ser:

asintomática o subclínica y la asintomática que se subdivide en: pulmonar aguda,

pulmonar crónica y diseminada, en pacientes inmunocomprometidos.

Diagnóstico:

Muestra: Dependerá de la forma clínica que presente el paciente. Esputo,

lavado broncoalveolar, médula ósea, sangre, biopsias, exudados de lesiones

mucosas y cutáneas, material de ganglios linfáticos, LCR y otros líquidoscorporales.

Examen directo:

Extendidos coloreados con Giemsa o Wright.

Coloraciones histológicas (HE, PAS, plata-metnamina).


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Calcofluor.

Por ser las levaduras de H. capsulatum muy pequeñas no pueden ser

reconocidas en fresco o con KOH.

Al examen directo se observan blastoconidias ovaladas de 2-3 m,

intracelulares, generalmente con una sola gema (Figura 28); por efecto de algunas

coloraciones ocurre una retracción de la membrana citoplasmática que le da

apariencia de una cápsula. En los pacientes con SIDA, las blastoconidias pueden

observarse extracelularmente debido a la multiplicación intracitoplasmática

excesiva, causando la destrucción del fagocito.

En los cortes histológicos, la pared del hongo se tiñe débilmente con HE

pero se destaca con PAS y plata metenamina (Figura 29). Se observan

blastoconidias intracelulares y otras libres por la ruptura del fagocito, rodeadas por

una reacción granulomatosa, con predominio de células epitelioides y gigantes.

Cult ivo:

Se realiza sobre agar sangre, Sabouraud o extracto de levadura. Para verificar

el dimorfismo de H. capsulatum, el cultivo se incuba tanto a temperatura ambiente

Figura 28: Blastoconidias (B) de Histoplasmacapsulatum en el interior de una célulafagocitica (F). Observe el núcleo del fagocito(NF). Extendido coloreado con Giemsa.

www.scielo.org.ar/.../abcl/v39n4/4a09f2.jpg

Figura 29: Blastoconidias (B) de Histoplasmacapsulatum. Coloración histológica Plata-metenamina.pathmicro.med.sc.edu/mycology/mycology-

6.htm

http://pathmicro.med.sc.edu/mycology/mycology-6.htmhttp://pathmicro.med.sc.edu/mycology/mycology-6.htmhttp://pathmicro.med.sc.edu/mycology/mycology-6.htmhttp://pathmicro.med.sc.edu/mycology/mycology-6.htm


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como a 37 ºC. La identificación del H. capsulatum se hace en su fase micelial

(temperatura ambiente), formando colonias blancas y algodonosas en los medios

de cultivo. En el microcultivo se observan hifas tabicadas, microconidias y

macroconidias tuberculadas, que identifican el agente etiológico. (Figura 30)

El cultivo es el método más específico para establecer definitivamente el

diagnóstico. Sin embargo tiene poca sensibilidad en la mayoría de las formas

clínicas de histoplasmosis y tarda entre 1 y 5 semanas por lo que se hace

necesario la implementación de otras pruebas diagnósticas como lo son las

inmunológicas.

Estudio Inmuno lógico

Inmunidad celular: se estudia con la aplicación, por vía intradérmica, de 0,1

c.c. de histoplasmina, en la cara anterior del antebrazo. La lectura se realiza a las

48 horas, siendo positiva con la presencia de una induración igual ó mayor de 5

mm de diámetro. La IDR con la histoplasmina es de poco valor diagnóstico, sólo

indica contacto con el hongo.

DIBUJO

Figura 30: Macroconidias tuberculadas (M) ymicroconidias (m) de Histoplasma capsulatum.Observadas en cultivo en lámina, coloreadas con azulde lactofenol. http://alsubs.blogspot.com/


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Inmunidad humoral: Se pueden determinar tanto anticuerpos como

antígenos circulantes. La técnica más usada es la IDD donde pueden ser

observadas dos bandas de identidad, una banda “M” y una “H”. La banda M es la

que se encuentra con mayor frecuencia y es evidencia presuntiva de infecciones

iniciales o de infección pasada (esta banda persiste rara vez después de 3 a 6

meses de la recuperación clínica del paciente). La banda “H” aparece con menor

frecuencia que la “M”, usualmente indica la presencia de una enfermedad clínica

activa, sin embargo su ausencia no excluye la histoplasmosis activa. Esta banda

tiende a desaparecer con la curación del foco infeccioso.

PARACOCCIDIOIDOMICOSIS:

Es causada por el hongo dimórfico Paraccocidioides brasiliensis, constituye

una de las micosis sistémicas más importante de la América Latina. Hasta la fecha

se desconoce el hábitat del hongo, sólo ha sido aislado de tierras en contadas

ocasiones y en forma ocasional ha sido asilado de alimentos para perros y deheces de pingüinos; sin embargo el consenso general señala el suelo de áreas

endémicas como el nicho ecológico.

Afecta principalmente a hombres adultos entre 30 y 60 años de edad,

trabajadores de la tierra, que se infectan por vía inhalatoria, por lo que la

BANDA “H”

BANDA


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primoinfección ocurre en los pulmones, desde donde se disemina a otros órganos.

La menor frecuencia de casos en mujeres parece estar relacionada con factores

hormonales.

Se describen las siguientes formas clínicas:

Infección subclínica asintomática.

Enfermedad, se subdivide en:

Juvenil

Crónica del adulto (Figura 31)

Residual

DIAGNÓSTICO

Muestra: dependerá de la forma clínica que presente.

Esputo o lavado broncoalveolar

Exudado de ulceras en mucosas y el piel

Material purulento de nódulos linfáticos

Biopsias

Figura : Forma crónica del adulto. Lesiones (L) enpaladar ocasionadas por P. brasiliensis. Foto cortesíaProfa. Leyla Humbría.

L

L

Figura 31: Forma crónica del adulto. Lesiones (L) en paladarblando ocasionadas por P. brasiliensis. Foto cortesía Profa.Leyla Humbría.


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Orina

LCR y otros líquidos corporales.

Examen directo:

En fresco, entre lamina y laminilla

KOH al 10% con o sin tinta

Negro de clorazol

Calcofluor

Coloraciones histológicas (PAS, HE, plata-metenamina)

Se observan blastoconidias de diferentes tamaños, entre 3-40 µm de diámetro,

redondeadas, de pared gruesa y refringente, con inclusiones citoplasmáticas.

Característicamente se observan células multigemantes, llamadas de timón de

barco, unidas entre sí directamente o a través de un pequeño puente

citoplasmático. Además de las formas multigemantes, es posible ver cadenas de

blastoconidias o células con gemación única o solitarias (Figura 32).

Figura : Levadura (L) multigemante de P. brasiliensis observada en examen directo con KOH al 10%. Fotocortesía Profa. Leyla Humbría.

L DIBUJO

Figura 32: Levadura (L) multigemante de P.brasiliensis observada en examen directocon KOH al 10%. Foto cortesia Profa. LeylaHumbría.


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En las biopsias, la observación del hongo es más fácil con la coloración de

plata-metenamina y PAS que con HE (tiñe mal la pared del hongo). Se observan

una respuesta tisular mixta, característica de una micosis crónica, con formación

de microabcesos y granulomas. El hongo suele encontrarse asociado con las

células gigantes multinucleadas del granuloma, donde exhibe sus características

descritas anteriormente, excepto las inclusiones intracitoplasmáticas y la

refringencia de la pared.

Cult ivo:

Se realiza en agar Sabouraud adicionado o no de antibióticos y

cicloheximida. Se incuba a temperatura ambiente y a 37 ºC para demostrar su

dimorfismo. P. brasiliensis es de crecimiento lento.

A temperatura ambiente, en el anverso, crece como un moho de color

blanco o crema y en el reverso de la colonia muestra un color marrón claro. Al

microscopio, en un cultivo en lámina, se observan hifas delgadas con artroconidias

y clamidosporas intercalares y terminales. Este tipo de crecimiento es de escaso

valor diagnóstico.

A 37 ºC se forman colonias blanquecinas, de aspecto cerebriforme, que al

ser observadas al microscopio demuestran la presencia de levaduras

multigemantes que permiten la identificación definitiva del hongo (Figura 33).


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Estudio inm unológico

Inmunidad celular: se estudia con la aplicación de 0,1 c.c. de

paraccoccidioidina, vía intradérmica en la cara anterior del antebrazo. Se aplican

simultáneamente un antígeno control (PPD) y la histoplasmina, para evaluar

posibles reacciones cruzadas. La lectura se realiza a las 48 horas, considerándose

positiva una induración igual ó mayor de 5 mm de diámetro (Figura 34).

Figura : Cultivo levaduriforme deP. brasiliensis

. Agar Sabouraud.Foto cortesía Profa. Leyla Humbría.

P

Figura 33: Cultivo levaduriforme de P. brasiliensis. Agar Sabouraud.Foto cortesía Profa. Leyla Humbría.


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La IDR con paraccoccidioidina carece de valor diagnóstico, sólo indica

contacto previo con el hongo. Esta prueba se hace negativa en estados anérgicos,

de pronóstico reservado, por lo que su aplicación se recomienda cuando se desee

evaluar las condiciones inmunológicas del paciente, para hacer seguimiento

después del tratamiento y para estudios epidemiológicos.

Inmunidad humoral:

En los casos de paracoccidioidomicosis pulmonar crónica unifocal, en los

cuales se hace difícil una toma de muestra clínica representativa que facilite la

observación del hongo con un examen directo, la IDD es recomendada por su

simplicidad y efectividad diagnóstica. Esta prueba detecta anticuerpos de tipo IgGen un 93% de los casos activos y puede utilizarse de forma cuantitativa para

determinar aumento o disminución de anticuerpos circulantes durante el

seguimiento de tratamiento del paciente.

Figura : Resultados de la aplicación de la pruebaintradérmica con histoplamina (H) y paracoccidioidina(P). Foto cortesía Profa. Leyla Humbría.

H P

Figura 34: Resultados de la aplicación de la prueba intradérmicacon histoplasmina (H) y paracoccidioidina (P). Foto cortesíaProfa. Leyla Humbría


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dimórficos pertenecientes al género Coccidioides: Coccidioides immitis conocido

como la especie Californiana, y la recién nombrada especie no Californiana,

Coccidioides posadasii. La fase saprofítica de estos microorganismos se

desarrolla en la tierra de áreas endémicas; parte del suroeste de los Estados

Unidos, México, Centro y Suramérica; y la infección en humanos, así como en

varias especies de animales, se adquiere principalmente por vía inhalatoria.

En Venezuela, las áreas endémicas de esta micosis se localizan en la

región noroccidental, en las zonas áridas y semiáridas de los estados Falcón, Lara

y Zulia.

Se considera como principal mecanismo de infección la inhalación de lasartroconidias presentes en el suelo, las cuales se desprenden al moverse la tierra

seca, o bien, se desplazan con las corrientes de aire. La infección depende de la

exposición al hongo en un área endémica; afecta a cualquier edad o sexo y es

más frecuente en campesinos, soldados, arqueólogos, entre otros. Los casos se

pueden incrementar después de temblores de tierra, épocas de sequías, así como

cambios en el suelo (altas concentraciones de sales eliminan flora microbiana

competitiva), migraciones de individuos susceptibles y la humedad relativa del

suelo y aire.

Coccidioides posadasii e immitis producen un espectro amplio de

manifestaciones clínico-patológicas que van desde una infección asintomática a

una enfermedad pulmonar primaria, enfermedad cutánea primaria, enfermedad

pulmonar progresiva y la diseminación extrapulmonar que puede ser aguda,

crónica, o progresiva (Figura 36). La severidad de la infección va a depender delos mecanismos de defensa del huésped, tamaño del inóculo y, posiblemente, de

factores específicos de la virulencia o de resistencia del hongo.


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DIAGNÓSTICO

Muestra:

Esputo Lavado bronquioalveolar

Exudados de lesiones en mucosas y piel

Biopsias

Material purulento

Sangre

Médula ósea

LCR y otros líquidos corporales.

Examen directo:

En fresco entre lamina y laminilla

KOH al 10-20%, con o sin tinta

Coloraciones histológicas (PAS, HE, Plata-metenamina)

Figura : Lesión en nariz de un paciente concoccidioidomicosis diseminada. Foto cortesía Profa.Dilia Martinez.

Figura 36: Lesión en nariz de un paciente concoccidioidomicosis diseminada. Foto cortesía Profa. DiliaMartinez.


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Calcofluor.

Se observan esférulas de 10 a 80 µm, con pared doble y refráctil y endosporas

de 2 a 5 µm (Figura 37).

Cult ivo:

El método definitivo para confirmar el diagnóstico de CDM es el aislamiento

del hongo a partir del espécimen clínico. Coccidioides spp crece fácilmente en la

mayoría de los medios de cultivo utilizados en los laboratorios clínicos. En medio

Sabouraud con o sin antibiótico, a temperatura ambiente, al tercer día se observan

colonias glabra, después vellosas y luego francamente algodonosas, de color

blanco grisáceo o amarillento (Figura 38). Microscópicamente se observan hifas

delgadas y septadas con artrosporas o artroconidias rectangulares de 2 por 4 ó 3

por 6 µm (Figura 39). La forma micelial de Coccidioides spp representa un alto

riesgo de infección al personal del laboratorio debido a que es altamente

Figura : Examen directo con KOH% de muestra clinica proveniente de lesión en nariz.Se observan esférulas (E) rotas y completas, con endosporas (e) en su interior y

libres. Foto cortesía Profa. Leyla Humbría.

E

e

E

E

e

e

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Figura 37: Examen directo con KOH al 20% de muestra clínica proveniente de lesión en nariz deun paciente con coccidiodomicosis diseminada. Se observan esférulas (E) rotas y completas,con endosporas (e) en su interior y libres. Foto cortesía Profa. Leyla Humbria.


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contagiosa, por lo que los cultivos deben ser manipulados únicamente dentro de

campanas de bioseguridad clase II.

Estudio inmunológico:

Inmunidad celular: Se realiza la IDR utilizando antígenos fúngicos, que en el

caso de coccidioidomicosis, pueden ser de dos tipos: la coccidioidina, obtenida de

la fase micelial o saprófita y la esferulina, constituida por la pared de las esférulas.

Figura : Cultivo micelial (temperatura ambiente) en tubo de Coccidioides posadasii . Se observa una colonia de color blanco, algosonosas. Fotocortesía Profa. Leyla Humbría.

Figura 39. Artroconidias de Coccidioides immitis de uncultivo en forma micelial (preparación con azul deLactofenol). Fragmentación del micelio (M) en esporas(artroconidias) rectangulares. Preparación con Azul deLactofenol, 1200 X. tomado de: Restrepo M., A. Rev. Acad.Colomb. Cienc. 2006; 30 (116):367-386.

Figura 38: Cultivo micelial (temperatura ambiente) en tubo de Coccidioides immitis o posadasii . Se observa una colonia de color blanco, algodonosa. Foto cortesia Profa.Leyla Humbría.


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El antígeno se inyecta en volumen de 0,1 c.c., por vía intradérmica, en la cara

anterior del antebrazo y la reacción se observa a las 48 horas. Se considera

positiva si se obtiene una induración igual ó mayor de 5 mm. de diámetro. Debido

a que los preparados antigénicos contienen antígenos específicos y antígenos

comunes a otros hongos, se pueden observar reacciones positivas en pacientes

con histoplasmosis y paracoccidioidomicosis.

La IDR se utiliza básicamente en estudios epidemiológicos para investigar

la existencia de infección subclínica en una población y rara vez como orientación

diagnóstica, ya que una reacción positiva de 5 mm o más significa que la

respuesta inmunitaria del paciente está intacta y sólo señala exposición al agente.

Por el contrario, una reacción negativa no necesariamente excluye infección y sepuede observar en pacientes con CDM diseminada, lo que indica un estado de

anergia de la respuesta inmunitaria celular. La IDR se considera una prueba

auxiliar en el diagnóstico, pronóstico y valoración del estado inmunitario del

paciente con CDM. Es positiva 2 a 3 semanas después del inicio de los síntomas y

puede persistir durante años. En pacientes sintomáticos la positividad a la IDR se

considera de buen pronóstico; mientras que su negatividad se traduce en una

inadecuada respuesta celular, anergia y por lo tanto, mal pronóstico.

Inmunidad humoral: Consiste en la detección de anticuerpos específicos

contra Coccidioides immitis o posadasii en suero o LCR (en sospecha de

meningitis). Su presencia confirma el diagnóstico, siempre y cuando los resultados

obtenidos se correlacionen con los aspectos epidemiológicos, clínicos e

histopatológicos del paciente.

La técnica más usada es la IDD, en donde se detectan la formación de

varias bandas, especialmente la “F” establece el diagnóstico en un 93% de los

pacientes con formas activas. Una banda específica entre la muestra del paciente

y el pozo de antígeno para Coccidioides spp.es evidencia presuntiva de

coccidioidomicosis activa o reciente. Algunos individuos continúan la producción


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de anticuerpos detectables por periodos significativos (más de 1 año) después de

la recuperación clínica de la enfermedad activa. Una prueba negativa no excluye

la enfermedad. Existen reacciones cruzadas con H. capsulatum y P. brasiliensis,

pero a títulos menores que los exhibidos con los antígenos homólogos.

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