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5/14/2018 MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL - slidepdf.com

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MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL

ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL

2011

ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA

FACULTAD DE INGENIERÍA

ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE

INGENIERÍA AMBIENTAL

ESTUDIANTE: Carlos Alberto Casiano Inga

PROFESORA: Dra. Flor García Huamán

CURSO: Microbiología Ambiental

TEMA: Prácticas de Microbiología Ambiental

CHACHAPOYAS 2011





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MEDIOS DE CULTIVO

I. INTRODUCCIÓN:

Nos maravilla el conocimiento que hoy tenemos sobre la gran diversidad microbiana.

Sin embargo, poco se habla de ello, a pesar de su enorme importancia. Abordar el

tema de la microbiología ambiental resulta largo y complejo, pero seleccionandoalgunos ejemplos es posible dar una idea clara de la importancia de conocer la

interacción entre los parámetros ambientales y los microorganismos.

Las bacterias se encuentran en el ambiente junto con otros microorganismos, razón

por la cual es difícil aislarlas. Pero debemos estar preparados para aislar, cultivar e

identificar a la misma. Uno de los sistemas más importantes para la identificación de

microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales

preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los

microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el

Cultivo.

Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros

componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los

microorganismos. Es decir, es un soporte que proporciona sustancias nutritivas que

permitan el desarrollo y reproducción de microorganismos. La diversidad metabólica

de los microorganismos es enorme, por ello, la variedad de medios de cultivo también

lo es, no existiendo un medio de cultivo universal adecuado para todos ellos.

Las condiciones que reúne un medio de cultivo artificial para que los microorganismos

crezcan son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuado, así

como un grado correcto de acidez o alcalinidad.

El conocimiento de las necesidades nutritivas y físicas de los microorganismos es

fundamental para seleccionar un medio de cultivo adecuado. Los requisitos que debe

reunir el cultivo de un microorganismo tienden a reproducir el ambiente natural en el

que se desarrollan.

La utilización de los medios de cultivo son necesarios para:

- Separación y aislamiento de las distintas especies microbiales presentes en una

muestra.

- Estudio de identificación de un microorganismo problema.

- Estudios macroscópicos. Visualizar las características de las colonias en medios

sólidos.

- Para la conservación de especies microbiales o muestras, etc.





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Clasificación de los medios de cultivo:

1.- Según su naturaleza:

Medios naturales o complejos: constituido por sustancias complejas de origen

animal o vegetal, así como minerales y otras sustancias.

Medios definidos o sintéticos: Composición química definida cualitativamente

y cuantitativamente.

2.- Según su uso:

Medios de enriquecimiento: Son medios líquidos, favorecen el crecimiento de

un tipo de microorganismo en particular

Medios Selectivos: Parecidos a los de enriquecimiento, con la diferencia de ser

sólidos, diseñados para el aislamiento de microorganismos específicos.

Medios Diferenciales: Contiene indicadores de productos derivados de la

actividad microbiana. Permite revelar características fisiológicas de los

microorganismos.

Almacenamiento de los medios de cultivo:

Generalmente se almacenan en un lugar fresco (entre 15 y 25°), con poca humedad y

protegidos de la luz solar directa. Nunca se deben almacenar cerca de autoclaves,

hornos ni otra fuente de calor o vapor. Una vez que el medio de cultivo ha sido

preparado y esterilizado, puede almacenarse a temperatura ambiente por un periodo

máximo de 2 semanas protegido de la luz, o por periodos mayores a 12 -15°C. Sin

embargo, almacenados bajo refrigeración entre 2 y 8°C se prolonga la vida útil de los

mismos, (nunca por debajo de 0°C porque se destruye la estructura del gel). Los

medios de cultivo se deben mantener en recipientes bien cerrados para evitar su

deshidratación.

Características de los microorganismos al momento de preparar un medio de cultivo:

1.- Trófico: requerimientos de carbono y energía, según los cuales se clasifica en

autótrofos, heterótrofos, quimiótrofos (litótrofos u organótrofos) y fotótrofos.

2.- Respiratorio: Aerobios, anaerobios, anaerobios facultativos y microaerófilos.

3.- Temperatura óptima de Crecimiento: según el rango de temperatura al cual el

microorganismo presenta su mayor crecimiento, se los clasifica en sicrófilos, mesófilos

y termófilos.

4.- Rango de pH: El rango óptimo de pH para la mayoría de bacterias oscila entre 6,6 y

7,2.

En el laboratorio, los medios de cultivopueden presentarse en forma líquida, encuyo caso se los denomina caldos, o enforma sólida si se le agrega agar al caldo.





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Constituyentes habituales de los medio de cultivo: Los siguientes elementos son

frecuentemente utilizados en la preparación de los medios de cultivo.

1.- Agua destilada o desionizada: Libre de inhibidores del crecimiento.

2.- Agar: Utilizado como agente gelificante, para dar solidez a los medios de cultivo. El

componente dominante en el agar es un polisacárido, al que acompañan algunas

impurezas y que se obtiene de ciertas algas marinas. Existe en rama o en polvo, se

solubiliza en agua a ebullición (funde hacia los 98°C) y al enfriarse forma un gel

inodoro e insípido (se gelifica alrededor de los 42°C), dependiendo de su grado de

pureza, por lo que tiene la ventaja de ser sólido a la temperatura de incubación. Con la

excepción de algunos microorganismos marinos, el agar no es empleado como

nutriente. Para preparar un medio sólido se le agrega agar al 12-18 %. Si se desea

visualizar movilidad se usa agar blando y se le agrega agar al 3 %.

3.- Extractos: Para su preparación, se utilizan ciertos órganos, tejidos animales o

vegetales (por ejemplo carne, hígado, semillas, etc.). Son extraídos con agua y calor, y

posteriormente concentrados hasta la forma final de pasta o polvo. Estos preparadosdeshidratados son frecuentemente empleados en la confección de medios de cultivo.

Por ejemplo: extracto de carne, de levadura, de malta, etc. En el caso del extracto de

carne en polvo o pasta, provee sustancias nitrogenadas, minerales y vitaminas,

mientras que el extracto de levaduras provee vitaminas del grupo B, nitrógeno y

carbono.

4.- Peptonas: Son mezclas complejas de compuestos orgánicos nitrogenados y sales

minerales, carecen de identidad química definida; se obtienen por digestión

enzimática o química de proteínas animales o vegetales (soja, carne, gelatina, caseína,

etc.). Las peptonas son muy ricas en péptidos y aminoácidos, pero pueden ser

deficientes en determinadas vitaminas y sales. Proveen proteosas, peptonas,polipéptidos y aminoácidos.

5.- Fluidos Corporales: Sangre completa, plasma o suero sanguíneo son

frecuentemente añadidos a los medios empleados para el cultivo de algunos

patógenos. La sangre no puede ser esterilizada y debe, por tanto, ser obtenida en

condiciones asépticas directamente de un animal sano. Los fluidos corporales no

solamente contribuyen con factores de crecimiento, sino también con sustancias que

neutralizan inhibidores del crecimiento de algunas bacterias.

6.- Sistemas amortiguadores: Algunos componentes son incorporados al medio de

cultivo para mantener el pH dentro del rango óptimo del crecimiento bacteriano. Los

microorganismos más comunes son los neutrófilos (el pH óptimo para su crecimientoestá próximo a la neutralidad), y sales como fosfatos bisódicos o bipotásicos, o

sustancias como las peptonas, previenen una desviación del pH.

7.- Indicadores de pH: Los indicadores ácido base se añaden a menudo a los medios

de cultivo con objeto de detectar variaciones del pH.





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8.- Agentes selectivos: La adición de determinadas sustancias al medio de cultivo

puede convertirlo en selectivo, por ejemplo: cristal violeta, sales biliares, azida sódica,

telurito potásico, antibióticos, etc., a la concentración adecuada, actúan como agentes

selectivos frente a determinados microorganismos.

II. MATERIALES:Además de un ambiente apto para el trabajo microbiológico, el laboratorio demicrobiología requiere de una instrumentación básica de uso corriente enmicrobiología, y para la práctica de Medios de cultivo se utilizaron los siguientesinstrumentos:

Tubos de ensayo: Destinados a conservarmedios de cultivo en pequeños volúmenes. Seutilizan tubos de diversos tamaños. El vidriodebe ser de buena calidad, neutro, transparentee inalterable a los tratamientos.

Placas Petri: Cajas de vidrio de seccióncircular, con tapa. Existen de diferentestamaños según su uso, aunque las másfrecuentemente utilizadas tienen 10 cm dediámetro.

Pipetas graduadas: Para su uso en ellaboratorio de microbiología se les coloca untapón de algodón en el extremo superior, con lafinalidad de que el operador no aspire loslíquidos potencialmente contaminados, o quecontamine el medio de cultivo al aspirarlo. Seutiliza para realizar inoculaciones y diluciones.

Matraz de Erlenmeyer: Utilizado para lapreparación de los medios de cultivo, o para edesarrollo de microorganismos en mediolíquido con agitación o aireación.





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Mechero de alcohol: Destinado a proporcionarcalor por combustión.

Balanza: Diseñados para la determinación demasas de diversas sustancias.

Fósforo yCucharita: para tomar muestras de ciertassustancias.

Varillas de vidrio: Llamados agitadores obaguetas.

Gradillas para tubos de prueba: de metal o demadera para portar los tubos de prueba duranteel trabajo.

Cocinas eléctricas: utilizadas para fundirciertas sustancias.





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TSI: Agar de tres azúcares (lactosa, sacarosa y glucosa) e hierro (citrato férrico), tiosulfato

de sodio, elevada concentración de aminoácidos y rojo fenol como indicador.

LIA:

Citrato: Esta prueba es muy utilizada para la investigación de bacilos Gram -.

Mc. Conkey: Contiene lactosa y un indicador de pH (rojo neutro) que varía hacia rojo a pHácido cuando la lactosa es fermentada.

Caldo Brila: Caldo verde brillante.

Extracto de levadura:

III. MÉTODOS:Empezaré por explicar la preparación del caldo brila, el cual nos permitirá tener unaidea de la elaboración de los otros medios de cultivo que ya lo teníamos preparadosen diferentes matraces.

III.I) Caldo BrilaLeer las indicaciones del recipiente de Caldo Brila, éste nos permite manejar las

cantidades apropiadas, para el Caldo Brila utilizar 40 g. con 100 ml de agua; nosotrosdeseamos utilizar 400 ml de agua, ¿Qué hacemos? Mediante una regla de tres simplecalculamos la cantidad de Caldo Brila a utilizar; de la siguiente manera:

Una vez calculada la cantidad requerida de Caldo Brila procedemos a pesarla. Estos 16g de Caldo Brila los vertimos en una fiola. Haciendo uso de una pipeta adicionamosagua destilada a la misma. Con leves movimientos circulatorios diluimos la solución.

Luego haciendo uso de una cocina eléctrica se calienta la solución hasta que éstaadquiera el color verde (color característico del Caldo Brila).Se deja enfriar por unos minutos; luego se hace uso de una pipeta para verter lasolución a los tubos de ensayo, aproximadamente hasta la parte superior de un tubo o“campana” Durham que se encuentran dentro de estos. Estos microtubos deben deser llenados, para esto se inclina levemente los tubos de ensayos.Hay que recordar que mientras realizamos todo este trabajo, hacemos uso del calor deun mechero para mantener estéril nuestros instrumentos de trabajo.





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Por último se tapan los tubos de ensayo con porciones de algodón para mantenerestéril nuestro preparado de Caldo Brila. Colocamos los tubos de ensayo en undepósito forrado con papel blanco, el depósito contiene algodón en el interior para no

causar daños. Se rotula y se coloca en la autoclave (121° x

- 1 atm). Deben seguirselas instrucciones en cuanto a tiempo y temperatura para asegurarse la obtención demedios de cultivo útiles. Debe tenerse en mente que la presión varía de acuerdo conla altura y por tanto no es un factor constante. De tal manera que son el tiempo y latemperatura los parámetros que deben tomarse en consideración en el proceso deautoclavado.

III.II) TSIAhora cogemos el TSI, el cual está contenido en un matraz y se encuentra solidificado.Para que esta sustancia se encuentre como está ha tenido que seguir los pasos de laelaboración del Caldo Brila. Para fundirlo utilizaremos una cocina eléctrica. Con la

ayuda de una pinza se coge el matraz con TSI, se coloca y se retira de la cocina sindejar de agitarlo levemente, con la finalidad de que el material no se sobrecaliente ycause prejuicios. Al cabo de unos minutos se tendrá el TSI líquido.

Se deja enfriar el matraz por unos minutos, mientras eso se prepara los tubos deensayo en los cuales se depositará el TSI, también el mechero con alcohol. Una vezque el matraz se encuentra relativamente frío se procede a depositar el TSI en lostubos de ensayo, pero para mantener nuestros materiales esterilizados y mientras serealiza el intercambio de depósito del TSI se hace uso del calor del mechero (calor





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seco-fuego directo). Luego raudamente se tapan los tubos de ensayo con algodón deigual forma con el matraz, y se titulan los tubos de ensayo.

Luego de verter el TSI en los tubos de ensayo se colocan con una leve inclinación. Unavez que estos se solidifican se colocan en la gradilla.

“Los pasos realizados con el TSI también son aplicados al LIA y al Citrato”

También tenemos las siguientes sustancias solidificadas en los matraces conprocedimientos de preparación muy parecidos a los del caldo brila: Mc. Conkey yextracto de levadura, pero con la única diferencia de que estos serán depositados enplacas Petri. El procedimiento es el mismo, se funde las sustancias Mc. Conkey y el

extracto de levadura, se deja enfriar, luego se vierte en las placas Petri (1/3), seesparce de forma uniforme en toda la placa petri, se tapa y se rotula. Para laesterilización de los materiales al verter se utiliza el calor del mechero (calor seco-fuego directo).

IV. RESULTADOS:Los procedimientos anteriores nos permiten elaborar medios de cultivo, conociendosu tremenda diversidad, para bacterias que serán analizadas y estudiadas en nuestroproceso de aprendizaje. Las diversas sustancias que se utilizan para la elaboración deun medio de cultivo nos permiten predecir el inmenso número de microorganismoque podemos encontrar.

Hemos elaborado dos medios de cultivo según su presentación: Medios sólidos en placas Petri: estos ocupan una superficie losuficientemente grande como para poder visualizar perfectamente lascolonias microbianas. El sistema en placa es uno de los medios que permitemejor el aislamiento de microorganismos que puedan crecer en él. Estosmedios de cultivo fueron: Mc. Conkey (color rojizo) y Extracto de Levadura(color marrón).





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Medios sólidos en tubos: que corresponden a tubos con agar inclinado ysolidificado con el fin de aumentar la superficie donde se va a producir elcrecimiento microbiano una vez sembrado. Estos fueron los siguientes: TSI(color anaranjado), LIA (color purpura claro), Citrato (color verde) y Brila(verde brillante).

V. DISCUSIÓN:¿Qué es un medio de cultivo? ¿Qué tipos de cultivos se ajustan más a las condiciones

naturales?

Un buen medio de cultivo es aquel que le provee a los microorganismos los nutrientesindispensables en la concentración adecuada, cantidad necesaria de sales y agua, quetenga la consistencia y el pH adecuados, que sea estéril y que no contenga sustanciasinhibidoras.

Caldo Brila Citrato

|

TSI Mc. Conkey

LIA Extracto de Levadura





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Por ejemplo el TSI (Triple Sugar Iron) contiene tres azúcares (lactosa, sacarosa yglucosa), citrato férrico y tiosulfato de sodio, elevada concentración de aminoácidos yrojo fenol como indicador. Este medio de cultivo en clases futuras nos permitirádeterminar variedad de bacterias, su composición, etc. Y continuando con esteejemplo podemos citar que las bacterias cultivadas se inoculan en picadura

(microaerobiosis) y extensión superficial. Las fermentadoras generan color amarillopor acidificación y las oxidativas rosa sobre la superficie (basificación). Las bacteriassulfito-reductoras dan sulfuro de hierro que resulta en precipitados negros en la zonaanaeróbica. ¿Por qué es importante el conocimiento de las necesidades nutritivas y físicas de los

microorganismos?

Es importante porque nos permite seleccionar el medio de cultivo más adecuado delmismo. Así un medio de cultivo reúne los requisitos de los microorganismos yreproduce el ambiente natural en el que se desarrollan.¿Cuál es el principio del TSI?

En TSI se determina la capacidad de un microorganismo para atacar los hidratos decarbono glucosa, lactosa y/o sacarosa, con producción o no de gases (CO2 y H2), juntocon la producción o no de ácido sulfhídrico (H2S).

VI. REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA:Manacorda, Ana M., Cuadros, Daniela P. y Álvarez, Anahí. Manual Práctico deMicrobiología Ambiental. edición: 2007.Granados Pérez, R. y Villaverde Peris C. Microbiología: Bacteriología, mediosde cultivo y pruebas bioquímicas. Editorial Paraninfo.España, 1998.httpwww.microinmuno.qb.fcen.uba.arguia.pdf http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioMedios.htm

Difco y BBL. 2003. Manual de Medios de Cultivo Microbiológicos.Clavell, L.; Pedrique de Aulacio, M. 1992. Microbiología. Manual de MétodosGenerales (2da edición). Facultad de Farmacia. Universidad Central de

Venezuela.Madigan, M. T.; Martinko G. M.; Parker J. Brock, Biología de losMicroorganismos. Ed. Pretice Hall. 8ª edición. 2004.Koneman Elmer W. The Enterobacteriaceae in Diagnostic Microbiology. 5ª.Edición, Washington Square: Lippincott – Raven Publishers, 1997: 173- 203

http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioMedios.htm







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PREPARACIÓN DE TINCIONES BACTERIANAS

I. INTRODUCCIÓN:

El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver

con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula

y el medio que la rodea, y el medio más simple de aumentar el contraste es lautilización de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos

diferentes de células o para revelar la presencia de determinados constituyentes

celulares, tales como flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares, etc.

Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teñirlas,

proceso llamado fijación. Para bacterias, la fijación por el calor es lo más corriente,

aunque también puede fijarse con sustancias químicas como formaldehido, ácidos y

alcoholes. Después de la fijación, si se añade el colorante, no se producen ulteriores

cambios estructurales en el protoplasma. La fijación se realiza habitualmente en

células que han sido fijadas sobre un portaobjetos, tratando después éste con el

agente fijador, y siguiendo inmediatamente el proceso de tinción. La fijación producehabitualmente el encogimiento de las células; la tinción, por el contrario, hace que las

células aparezcan mayores de lo que son realmente, de manera que las medidas de las

células que han sido fijadas o teñidas no pueden realizarse con mucha precisión.

La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad

específica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia

son moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los

constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los ácidos nucleicos y los

polisacáridos ácidos. Ejemplos de colorantes catiónicos son el azul de metileno, el

cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son moléculas cargadas negativamente

(aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente,tales como muchas proteínas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina ácida y el

rojo Congo.Algunos colorantes teñirán mejor sólo después de que la célula haya sido tratada con

otra sustancia química, que no es un colorante por sí mismo. Esta sustancia se

denomina mordiente; un mordiente habitual es el lugol. El mordiente se combina con

un constituyente celular y lo altera de tal modo que ahora sí podrá atacar el colorante.

Si se desea simplemente incrementar el contraste de las células para la microscopía,

son suficientes los procedimientos simples de tinción. El azul de metileno es un buen

colorante simple que actúa sobre todas las células bacterianas rápidamente y que noproduce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares. Es especialmente

útil para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales, puesto que la

mayor parte del material no celular no se tiñe.





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II. MATERIALES Y MÉTODOS

- Muestra de agua con bacterias

- Mechero con alcohol

- Lamina portaobjetos

- Asa bacteriológica

- Azul de Metileno

- Cristal Violeta

- Lugol (Mordiente)

- Alcohol Cetona (Descolorante)

- Safranina (Colorante de contraste)

En la preparación de tinciones bacterianas hemos trabajado las de coloración simple y

las de coloración Gram.

Coloración Simple:

Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se tiñen con la

misma tonalidad (Tinta china, Azul Metileno de Loeffler, Azul de lactofenol).

Cogemos nuestra muestra y con ayuda de un asa bacteriológica extendemos y fijamos

la muestra a un portaobjetos, mientras mantenemos un mechero para mantener

esterilizado la muestra y los materiales. Luego se agrega el colorante azul de metileno;

se lava para quitar el exceso de colorante de modo, que el agua no golpee

directamente la muestra y se lave todo. Luego se deja secar, y nuestra coloración

simple está lista para observar al microscopio a un aumento de 100x.





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Coloración Gram:

Esta tinción se denominada así por el bacteriólogo danés Christian Gram, quien la

desarrolló en 1844. Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram, las bacterias

pueden dividirse en dos grupos, grampositivas y gramnegativas (en este caso, los

términos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga eléctrico, sinosimplemente designan dos grupos morfológicos distintos de bacterias).

Contamos con nuestra muestra, la extendemos y la fijamos a una lámina portaobjetos

con ayuda de un asa bacteriológica; siempre contando con nuestro mechero para la

esterilización. Se agrega Cristal violeta por lo tanto nuestra muestra se colorea de azul,

se deja reposar de 3-5 minutos. Luego se lava como se muestra en el dibujo. Se

procede a agregar lugol (mordiente), en este proceso unas se fijan con mayor

intensidad; se deja reposar de 3-5 minutos y se lava nuevamente. Se agrega el alcohol

cetona (descolorante), en este procedimiento las bacterias que no se han fijado bien

se despintan, se deja reposar de 3-5 minutos y se lava. Por último agregamos safranina(colorante de contraste) que es la que tiñe a las bacterias que no se han fijado en el

procedimiento anterior, se lava y se deja secar a temperatura ambiente para luego

observar al microscopio con un aumento de 100x.





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III. RESULTADOS

Coloración Simple: Se entiende por tinción (o coloración) simple al teñido de los

microorganismos aplicando sólo una solución colorante (azul de metileno).

Coloración gram:

ETAPAS EN LA TINCIÓN

Pasos Método Gram positivas Gram negativas

Colorante BásicoCristal Violeta

(luego de unos minutos selava con agua el

exceso de colorante)

Se tiñe de violeta Se tiñe de violeta

Mordiente Lugol (pasado unos min.se lava con agua el

exceso de lugol)

Permanece violeta Permanece violeta

Descoloración

Alcohol-acetona (luego deunos minutos

lavarcon agua para

eliminar el resto dedisolvente)

Permanece violeta Se descolora

ContrasteFucsina o Safranina

(luego de unos minutos selava con agua el

exceso de colorante)

Permanece violeta Se tiñe de rosa

Observar al microscopioColocar sobre el

frotis una gota deaceite de inmersión.

Violeta Rosa





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IV. DISCUSIÓN

¿Por qué teñir una muestra?

Porque nos permite distinguir a cada una de ellas, diferenciarlas por sus características

morfológicas, taxonómicas, etc.

¿Cómo debe de ser la descoloración de una muestra?

La decoloración debe realizarse con poca agua para evitar que pierdan la tinción las

células grampositivas. EI proceso de decoloración debe ser corto y es esencial un

cálculo preciso del tiempo para obtener resultados satisfactorios.

¿Qué se hace en la coloración simple?

Se cubre el frotis, después de fijado, con la solución colorante y se deja actuar el

tiempo preciso. Se cubre el preparado con la solución de uso (azul de metileno

alcalino de Loeffler) sin diluir y se deja actuar 3 a 5 minutos.

¿Se puede agregar un álcali a la solución de azul de metileno de uso? ¿Por qué si? ¿Por

qué no?

Si se puede agregar un álcali (KOH) como intensificante, que actúa haciendo másrápida e intensa la reacción de coloración.

V. BIBLIOGRAFÍA

Manual Práctico de Microbiología. R. Díaz, y colaboradores, 2a edición. Ed.Masson, Barcelona, 1999

Forbes, B. A.- Sahm D. F. – Weissfeld A. S. Bailey y Scott, DiagnósticoMicrobiológico, 11ª Edición. Editorial Médico Panamericana. 2004





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OBSERVACIÓN DE LA DIFERENTES FORMAS Y AGRUPACCIONES BACTERIANAS

I. INTRODUCCIÓN:

Casi la totalidad de los organismos unicelulares son imperceptibles para el ojo

humano, y para observarlos es esencial el microscopio. El uso de este dispositivo es

indispensable en el Laboratorio de Microbiología para el estudio de agrupaciones,morfología y estructura de los microorganismos, así como su reacción a diferentes

colorantes, lo cual junto con otros criterios, permitirá su identificación, por lo tanto, es

importante conocer su adecuado manejo.

Para contrastar o realzar de forma específica distintas características morfológicas o

estructurales se emplean tinciones diferenciales. Estas técnicas tienen un gran interés

en la identificación y clasificación de las bacterias. La tinción diferencial más utilizada

es la tinción de Gram. Otras tinciones de gran importancia son las que diferencian

bacterias “ácido- alcohol resistentes”, las que diferencian estructuras significativas

como las esporas o la tinción negativa de cápsulas.


Aceite de inmersión

Microscopio

Muestra de lactobacilos





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A continuación damos algunos detalles de un microscopio compuesto, con la finalidad

de conocer mejor los instrumentos a utilizar.

Un microscopio compuesto es aquel que dispone de dos o más lentes de aumento. Un

microscopio se divide en dos partes: el soporte y el sistema óptico.

1) SOPORTE: Es la pieza fija en la que sólo la platina y el condensador tienen un

cierto movimiento. Sus principales partes son:

a) Base: Normalmente alberga la fuente de iluminación, en determinados modelos

incorpora además, un sistema porta filtros con varios filtros y un diafragma de

campo luminoso.

b) Brazo: Soporta todo el sistema óptico, el cabezal porta oculares y el revólver porta

objetivos. En él se dispone también un sistema de anclaje de la platina (movimiento de

enfocado de la preparación).

c) Platina. Es la pieza donde se coloca la preparación microscópica para su

observación.

d) El Macrométrico y el Micrométrico: Ambos permiten enfocar la preparación. El

primero se emplea para un enfoque rápido cuando se trabaja con objetivo de menos

18 de aumento (x10), mientras que el segundo permite fijar el enfoque cuando se

utilizan los objetivos de mayor aumento (x40, x100).

2) SISTEMA ÓPTICO: Está formado por un cuerpo tubular donde se instalan las

lentes: los oculares en un extremo y los objetivos en el extremo opuesto.

Para poder realizar las observaciones y agrupaciones bacterianas es indispensable

conocer las partes de un microscopio y su manejo; en la parte inferior se muestra laspartes de un microscopio.

Lo primero en esta práctica fue contar con una muestra (preparada en una lámina

portaobjetos), se procede a enfocar las láminas con objetivo de 100x y se pone una

gotita de aceite de inmersión para visualizar.

III. RESULTADOS

Los modelos de agrupamiento celular de las bacterias son característicos de especies

definidas y se utiliza como uno de los criterios de clasificación. Cuando las células

microbianas como los cocos se dividen, pueden permanecer unidas unas con otras,

formando arreglos característicos.Los bacilos se dividen únicamente en un plano pero en algunas ocasiones pueden

encontrarse células unidas por los extremos o por los lados debido a la etapa del

desarrollo en que se encuentren o a las condiciones del cultivo. Las bacterias en

espiral generalmente no se agrupan, crecen individuales y aisladas.

A continuación algunas de nuestras observaciones como: estructuras de cocos, bacilos

y de estos algunas agrupaciones como diplococos, estafilococos y estreptococos.





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Forma Agrupación Representación

Coco (esférico)

Coco único o micrococo Cuando los cocos se dividen en un solo plano vertical,se separan y conservan su individualidad.

Diplococo cuando las células hijas se presentan enparejas

Estreptococo en cadenaCuando las células hijas forman cadenas

Estafilococolas células permanecen unidas pero después de unadivisión celular en dos o más planos y los cocosforman grupos irregulares en ocasiones de granvolumen similares a racimos de uvas.

Bacilos En forma de bastón

IV. DISCUSIÓN

¿Por qué es importante un microscopio en la observación de microorganismos?

Porque es la única manera en que las puedes observar a través de un instrumento con

lentes de aumento y así identificarlas.

¿Qué tipo de formas y agrupaciones bacterianas podemos encontrar en una muestra

tomada de un agua contaminada?

Para la muestra que hemos tomado encontramos: Cocos y bacilos y agrupaciones de

diplococos, estreptococos y estafilococos. Pero también podemos encontrar espirilos y

agrupaciones de sarcinas, tétradas, etc.

V. BIBLIOGRAFÍA

Manual Práctico de Microbiología. R. Díaz, y colaboradores, 2a edición. Ed.

Masson, Barcelona, 1999

Manual de Laboratorio, MICROBIOLOGIA APLICADA. Universidad Autónoma

Metropolitana. www.azc.uam.mx/cbi/quimica/microbiologia

http://www.unad.edu.co/fac_ingenieria/pages/Microbiologia_mutimedia/bac

t_clasif.htm

http://www.unad.edu.co/fac_ingenieria/pages/Microbiologia_mutimedia/bact_clasif.htm











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TÉCNICAS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS

I. INTRODUCCIÓN:

En la naturaleza los microorganismos se encuentran en comunidades más o menoscomplejas. Son diversos los procedimientos existentes para el estudio de los mismos

que dependerán del tipo de microorganismo y del período de tiempo de conservaciónque se requiera. Para ello existen técnicas de siembra, conservación y mantenimientode los cultivos microbianos. Una técnica esencial en Microbiología es la de obtenciónde cultivos puros, a partir de los cuales podemos realizar estudios sobre laspropiedades de los microorganismos. Un cultivo puro es aquel que contiene una solaclase de microorganismo. Para poder obtenerlo es necesario concurrir a las técnicasconocidas como aislamiento.

Sembrar: una bacteria es colocarla en un medio de cultivo, elegido de acuerdo a lasexigencias vitales del microorganismo, lo que permite su desarrollo y multiplicación, sise incuba en condiciones adecuadas, un tiempo conveniente.

Técnicas para medio sólido: Cuando el medio de cultivo a sembrar es sólido, se puedesembrar en superficie, en profundidad o en profundidad y superficie.

1.- En superficie:

a). Por estría: Introducir el ansa en anillo o aguja en el tubo de agar inclinado hasta el

fondo diluyendo el inóculo en el agua de condensación que se acumula en esa parte,

luego mover el ansa suavemente sobre la superficie del agar con un movimiento en

zig-zag ascendiendo desde el fondo hasta la parte superior del medio.

2.- En profundidad:

a). Por Puntura: El medio de cultivo que se emplea está solidificado en tubo en forma

vertical y la siembra se realiza con aguja, la que se introduce con el inóculo

rápidamente en el seno del medio y se retira de la misma forma. La punción se realiza

en el centro del medio o excéntricamente.

3). En profundidad y superficie:

a). Por puntura y estría: Se utilizan para la siembra tubos con agar inclinado pero con

mucho fondo. Se introduce la aguja en el tubo de agar inclinado, se punza el fondo, se

retira y se realiza un trazo o estría en el pico de flauta.





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Mechero

Placas Petri

Mac Conkey

TSI

CITRATO

LIA

Asa bacteriológica

Muestra de leche contaminada

Espátula o hisopo

Técnicas de siembra:

1.- Por estría: para la elaboración de esta técnica de siembra se utilizó agar Mac

Conkey, muestras de: agua estancada y leche contaminada. Este tipo de siembra seutiliza para un aislamiento primario; se necesita una placa Petri con medio de cultivo

Mac Conkey. Con un asa bacteriológica cogemos la muestra a utilizar y la estriamos, se

protege la siembra y se rotula. No hay que olvidar que para la esterilidad de nuestro

trabajo se utiliza un mechero.

2.- Por puntura: se esteriliza el asa bacteriológica, con esta misma se toma una

porción de nuestra muestra a utilizar y se somete en los tubos de ensayo (TSI, LIA y

CITRATO), aproximadamente hasta los ¾, se retira por el mismo lugar y se estría en el

pico de flauta, luego se tapa el tubo de ensayo y se rotula. Este tipo de técnica de

siembra nos permite estudiar la bioquímica de los microorganismos.

3.- Por diseminación: se cuenta con el agar nutritivo solidificado, entonces se funde y

se agrega en una placa Petri entre unos 15 y 18 mL. Se deja enfriar nuevamente, pero

esta vez en la placa Petri, se agrega la muestra (0,1 mL) y se hace la extensión de la

muestra, se protege el material y se rotula.

4.- Por incorporación: se agrega 1 mL de muestra en la placa Petri estéril vacía; se

funde el agar, se deja enfriar y se agrega sobre la muestra aproximadamente 15 a 18

mL y se realiza movimientos giratorios arriba y abajo para homogenizar tanto la

muestra como el agar, se protege y se rotula.





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III. RESULTADOS

IV. DISCUSIÓN¿Cuál es la finalidad de una siembra?

Puede ser la de realizar una transferencia o un aislamiento. La primera se efectúa con

cultivos puros (una sola especie bacteriana), ya sea con el objeto de renovar el medio

de cultivo para perpetuar la especie, o bien para conocer alguna de sus propiedades

culturales o bioquímicas. El aislamiento, en cambio, se realiza a partir de un material

que contiene una mezcla de especies bacterianas y su objeto es separarlas para

obtener cultivos puros.

¿Cuál es la finalidad de siembra por incorporación?

La principal función es la de homogenizar tanto la muestra como el medio de cultivo

para el recuento bacteriano. Es muy importante la distribución de las bacterias.

¿Cuál es la finalidad de la técnica de siembra por diseminación?

Con este tipo de siembra lo que se obtendrá es la biomasa de los microorganismos

cultivados.

¿Cuál es la diferencia entre los diferentes tipos de siembra?

Todos los tipos de siembra son muy diferentes, los pasos a seguir nos lo demuestran,

por ejemplo en la técnica de siembra por puntura tenemos los tubos de ensayo con

pico de flauta, la finalidad de esta inclinación es la utilización de la densidad de las

sustancias nutritivas que componen el agar utilizado.

V. BIBLIOGRAFÍA

http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioTinciones.htm

Gamazo, C., López-Goñi, I., y R. Díaz. 2005. Manual práctico de microbiología.

Ed. Masson. S.A. Barcelona. España








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RECONOCIMIENTO DE PROTOZOARIOS Y HELMINTOS

I. INTRODUCCIÓN:La parasitología es una ciencia que comprende aquellos seres vivos que de manera

permanente o temporal viven a expensas de otros organismos. El termino parásito es

aplicado a los protozoos, platelmintos y nematelmintos. Estos son excretados por las

heces de modo que pueden ser transmitidos al hombre a través del agua y suelo.

Algunos parasitarios pueden ser objeto de investigación en aguas de consumo y agua

utilizada en diferentes actividades; protozoarios como: Entamoeba histolytica, Giardia

lamblia, Cryptosporidium spp. Y algunos Helmintos como: Ascaris lumbricoides,

Trichiuris trichiura, Taenia solium, Enterobius vermicularis, etc. En aguas estancadas

(naturales, piscinas, sistemas de calefacción y refrigeración, etc.), pueden vivir

facultativamente en forma parásita: Amibas de vida libre como Acanthamoeba sp. yNaegleria sp. que suelen provocar inflamaciones de mucosas. Las técnicas de

investigación de protozoos parásitos intestinales están basadas en la detección del

parásito tras la filtración de volúmenes de agua.

Protozoarios:

Son seres unicelulares, constituidos por una masa de protoplasma; en su mayoría

microscópicos. Se encuentran en todos los ambientes; unos de vida libre, otros

parásitos y soprofitas, algunos poseen estructura relativamente compleja.

El phylum protozoarios incluye más de 30 especies que pueden atacar al hombre. De

estos, doce son patógenos verdaderos, diez son transmitidos por insectos y el resto(Giardia lamblia y Entamoeba histolítica) pueden ser transmitidos por moscas o por el

agua.

Helmintos:

Los platelmintos se caracterizan por ser gusanos aplanados, cuyo grupo originario está

constituido por los turbelarios. Los gusanos chupadores (trematodos) y los acintados

(cestodos), viven exclusivamente de modo parasitario.


Microscopio Muestras de agua

Algunas variedades de helmintos

Aceite de inmersión





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III. RESULTADOS

Protozoarios:

Se observaron amebas (Las amebas son protistas unicelulares. Son células eucariotas,

que se caracterizan por su forma cambiante, puesto que carecen de pared celular, y

por su movimiento ameboide a base de seudópodos (prolongación del citoplasma),

que también usan para capturar alimentos (a través del proceso llamado fagocitosis).

Las amebas pueden vivir libres en agua o tierra o parasitando el intestino del hombre

o de los animales.

Helmintos:

El término "helminto" se utiliza en referencia a una variedad de gusanos que parasitan

el intestino del ser humano. La infección por helmintos es el resultado de la

penetración de un gusano al interior del cuerpo donde maduran, depositan huevos y

obtienen nutrición del huésped. Estas infecciones pueden ser provocadas por

nematodos intestinales presentes en el suelo tales como la lombriz intestinal (Ascarislumbricoides) el gusano flageliforme (Trichuris trichiura), la tenia y especies que

habitan en el agua como el Schistosomahaematobiumy S. mansoni.

http://www.monografias.com/trabajos/celula/celula.shtml


http://www.monografias.com/trabajos15/kinesiologia-biomecanica/kinesiologia-biomecanica.shtml


http://www.monografias.com/trabajos7/alim/alim.shtml

http://www.monografias.com/trabajos14/administ-procesos/administ-procesos.shtml#PROCE

http://www.monografias.com/trabajos14/problemadelagua/problemadelagua.shtml


http://www.monografias.com/trabajos11/tierreco/tierreco.shtml


http://www.monografias.com/trabajos15/fundamento-ontologico/fundamento-ontologico.shtml

http://www.monografias.com/trabajos10/cani/cani.shtml



http://www.monografias.com/trabajos15/fundamento-ontologico/fundamento-ontologico.shtml



http://www.monografias.com/trabajos14/administ-procesos/administ-procesos.shtml#PROCE

http://www.monografias.com/trabajos7/alim/alim.shtml







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Trichuris trichiura: Es un parásito que puede ser considerado cosmopolita, al

igual que el Ascarislumbricoides, de localización intestinal baja (intestino

grueso) y ciego. El gusano adulto sexualmente maduro mide 5 cinsde longitud

y se presenta en forma de %átigo%la hembra parasitaria estáenrollada en un

extremo en forma de mazo de reloj. La infección se produce por ingerir las

larvas contenidas en el huevo y cuyo desarrollo se produce entre 1 a 3 meses.

Sólo si la infección es masiva se produce (6) : diarrea, muco-sanguinolenta,

anemia y en casos extremos por el continuo pujo y tenesmo rectal, que

debilitan los músculos elevadores del ano, se produce el '1elescopaje" rectal,

de tal manera que la mucosa rectal protuyehacia fuera, inclusive apreciándose

los gusanos adultos adheridos a la mucosa. La profilaxis consiste en no ingerir

agua y principalmente verduras crudas.

Ascaris Lumbricoides (las lombrices): El Ascaris lumbricoides es un nematodo

que produce una de las parasitoide mayor difusión en el mundo: la ascariasis.Esta enfermedad cursa con una sintomatología muy variable; generalmente es

asintomática en el adulto, y es en el niño donde vemos la más florida signo

sintomatología y las complicaciones de esta enfermedad. Como la mayoría de

las enteroparasitosis, la ascariasis prevalece y es endémica en áreas

desprovistas de infraestructura sanitaria, con viviendas precarias, pobreza e

ignorancia.





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Fasciola

Huevo de heminolepsis nana

IV. DISCUSION

La mayor parte de estos helmintos actúan como parásitos por no decir todos, estos

viven parasitando los diversos medios donde se desarrollan. Algunos de ellos causan la

muerte o lesiones graves. Los citados en la parte inferior tienen síntomas muy

variables. Es muy importante su estudio porque le causan daño a los seres humanos,

su estudio sería una de las llaves para conocer más acerca de este mundo y prevenir

ciertas acciones.

V. BIBLIOGRAFIA

http://www.azc.uam.mx/cbi/quimica/microbiologia/p24.pdf

Villegas, Elsi. 2005. Parasitología. Editorial sombra. Guadalajara. Mexico.

PIEKKARSKI, Gerhard. Tratado de parasitología. Madrid, Aguilar, 1959




manual de prÁcticas de microbiologÍa ambiental

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