UNIVERSIDAD DEL CAUCA

Laboratorio de Bioquímica II Metabolismo

Programa – Química

Práctica Nº 3

Practica: Metabolismo de carbohidratos y Fermentación

de la Glucosa por levadura de Panificación

Dr. Ricardo Benítez Benítez

Ingrid Eliana Fernández Campo

Catherine Daza Gómez

Popayán – Cauca

2010

ANALISIS

Para tener un mejor conocimiento de los procesos llevados a cabo en esta práctica de laboratorio, se hace necesario el empezar explicando detalladamente que es una levadura.

Levadura:

Se denomina así a cualquiera de los diversos hongos microscópicos unicelulares que son importantes por su capacidad para realizar la descomposición mediante fermentación de diversos cuerpos orgánicos, principalmente los azúcares o hidratos de carbono, produciendo distintas sustancias.

Producen enzimas capaces de descomponer diversos sustratos, principalmente los azúcares. A estas se les ha dado diferentes usos, en gastronomía se utiliza desde la antigüedad en la elaboración de distintos alimentos, como el pan, el vino o la cerveza.

En cada una de las pruebas realizadas se emplearon los siguientes carbohidratos:

Tabla 1. Carbohidratos EmpleadosCarbohidrato Clase de Carbohidrato

Glucosa Monosacárido , aldosa , hexosaFructosa Monosacárido, cetohexosaSacarosa Disacárido , (alfa-glucopiranosa y beta-fructofuranosa )Almidón Polisacárido, (amilosa y amilopectina)

En la Tabla 1 se describe la conformación de varios de los carbohidratos, además de algunos aspectos generales referentes a su estructura.

1. Prueba (Carbohidrato + levadura + Agua):

Las condiciones necesarias para llevar a cabo el procedimiento, fueron ausencia de oxígeno y un medio acuoso, debido a que el proceso de fermentación alcohólica desarrollado en varios de los carbohidratos, se genera en condiciones anaeróbicas que contribuyen a la producción de dióxido de carbono y etanol.

Los resultados obtenidos en muchos de los casos no fueron lo esperado, esto se explicara más adelante, aun así se ha hecho una estimación de lo que debería obtenerse en condiciones favorables.

Tabla 2. Desplazamiento del embolo (orden de mayor a menor )1. Fructosa2. Glucosa3. Sacarosa

4. Almidón (No hay desplazamiento)

En la Tabla 2 se describe el desplazamiento del embolo de mayor a menor, la estimación de estos resultados se explicara más detalladamente a continuación.

Glucosa + levadura + agua :

El desplazamiento generado para esta prueba es bastante significativo , aunque menor al generado por la fructosa , esto se debe a que se parte inicialmente del sustrato principal del proceso de glucolisis , en donde la levadura actúa enzimáticamente segregando las enzimas principales conocidas como zimasas , encargadas de convertir la glucosa en etanol y dióxido de carbono ,esta actividad de estos microorganismos permite procesar muchos de los carbohidratos , formando así energía suficiente para la supervivencia de estos .

Una vez la levadura inicia el proceso enzimático sobre el sustrato se genera la glicolisis, en donde el objetivo principal es la formación de un compuesto que pueda escindirse fácilmente en derivados fosforilados de tres carbonos. la energía requerida se obtendrá de estos compuestos.

La glucosa entra en la mayoría de las células por medio de un transportador específico o sistema activo, dentro de la célula solo tiene un único destino: ser fosforilada por el ATP para formar glucosa – 6 – fosfato. la transferencia del grupo fosforilo del ATP al grupo hidroxilo del C-6 de la glucosa se halla catalizado por la hexoquinasa, como se muestra en la Figura 1.

Fig. 1. Conversion de la Glucosa a Glucosa-6-fosfato

La hexoquinasa, entonces, es una enzima que transfiere un grupo fosforilo desde el ATP a un grupo de azucares de seis carbonos (hexosas). La hexoquinasa al igual que otras quinasas requiere para su actividad Mg +2. .

La etapa siguiente en la glicolisis es la isomerización de la glucosa -6-fosfato a fructosa-6-fosfato. el anillo piranosico de seis miembros de la glucosa -6-fosfato se convierte en el anillo furanosico de cinco miembros de la fructosa-6-fosfato, esto se conoce como la conversion de una aldosa a una cetosa (Fig 2).

ATP

Fig 2. Conversión de la Glucosa-6-fosfato a frutosa-6-fosfato

A la etapa de isomerización le sigue una segunda reacción de fosforilacion. la fructosa-6-fosfato es fosforilada por el ATP hasta fructosa-1,6-difosfato (Fig3).

Fig 3. Conversión de la Fructosa-6-fosfato a Fructosa-1,6-difosfato

Esta reacción es catalizada por la fosfofructoquinasa, una enzima alosterica. La marcha de la glicolisis depende críticamente del nivel de actividad de esta enzima. la actividad catalítica de la fosfofructoquinasa es controlada alostericamente por el ATP y otros metabolitos.

La segunda etapa de la glicolisis consta de cuatro pasos, comenzando por la división de la fructosa-1,6-difosfato en gliceraldehido-3-fosfato y dihidroxiacetona fosfato. En los siguientes pasos de la glicolisis reaccionan compuestos de tres carbonos en vez de compuestos de seis carbonos (Fig 4).

Figura 4.

Esta reacción esta catalizada por la aldolasa, el gliceraldehido-3-fosfato se encuentra en la vía directa de la glicolisis, pero no la dihidroxiacetona fosfato. Sin embargo, esta última puede convertirse fácilmente en gliceraldehido-3-fosfato. Estos compuestos son isómeros: la dihidroxiacetona fosfato es una cetosa mientras que el gliceraldehido-3-fosfato es una aldosa. La isomerización de los azucares fosforilados de tres carbonos va catalizada por la triosa fosfato isomerasa (Fig 5).

Figura 5.

Así pues se forman dos moléculas de gliceraldehido-3-fosfato a partir de una molécula de fructosa-1,6-difosfato por la acción secuencial de la aldolasa y la triosa fosfato isomerasa (Fig 6).

Figura 6.

De esta forma hasta ahora se ha transformado una molécula de glucosa en dos moléculas de gliceraldehido-3-fosfato. Todavía no se ha extraído energía. ahora llegamos a la reacción de conversión del gliceraldehido-3-fosfato hasta 1,3-difosfoglicerato (1,3-DPG), reacción catalizada por la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa.

Gliceraldehido-3-fosfato + NAD+ + Pi 1,3-DPG + NADH + H +

En seguida se utilizara el alto potencial de transferencia de fosfato del 1,3-DPG para generar ATP, esta es la primera reacción de generación de ATP en la glicolisis .la fosfogliceratoquinasa cataliza la transferencia del grupo fosfórico del 1,3-DPG al ADP.

Una vez se obtiene el 3-fosfoglicerato, este es convertido a 2-fosfoglicerato por medio de la acción catalítica del fosfogliceratomutasa, que se encarga de generar un cambio intramolecular de un grupo químico como el fosfórico (Fig 7).

Fig 7. Cambio Intramolecular

En la siguiente reacción se forma un enol por la deshidratación del 2- fosfoglicerato. La enolasa cataliza la formación del fosfoenolpiruvato . esta reacción de deshidratación eleva marcadamente el potencial de transferencia del grupo fosforilo. (Fig 8).

Fig 8. Reacción de Deshidratación

La ultima reacción para la formación del piruvato , es la transferencia de un grupo fosforilo desde el fosfoenolpiruvato hasta el ADP que se encuentra catalizada por la piruvatoquinasa, (Fig 9).

Fig 9. Obtención del Piruvato

Para la producción de etanol , se lleva a cabo una descarboxilacion del piruvato.

Piruvato + H+ acetaldehído + CO2

Esta reacción se encuentra catalizada por la piruvato descarboxilasa , que contiene tiamina pirofosfato como coenzima . La tiamina pirofosfato actua como coenzima de una serie de descarboxilasas.

En seguida se produce la reducción de acetaldehído a etanol por el NADH. El alcohol deshidrogenasa cataliza esta reacción de óxido-reducción

Acetaldehído + NADH + H+ etanol + NAD +

La reacción neta de este proceso anaeróbico es:

Glucosa + 2 Pi + 2ADP + 2H+ 2 etanol + 2 CO2 + 2 ATP + 2 H2O

De esta forma se obtiene el CO2 que desplaza el embolo , debido a que este es más denso que el oxígeno, por lo que la presión generada dentro de la jeringa será mayor , contribuyendo a su desplazamiento.

Fructosa + levadura + H20 :

La fructosa es un monosacárido por lo que la obtención de CO2 y etanol , en este caso se generaran de la misma forma que para glucosa, la cantidad de gas producido para este caso debe ser mayor, puesto que se parte de un sustrato intermediario y no de la glucosa ,esto contribuye a que se lleve a cabo la fosforilacion de inmediato , generando que la célula se ahorre un paso en el proceso de glicolisis, su desplazamiento se ve incrementado debido a que se genera más desprendimiento de gas , pues la duración del proceso es mucho más corta en relación a el de la glucosa , la cual debe primero fosforilarse y convertirse a fructosa , la obtención de etanol y

dióxido de carbono se lleva a cabo de la misma forma que para la glucosa , pues las dos sufren un proceso de glicolisis que es llevado a fermentación una vez se obtiene etanol a partir del acetaldehído generado por la descarboxilacion del piruvato .

El que el proceso de glicolisis se lleve a cabo en menos pasos implica que la cantidad de gas generado en una misma cantidad de tiempo debe ser mayor que el generado por la glucosa.

Sacarosa + levadura + H20 :

La obtención de gas en este caso es menor debido a que la sacarosa es un disacárido , por lo que primero debe generarse un proceso de hidrolisis que permita que los carbohidratos por los que esta se encuentra compuesta queden dispuestos en monosacáridos como glucosa y fructosa , las enzimas encargadas de este proceso de hidrolisis son secretadas por la levadura y se denominan invertasas , se caracterizan porque su hidrolisis puede hacerse al nivel del puente de oxigeno por una glucosidasa o del lado de la fructosa con la inversión de una b-fructosidasa , generando siempre los mismos productos y dando paso a la iniciación de la glicolisis hasta generar CO2 y etanol , el desprendimiento de gas en este caso es menor debido a que inicialmente el carbohidrato debe sufrir un proceso de ruptura, por lo que comparando el tiempo que emplea la glucosa para empezar este proceso , podría decirse que esta inicia más rápidamente, por lo tanto la obtención de dióxido de carbono y etanol será mucho más eficaz en este caso que en el de la sacarosa , la cual debe sufrir primeramente una hidrolisis para iniciar así la glicolisis en la célula.

Almidón + levadura + H20 :

Este polisacárido no obtuvo desprendimiento de gas y por consecuencia tampoco se generó movilidad del embolo , este resultado se debe a que el proceso de hidrolisis al que debe ser sometido lleva tiempo y quizás necesite de la acción de un ácido que acelere este proceso , el almidón puede ser fermentado y por lo tanto producir dióxido de carbono y etanol , pero las condiciones expuestas del laboratorio no fueron lo suficientemente fuertes como para hidrolizarlo completamente, por esta razón el proceso de glicolisis no se llevó a cabo.

Muy posiblemente la completa hidrolisis del almidón pueda llevarse más efectivamente en presencia de otras levaduras.

2. Prueba ( Carbohidrato + levadura + inhibidor ) :

Inhibidor : NaOH

En este caso ninguno de los carbohidratos empleados genero desplazamiento del embolo , lo cual indica que el proceso de fermentación alcohólica no se llevó a cabo , esto se debe a que la adición de una base dismuye el pH de la solución por lo que el crecimiento y desarrollo de las levaduras se verá afectado , pues su rango de actividad se sitúa entre pH 3.5 y 5.5 por lo que la disminución del mismo contribuye a que su acción sobre el sustrato se vea seriamente afectada , evitando así que la glicolisis se lleve cabo y por consiguiente también el proceso de fermentación .

3. Prueba ( Glucosa + yogurt +agua ) :

Para este caso la presencia de levadura se reemplaza por una cepa de microorganismos llamados lactobacillus , los cuales contribuirán a llevar a cabo la fermentación láctica esperada, la cual es

una ruta metabólica anaeróbica que ocurre en el citosol de la célula, en la que se oxida parcialmente la glucosa para obtener energía y donde el producto de desecho es el ácido láctico.

Esta reacción también se genera en las células de los organismos superiores cuando la cantidad de oxigeno disponible es limitada, como ocurre en el musculo durante la actividad intensa. La reducción del piruvato por el NADH para formar lactato esta catalizada por la lacto deshidrogenasa :

la reacción global de la glucosa en lactato es :

Glucosa + 2 Pi + 2 ADP 2 Lactato + 2 ATP + 2 H2O

Al igual que en la fermentación alcohólica , no existe oxido-reducción neta . el NADH formado en la oxidación del gliceraldehido -3-fosfato se consume en la reacción del piruvato. La regeneración del NAD+ en la reducción del piruvato hasta lactato impiden que la glicolisis cese en condiciones anaeróbicas. Solamente una pequeña fracción de la energía de la glucosa se libera en la conversión anaeróbica hasta lactato ,para este caso no se espera desplazamiento del embolo debido a que no se genera fermentación alcohólica que produzca dióxido de carbono , pues lo que se lleva a cabo es una fermentación láctica en donde se ocasiona nuevamente el proceso de glicolisis ya descrito anteriormente para la glucosa hasta piruvato en donde gracias a las enzimas especializadas , el piruvato pasa a ácido láctico .

La adición del medio acuoso facilita la actuación de los microorganismos sobre el sustrato.

El fracaso en muchos de las pruebas realizadas se debió a que la solución tampón no se encontraba bien preparada ocasionando que el amortiguamiento del pH no se llevara a cabo de forma eficaz ,lo cual es necesario ya que el efecto de la levadura sobre el sustrato se ve claramente afectado si no se tiene un pH comprendido entre 3.5 y 5.5 ,pues la modificación de este se genera a medida que se lleva a cabo la glicolisis con mucho de los sustratos intermediarios.

De esta forma se puede concluir que como la solución amortiguadora no fue lo suficientemente fuerte como para regular el pH , en muchos de los casos no se pudo llevar a cabo el proceso de glicolisis pues el efecto de la levadura se vio alterado.

Determinación de la presencia de etanol:

Para este proceso se empleó carbonato de sodio para eliminar el agua presente en el medio , enseguida se añadió una solución de yodo/yoduro en condiciones de temperatura de 70°C a través de un baño de agua , la adición de la solución de yodo se hace en exceso para asegurar que todas las moléculas de etanol reaccionen y den paso a la formación del precipitado de yodoformo, la formación de este se genera por el desprendimiento del carbono 2 de la molécula

de etanol, al encontrarse ligado a tres átomos de yodo ; por medio de este precipitado puede determinarse la presencia de etanol efectivamente.

Esta prueba para nuestro caso fue negativa puesto que en ninguno de los casos se obtuvo una fermentación alcohólica.

Determinación de la presencia de Ácido láctico:

Para esta prueba se empleó éter etílico , en el cual se disolvió el ácido láctico generado por la fermentación láctica , esta disolución permite un aislamiento de este producto, facilitando así la determinación del mismo por la formación de un complejo de hierro +3 , la obtención de este compuesto genera en la solución una coloración verde-amarillenta .

Complejo formado

Para nuestro caso esta prueba dio negativa debido a que no se obtuvo ácido láctico , por lo tanto la determinación del mismo no fue posible.

CONCLUSIONES

la determinación de la fermentación alcohólica puede hacerse visualmente con el desplazamiento del embolo , debido al desprendimiento de gas obtenido por la generación de dióxido de carbono ; mientras que la fermentación láctica se determina solo por el aumento del volumen del líquido contenido en la jeringa , proveniente del ácido láctico producido.

La utilización de una solución tampón , permite el favorecer las condiciones óptimas de pH para que la levadura pueda actuar de forma satisfactoria sobre cada uno de los sustratos.

El empleo de una solución tampón se hace necesaria debido a que a medida que se lleva a cabo el proceso de glucolisis , la generación de cada uno de los sustratos intermediarios modifica el pH de la solución , lo cual puede afectar la acción de la levadura.

El desprendimiento de gas estimado para la fructosa debe ser mayor , puesto que esta es un sustrato intermediario , en donde la fosforilacion por parte de la enzima da paso al desarrollo de glucolisis , esto quiere decir que el proceso no tarda tanto pues se parte de un producto intermediario.

En el caso de sacarosa el desprendimiento de gas fue menor , pues antes de iniciar el proceso de glucolisis y fermentación , la célula debió segregar enzimas que dieran paso su hidrolisis.

El almidón no genero un desprendimiento de gas , debido a que este es un polisacárido , por lo que las condiciones para que se llevara a cabo su fermentación debieron ser más fuertes, generando así los monosacáridos que serán empleados en el proceso de glucolisis.

BIBLIOGRAFIA

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Fermentación alcohólica: Una opción para la producción de energía renovable a partir de desechos agrícolas", H.J. Vázquez, INGENIERÍA Investigación y Tecnología VIII. 4. 249-259, 2007.

Fermentation Process Development of Industrial Organisms", Justin O. Neway, 1989; Marcel Dekker; ISBN 0-8247-7917-7.