INSTITUTO TECNOLGICO DE MRIDA Divisin de Estudios de Postgrado e Investigacin

Cuarto Informe Condiciones para la produccin de etanol carburante a partir de los desechos slidos de la sbila sacarificados

Alumna: Br. Lilia Prez Oyosa No. de Beca 032007 105 A Director: M. en C. Gerardo Rivera Muoz

Octubre de 2008

INTRODUCCIN: El cultivo de la sbila en el estado de Yucatn cobr importancia recientemente como una alternativa para la diversificacin de la zona henequera, ya que se adapta perfectamente a las condiciones de suelo que predominan en ella. Adems de que su costo de produccin es muy bajo y tiene una fuerte demanda en el mercado internacional. Sin embargo en los ltimos aos se han presentado serios problemas de comercializacin local, primero por la dependencia de un solo comprador y despus por el cierre de la industria que acopiaba la produccin de hojas de sbila. La carencia de industrias o de opciones de locales de comercializacin ha repercutido en el abandono de las plantaciones y en el quebranto de una importante alternativa productiva para la zona henequenera del estado. Aunado a todo esto el procesamiento de la sbila ha estado circunscrito a la produccin de gel 1:1 cuya obtencin es sumamente sencilla y de baja inversin o como gel concentrado 1:20 y 1:40 y el gel liofilizado (1:200) sin embargo participar en el mercado de estas tres ltimas opciones requiere de una fuerte inversin, calculada en un milln de dlares en el ao 2002. Otra alternativa es la diversificacin de las opciones de industrializacin de las hojas de sbila, para ello es necesario ampliar la gama de productos susceptibles de ser obtenidos de las hojas de sbila, con la idea de encontrar alternativas de alta demanda y valor agregado atractivo. En este proyecto se plantea la posibilidad de obtener etanol como un producto paralelo al gel de sbila, usando los subproductos y desechos que se generan durante el proceso de obtencin del mismo. Nuestro grupo de trabajo ha venido colaborando con varias asociaciones de productores de sbila del estado de Yucatn y pretende aportar nuevas opciones para la industrializacin de la sbila a travs del establecimiento de las bases para una eventual utilizacin de los desechos slidos de la sbila, en la produccin de azcares fermentables y la conversin de los mismos en etanol para su uso como combustible. ANTECEDENTES: Los desechos slidos de la sbila estn compuestos por polisacridos como la celulosa, pectina y hemicelulosas, Figura 1, cuyos monmeros son azcares. Por ello es factible pensar en la posibilidad sacarificarlos por va qumica, Tabla I. O por va enzimtica, Tabla II, para producir hidrolizados ricos en azcares fermentables. Mismos que pueden ser usados en la produccin de etanol, mediante una fermentacin alcohlica, Tabla III. Sin embargo no se encontraron reportes en los que esta opcin sea analizada. Cabe destacar que la produccin de etanol a partir de subproductos y desechos agroindustriales ya ha sido valorada, Tabla III. En este sentido destacan los estudios realizados en Colombia en los que se produjo etanol a partir de la cscara de pltano y almidn de yuca (Monsalve 2006). Los realizados por el grupo de Saha (2006) en los que se us paja de trigo para la produccin de etanol previa sacarificacin enzimtica. El grupo de Kemppainen (2005) us desechos de madera de lamo y papel peridico para producir azcares fermentables que posteriormente usaron para la produccin de etanol. Wingren en suiza ha realizado estudios en torno a la produccin de etanol usando maderas suaves pretratadas con vapor y ha hecho la evaluacin econmica (Wingreem, 2004); el mismo grupo evalu el efecto del lavado de las maderas tratadas, sobre el rendimiento de etanol

Sderstrm (2004). Belkacemi en la Universidad Laval en Canad ha trabajado en la produccin de etanol a partir de desechos agrcolas fraccionados con vapor de agua, (Belkacemi 1997; Belkacemi 2002). Taylor y colaboradores (2000) desarrollaron un proceso para la produccin fermentativa de etanol carburante. Doran en 1993 desarroll un proceso para la produccin de etanol usando celulosa cristalina como sustrato de fermentacin y como microorganismo productor Klepsiella oxytoca conteniendo los genes de Zymomonas mobilis. Es evidente que existe inters a nivel mundial en usar productos, subproductos y desechos agrcolas, diferentes del almidn de maz o de la azcar de caa en la produccin de etanol. En este sentido el uso de los residuos agrcolas generados en la Pennsula de Yucatn y en especial los generados en el estado de Yucatn por la industria sabilera adquieren singular importancia.

Aloe barbadensis

Agua 99.5%

Slidos 0.1%

Molculas de alto peso molecular 0.1 Polisacridos: Quinonas Azcares reductores Protenas Polisacridos de varios tipos qumicos

Molculas de bajo peso molecular 0.4% Cationes K+ Ca++ Na+ Mg++ Aniones Cl- Lactato Oxalato Azcares Glucosa Manosa Sales Grasas Aminocidos Polisacridos: mananos, dextranas ramificadas y pectinas

Figura 1) Composicin de la sbila

TABLA I SISTEMAS DE SACARIFICACIN QUMICA DE DESECHOS AGROINDUSTRIALESPRIMER ETAPA Desechos usados Residuos forestales de Eucalipto Cascarilla cebada Cscara banano Almidn yuca de de de H2SO4 diluido H2SO4 diluido H2SO4 20 % 5% 1% 500g H2SO4 100g H2SO4 40-50 ml/500g muestra 90 g/l Bao Mara a 94 C, 395 rpm 6 hrs muestra/50ml 125 C en autoclave 15 min Monsalve, 2006 Monsalve, 2006 muestra/5000ml 80 a 180 C 0 a 330 min Aguilar, 2004 Reactivo usado H2SO4 72 % 30 C Concentracin Temperatura Tiempo reaccin 60 min Relacin Sustrato/Qumico 300mg muestra/3.0 ml H2SO4 SEGUNDA ETAPA Dilucin final 3.0% Temperatura de hidrlisis 125C en autoclave Tiempo de hidrlisis 60 min Canettieri, 2007 REFERENCIA

TABLA II SISTEMAS DE SACARIFICACIN ENZIMTICA DE DESECHOS AGROINDUSTRIALESPRETRATAMIENTO Desechos usados Paja Trigo de Reactivo usado Solucin acuosa de H2O2 ajustada a pH Rastrojo de maz Cscara de almendra Madera pino Rastrojo de maz de 11.5 1.4 % 2.2 g acido/kg mezcla 0.0- 4.5 g acido/ kg de mezcla 0.03-0.06 g acido/ g biomasa 180 a 200 C 176 a 231 C 190 C 180 a 215 C 8 min 0.9-1.1 min 1.0-5.5 min 1 min 25-35% w/w 7% w/w 14% w/v con NaOH H2SO4 diludo H2SO4 diludo H2SO4 diludo H2SO4 diludo Complejo Celulasa Complejo Celulasa de Aspergillus niger de Aspergillus niger 50 C, 200 48 hrs Martinez, 1997 rpm, pH 4.8 0-4.3 % Concentracin Condiciones de reaccin 25 a 35 C, 250 rpm Tiempo reaccin 3 a 24 horas Relacin Sustrato/Qumico 8.6% w/v CMCasa -glucosidasa Xilanasa B-Xilosidasa L-Arabinofuranosidasa CPN celulasa 45 50 C, C, 130 200 168 hrs 48 hrs Kadam, 2004 Martinez, 1997 rpm, pH 4.8 rpm, pH 4.8 HIDRLISIS ENZIMTICA Enzima usada Condiciones de reaccin 45 C, 100 rpm, pH 5.0 Tiempo de hidrlisis 72 a 120 hrs Saha, 2006 REFERENCIA

TABLA III SISTEMAS PARA LA PRODUCCIN DE ETANOL USANDO COMO FUENTES DE CARBONO SUBPRODUCTOS O DESECHOS AGROINDUSTRIALESSustrato usados Hidrolizado enzimtico de Paja de Trigo adicionado con 10g de triptona y 5.0 g de extracto de levadura por litro Hidrolizado enzimtico de Paja de Trigo adicionado con 10g de triptona y 5.0 g de extracto de levadura por litro Hidrolizados almidn de yuca de Zymomona mobilis CP4 La conc. de azcares reductores para el jarabe de yuca se ajust a 20, 40 y 60 g/l y para el jarabe de cscara de banano a 20 g/l en el medio complementado con KH2PO4, (NH4)2SO4, extracto de levadura y MgSO47H2O durante 72 horas Hidrolizados almidn de yuca de Saccharomyces cerevisiae NRRL Y-2034 La conc. de azcares reductores para el jarabe de yuca se ajust a 90 g/l y para el jarabe de cscara de banano a 20 g/l en el medio complementado con KH2PO4, (NH4)2SO4, extracto de levadura y MgSO47H2O durante 5 horas Erlenmeyers de 250 ml con volumen de operacin de 50 ml, en anaerobiosis 4 30 C 200 rpm Monsalve, 2006 cscara de banano y Erlenmeyers de 250 ml con volumen de operacin de 50 ml, en anaerobiosis 6.6 30 C 200 rpm Monsalve, 2006 cscara de banano y Escherichia recombinante FBR5 Coli Cultivo de clulas en medio Luria incubado a 37 C durante 24 horas a 100 rpm 5.0% Fermentador de dos litros volumen de operacin de 1.5 L en semi-anaerobiosis (SSF) 6.0 37 C 150 rpm Saha, 2006 Microorganismo usado Escherichia recombinante FBR5 Coli Cultivo de clulas en medio Luria incubado a 37 C durante 24 horas a 100 rpm Caractersticas del inculo Relacin de inculo 5.0% con Condiciones de reaccin Matracez de 500 ml volumen de operacin de 350 ml, en semi-anaerobiosis (SHF) 6.5 pH Temperatu ra 37 C 130 rpm Saha, 2006 Agitacin Referencia

La prxima generacin de etanol combustible Todava hay que superar algunos obstculos antes de que se haya desarrollado un proceso totalmente comercial y hasta ahora la biomasa slo se ha convertido en etanol en unas cuantas plantas piloto. Sin embargo, esto podra constituir los humildes albores de un enorme sector industrial nuevo que podra crecer e incluso superar la existente industria de etanol combustible de primera generacin. El trmino primera generacin describe la conversin de cosechas de azcar y cereales con alto contenido en almidn, p.ej. el maz, mientras que segunda generacin se refiere a la conversin de lignocelulosa, mejor conocida como biomasa, un sustrato muy abundante que existe en todo el mundo. Antes, el alto costo de las enzimas para convertir la lignocelulosa en azcar se consideraba uno de los principales obstculos a la comercializacin, pero los costos se han reducido. En el 2001, el Ministerio de Energa de EE.UU. concedi un contrato de investigacin de tres aos a Novozymes de un valor de 14.8 millones de dlares, con el fin de reducir diez veces el costo de las enzimas. En el 2004, al terminar esta investigacin financiada por el gobierno, el costo se haba reducido al nivel objetivo. El costo de las enzimas ya no es la barrera econmica dominante en la produccin de etanol a partir de biomasa comenta Joel Cherry, Director, Biotecnologa/Bioenerga, que dirigi el proyecto de investigacin en el centro de investigacin de Novozymes en Davis, California, donde el trabajo de investigacin contina bajo su direccin. l prev que se desarrollarn enzimas todava ms eficientes y que el proceso ser optimizado junto con colaboradores de Novozymes. La conversin de biomasa en etanol todava no es un proceso industrial comercial, pero es probable que se convierta en una oportunidad muy interesante para Novozymes en el futuro prev Emmanuel Petiot, Gerente de Desarrollo de Negocios Global de Novozymes para aplicaciones de biomasa. Estamos viendo el principio de una industria nueva. Creemos que tardar todava cuatro o cinco aos desarrollar y comercializar las enzimas para este campo nuevo. Aunque no haya empezado la venta comercial de las enzimas, la conversin de la biomasa en etanol ya est recibiendo la atencin plena de Novozymes que est intensificando significativamente los esfuerzos de I+D, comercializacin y otras reas. De hecho, la bsqueda de celulasas y hemicelulasas de alto desempeo representa una movilizacin global de los recursos de investigacin y pericia de Novozymes en este campo. Novozymes tambin participa activamente en conferencias clave sobre el tema y est solicitando ms financiacin estatal para acelerar el desarrollo a nivel global. La investigacin de biomasa se lleva a cabo en los laboratorios de Novozymes en todo el mundo, mientras que la comercializacin de la biomasa tiene su sede en Novozymes Norteamrica y est dirigida por Emmanuel Petiot. Novozymes tiene una larga historia de colaboraciones mutuamente beneficiosas. Las colaboraciones que Novozymes inicia son signos visibles de sus esfuerzos de investigacin. La implementacin y afinacin de los procesos enzimticos de Novozymes por medio de asociaciones con colaboradores industriales que llevan la tecnologa a la fase de ensayo en planta piloto, constituyen el enfoque actual de la I+D de la biomasa. En junio del 2006, p.ej. Novozymes firm un acuerdo de investigacin de tres aos con China Resources Alcohol Corporation (CRAC) sobre el desarrollo de biomasa para combustible biolgico en China. CRAC es un rea de negocio dentro de China National Cereals Oils & Foodstuffs Corporation (COFCO) que cuenta con tecnologas interesantes para la produccin de combustible biolgico. CRAC ha instalado una

planta piloto para la produccin de etanol a partir de hojas y troncos de maz en Zhaodong, provincia de Heilongjiang. A largo plazo, China espera convertirse en un importante mercado para el combustible biolgico. El consumo de combustible ha crecido considerablemente durante los aos recientes a medida que ha aumentado el nmero de vehculos del pas y esto ha llamado la atencin a la energa sustentable, especialmente el combustible biolgico. Se reconoce generalmente que la produccin de etanol de primera generacin, basada en cosechas alimentarias, no crecer mucho en China en los aos venideros, porque China importa en gran parte maz y otros cereales para uso alimentario. Contrariamente, China espera concentrarse en el desarrollo de cosechas no alimentarias como mandioca y sorgo dulce y en la produccin de etanol combustible de segunda generacin a partir de biomasa. En EE.UU.,, Novozymes acaba de firmar un contrato de colaboracin con Broin con el fin de tomar el prximo paso para comercializar etanol rentable producido a partir de hojas y troncos de maz. Esta colaboracin es una extensin de la estrecha colaboracin que ya existe entre las dos empresas. Es una oportunidad para que Novozymes pueda aprovechar su extraordinaria plataforma biotecnolgica y para que Broin pueda alcanzar una comercializacin rpida. stos son slo dos ejemplos de lo que se est haciendo para situar el etanol basado en biomasa en la arena comercial. La produccin de etanol a partir de biomasa puede dividirse en fases tal como se desprende del diagrama. Para que la comercializacin tenga xito, es necesario observar todas estas fases de una forma holstica porque estn unidas por una interaccin compleja. Las fibras lignocelulsicas se componen de tres fracciones principales: celulosa, hemicelulosa y lignina. Las enzimas atacan la cadena polimrica de azcar de las fracciones de celulosa y hemicelulosa, liberando azcares monomricos para la fermentacin. Se necesita un pretratamiento para abrir las fibras y hacer que el sustrato lignocelulsico sea accesible para la accin enzimtica. Evidentemente, las enzimas tienen que corresponder al sustrato. Si se utiliza un pretratamiento con cido diluido, se degrada la mayor parte de la hemicelulosa y no se necesita una hemicelulasa. Sin embargo, si se utiliza un pretratamiento alcalino o neutro, todava es necesario hidrolizar la hemicelulosa y se necesitan hemicelulasas. Para los investigadores o las empresas que desean ensayar enzimas en el laboratorio, el Biomass Kit de Novozymes contiene pequeas muestras de enzimas. En la fase de fermentacin se presenta otro reto ya que los azcares del 5-carbono (C5) producidos por la degradacin de la hemicelulosa, no son fermentados por la levadura utilizada actualmente. Los investigadores estn desarrollando organismos capaces de aprovechar eficientemente estos azcares para incrementar los rendimientos de etanol y, por consiguiente, aumentar todava ms la rentabilidad de todo el proceso. La recoleccin de materias primas es un desafo logstico. A menudo, las hojas y troncos de maz, que han constituido el enfoque de la mayor parte de la investigacin en EE.UU. y China, no se recolectan, sino que se dejan descomponer en los campos. Hay que establecer sistemas de recoleccin. Por eso, los ensayos con biomasa a menudo se basan en los que se llama materia interna, es decir residuos o subproductos existentes de las plantas de etanol de primera generacin. Las fibras de maz residuales del procesado de almidn de maz y bagazo del procesado de caa de azcar son ejemplos de materias primas lignocelulsicas

disponibles para la conversin. Tambin pueden utilizarse astillas y pedazos de madera. La biomasa representa una materia prima renovable para la produccin de combustible biolgico como una alternativa a la gasolina. Con los crecientes precios del petrleo y los fuertes incentivos estatales, la produccin de etanol a partir de biomasa es cada da ms viable. A medida que crece la conciencia sobre el calentamiento global, los combustibles biolgicos podran tener un futuro prometedor. Ya que tanto los factores polticos, econmicos y medioambientales favorecen los combustibles biolgicos, existe ahora una fuerte voluntad en ciertos pases para desarrollar la conversin de biomasa en etanol. Novozymes est involucrado en un esfuerzo de investigacin sin precedentes destinado a buscar las celulasas y hemicelulasas necesarias para que tenga xito la industria de etanol combustible de segunda generacin. FASES DEL PROCESO DE CONVERSIN Recoleccin y entrega de la materia prima

Preprocesado

Pretratamiento

Celulasas

Hidrlisis enzimtica de la celulosa

Microorganismo que utiliza hexosa y pentosa

Fermentacin de mezcla de azcares de la biomasa

Etanol u otro producto de fermentacin

JUSTIFICACIN: El cultivo de la Sbila en el estado de Yucatn se estableci inicialmente para suministrar la materia prima a Estados Unidos y despus se promovi el cultivo como respuesta a la crisis henequenera (Chel, 2005). Y su auge se dio por la capacidad del cultivo para adaptarse a las condiciones edafolgicas del suelo de Yucatn, sin embargo es importante la bsqueda de alternativas o estrategias que permitan la comercializacin rentable de este recurso natural. La carencia de industrias o de opciones de locales de comercializacin ha repercutido en el abandono de las plantaciones y en el quebranto de una importante alternativa productiva para la zona henequenera del estado. Aunado a todo esto el procesamiento de la sbila a estado circunscrito a la produccin de gel 1:1 cuya obtencin es sumamente sencilla y de baja inversin o como gel concentrado 1:20 y 1:40 y el gel liofilizado (1:200) sin embargo participar en el mercado de estas tres ultimas opciones requiere de una fuerte inversin, calculada en un milln de dlares en el ao 2002. Otra alternativa es la diversificacin de las opciones de industrializacin de las hojas de sbila, para ello es necesario ampliar la gama de productos susceptibles de ser obtenidos de las hojas de sbila, con la idea de encontrar alternativas de alta demanda y valor agregado atractivo. En este proyecto se plantea la posibilidad de obtener varios productos alternos al gel de sbila, usando los subproductos y desechos que se generan durante el proceso de obtencin del gel de sbila. Nuestro grupo pretende aportar nuevas opciones para la industrializacin de la sbila a travs del establecimiento de las bases para: La eventual utilizacin de los desechos slidos de la sbila, en la produccin de azcares fermentables y la conversin de los mismos en etanol para su uso como combustible. Finalmente poder establecer un proceso industrial en el que se logren productos homogneos y con ello garantizar una calidad homognea de los productos obtenidos. HIPTESIS: Dado que los desechos slidos de la sbila contienen polmeros estructurales cuyos monmeros son azucares y dado que es posible mediante un proceso de sacarificacin qumica o enzimtica producir azcares fermentables. Es de esperarse que estos puedan ser transformados a etanol mediante una fermentacin alcohlica OBJETIVO GENERAL: Establecer las condiciones para la produccin de etanol a partir de los desechos slidos de la sbila sacarificados OBJETIVOS ESPECFICOS: 1. Establecimiento de las condiciones para recuperar alona de los desechos slidos generados durante la recuperacin del gel de sbila.

2. Establecer las condiciones de sacarificacin qumica de los desechos slidos generados durante la recuperacin del gel de sbila. 3. Establecer las condiciones de fermentacin para la produccin de etanol carburante usando como fuente de carbono los desechos slidos de la sbila, sacarificados.

MATERIAL Y MTODOS: Materia prima: Para el desarrollo de este trabajo se utilizaron pencas de sbila Aloe barbadensis Miller obtenidas de plantas cultivadas bajo diferentes condiciones de densidad de poblacin en suelos mecanizados del campo experimental del Centro de Investigacin Regional del Sureste del INIFAP, ubicado en Uxmal, Yucatn. Y de la plantacin tradicional en suelo pedregoso del Sr. Evelio Salazar Seba ubicada en Umn, Yucatn. Obtencin de los desechos slidos: Este material fue procesado en el laboratorio de Tecnologa enzimtica y microbiana de la Divisin de Estudios de Posgrado e Investigacin, el procedimiento consisti en el lavado de las pencas con una posterior sanitizacin. Posteriormente se procedi a cortar el pice y la base. Se les retiraron las espinas y el envs. Se retir el gel y los residuos fueron picados en tiras de aproximadamente 2 cm de ancho. Secado de los residuos Slidos: Los residuos slidos picados fueron secados en un horno a 50C por 96 horas. Molienda de los residuos slidos secos Los residuos slidos ya secos fueron molidos en una licuadora industrial durante 30 segundos, 1 minuto y 5 minutos, cada muestra fue de 150 gr, todas por duplicado. Determinacin del perfil Granulomtrico Los residuos ya secos fueron tamizados con las siguientes mallas 10, 20, 30, 40, 50 y fraccin de finos. Hidrlisis qumica de los residuos: Los residuos secos y molidos se hidrolizaron mediante la adicin de H2SO4 al 10, 20 y 30%. En tubos de ensayo se colocaron 3 gr. de muestra por cada tiempo de molienda (30 segundos, 1minuto y 5 minutos) y una muestra control sin moler y se les adicion 15 ml de cido al 10%, se agita por completo; se hizo la misma metodologa para las concentraciones de cido al 20 y al 30%. Posteriormente los tubos con la muestra y el cido se metieron a la autoclave a 125C durante 15 min. Transcurrido ese tiempo, se dejaron enfriar los tubos y se les agreg 15ml de agua, se pas la mezcla a matraces y se les agreg 20ml ms de agua, llevando el volumen a 50ml. Posteriormente se tom una alcuota de estos matraces; stas alcuotas se centrifugaron a 1500g por 10min. Se recuper el sobrenadante y se le determin la concentracin de azcares reductores por el mtodo de DNS tomando .1ml como tamao de alcuota. Hidrlisis qumica, ajustando pH: Los residuos secos y molidos se hidrolizaron mediante la adicin de H2SO4 al 10, 20 y 30%. En tubos de ensayo se colocaron 3 gr. de muestra por cada tiempo de molienda (30 segundos, 1minuto y 5 minutos) y una muestra control sin moler y se les adicion 15 ml de cido al 10%, se agita por completo; se hizo la misma

metodologa para las concentraciones de cido al 20 y al 30%. Posteriormente los tubos con la muestra y el cido se metieron a la autoclave a 125C durante 15 min. Transcurrido ese tiempo, se dejaron enfriar los tubos y se les agreg NaOH 6N, para neutralizar las muestras hidrolizadas con 10% de cido se utilizaron 8ml de NaOH y se llev a 50 ml con agua, para las muestras con 20% de cido se utilizaron 16 ml de NaOH y finalmente para las muestras con 30% de cido se utilizaron 25 ml de NaOH y se llevaron a 50 ml de volumen con agua pasando las muestras a matraces. Posteriormente se tom una alcuota de estos matraces; stas alcuotas se centrifugaron a 1500g por 10min. Se recuper el sobrenadante y se le determin la concentracin de azcares reductores por el mtodo de DNS tomando .2ml como tamao de alcuota. Hidrlisis enzimtica de los residuos: Se llev a cabo la hidrlisis enzimtica de los residuos secos y molidos utilizando la enzima Pectinex AR. Se hizo un diseo factorial 33, tomando como variables: temperatura, concentracin de enzima y tiempos de molienda. El diseo factorial que se realiz fue el siguiente: Pectinex AR 35C 40C 45C 2.0 ml 4.0 ml 6.0 ml 2.0 ml 4.0 ml 6.0 ml 2.0 ml 4.0 ml 6.0 ml A B C A B C A B C A B C A B C A B C A B C A B C A B C En donde: En la primera lnea se indica la temperatura de trabajo En la segunda lnea los mililitros de enzima que se usaran. En la tercera lnea se maneja las muestras de desecho con diferentes tiempos de molienda, la nomenclatura usada es la siguiente: A= 30 segundos de molienda B= 1 minuto de molienda C= 5 minutos de molienda Se utiliz como control una muestra sin moler. Se colocaron 3 gramos de muestra y se le aadi 28, 26 y 24ml de agua segn fue el caso, se pusieron a preincubar a la temperatura de ensayo, una vez alcanzada la temperatura requerida se aadi la enzima alcanzando los 30ml de solucin y se dej reaccionar durante 30 minutos; transcurrido este tiempo, la reaccin se detuvo haciendo pasar los tubos a un recipiente conteniendo agua con hielo. El sistema se llev a 50ml en pequeos matraces aadiendo 20ml de agua, se tom una alcuota de esta mezcla y se centrifug a 1500g durante 10min. Se recuper el sobrenadante y se le determin la concentracin de azcares reductores por el mtodo de DNS tomando .1ml como tamao de alcuota.

Montaje de tcnica para determinacin de azucares reductores (DNS): Para la determinacin de azcares fermentables producto de la hidrlisis de los desechos slidos de la sbila, se seguir el mtodo reportado por Miller (1953). Para la elaboracin de una curva estndar de glucosa se seguir la siguiente metodologa

REACTIVOS 1) Solucin de glucosa en agua a concentraciones entre 0 y 1000 g /ml 2) Reactivo de DNS PROCEDIMIENTO Se preparan 10 tubos de ensayo como se indica en las columnas y se agregan 3.0 ml de reactivo DNS a cada tubo, se lleva a ebullicin en bao de mara por 5 minutos. Se deja enfriar el sistema a temperatura ambiente y se completa a 20 ml con agua destilada. Se lee la densidad ptica a 550 nm. La curva final resulta del promedio de mnimo 3 curvas. 1g 1 x 106 g 1 x 10-3 g 1000 g

Tubo 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Glucosa g /ml 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000

Solucin stock (ml) 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0

Agua (ml) 1.5 1.4 1.3 1.2 1.1 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5

PREPARACIN DE LA SOLUCIN STOCK DE GLUCOSA1 x 10-3 g 1 ml g a pesar volumen a preparar

Determinacin de la protena extracelular Para la determinacin de azcares de la produccin de protena extracelular en los sistemas de fermentacin se seguir el mtodo reportado por Lowry(1953). Para la elaboracin de una curva estndar de Albmina srica bovina se seguir la siguiente metodologa. CURVA ESTNDAR DE ALBUMINA SERICA BOVINA O CASEINA

REACTIVOS 1. Solucin de ASB de 500 g/ml. 2. Reactivos de Lowry: Reactivo A: Sulfato de Cu pentahidratado al 1% en agua. Reactivo B: Tartrato de Na y K al 2%. Reactivo C: Carbonato de Na al 2% en NaOH 0.1M. Reactivo D: 1 vol de A + 1 vol B. Reactivo E: 1 vol de D + 50 vol de C. Reactivo de Folin-Ciocalteu diluido 1:1 con agua.

Tub o0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Protena g/ml 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500

Solucin stock (ml) 0.0 0.0* 0.1 0.3 0.2 0.6 0.3 0.9 0.4 1.2 0.5 1.5 0.6 1.8 0.7 2.1 0.8 2.4 0.9 2.7 1.0 3.0

Agua (ml) 1.0 3.0 0.9 2.7 0.8 2.4 0.7 2.1 0.6 1.8 0.5 1.5 0.4 1.2 0.3 0.9 0.2 0.6 0.1 0.3 0.0 0.0

PROCEDIMIENTO A cada tubo preparado se aaden 5 ml de reactivo E y se agita. Se deja reposar durante 10 minutos, se agregan 0.5 ml de reactivo Folin 1:1 en agua y se agita. Se deja reposar durante 30 minutos y se lee la absorbancia a 590 nm. La curva final resulta del promedio de mnimo tres curvas. * Volmenes utilizados para la curva estndar a 280 nm.

PREPARACIN DE LA SOLUCIN STOCK DE ASB Y CASENA1g 1 x 106 g 5 x 10-4 g 500 gResultados

5 x 10-4 g 1 ml g a pesar volumen a preparar

Curvas Estndar de Glucosa En la siguiente tabla y grafica se representan los resultados de cada una de las curvas de los datos obtenidos de la lectura de la densidad ptica promedio de la solucin de Glucosa.

Glucosa 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000

D.O. 1 0,0145 0,0755 0,1425 0,214 0,2845 0,3475 0,4125 0,483 0,539 0,6165

D.O. 2 0,0175 0,079 0,144 0,206 0,274 0,34 0,415 0,4675 0,5345 0,5985

D.O. 3 0,0065 0,047 0,108 0,171 0,2355 0,3 0,364 0,4275 0,485 0,5565

D.O 4 0,027 0,092 0,1665 0,2345 0,3155 0,3635 0,44 0,527 0,559 0,67

D.O 5 0,0245 0,104 0,1735 0,249 0,3165 0,3915 0,4625 0,535 0,616 0,6925

D.O 6 0,034 0,108 0,182 0,256 0,327 0,3965 0,472 0,539 0,6215 0,7065

Curvas Estandar de Glucosa0,8 CURVA 0,7 Densidad Optica 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 200 400 600 Glucosa 800 1000 1200 D.O. 1 D.O. 2 D.O. 3 D.O 4 D.O 5 D.O 6

ESTNDAR DE ALBUMINA SERICA BOVINA O

CASEINA

Grfica 1) Curva Estndar de Glucosa

Curva Estndar De Casena En la siguiente tabla y grafica se representan los resultados de cada una de las curvas de los datos obtenidos de la lectura de la densidad ptica promedio de la solucin de casena.

Casena 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500

D.O. 1 0,060 0,108 0,166 0,186 0,226 0,273 0,319 0,357 0,411 0,463

D.O. 2 0,0675 0,134 0,204 0,271 0,3445 0,413 0,494 0,549 0,63 0,702

D.O. 3 0,047 0,102 0,137 0,183 0,231 0,273 0,3335 0,36 0,404 0,4525

D.O. 4 0,044 0,09 0,1375 0,1885 0,2345 0,272 0,3175 0,364 0,411 0,4655

D.O. 5 0,0595 0,1325 0,1705 0,215 0,2535 0,306 0,3605 0,397 0,4385 0,476

D.O. 6 0,0675 0,112 0,1585 0,2095 0,2505 0,313 0,354 0,39 0,435 0,47

Curvas Estandar de Casena0,800 0,700 Densidad Optica 0,600 0,500 0,400 0,300 0,200 0,100 0,000 0 100 200 300 Casena 400 500 600 D.O. 1 D.O. 2 D.O. 3 D.O. 4 D.O. 5 D.O. 6

Grfica 2) Curva Estndar de CasenaContenido de humedad de los residuos slidos. Hasta el momento se han procesado 15.8 kg de residuos slidos de la sbila integrados por el as, el envs, 5 cm del pice y las espinas de la penca. Este material tiene un 89.58 % de humedad y un 10.41% de slidos. Por lo que contamos con un lote de 1.57 kg de material que ser usado para el desarrollo de este proyecto. Perfil Granulomtrico. En la figura 2, se muestra el efecto del tiempo de molienda sobre el perfil granulomtrico de las muestras, y como puede observarse conforme se incrementa el tiempo de molienda la fraccin de slidos finos se va incrementando, esto puede ser importante para facilitar el proceso de hidrlisis tanto qumica como enzimtica

o en su caso para definir que perfil granulomtrico es el ms adecuado para realizar las fermentaciones en estado slido.

Perfil Granulomtrico70 60 50 40 30 20 10 0 10 20 30 40 50 Finos Prom

Malla

Perfil Granulomtrico70 60 50 40 30 20 10 0 10 20 30 40 50 Finos Prom

Malla

Perfil Granulomtrico70 60 50 40 30 20 10 0 10 20 30 40 50 Finos Prom

Malla

Figura 2) Efecto del tiempo de molienda sobre el perfil granulomtrico de las muestrasMetodologas para la Recuperacin de Alona. Para seleccionar la tcnica que se usara para la recuperacin de la alona se realizo un anlisis de la marchas reportadas con este fin, y se selecciono la ms sencilla de realizar, Opcin 1

Opcion 1

Extracto de aloe

Disolver en agua

Filtrar

Acidificar el filtrado con Ac. Sulfrico para precipitar resinas

Filtrar

Resina

Neutralizar el filtrado con hidrxido de amonio

Precipitar la alona cruda en etanol al 50%

El estndar se disuelve en etanol al 50%

TLC, HPLC

Filtrar 0.45

Referencia: Elamthuruthy, A.T.; Shah, C.R.; Khan, T.A.; Tatke, P.A.; Gabhe, S.Y.; Standardization of marketed Kumariasava-an Ayurvedic Aloe vera product; Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis; 2005; 37, 937-941

Opcin 2

Alcuota de 0.5 g de acbar Etanol (10 ml)

Sonicar por 1h a 50C

Centrifugar suspensin obtenida a 3000g por 10 min

Estndar disolver en etanol

Sobrenadante se usa para HPLC

Filtrar en membrana de 0.45 m antes de inyectarCondiciones HPLC Columna: NOVA-PAK C 18 4m (150 x 3.9 mm Di) Fase Mvil: Metanol 25-30% (gradiente lineal, 5 min) Metanol 30-35% (gradiente lineal, 10 min) Metanol 35-70% (gradiente lineal, 35 min) Metanol 70% (isocrtico, 10 min) Velocidad de flujo: 0,7 ml/min Temperatura: ambiente Longitud de onda: 293 nm

Referencia: Park, M.K., Park, J.H., Na Young Kim, Yong Geun Shin, Yong Seok Choi, Jin Gyun Lee, Kyeong Ho Kim; Seung Ki Lee; Analysis of 13 phenolic compound in Aloe species by high performance liquid chromatography; Phytochemical Analysis; 1998; 9, 186-191

Opcin 3

Preparacin de la muestra (HPLC) Alcuotas de 300 mg de muestra en polvo Disolver en 100 ml de metanolagua (1:1) en agitacin por 15 min

Filtrar una alcuota de solucin en filtro de acetato de celulosa Muestras Estndar Aloinosidos A y B se obtienen de la planta por medio de TLC Precisin Soluciones de 100 mg de aloina A/B en 100 ml de matnol-agua (1:1)

TLC; sistema solvente: acetato de etilo-metanol-agua (100:17:13)

Cromatografa (5 veces)

Referencia: Rauwald, Hans W.; Beil, Anette; High-performance liquid chromatographic separation and determination of diastereomeric anthrone-Cglucosyls in Cape aloes; Journal of Chromatography, 1993; 639, 359-362

Opcin 4

Preparacin de muestra (HPLC) Muestra Aloe 50 mg

Preparacin de muestra (GC) Pesar 5 g de aloe en polvo en un frasco de 100 ml

Disolver en etanol al 40% Sonicar por 10 min

Sellar con septum de aluminio-caucho Aadir 0.02 l de propionato de etilo

Filtrar en membrana 0.22 m PTFE Calentar a 105 C por 30 min

Realizar headspace por 150 s con helio a una razn de 8 ml/min

Referencia: Sacc, Debora; Bogoni, Paolo; Procida, Giuseppe; Aloe Exudate: Characterization by Reversed Phase HPLC and Headspace GC-MS; J. Agric. Food Chem. 2001, 49, 4526-4530

Opcin 5

Mtodo de extraccin

Liquidos diluciones 1:10 y 1:100 Gel diluciones 1:10 y 1:100 Solidos 0.2 g con 2 ml de metanol Por sonicacin 1 ml de solucin

Remover

Evaporar

Residuo disolver en 1 ml de aguaPreparacin de la muestra

1 ml de la muestra 1:10 La capa de encima remover y mezcla con el 1er. extracto

Adicionar 1 g de crisofanol como estndar inicial Mas 0.5 ml de alcohol reactivo mas 1 ml de NaCl saturado

La mezcla extraida mas 3 ml etilacetato/metanol (9:1)

Los extractos combinados fueron evaporados y secados

La capa se traslada a un tubo de ensayo

El residuos disolver en un volumen peq. De metanol

Transferir a un GCLa capa liquida extraida con 1 ml de etilacetato/metano

(9:1)

El metanol fue evaporado

Referencia: ElSohly, Mahmoud A; Gul, Waseem; Murphy, Timothy P.; Analysis of the anthraquinones aloe-emodin and aloin by gas chromatography/mass spectrometry; International Immunopharmacology; 2004; 4, 1739-1744

Hidrlisis Qumica. En la grfica 3, se muestra el efecto que tiene la hidrlisis qumica sobre la produccin de azcares reductores a partir de los residuos de sbila, como se observa, las condiciones a las que se obtienen una mayor concentracin de azcares reductores es cuando se utilizan concentraciones bajas de cido, en este caso al 10% y usando las muestras control (sin moler) y las que fueron molidas durante 5 min. (Los datos de la grfica estn contenidos en el anexo 2)Efecto de las condiciones de hidrlisis qumica sobre la produccin de azcares reductores (Glucosa) a partir de los residuos slidos de sbilaConcentracin de Glucosa g/ml 180000 160000 140000 120000 100000 80000 60000 40000 20000 0 10% 20% Sin moler 30% 10% 20% 5 min 30% 10% 20% 1 min 30% 10% 20% 30 seg 30% Concentracin H2SO4 Tiempo de molienda

Condicin de sacarificacin

Grfica 3) Efecto de la hidrlisis qumica sobre la determinacin de azcares reductores.

En la grfica 4, se puede observar el efecto del pH sobre la determinacin de los azcares reductores, se observa una disminucin en la cuantificacin de estos con altas concentraciones de cido (20 y 30%), esto es debido a que el sistema para la determinacin de azcares reductores por el mtodo de DNS es bsico y al momento de llevarse a cabo la reaccin el sistema se acidifica y se forma sulfato de sodio, lo cual altera la determinacin de azcares.

Efecto del pH sobre la determinacin de azcares reductores por el mtodo de DNS180000 Concentracin de Glucosa g/ml 160000 140000 120000 100000 80000 60000 40000 20000 0 10% 20% .1 ml 30% 10% 20% .5 ml Condicin de sacarificacin 30% 10% 20% 1 ml 30% 14 12 10 8 pH 6 4 2 0 Glucosa pH

Grfica 4) Efecto del pH sobre la determinacin de azcares reductores de la hidrlisis qumica

Hidrlisis Qumica. (Ajuste de pH posterior a la hidrlisis) Se llev a cabo la hidrlisis qumica con H 2 SO 4 con las mismas concentraciones que en el experimento anterior, esta vez ajustando el pH con NaOH, para evaluar el efecto del pH sobre la determinacin de azcares reductores. El ajuste de pH se realiz con el propsito de que el sistema de determinacin de azcares reductores por el mtodo de DNS no se acidificara. Se esperaba que se obtuvieran mayores concentraciones de azcares reductores al ajustar el pH de las muestras antes de hacer la determinacin, como se puede observar esto no fue as, las concentraciones fueron menores que en la hidrlisis donde no se ajusto el pH, pero se encontr que en la mayora de las muestras que se haban hidrolizado con 20% de cido un aumento en la concentracin de glucosa. En el caso de las muestras hidrolizadas con 30% de cido la concentracin sigue siendo baja, esto podra ser debido a que con esa concentracin de cido las muestras se carbonizan lo que hace que la determinacin de azcares se vea alterada.

Efecto de las condiciones de hidrlisis qumica (ajustando pH) sobre la produccin de azcares reductores a partir de los residuos slidos de sbila Concentracin de Glucosa g/ml 120000 100000 80000 60000 40000 20000 0 10% 20% 30% 10% 20% 30% 10% 20% 30% 10% 20% 30% Sin moler 5 min 1 min 30 segConcentracin H2SO4 Tiempo de molienda

Glucosa

Condicin de sacarificacinGrfica 5) Efecto de la hidrlisis qumica sobre la determinacin de azcares reductores, ajustando pH

Hidrlisis Enzimtica. A continuacin se presentan los resultados del diseo factorial de la sacarificacin enzimtica. En la grficas 6, 7 y 8 se puede observar la concentracin de azcares reductores contra la concentracin de enzima y el tiempo de molienda de la muestra, se nota un aumento en la produccin de azcares cuando se incrementa la concentracin de enzima y cuando se tienen las muestras ms molidas.Efecto de la hidrlisis enzimtica sobre la determinacin de azucares reductores a partir de los residuos de sbila Concentracin de Glucosa g/ml 120000 100000 80000 60000 40000 20000 0 1 ml 2 ml Sin moler 3 ml 1 ml 2 ml 30 seg 3 ml 1 ml 2 ml 1 min 3 ml 1 ml 2 ml 5 min 3 ml

Condicin de hidrlisis

Grfica 6) Hidrlisis Enzimtica a 35CEfecto de la hidrolisis enzimatica sobre la determinacion de azucares reductores a partir de los residuos de sabila Concentracion de Glucosa mg/ml 140000 120000 100000 80000 60000 40000 20000 0 1 ml 2 ml Sin moler 3 ml 1 ml 2 ml 30 seg 3 ml 1 ml 2 ml 1 min 3 ml 1 ml 2 ml 5 min 3 ml

Condicion de sacarifiacion

Grfica 7) Hidrlisis Enzimtica a 40C

Efecto de la hidrlisis enzimtica sobre la determinacin de azcares reductores a partir de los residuos slidos de sbila Concentracion de glucosa mg/ml140000 120000 100000 80000 60000 40000 20000 0 Sin moler 30 seg 1 min 5 min 1 ml 2 ml 3 ml 1 ml 2 ml 3 ml 1 ml 2 ml 3 ml 1 ml 2 ml 3 ml de enzimaTiempo de molienda Concentracin

Glucosa

Condicion de sacarificacionGrfica 8) Hidrlisis Enzimtica a 45C Se observ tambin que la mayor produccin de azcares se obtuvo cuando la temperatura a la cual se llev la reaccin fue de 40C, mientras que en 35 y 45 disminuye la concentracin, debido que la mayor actividad de la enzima se da aproximadamente a 40C.

Anexos

Anexo I Datos del Perfil granulomtrico de las muestras de la cutcula de sbila molidas durante diferentes intervalos de tiempo.

Para 30 segundos Malla 10 20 30 40 50 Finos Fraccin 1 43.7 67.15 17.5 6.2 3.1 10.7 Fraccin 2 26 70 21.4 7.5 4.9 13.4 Prom 34.85 68.575 19.45 6.85 4 12.05

Para 1 minuto Malla 10 20 30 40 50 Finos Fraccin 1 15.9 64.4 26.7 10.55 6.8 25.2 Fraccin 2 12.1 69.8 26.7 10.8 6.1 21.8 Prom 14 67.1 26.7 10.675 6.45 23.5

Para 5 minuto Malla 10 20 30 40 50 Finos Fraccin 1 0.3 16.2 33.5 23.8 13.1 58.2 Fraccin 2 0 6.5 24.4 29.4 15.2 72.1 Prom 0.15 11.35 28.95 26.6 14.15 65.15

Anexo 2 Datos obtenidos de la hidrlisis qumica, con diferentes tiempos de molienda y concentracin de cido.

Muestra Sin moler 10% 20% 30% 10% 20% 30% 10% 20% 30% 10% 20% 30%

5 min

1 min

30 seg

Glucosa Promedio g/ml 158732,14 65785,71 6803,57 149678,57 65678,57 1125,00 133071,43 55821,43 1982,14 129321,43 69857,14 589,29

Efecto del pH en la determinacin de azcares reductores de la hidrlisis qumica, utilizando alcuotas de .1, .5 y 1ml de hidrolizado de la muestra molida por 5 minutos.

.1 ml

.5 ml

1 ml

Concentracin H2SO4 10% 20% 30% 10% 20% 30% 10% 20% 30%

pH promedio 11,53 11,01 10,07 7,61 4,83 4,75 4,76 4,38 3,47

Anexo 3 Datos obtenidos de la hidrlisis qumica, con diferentes tiempos de molienda y concentracin de cido y ajustando el pH posterior hidrlisis.

Muestra Sin moler 10% 20% 30% 10% 20% 30% 10% 20% 30% 10% 20% 30%

5 min

1 min

30 seg

Glucosa Prom 46741,07 86049,11 18750,00 113370,54 99843,75 48013,39 57924,11 88459,82 20424,11 39508,93 73727,68 28392,86

Anexo 4 Datos del diseo factorial para la hidrlisis enzimtica Hidrlisis enzimtica realizada a 35C Glucosa Promedio Muestra g/ml 1 ml 38303,57 Sin moler 2 ml 34928,57 3 ml 44732,14 1 ml 28714,29 30 seg 2 ml 39750,00 3 ml 44785,71 1 ml 62357,14 1 min 2 ml 85125,00 3 ml 99428,57 1 ml 74410,71 5 min 2 ml 84321,43 3 ml 111428,57 Hidrlisis enzimtica realizada a 40C Glucosa Promedio Muestra g/ml 1 ml 29732,14 Sin moler 2 ml 23410,71 3 ml 44142,86 1 ml 38196,43 30 seg 2 ml 43017,86 3 ml 56732,14 1 ml 85178,57 1 min 2 ml 92946,43 3 ml 129589,29 1 ml 99750,00 5 min 2 ml 105053,57 3 ml 125732,14 Hidrlisis enzimtica realizada a 45C Glucosa Promedio Muestra g/ml 1 ml 32410,71 Sin moler 2 ml 40875,00 3 ml 24321,43 1 ml 45482,14 30 seg 2 ml 54267,86 3 ml 58339,29 1 ml 87910,71 1 min 2 ml 103767,86 3 ml 115500,00 1 ml 102000,00 5 min 2 ml 109285,71 3 ml 107785,71

CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES Mes Actividad 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Revisin bibliogrfica x x x x x x x x x x x x 1. Establecimiento de las condiciones para recuperar alona de los desechos slidos generados durante la recuperacin del gel de sbila. 1.1 Efecto del tamao de partcula en el rendimiento de alona. x x x 1.2 Efecto de la concentracin y tipo de reactivo usado para la extraccin de la Alona. x x x 1.3 Efecto de la temperatura sobre la velocidad extraccin de la alona. x x x 2. Establecer las condiciones de sacarificacin qumica de los desechos slidos generados durante la recuperacin del gel de sbila. 2.1 Efecto del tamao de partcula en el velocidad de sacarificacin x x x 2.2 Efecto de la concentracin y tipo de reactivo usado para la sacarificacin x x x 2.3 Efecto de la temperatura sobre la velocidad de sacarificacin x x x 3. Establecer las condiciones de fermentacin para la produccin de etanol carburante usando como fuente de carbono los desechos slidos de la sbila, sacarificados. 3.1 Efecto de la concentracin de azcares reductores sobre le velocidad de produccin y x x x el rendimiento de etanol. 3.2 Efecto del pH sobre la velocidad de produccin y rendimiento de etanol. x x x 3.3 Efecto de la temperatura sobre la velocidad de produccin y rendimiento de etanol. x x x Anlisis discusin de datos x x x x x x x x x Redaccin del documento de tesis x x x

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