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Tlamati Sabiduría, Volumen 7 Número Especial 2 (2016)

4° Encuentro de Jóvenes Investigadores – CONACYT 11° Coloquio de Jóvenes Talentos en la Investigación

Acapulco, Guerrero 21, 22 y 23 de septiembre 2016

Memorias

Efecto de las nanopartículas LDHs en indicadores de estrés oxidativo en

homogenizados y mitocondrias de Chiton articulatus (Mollusca:

Polyplacophora)

Aritzel Aramara Morfin-Jiménez, -Moisés

Facultad de Ecología Marina de la UAGro

Programa A.M.C. [email protected] Área: II Biología y Química

Dr. Fermín Paul Pacheco Moises (Asesor-investigador)

Profesor-investigador del Centro Universitario de Ciencias Exactas e Ingenierías de la

Universidad de Guadalajara

[email protected]

Resumen

Las características físico-químicas de los materiales nanoestructurados han generado un

gran interés científico y tecnológico en varias áreas potenciales de aplicación tales como la

catálisis, óptica, medicina, etc. Dentro de este grupo de materiales se encuentran los hidróxidos

dobles laminares que son hidróxidos sintéticos o naturales con al menos dos tipos de cationes

metálicos en las láminas principales y que en el dominio interlaminar contienen especies

aniónicas. Dado que se tiene planteado el uso de los LDHs como sistemas de transporte y

liberación de fármacos el objetivo de este trabajo fue determinar si los LDHs que contienen zinc

y aluminio, y LDHs de zinc y aluminio modificados con gadolinio y disprosio, respectivamente,

inducen un estrés oxidativo en homogenizados y mitocondrias de Chiton articulatus. Los

resultados obtenidos muestran que los LDHs tienen un efecto particular en los indicadores de

estrés oxidativo que se cuantificaron. Por ejemplo, las partículas que sólo contenían zinc y

aluminio no modificaron significativamente los niveles de lipoperóxidos en las muestras de

machos y hembras en comparación con muestras de tejido control no tratado con LDHs. En tanto

mailto:[email protected]

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que los niveles de nitritos y nitratos aumentaron significativamente en machos y hembras. Los

niveles de carbonilos en las muestras mostraron un comportamiento diferente en machos y

hembras, esto es, los carbonilos aumentaron en las muestras de hembras y disminuyeron en los

machos. En tanto que la fluidez de la membrana disminuyo en las muestras de hembras y no se

modificó en las muestras de los machos. Las partículas de zinc y aluminio y las que contienen

gadolinio y disprosio en mitocondrias de machos y hembras tienen un efecto antioxidante y pro-

oxidante, respectivamente. Las partículas de gadolinio y disprosio, en general tuvieron poco

efecto y el efecto más importante fue el de incrementar la oxidación de las proteínas.

Palabras Clave: Chiton articulatus, Hidróxidos dobles lamelares, estrés oxidativo.

Introducción

Chiton articulatus (Sowerby en Broderip y Sowerby, 1832) (Mollusca Polyplacophora)

habita en la zona intermareal, expuesto al oleaje, su distribución se encuentra en toda la costa

rocosa del Pacifico mexicano. Su reproducción es dioica, presenta ocho valvas articuladas

rodeadas por una banda de tejido muscular llamada cinturón, estas valvas, así como un gran pie

muscular les permite protegen sus partes blandas y acoplarse perfectamente a superficies

irregulares, son de es hábitos nocturnos, esperan la noche para poder moverse sobre las rocas y

alimentarse. La especie presenta una gran importancia en el ecosistema marino, ya que presenta

un hábito alimenticio variado. Han mencionado que el C. articulatus es una especie dominante

y/o muy frecuente en la zona intermareal, por su abundancia y el conocimiento de su biología

básica, hace suponer que es una especie centinela para evaluar la contaminación oxidativa

(Santelices & Correa 1985). Este organismo es utilizado para consumo humano siendo un recurso

de importancia pesquera (García-Ibáñez et al. 2013).

El estrés oxidativo es el daño a nivel celular, tisular u orgánico producido por especies

reactivas de oxígeno, las que son liberadas al medio interno como resultado de la exposición a

contaminantes, la ingestión a través de la dieta, la radiación UV o de los procesos metabólicos

que implican oxígeno.

Las partículas a nanoescala son denominadas nanopartículas (NPs). Las NPs pueden

formarse mediante procesos naturales. Debido a la masiva producción de productos

nanotecnológicos, empieza a existir una clara preocupación por los posibles efectos perjudiciales

que pueden ocasionar las NPs sobre la salud y el medioambiente (Frejo et al., 2011).

Tlamati Sabiduría Volumen 7 Número Especial 2 (2016)

Los materiales nanoestructurados tienen la característica de que al menos una de sus

dimensiones es de escala nanométrica y sus características físico-químicas han generado un gran

interés científico y tecnológico en varias áreas potenciales de aplicación tales como la conversión

de energía, electrónica, catálisis, óptica, medicina, etc. El término hidróxidos dobles laminares

(LDHs del inglés layered double hydroxides) se utiliza para designar hidróxidos sintéticos o

naturales con al menos dos tipos de cationes metálicos en las láminas principales y que en el

dominio interlaminar contienen especies aniónicas. Los hidróxidos dobles laminares pueden ser

definidos por su espacio interlaminar, composición química y secuencia de apilamiento. La

estructura de los LDHs permite modificar un gran número de variables, tales como la naturaleza

y relación molar entre cationes, tipo de aniones de la interlámina, cantidad de agua interláminar,

morfología y tamaño de los cristales.

Dado que se tiene planteado el uso de los LDHs como sistemas de transporte y liberación

de fármacos surgió el interés en investigar si dichos LDHs inducen un estrés oxidativo en un

modelo in vitro, tal como lo es el uso de homogenizados y las mitocondrias de C. articulatus. A

la fecha no existe conocimiento acerca del efecto que pudieran tener dichos LDHs en los sistemas

antioxidantes de C. articulatus, ni su relación con el sexo u otra condición, por lo que el estudio

aporta los primeros antecedentes acerca de estos.

Materiales y Métodos

Se seleccionó un sitio ubicado en el intermareal rocoso en el municipio de Acapulco de

Juárez, Guerrero: el cual se le conoce como “Playa escondida” (16°49’47.61” N –

99°53’23.07”O), considerada como posible área contaminada Los ejemplares de Chiton

articulatus fueron recolectados manualmente en el intermareal durante marea baja, en el mes de

junio del 2016. Posteriormente se depositaron una hielera, con una pequeña cantidad de agua de

mar para trasladarlo al Laboratorio de neurociencias en el Centro de Investigación Biomédica de

Occidente (CIBO) en Guadalajara, Jalisco.

Para determinar diferencias entre sexos en la inducción del estrés oxidativo se determinó

el sexo de los organismos mediante el color de la gónada de acuerdo a Rojas (1988), las gónadas

del macho presentan una coloración naranja o rosa salmón, mientras que en las hembras una

coloración verdosa.



Se separó el pie muscular de los organismos seleccionados y se coloco en vasos de

precipitado de 50 mL, separando hembras de machos. Enseguida el tejido se fragmento y se

homogenizo con ayuda de un homogenizador Potter-Elvehjem en un amortiguador (50 mM

fosfato y 250 mMm de sacarosa a un pH de 7.4). A partir del homogenizado se obtuvieron las

mitocondrias mediante centrifugación diferencial.

En el laboratorio de química del Dr. Gregorio Carbajal Arizaga del Centro Universitario

de Ciencias Exactas e Ingenierías de la Universidad de Guadalajara sintetizaron tres tipos de

LDHs: los cuales contienen zinc y aluminio, y LDHs de zinc y aluminio modificados con

gadolinio y disprosio, respectivamente.

Tanto el homogenizado como las mitocondrias se incubaron con concentraciones

crecientes (0, 20 µg, 100 µg y 200 µg) de las partículas de los LDHs durante 1 hora a 4 °C.

Enseguida de la incubación, se evaluaron los indicadores de estrés oxidativo.

La determinación de lipoperoxidación se efectúo usando 1 mg de proteína de las muestras

y las concentraciones indicadas de los LDHs. Los lipoperóxidos (malondialdehído + 4-

hidroxialquenos se cuantificaron con un método espectrofotométrico que se basa en la reacción

del cromógeno N-metil-2-fenilindol con el malondialdehído y 4-hidroxialquenos a 45 °C. En este

método una molécula de malondialdehído o 4-hidroxialquenos reacciona con dos moléculas del

N-metil-2-fenilindol para producir un cromóforo estable con una absorbancia máxima a 586 nm.

Los nitritos y nitratos fueron determinados usando la reacción colorimétrica de Griess. La

reducción de nitritos a nitratos se efectúo con 100 µl de VCL3 al 0.8 % (p/v) en H3PO41 M. La

absorbancia de las muestras se leyó a 540 nm. La curva estándar se efectúo con concentraciones

conocidas de nitrato.

Los grupos carbonilo se cuantificaron utilizando la reacción con 2,4-dinitrofenilhidrazina

(DNPH) descrito por (Levine et al. 1976). Se utilizaron 50 µl tanto como del homogenizado y de

las mitocondrias a los cuales se les añadió 500 µl de hidracina. Enseguida las muestras se

incubaron durante una hora a temperatura ambiente, posteriormente se les añadió 500 µl de ácido

tricloroacético y la mezcla se centrifugo a 11000 ×g durante 3 minutos. El precipitado obtenido

se lavó tres veces con etanol-etil acetato (1:1). Los sedimentos finales después del tercer lavado

se resuspendieron en 0.6 ml de guanidina y se incubaron a 37 ° C durante 15 min. Después la

absorbancia se midió espectrofotométricamente a 370 nm.


La fluidez de la membrana se estimo mediante el cociente de fluorescencias de excimero a

monómero del diperenilpropano incorporado en las membranas (Ie/Im) de acuerdo como se

publicado (Ortiz et al., 2008).

Resultados

En la tabla 1 se muestran los valores de los lipoperóxidos en muestras de homogenizados

de tejido muscular de hembras y machos de C. articulatus. Se observó que los mayores niveles de

lipoperóxidos se encuentran en machos, con los LDHs que contienen zinc y aluminio y en las de

aluminio modificado con disprosio en concentraciones de 200 y 20 mg respectivamente. Mientras

que las hembras muestran los valores más bajos en LDHs de zinc y aluminio en dosis de 20 mg.

Tabla 1. Valores de lipoperóxidos en homogenizados en hembras y machos de Chiton articulatus

tratados con diferentes dosis de LDHs que contienen zinc y aluminio (C) y LDHs de zinc y

aluminio modificados con gadolinio (G) y disprosio (D).

C, homogenizado control sin LDHs. 1, 20 g de LDHs, 2, 100 g de LDHs, 3, 200 g de

LDHs. n.d., no determinado

Los valores de nitritos y nitratos de los homogenizados de tejido muscular de hembras de

C. articulatus. tratados con los LDHs mostraron un aumento en relación a los homogenizados del

grupo control, en las muestras tratadas con las partículas que contienen zinc y aluminio a dosis de

100 y 200 mg. En tanto como con los LDHs de gadolinio se observa una tendencia a aumentar

dichos niveles (figura 1).

Hembras (M) Machos

Control 0.01 ± 0.08 0.08 ± 0.05

C1 0.03 ± 0.01 0.07 ± 0.06

C2 0.05 ± 0.01 0.08 ± 0.03

C3 0.04 ± 0.001 0.22 ± 0.05

G1 0.05 ± 0.001 0.04 ± 0.01

G2 0.04 ± 0.004 0.18 ± 0.15

G3 0.06 ± 0.01 0.06 ± 0.03

D1 n.d 0.46 ± 0.35

D2 n.d 0.04 ± 0.01

D3 n.d 0.038 ± 0.004



Figura 1. Niveles de nitritos-nitratos en homegenizado de tejido muscular de hembras de C.

articulatus tratadas con nanoparticulas LDHs de zinc y aluminio (A) y gadolinio (B).

En mitocondrias de hembras se observó un aumento de los valores de nitritos y nitratos en

las muestras tratadas con LDHs de gadolinio y disprosio a la concentración más alta de

partículas. En tanto que las partículas de LDHs que solo contienen zinc y aluminio inducen una

disminución de los nitritos y nitratos (figura 2)


Figura 2. Niveles de nitritos-nitratos en mitocondrias de tejido muscular de hembras de C.

articulatus tratadas con nanoparticulas LDHs de zinc y aluminio (A), disprosio (B) y gadolinio

(C).

Los niveles de nitritos y nitratos en muestras de homogenizado de machos aumentaron

con los tratamientos de LDHs que contienen zinc y aluminio, como en los que contienen y

gadolinio, a las dosis más altas. Las partículas que contienen disprosio indujeron un aumento

importante de los nitritos-nitratos a la dosis de 100 g (figura 3). Por otro lado los niveles de

nitritos y nitratos en las mitocondrias de machos se observó que en las muestras tratadas con

LDHs que contienen zinc y aluminio entre más aumenta las dosis mayores son los niveles de

nitritos y nitratos caso contrario de los LDHs que contienen gadolinio ya que entre mayor es la

dosis menores son sus niveles de nitritos (figura 4).



Figura 3. Niveles de nitritos-nitratos en homegenizado de tejido muscular de machos de C.


(C).


Figura 4. Niveles de nitritos-nitratos en mitocondrias de tejido muscular de machos de C.


(C).

En relación con los niveles de carbonilos en el homogenizado de hembras tratados con las

partículas, se observó que los LDHs que contienen zinc y aluminio inducen un aumento en dichos

niveles a la dosis de 200 g, mientras que para los tratados con LDHs con gadolinio hubo una

disminución de los carbonilos en comparación con el grupo control no tratado con LDHs (figura

5). En los homogenizado de machos se observó un aumento de los niveles de carbonilos en

proteínas con una dosis de 20 g de partículas de zinc y aluminio. Además de que a dosis más

altas hay una disminución de dichos valores en comparación al grupo control. Las partículas de

disprosio y gadolinio a las dosis de 20 y 100 g disminuyen los niveles de carbonilos y a la dosis

de 200 mg aumentan los carbonilos (figura 6).

Se observó que la fluidez membranal en homogenizados de tejido muscular de hembras

disminuye a la dosis de 200 mg de LDHs que contienen zinc y aluminio, mientras que en las que

contienen gadolinio no se modificó significativamente la fluidez membranal (figura 7).



Figura 5. Niveles en carbonilos en el homegenizado de tejido muscular de hembras de C.


Figura 6. Niveles en carbonilos en el homegenizado de tejido muscular de machos de C.


(C).


Figura 7. Fluidez de membrana en el homegenizado de tejido muscular de hembras de C.


Figura 8. Fluidez de membrana en el homegenizado de tejido muscular de machos de C.

articulatus tratados con nanoparticulas LDHs de zinc y aluminio (A), disprosio (B) y gadolinio

(C).



En cuanto a la fluidez de la membrana en el homogenizado de machos en las muestras que

contenían zinc y aluminio la fluidez no se modificó. En tanto que las LDHs de disprosio y

gadolinio a las dosis de 200 mg indujeron un aumento y una disminución de la fluidez,

respectivamente, en comparación con las muestras que no fueron tratadas con las partículas de

LDHs (figura 8).

Discusión y conclusiones

Las partículas de los LDHs usadas en este trabajo mostraron un comportamiento

particular en los indicadores de estrés oxidativo que se cuantificaron. Por ejemplo, las partículas

que sólo contenían zinc y aluminio no modificaron significativamente los niveles de

lipoperóxidos en las muestras de machos y hembras en comparación con muestras de tejido

control no tratado con LDHs. En tanto que los niveles de nitritos y nitratos aumentaron

significativamente en machos y hembras. Los niveles de carbonilos en las muestras mostro un

comportamiento diferente en machos y hembras, esto es, los carbonilos aumentaron en las

muestras de hembras y disminuyeron en los machos. En tanto que la fluidez de la membrana

disminuyo en las muestras de hembras y no se modificó en las muestras de los machos.

De manera interesante las partículas de zinc y aluminio y las que contienen gadolinio y

disprosio en mitocondrias de machos y hembras tienen un efecto antioxidante y pro-oxidante,

respectivamente, esto determinado por los cambios en los niveles de nitritos-nitratos

Las partículas de gadolinio y disprosio, en general tuvieron poco efecto en aumentar los

indicadores de estrés oxidativo en los homogenizados probados, y consideramos que el efecto

más importante fue el de incrementar la oxidación de las proteínas.

Agradecimientos

Agradezco a todos los integrantes del laboratorio de CIBO por brindarme su ayuda y

apoyarme cuando lo necesitaba y a los del laboratorio de química, a Cecilia Sánchez Jiménez por

permitirme trabajar con las partículas que ellas misma sintetizo, al Dr. Gregorio G. Carbajal

Arizaga y al Dr. Fermín Pacheco Moisés por brindarme su asesoría y apoyo., así como al Centro

de Investigación Biomédica de Occidente (CIBO), al Centro Universitario de Ciencias Exactas e

Ingenierías, a la Facultad de Ecología Marina, a la Universidad Autónoma de Guerrero, al


programa de la Academia Mexicana de Ciencias, y en especial a mi madre Sandy Jiménez a mi

padre José Morfin y a mis hermanas Lesly y Tacumi Morfin.

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