Criterios cuantitativos en toxicología forense

María Antonia Martínez González Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses, Departamento de Madrid, Las Rozas de Madrid, Madrid, España Resumen

La toxicología forense requiere resultados analíticos científicamente indiscutibles y legalmente defendibles. Disponer de datos analíticos fiables es indispensable para interpretar correctamente los resultados toxicológicos. Los criterios analíticos en toxicología forense, basados en las normativas y recomendaciones vigentes son proporcionados por prestigiosos organismos de ámbito internacional y local, y su cumplimiento es fundamental para obtener resultados toxicológicos científicamente sólidos. Este trabajo supone una continuación en la revisión y evaluación de los criterios analíticos en toxicología forense, iniciada con el anterior trabajo recientemente publicado en esta revista «Criterios cualitativos en toxicología forense». Su objetivo es contribuir a la calidad de la pericia y al avance en la unidad de criterio científico, aspectos cruciales en toxicología forense. Este trabajo revisa, evalúa y recopila los criterios para una correcta cuantificación detallándose los requisitos para validar las metodologías. Además, pretende servir a aquellos profesionales que deban evaluar resultados toxicológicos emitidos por laboratorios forenses.

Artículo

Introducción

La toxicología forense (TF), se define como una de las disciplinas científico-técnicas que constituyen las denominadas Ciencias Forenses y que sitúa a la Toxicología al servicio de la Administración, fundamentalmente de la Justicia1.

No es posible hablar de TF sin hablar de toxicología analítica. Esta hace uso de las herramientas que proporciona la química analítica en la estimación cualitativa y cuantitativa de las sustancias de interés toxicológico presentes en los distintos tipos de matrices2.

El cumplimiento en TF de los criterios analíticos, basados en las normativas y recomendaciones vigentes, es fundamental para lograr obtener resultados toxicológicos científicamente sólidos. En sus aspectos más generales, estos criterios son proporcionados por prestigiosos organismos de ámbito internacional y local en el área, entre los que destacan:

- «Laboratory Guidelines»3, de la Asociación Internacional de Toxicólogos Forenses (TIAFT).

- «Forensic Toxicology Laboratory Guidelines, 2006 Version»4, de la Sociedad de Toxicólogos Forenses y la Academia Americana de Ciencias Forenses (SOFT/AAFS).

- «Guidelines and Recommendations of the GTFCh»5, de la Sociedad Alemana de Química y Toxicología Forense (GTFCh).

Dichos criterios referentes a la cuantificación, están basados en varias recomendaciones y normativas entre las que destacan citadas por orden cronológico de aparición:

- Las recomendaciones referentes al análisis cuantitativo de drogas y/o sus metabolitos en muestras biológicas mediante cromatografía de gases (GC) o cromatografía de líquidos de alta presión (LC) y sus modernas combinaciones con la espectrometría de masas (MS), tales como LC-MS, LC-MS-MS,

GC-MS, y GC-MS-MS elaboradas por la FDA, el CDER y el CVM y que aparecen recogidas en el documento «Guidance for Industry. Bioanalytical Method Validation»6.

- La reglamentación sobre el análisis de residuos en los productos de origen animal. En Europa aparece recogida en el Diario Oficial de las Comunidades Europeas «European Unión Decision 2002/657/EC»7.

- La reglamentación analítica para el control del dopaje en las prácticas deportivas elaborada por la WADA en el documento «WADA Technical Document TD2003IDCR, Identification Criteria for Qualitative Assays, Incorporating Chromatography and Mass Spectrometry»8.

Los requisitos generales para la Competencia de los Laboratorios de Ensayo y Calibración que están recogidos en la norma UNE-EN ISO/EC 17025:20059, constituyen la base de la acreditación y, también están presentes en la filosofía de las recomendaciones y normativas anteriormente citadas.

El presente trabajo «Criterios cuantitativos en TF», tiene como objetivo continuar con la revisión, evaluación y recopilación en un único documento de las distintas directrices existentes sobre criterios analíticos en TF, ya iniciada con el anterior trabajo recientemente publicado en esta revista10, «Criterios cualitativos en TF». Con ello, se pretende enfatizar la necesidad de su cumplimiento en las prácticas rutinarias de los laboratorios de TF. Además, también se pretende con ello contribuir a la calidad de la pericia y al avance en la unidad de criterio científico, aspectos cruciales en TF para obtener resultados analíticos basados en fundamentos científicos sólidos, y que sean, por tanto, comparables y legalmente defendibles ante los Tribunales de Justicia. Asimismo, esta revisión y recopilación de criterios pretende

servir a aquellos profesionales que deban evaluar los resultados toxicológicos emitidos por los laboratorios forenses (Tabla 1).

Tabla 1. Siglas utilizadas en el texto

Siglas Significado

CDER Center for Drug Evaluation and Research (Centro para la Evaluación e Investigación de Fármacos, dependiente de la USFDA)

CV Coeficiente de variación (indica la precisión de un método analítico, se expresa en porcentaje)

CVM Center for Veterinary Medicine (Centro de Medicina Veterinaria, dependiente de la USFDA)

GC Gas Chromatography (cromatografía de gases)

GC-MS/GC-MS-MS

Gas Chromatography-Mass Spectrometry (cromatografía de gases-espectrometría de masas)

GTFCh Gesellschaft für Toxikologische und Forensische Chemie (Sociedad Alemana de Química y Toxicología Forense)

HPLC High Performance Liquid Chromatography (cromatografía de líquidos de alta resolución o presión)

HS-GC-FID Cromatografía de gases con detector de ionización de llama acoplada a un autoanalizador de espacio en cabeza

IS Internal Standard (patrón interno)

LC Liquid Chromatography (cromatografía de líquidos de alta resolución o presión)

LC-MS/LC-MS- Liquid Chromatography-Mass

MS Spectrometry (cromatografía de líquidos-espectrometría de masas)

LD Límite de detección

LLQ Lower limit of quantitation (límite de cuantificación bajo)

LQ Límite de cuantificación (usualmente suele referirse LLQ, aunque, obviamente, existe también un ULQ)

RPM Redistribución postmortem

SD Standard deviation (desviación estándar)

S/N Relación señal/ruido

SI Sistema Internacional

SOFT/AAFS

Society of Forensic Toxicologists and American Academy of Forensic Sciences(Sociedad de Toxicólogos Forenses y Academia Americana de Ciencias Forenses)

TF Toxicología forense

TIAFT The International Association of Forensic Toxicologists (Asociación Internacional de Toxicólogos Forenses)

Tra Tiempo de retención absoluto

Trr Tiempo de retención relativo

ULQ Upper limit of quantitation (límite de cuantificación alto)

UNE-EN ISO/EC 17025:2005

Requisitos generales relativos a la competencia de los laboratorios de ensayo y calibración 17025:2005

USFDA United States Department of Health and Human Services Food and Drug Administration (Administración Americana de

Alimentos y Medicamentos)

Xm Valor de una muestra utilizada como blanco

WADA World Antidoping Agency (Agencia Mundial Antidopaje)

El análisis toxicológico cuantitativo

Según la TIAFT3, el análisis toxicológico comprende la detección, identificación y cuantificación de sustancias con interés toxicológico y la interpretación de sus resultados.

El análisis cuantitativo, tiene como objetivo determinar mediante una serie de procesos (pretratamiento de muestras, extracción-purificación y análisis instrumental) la cantidad o concentración en que los tóxicos se encuentran en la muestra en cuestión.

Criterios de cuantificación

Dadas las connotaciones legales y sociales derivadas de los resultados analíticos, cualquier aspecto o procedimiento relacionado debe ser científicamente indiscutible y legalmente defendible. Por ello, siempre deben conocerse los parámetros de validación del método, someterse a consideración y documentarse en los informes analíticos con el fin de que los resultados puedan ser interpretados correctamente.

A continuación se revisan, evalúan y recopilan los criterios cuantitativos en TF, basados en las recomendaciones internacionales, con relación a los aspectos analíticos clave para acometer la cuantificación de tóxicos en muestras biológicas.

Generalidades

Con relación al análisis cuantitativo en TF conviene tener presentes/adoptar los siguientes criterios3, 4:

- El análisis cuantitativo solamente se acometerá cuando sea significativo desde el punto de vista toxicológico para la interpretación del caso forense.

- Los fármacos administrados en el hospital normalmente no se cuantifican salvo petición expresa por denuncia médica.

- Lo ideal es realizar el análisis cuantitativo en una alícuota de muestra distinta de la que se empleó para realizar el análisis de barrido «screening» y/o cualitativo de la muestra.

Criterios toxicológicos para la cuantificación

La sangre (o el plasma, en sujetos vivos) es la muestra más importante objeto de cuantificación, ya que lo que en ella se detecta, sería, en principio, indicativo del efecto, terapéutico, tóxico o letal producido sobre el individuo11. Al evaluar estas concentraciones, hay que tener siempre en cuenta, que en los consumos asociados de drogas de abuso y psicofármacos (u otros tóxicos en general) los efectos tóxicos son susceptibles de potenciarse por fenómenos de sinergismo.

Con relación a las drogas de abuso, si bien estas siempre suelen ser objeto de cuantificación y muy especialmente en la muestra de sangre, cabe resaltar que de los resultados cuantitativos de las mismas no se puede desprender el grado de afectación tóxica, no pudiendo aquí, además, ser olvidados los fenómenos de tolerancia en los toxicómanos. Las drogas de abuso no son fármacos, no existiendo, por tanto, concentraciones terapéuticas («seguras») y/o tóxicas/letales, ya que en ausencia de otra circunstancia que justifique la causa de la muerte, su sola presencia en las muestras biológicas puede ser compatible con la misma por reacción adversa.

Las cuantificaciones realizadas en vísceras y contenido gástrico (si se conoce su totalidad) aportan información complementaria a la obtenida de la muestra de sangre, siendo muy valiosas,

especialmente, en casos de ingestas masivas de tóxicos. Sin embargo, los resultados cuantitativos en orina no aportan ninguna información, por considerarse la orina muestra de eliminación, estando las concentraciones afectadas por la cantidad de líquidos ingeridos y por la actividad de la función renal12.

Para ser lo más preciso y exacto posible en la valoración toxicológica de las concentraciones de tóxicos, es fundamental conocer todos los detalles de la historia del caso.

Las concentraciones de tóxicos en sangre postmortem deben ser siempre evaluadas con cautela, pues muchos tóxicos son inestables, por sufrir degradación (bacteriana y/o metabólica)13, 14, 15, y/o redistribución postmortem (RPM)16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, desde las etapas más tempranas de acontecer el fallecimiento. Las concentraciones postmortem no reflejarían, pues, con exactitud las concentraciones antemortem. Los tubos que tienen como conservante fluoruro sódico y como anticoagulante oxalato potásico, y que usualmente tienen tapón de color gris, son los ideales para tomar la muestra de sangre, pues evitarán que los tóxicos se degraden y, además, facilitarán su correcta medición. No obstante, también es necesario tomar muestra de sangre en tubos sin aditivos, usualmente son los de tapón rojo, pues hay tóxicos como los pesticidas organofosforados24 y muchos psicofármacos13, 14, 15 susceptibles de degradarse por la acción del ión fluoruro. Mantener las muestras biológicas congeladas hasta su análisis al menos a −20 °C es clave para evitar la degradación de los tóxicos. Se sabe que, especialmente, los tóxicos de carácter básico y de alto volumen de distribución (p. ej., los antidepresivos) sufren RPM, por ello sus concentraciones pueden estar incrementadas hasta 20 veces en sangre de cavidad central (p. ej., cardiaca) en comparación con la sangre periférica (p. ej., femoral)16, 23. Los

barridos toxicológicos iniciales deben por ello, realizarse en sangre de cavidad central, pues es donde en general, los tóxicos van a estar más concentrados. Cuando las concentraciones detectadas en las sangre de cavidad central se encuentran en rango tóxico, se debe proceder a realizar la cuantificación en la sangre periférica para aclarar si se trata de un fenómeno de la RPM. Contar pues, con ambos tipos de sangre, central y periférica, permitirá aclarar si el tóxico objeto de interés ha estado sujeto a RPM, ello, posteriormente, permitirá poder realizar una correcta interpretación de los resultados toxicológicos.

De todo lo anteriormente expuesto, también se deduce que en matrices en descomposición, obviamente, las concentraciones obtenidas tienen un valor interpretativo altamente limitado desde el punto de vista toxicológico.

Tipos de calibración

Para poder acometer con corrección el análisis cuantitativo de las muestras los instrumentos de medida deben estar calibrados. El calibrado en un método instrumental es el proceso mediante el que se obtiene una relación matemática («función analítica») entre la señal del analito y su concentración mediante la comparación con uno o más patrones («calibradores»).

Los tipos de calibración que se recomienda emplear en los laboratorios de TF son12, 25:

- Curva de calibrado multinivel. Requiere un mínimo de 3 calibradores, siendo deseables al menos 5, 2 de ellos próximos al límite de detección. Los gráficos de calibración se construirán a partir de los patrones añadidos al mismo tipo de matriz que la muestra objeto del análisis y someterse a los mismos procedimientos de extracción que las muestras

problema. El gráfico de calibración debe construirse representando los ratios (relaciones) analito/patrón interno (IS) de respuestas obtenidas en el detector (eje de ordenadas) frente a las concentraciones (eje de abscisas). Es necesario determinar si la calibración se ajusta a un modelo lineal, cuadrático u otro. El modelo lineal de calibración es el preferible, pero si es necesario se debe emplear un modelo no-lineal. Los modelos lineales deben aplicarse para conjuntos de datos con homoscedasticidad, esto quiere decir que debe de existir una homogeneidad de las varianzas a lo largo de todo el rango de calibración. Como regla de oro, esto debe esperarse para rangos de calibración que no se expandan más de un orden de magnitud. Sin embargo, la mayor parte de los métodos de análisis toxicológico se expanden 2 o 3 órdenes de magnitud, lo cual suele llevar implícito un grado significante de heteroscedasticidad. Para compensar la heteroscedasticidad debe adoptarse un modelo de calibración basado en el ajuste ponderado mediante mínimos cuadrados utilizando un factor de ponderación de 1/×, 1/×2, 1/×3, etc. En el caso de adoptarse el modelo lineal, debe siempre comprobarse que existe una relación lineal entre la respuesta y la concentración a lo largo de todo el rango de calibración establecido26,27, 28, 29, 30, 31. En todo caso, la concentración de un calibrador calculada frente a la curva de calibrado con él generada debe estar comprendida en ± 20% de su valor. La curva de calibrado se verificará en cada tanda de análisis mediante el uso de controles obtenidos de fuentes diferentes de las que se han generado los calibradores y los resultados que arrojen también deben estar comprendidos en ± 20% de su valor nominal.

En el caso de que no se prepare una recta de calibrado completa, por no tratarse de analitos objeto de cuantificación

frecuente en el laboratorio, los patrones para la cuantificación deben estar en torno a la concentración del analito en la muestra problema. En este sentido, y con relación a los métodos analíticos basados en un punto de calibración, Peters y Maurer32concluyeron, tras sus estudios, que la utilización de solo un punto de calibración en GC-MS y en LC-MS puede ser válida y constituir una alternativa a la utilización de un rango completo de calibradores si el punto de calibración elegido se sitúa cerca del punto medio del rango total de calibración. Tan et al.33 más recientemente han llegado a la misma conclusión utilizando solo 2 puntos de calibración en LC-MS.

- Método de las adiciones estándar. Se utiliza cuando existe un efecto matriz que no es posible corregir. Consiste en medir las respuestas de «n» alícuotas iguales de la muestra a las que se adicionarán (a todas menos a una) cantidades crecientes (en igual volumen) del analito que se pretende medir. La propia muestra problema actuará como blanco del método. Es un método laborioso que se suele utilizar fundamentalmente en los métodos espectrofotométricos y potenciométricos y, también, cuando el blanco de matriz no es fácil de obtener como en el caso de las muestras procedentes de embalsamamientos. El gráfico de calibración debe construirse representando las respuestas detectadas (eje de ordenadas) frente a las concentraciones (eje de abscisas). El punto de corte de la gráfica (normalmente es lineal, recta de regresión) con el eje de abscisas determinará la concentración del analito en la muestra.

Cualquiera que sea el tipo de calibración utilizado, los resultados se expresarán siempre de forma inequívoca y utilizando unidades de medida del sistema internacional (SI).

Tipos de calibradores

Los tipos de calibradores que existen en los laboratorios forenses son6, 12, 25:

- Disoluciones de patrones: Son útiles cuando el método no obliga al uso de otro tipo de patrones, y cuando no existe efecto matriz (p. ej., análisis de volátiles por GC con detector de ionización de llama acoplada a un autoanalizador de espacio en cabeza [HS-GC-FID]).

- Material de referencia: En este material una o más propiedades deben estar confirmadas mediante un método validado. Por ejemplo, la concentración certificada de un analito en una determinada matriz, así una sangre con una concentración certificada de alcohol etílico sería un material de referencia certificado.

- Calibradores fabricados en el propio laboratorio: Son los de mayor objeto de preocupación, se usan en métodos analíticos complejos que requieren extracción, evaporación, etc. A partir de disoluciones «madre» del principio activo de 1 mg/mL (en el disolvente adecuado) se obtienen lo que se llaman «disoluciones de patrones de trabajo» «working standard solutions»que se conservan a −20 °C y en tubos de vidrio ámbar. Deben atemperarse antes de su uso y establecer su periodo de validez. Se utilizarán para enriquecer («sembrar») las matrices y así generar los calibradores.

Patrón interno

Se recomienda el uso del IS en todos los métodos de análisis cromatográficos 3, 12, 25, 31. El IS corrige la cuantificación del analito, al minimizarse errores aleatorios y sistemáticos, bien debidos a pérdida del analito por: adsorción a las superficies, extracción, evaporación, derivatización; como también a la irreproducibilidad del método durante la transferencia e inyección de la muestra en los equipos de análisis. Lo ideal es que el IS sea un homólogo del

analito, y si no es posible, se elegirá un compuesto con propiedades físico-químicas muy similares. Cromatográficamente debe eluir cerca del analito, y estar resuelto (suficientemente separado) de cualquier otra sustancia que pueda estar presente. Si el analito se va a derivatizar, el IS que se elija debe formar un compuesto derivatizado análogo. Los isótopos estables (p. ej., deuterados) son los que se recomiendan para los análisis por GC-MS y LC-MS, aunque los IS no deuterados bien elegidos pueden proporcionar en ocasiones resultados equivalentes e incluso mejores. En el caso de los análisis por LC-MS los IS marcados isotópicamente son los únicos que pueden compensar la «supresión iónica» (ion supression)34, 35, 36. Siempre que sea posible, el IS se preparará en disolución acuosa para facilitar su miscibilidad con las muestras biológicas, y debe añadirse a estas lo antes posible en las etapas iniciales del método, y en cualquier caso, antes de añadir el tampón y de proceder a la extracción. Los marcadores que se añaden después de la extracción inicial se consideran «patrones externos» y su uso es desaconsejable.

Validación y aspectos relacionados

Para garantizar la calidad y, por tanto, la fiabilidad de los resultados analíticos obtenidos en los laboratorios de TF, estos deben dimanarse de metodologías analíticas escritas, validadas y aprobadas por el responsable del laboratorio, todo ello de acuerdo con la norma UNE-EN ISO/EC 17025:20059, y siguiendo las directrices de los organismos internacionales y la normativa internacional anteriormente citados.

La validación de las metodologías junto a otras actividades englobadas en el control del aseguramiento de la calidad, permite demostrar a los laboratorios, en general, que sus métodos analíticos proporcionan resultados fiables. Validar un método consiste en verificar y documentar su validez, esto es, su

adecuación a unos determinados requisitos, previamente establecidos por el laboratorio para poder resolver un problema analítico particular.

Todos los métodos analíticos deben ser validados6, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45,46, 47 utilizando la misma matriz en la que de manera rutinaria se van a realizar los análisis (p. ej., sangre, suero, tejidos), para ello las matrices se sembrarán con cantidades conocidas de drogas/tóxicos y se analizarán siguiendo el procedimiento analítico completo. Los parámetros analíticos que deben ser validados son la exactitud, la precisión y el rendimiento absoluto, todos ellos a diferentes concentraciones, el rango de calibración, la selectividad, los límites de detección (LD) y de cuantificación (LQ) y si es posible también la robustez y la incertidumbre. Se recomienda que los límites bajo y alto de cuantificación (LLQ y ULQ) coincidan, respectivamente, con los calibradores inferior y superior de la recta de calibración31. El rango de calibración en sangre debe ser tal, que, en principio, sirva para abarcar concentraciones de fármacos desde terapéuticas hasta letales22, 48, 49,50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58. En la validación de métodos por LC-MS-MS es especialmente importante conocer el efecto matriz44, 45.

Modernamente, el rendimiento de extracción no se considera, obviamente, un parámetro esencial de validación, pues los calibradores se preparan en la misma matriz31. Sin embargo, sí que es fundamental estudiar la exactitud y precisión (intra-ensayo e inter-ensayo). Para ello, se utilizarán un mínimo de 5 determinaciones procedentes de diferentes tandas, por nivel de concentración (excluyéndose las muestras blanco). Deben estudiarse un mínimo de 3 concentraciones comprendidas en el rango de medida: baja, media y alta. El valor medio de la exactitud debe estar comprendido en ± 15% del valor teórico, excepto en el

LLQ que debe estar comprendido en ± 20%. La precisión en torno al valor medio no debe exceder el 15% del coeficiente de variación (CV), excepto en el LLQ, donde el CV no debe exceder el 20%6.

La SOFT/AAFS hace además especial mención a los siguientes aspectos fundamentales a tener en cuenta con relación al diseño de protocolos de validación de métodos analíticos4:

- Al realizar los análisis en los laboratorios las muestras deben de agruparse en «tandas». Cada «tanda» debe de contener un número suficiente de controles y calibradores que dependerá del tamaño de la tanda y del tipo de prueba.

- Cuando los análisis se vayan a realizar sobre muestras no habituales (tejidos en descomposición, humor vítreo, etc.) deben emplearse, siempre que sea posible, calibradores apropiados a esas matrices, que sean preparados y analizados a la par que las que las muestras.

- En el caso de los inmunoensayos, el laboratorio puede calcular el LD sumando al valor medio del blanco (Xm) 3 desviaciones estándar (SD), o sea, LD = Xm + 3 SD. Con relación a las técnicas cromatográficas (p. ej., GC y cromatografía de líquidos de alta resolución [HPLC]), si bien existen diferentes métodos, para su cálculo, uno de ellos consistiría en calcular el LD como la menor concentración de una droga que proporcionara una señal con una altura de pico de 3 veces la relación señal/ruido de fondo (S/N) correspondiente a un blanco de muestra. El valor del LD nunca debe de ser menor que el valor del blanco más 3 SD. El LQ puede ser calculado añadiendo al valor del blanco 10 SD (LQ = Xm + 10 SD). Sin embargo, es preferible determinar el LQ experimentalmente como la concentración más baja que puede medirse con un coeficiente de variación no superior al 20%.

- La linealidad del método debe establecerse utilizando al menos 3 calibradores. La concentración inicialmente estimada de la muestra problema debe estar comprendida dentro del rango de calibración. En el caso de que la muestra problema tenga una concentración mayor que la del calibrador más alto, entonces la muestra debe primero diluirse con agua desionizada, y después someterse a extracción. Si ello no se realizara, entonces debe de reportarse la concentración como mayor que el calibrador más alto. Si la concentración de la muestra estuviera por debajo del calibrador más bajo se debe de añadir un calibrador adicional que esté por debajo de la concentración del analito en la muestra. Otra opción posible es duplicar el volumen de la muestra y proceder a la re-extracción, siempre y cuando se haya demostrado que el análisis no sea dependiente de la matriz. Si no se requiere una cuantificación exacta, entonces se puede reportar que la muestra contiene al analito en una concentración menor que el calibrador más bajo («traza»). La utilización del término «traza» implica que la sustancia está presente en una concentración por encima del LD, pero por debajo del LQ del método.

- El criterio de aceptación de una calibración cromatográfica debe de quedar establecido en el método. En el caso de una calibración multinivel este factor es habitualmente el coeficiente de correlación. En la mayor parte de las aplicaciones, se considera como un factor aceptable 0,99. Sin embargo, puede haber casos en los que un coeficiente de correlación de 0,98 se pueda considerar como mínimamente aceptable. Además, se considera una buena práctica evaluar la calibración calculando el valor de cada calibrador frente a la curva generada. Valores de ± 20% se consideran, en general, aceptables para la mayoría de las aplicaciones, aunque en el caso del etanol se prefieren valores de ± 10%.

- Para muestras con concentraciones significativamente mayores que los calibradores más altos, el laboratorio debe asegurarse y tomar precauciones para que no se produzcan arrastres«carryover» en las siguientes muestras que se analicen. Para asegurarse de que no existen posibilidades de falsos positivos por arrastres se debe realizar una comprobación de la metodología analizando muestras similares con muy bajas concentraciones después del análisis de una muestra con un valor positivo muy alto.

- Es un hecho conocido que en un laboratorio, debido a diferentes causas, algunos resultados analíticos se desvían de modo falso y significativo del valor real («outliers»). Si esto le sucede a un blanco, a un control, o a un calibrador la percepción del hecho por el analista es obvia. Sin embargo, si esto le sucede a una muestra procedente de un caso, ello no se detectaría. Por esta razón, se recomienda replicar la extracción y el análisis cuantitativo, al menos en duplicado. El laboratorio debe determinar el criterio de aceptabilidad para replicados de análisis. Una desviación como máximo de ± 20% del valor medio se suele considerar aceptable.

- El tiempo de retención en los análisis cromatográficos tiene también su rol dentro de los criterios de aceptabilidad. Así, para análisis mediante GC se admiten desviaciones de los tiempos de retención (Tra) del 1-2% con relación a los calibradores o controles. En el caso de análisis mediante HPLC son aceptables desviaciones ligeramente superiores, y más concretamente si se han realizado en modo programado no-isocrático (Tabla 2)4, 5, 7.

Tabla 2. Rangos de aceptabilidad * de tiempos de retención cromatográficos

Tra Trr

GC ≤ ± 2% ≤ ± 1%

HPLC ≤ ± 5% ≤ ± 2,5%

Fuente: tomado de las referencias 4–6 .

* Con relación al material de referencia.

Finalmente, y como complemento ilustrativo y práctico de este trabajo, de revisión, evaluación y recopilación de criterios para la correcta cuantificación de tóxicos en los laboratorios de TF, se hace referencia a los trabajos científicos publicados en los últimos años por los grupos de investigadores del Dr. Maurer59, 60, 61, 62, 63, 64 y de la Dra. Huestis65, 66, 67, 68 por describirse en ellos excelentes ejemplos prácticos de métodos analíticos validados.

Conclusiones

El cumplimiento de los criterios cuantitativos, basados en las normativas y recomendaciones vigentes, es fundamental para poder obtener resultados toxicológicos científicamente sólidos y, por tanto, indiscutibles y legalmente defendibles ante los Tribunales de Justicia. La calidad de la pericia y el avance en la unidad de criterio científico, aspectos fundamentales en TF, se sustentan en su cumplimiento. La correcta cuantificación de tóxicos requiere la aplicación de metodologías analíticas de detección validadas basadas en los criterios establecidos. En definitiva, la correcta cuantificación de tóxicos en las muestras biológicas, es indispensable para poder acometer posteriormente una correcta interpretación de los resultados toxicológicos. En base a ello, el médico-forense, junto con el resto de la información relativa al caso, podrá establecer finalmente la causa de la muerte. Es por tanto fundamental, que estos profesionales estén familiarizados con los criterios existentes.

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