celindust [modo de compatibilidad]webs.ucm.es/info/btg/personales/jvsgago/celindust [modo de...

26/02/2010

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Utili ió d él lUtilización de células en procesos biotecnológicos

Dr. J.V. SinisterraBiotransformations Group

Faculty of PharmacyUniversidad Complutense

www.biotransformaciones.com

Aplicaciones industriales de las células enteras

Biotransformations using free enzymes as biocatalysts are now a fully accepted andvalidated synthetic methodology to prepare homochiral compounds used inpharmaceutical, food additives or agrochemical industries.

Contrarily to free enzyme Biocatalysis, the utility of whole cells as biocatalysts is wellknown although commercial applications have been largely restricted to special caseswhere the microorganism contains the enzyme required for a single step or where thecell is a natural producer of a chemical such as EtOH or a complex natural productsuch as tetracycline, astaxanthine etc.

This reduced utility has been associated to a lack of general and effective experimentaltools required to develop robust microorganism for industrial applications.

Nevertheless, the tremendous advances in the last years in metabolic engineering,genomics, metabolomics, proteomics, directed evolution etc. have opened the door tocreate tailored made microorganisms for industrial purposes.

Sinisterra y col. Industrial BiotransformationsEncyclopedia of Microbiology. RSMicrobiology. 2009, 212-251

Procesos biotecnológicos usando células

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Genéticamente estable Disponibilidad para el escalado De fácil crecimiento Rápida velocidad de crecimiento Disponibilidad para la manipulación genética (mutación yselección) .

Requerimientos de un microorganismode interés industrial

Crecimiento en medios relativamente baratos o materiales deresiduo: molasas, patatas, uvas, etc.


1.- Células enteras como productoras de enzimas. High throughput screening (HTS) y nuevos métodos de selección Búsqueda de nuevos microorganismos no mesófilosModificación de enzimas- Directed evolution

2.- Células en la producción de energía

3.- Células en industria de gran tonelaje

4.- Células como biocatalizadores selectivos: Fine Chemicals, Farmacia etc.

RESULTADOS PODRIAN SER ESPECTACULARES

INGENIERIA ENZIMÁTICA COMO INGENIERIA MULTIDISCIPLINAR Y COMPLEJA:

NUEVAS POSIBILIDADES EN TECNOLOGIAS DE ALIMENTOS

ENZIMASENZIMASENZIMASENZIMAS

Biodiversidad Súper-producciónAlteración de la secuencia

de aminoácidos 3D

MICROBIOLOGÍA BIOLOGÍA MOLECULAR

NUEVOS YMEJORES ENZIMAS

DNA RECOMBINANTE PCR

Aplicación a la Industria QUIMICA ORGANICA

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Búsqueda de nuevos microorganismos no mesófilos

Psicrofilos. Organismos cuya T óptima de crecimiento es <15ºC

Psicrotrofos organismos cuya T óptima de crecimiento es de 15 º<T<20ºC

Psicrotolerantes Organismos mesófilos que pueden adaptarse a vivir a bajas. T

Metodologías para aumentar la actividad enzimática en los organismos Psicrofilos

1.- aumentar la concentración intracelular de enzimas.- Psicrotolerantes y psicrotrofos

2.- Fabricando enzimas cuya actividad es casi independiente de T. G ≈ 0

3.- Fabricando enzimas muy específicas y de elevado turnover

α-amilasa T(ºC) K(s-1) ∆G≠

(kJ/mol)∆H≠

(kJ/mol)∆S≠

(J/mol x


(kJ/mol) (kJ/mol) (J/mol x K)

A.halophantis(psicrof)

15 187 58 71 46

B. amyloliquefaciens 15 34 62 97 122

Subtilisina

B.TA41 (psicrof) 15 25 62 36 -92

B. subtillis 15 5 66 46 -70

La diferencia fundamental es que sus proteínas son muy flexibles para que a bajas T sigan manteniendo la estructura 3D.

Por ello tienen:1)pocos puentes salinos o pares iónicos y por ello la relación (Arg+Lys)/ Lys

es muy baja2) posee pocos enlaces de H. esto hace que se pierdan los contactos

t l b il β Ti d á i á id ti


entre los barriles β. Tienen además pocos aminoácidos tipo Ser, Thr, Asn, Gln

3) tienen pocas interacciones de stacking entre anillos aromáticos Tyr, Phe y Trp.4) tiene pocas interacciones bipolares entre C=O y NH en las hélices – α5)sus proteínas tienen poca afinidad por iones estabilizadores de estructuras

tales como Ca(II)6)sus superficies son muy hidrófobas dando valores anormales de pI7) su interior es mas hidrófilo que en los mesofilos pro lo que hace que sedesnaturalicen por el agua.

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Enzymes which perform nucleoside synthesis

1) Nucleoside phosphorylases

B1O

OH

XOH

OOH

XOH

B2O

OH

XOH OPO3

-2

PO4-3

B1

B2PO4

-3

One pot nucleoside synthesis

2) N-2’-Deoxyribosyltransferases.

B1O

OH

XOH

OOH

XOH

B2O

OH

XOH Glu-R

R-Glu

B1

B2 R-Glu

Where: B1 y B2 = Purine and/or pyrimidine X = OH ó H

Holguin et al. Eur.J.Biochem. 54(2),525 (1975)Utagawa . J.Mol.Cat.B:Enzymatic 6(3),215 (1999)

Non natural nucleosides synthesis2.- Psychrotrophic strains

NH

O

N

NH

O

O

Cl

O

HOH

HHHH

HO

N

NH

O

O

F

NH

NH

O

O

O

O

HOH

HHHH

HO

N O

O

HOH

HHHH

HO

N O

O

HOH

HHHH

HO

N

N

NH2

O

NH

NH

O

N

NH

NH2

O

HOO

HOH

HHHH

N

NH

O

OHO

N

NN

N

NH2

O

HOH

HHHH

NH

NH

O

O

N N

NNH

H2N

Internal mass transfer is the rate controlling step.Reaction time increase from 20min (free cells) till 30 minLiterature 3hr-12hr

Number of cycles 37 (end yield 24%).Half life 13 cycles

2.- Psychrotrophic strainsOne pot nucleoside synthesis

A) B)

Fernandez-Lucas et a.- Biotechnol.Bioeng. 2008, 100, 213-222Calcium alginate Calcium pectate

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Arqueas (Archaea)Microorganismos primitivos cuyas biomoleculas, enzimas y mecanismo metabólicos son diferentes de los de otros microorganismos

Suelen estar adaptadas a vivir en condiciones extremas de T, pH, salinidad etc

HipertermófilosHalófilosMetanogéncios


g

Diferencias con los organismos mesófilos1) No tienen triglicéridos en las membranas sino polietersformados por uniones de glicerol y unidades de isopreno

OHO

O

O

OO

O

OO

O

O

HO

OO

OH


2) Microorganiosmo acidófilosSulfolobus sp. HO

OH

Paredes celulares con pseudo-peptidoglicanos deNAG beta-1-3 y NAT beta 1,3-resistentes a la lisozima bacteriana

Microorganismos Termófilos: Viven a Altas TemperaturasMicroorganismos Termófilos: Viven a Altas Temperaturas

ENZIMAS TERMORRESISTENTESENZIMAS TERMORRESISTENTES

PROCESOS A ALTA TEMPERATURA(prevención de contaminaciones, economía del proceso)PROCESOS A ALTA TEMPERATURA(prevención de contaminaciones, economía del proceso)

BIOLOGIA INDUSTRIA

Microorganismos termófilosMicroorganismos termófilos Enzima minoritaria Difícil de crecer en fermentadores

industriales

Enzima minoritaria Difícil de crecer en fermentadores

industriales

Clonación e hiperexpresión en microorganismos mesófilos hospedantes fáciles de manejar

Clonación e hiperexpresión en microorganismos mesófilos hospedantes fáciles de manejar

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ENZIMAS DE TERMÓFILOS

“criterio de selección natural”: eficacia biológica “criterio de selección natural”: eficacia biológica

a altas temperaturasa altas temperaturas

producto de la evolución natural: enzimas producto de la evolución natural: enzimas

termotermo--resistentesresistentes

criterio selección natural = criterio selección industrialcriterio selección natural = criterio selección industrial criterio selección natural criterio selección industrialcriterio selección natural criterio selección industrial

enzimas muy minoritarias

los microorganismos extremófilos

crecen muy lentamente

Clonación, súper expresión en microorganismos hospedadores adecuados

Tipos de microorganismos extremófilos

AMBIENTE COMPORTAMIENTO PARÁMETRO EJEMPLO ORGANISMO

Temperatura HipertermófiloTermófiloPsicrófilo

Crecimiento > 80ºCCrecimiento 60-80ºCCrecimiento < 15ºC

Pyrolobus fumarii (113ºC)Synechoccus lividisPsychrobacteria (algunos insectos)

Radiación Atomófilos Superior a 6000 rad/hr; 15 Mrad tot.

Deinococcus radiodurans

Presión Barófilos Por encima de los gigapascals Sh. Oneidensis, E. coli

Sequedad Xerófilos Ausencia de agua Artemia salina, hongos, etc

Salinidad Halófilos 2-5 M NaCl Halobacteriaceae, D. salina

pH(Acidez/alcalinidad)

AlcalófilosAcidófilos

pH > 9pH < 0

Natronbacterium, B. FirmusCyanadium caldarium (pH 0)

Presión de oxígeno AnaerobioMicroaerófilos”

No tolera O2Tolera bajas [O2]

Methanococcus jannaschiiClostridium

Extremos químicos GasesMetales

Atmosfera pura de CO2Elevadas concentraciones de metales

Cyanidium caldariumFerroplasmic acidarmanus

Aplicaciones industriales

1.- Arqueas metanogénicas .- producción de metano a partir de residuos urbanos

2.- DNA polimerasas termoestables de Thermus aquaticus para ensayos de PCR

3.- Alcohol deshidrogenasas resistentes a los medios orgánicos. Sulfolobus sulfataricus

4.- Recuperación de metales Ni, Cu, U, Au etc Sulfolobus sp.

Enzimas mas termoestables que las de los mesofilos

1.- Sustitución aminoácidos flexibles (Gly, Ser, Ala etc) por aminoácidos Rígidos (Thr, Val, Pro)

2.- Sustitución de aminoacidos con grupos reactivos Cys (SH), Glu y Asp(COOH), Asn (CONH2) porotros inertes Ala, Leu etc.3.- Tiene una relación Arg/Lys alta lo que permite fuertes interacciones

polares

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Enzimas de hipertermófilos

Hidrolasas.- Pyrobaculum calidifontis y Sulfolobus solfataricus producenCarboxil-esterasas y esterasas termoresistentes.No se han descrito hasta ahora verdaderas lipasas .-selectivas hacia esteres de ácidos grasos

Pyrococcus furiosus es un excelente productor de proteasas Su perfil de actividad es similar al de la subtilisina

P.furiosus, P.horikoskhii y S. sulfataricus producen enzimas sacarolíticasEstan descritas α-amilasa, β-glicosidasa, β- glucosidasa, β-galactosidasa yExo-β-D- glucosaminidasa

Temperatura óptima de la enzima: 62ºC

Elevada actividad a temperatura moderada

Amplia especificidad

Temperatura óptima del microorganismo: 60ºC

ESTERASA DE B. stearothermophilus

Thermophilic microorganisms are a group of microorganisms that grow in extreme conditions of temperature. These microorganisms offer useful enzymes to expand the range of reaction conditions suitable for biocatalysis. In this way some interesting enzymes have been described such as esterases, lipases, proteases, alcohol dehydrogenases, etc.

HO

N

NH

O

O

NHN

O NH

N

N

O

N NH

O

3.- Thermophilic strainsOne pot nucleoside synthesis

O

XOH

HHHH

NH

NNH

N NN

O

XOH

HHHH

HONH

NH

O+ +

Literature.- The thermotolerant B. stearothermophilus (optimal growing T= 50ºC) has been described byIribarren et al as useful biocatalyst in this process (Trelles et al. Biotechnol.Lett. 2005. 27, 759-763).

Pure thermophile such as Thermus thermophilus has not been used in this reaction

HTS .- Thermus thermophilus strains and different substrates

20

25

30

35

40

45

mo

l.h

-1.m

illi

on

cel

l-1x1

05 )

3.- ThermophilesOne pot nucleoside synthesis

The best strains :HB27, PRQ25, PRQ16, VG7, FIJI2, TthB

• The strains are selective versus 2’-desoxy-ribose compared to D-ribose

• There is not a dramatic influence of the presence of NH 2 or C=O In C-6 of purine ring

0

5

10

15

HB8 HB27 PRQ16 PRQ25 TthB TthRQ1 NR17 HN1.11 FIJI2CC16

VG7

Pro

du

ctiv

ity

(um

dUrd + Hypoxanthine Urd + Hypoxanthine dUrd + Adenine Urd + Adenine

Almendros & Sinisterra- Patent

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• Due to the fact that HB27 strain grows in repetitive conditions and that its genome is sequenced, this strain was selected to get the enzymes.

6 genes were considered but only three showed good activity:

TTC0194: 2’-deoxypurine nucleoside synthesis.TTC1070: 2’-deoxypurine nucleoside synthesis. TTC1412: 2’-deoxypyrimidín nucleoside synthesis.


The genes were cloned by standard methodology in an expression plasmid inducible by IPTG, and produced in the E. coli strain BL21(DE3).

Purification was carried out by heating at 80ºC, thus taking advance of the difference in optimal temperature of the host microorganism and the source microorganism.



40

60

80

100

120

Con

vers

ion

in 3

0 m

inut

es

(nm

ol.μ

g to

tal p

rote

in-1

)

Reaction time = 30 min.Reaction conditions: [substrate]= 5mM; [dUr]= 15mM; pH=7; T= 65ºCTTC0194= Selective versus 6-aminopurines █TTC1070= Selective versus 6-oxopurines █TTC1412= Selective in the inter-conversion between pyrimidine nucleosides █


Ino

5mMGuo

5mM5-ClU

5mMdAdo

5mMdIno

5mM5-FU

5mMdThd

5mM

TTC0194

TTC1070

TTC14120

20

0

10

20

30

40

50

60

70

N + 2,6-DAP N + BI N + 6MP Aciclovir Ara-A

TTC0194 TTC1070

Con

vers

ion

in 3

0 m

inut

es

(nm

ol.μ

g to

tal p

rote

in-1

)

Reaction time: 30 min.: [nucleoside donor]= 5mM (2,6-DAP= 2,5mM); [P]= 50mM; pH=7; temperature= 65ºC

Acronyms: N= donor nucleoside (TTC0194= deoxyadenosine; TTC1070= deoxyinosine; TTC1412=deoxyuridine)

2,6-DAP= 2,6-diaminopurine5ClU- 5-Cl-Uracyl


60y

5FU- 5 F-uracyl5IU- 5 I-uracyl

The most interesting reactions:TTC0194= 2,6-DAP -> 2,6-DAP-D-RibosideTTC1412= 5-Cl ≈ 5-F > 5-I ; ara-5-FU


0

10

20

30

40

50

TTC1412

(nm

ol.μ

g to

tal p

rote

in-1

)

NH

O

ON

O

HOH

FHHH

HO

ara-5-F-U

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9

0

0,25

0,5

0,75

1

50 55 60 65 70 75 80 85 90 95

temperature (ºC )

Rel

ativ

e ac

tivity

(A

U)


p ( )

TTC0194 TTC1070 TTC 1412

Reaction time: 30 minutes; [substrate]= 5mM; [P]= 50mM; pH=5;Substrates: TTC0194: dAdo; TTC1070: dIno; TTC1412: dUr+5-FU

Maximum temperature observed: 95ºC

Optimal pH was also determined by measuring activity within a range from 2 <pH< 8. All three enzymes showed maximum activity at

4.5 <pH <7


Bio-informatics

TTC0194

TTC1412Based on template 2dsjB(1.80ª)S id tit 98%

TTC1070

Based on template 1odkB(1.90ª)

Sequence identity 100%

Sequence identity 98%

La metodología esta basada en la mutagénesis especifica de lo entornos del centro activo o del centro de reconocimiento

Esta metodología fue introducida en 1997 por Manfred Reet (Instituto Max Plank) y tiene la ventaja de que es independiente de la estructura del biocatalizador o del mecanismo de reacción.

Es una combinación de métodos de biología molecular

Evolución dirigida

Es una combinación de métodos de biología molecular, mutagénesis aleatoria (Ramdom mutagenesis) y expresión génica acoplada a ensayos de alta eficacia (high – throughput assays) para la determinación de las actividades y enantioselectividades.

Esto hace que sea un paso más delante de la biocatálisis combinatoria.

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Reacción de hidrólisis catalizada por la lipasas de P. aeruginosa

Se parte de una enzima de una cepa salvaje por ejemplo con baja enantioselectividad hacia la reacción que quiero

1- 8 % e.e (< 1.1)

Reetz, Adv. Catal. 49,1-69(2006)

El gen que expresa la enzima salvaje se somete a una mutación aleatoria usando métodos clásicos de Biología Molecular como son1) Error en la acción de la polimerasas (error prone polymerase chain reaction (epPCR))2) Mutagénesis restauración3) Mutación en casetes4) “Barajeado de DNA” ( DNA shuffling)

DNA suffling- consiste en romper los genes y unirlos después mediante el 155(NNN) o el 162(NNN)


Después se inserta la librería de genes mutados obtenidos en un microorganismo apropiado.Se expresan las enzimas mutadas y se prueban individualmente en la reacción de interés (enantioselectividad y conversión).

El gen que da la enzima más interesante se vuelve a someter al procesoi) mutagenesis) gii) expresióniii) screening

y se vuelve a repetir el proceso. Este proceso crea una presión evolutiva que lleva a la formación e identificación de la enzima de la enzima optima.


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Empleando el método epPCR obtuvo 1.000 a 3.000 mutantes que utilizó en la hidrólisis del los esteres de p-nitrofenilo midiendo en el visible la aparición de p-nitro fenol empelando palcas de 96-pocillos lo que permite analizar entre 400 y 500 microorganismos día. Así obtuvo una lipasa mutada mejor que la cepa salvaje : e.e.81%, E=11.3.

Lipasa de P. aeruginosa en concreto

e.e.81%, E 11.3.

Empleando el método de barajeado a partir del menor gen obtuvo un gene mejorado con e.e.>95%, E > 51.



1.- Células enteras como productoras de enzimas. High throughput screening (HTS) ay nuevos métodos de selección Búsqueda de nuevos microorganismos no mesófilosModificación de enzimas- Directed evolution




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FASE DE HIDRÓLISIS

FASE DE ACIDIFICACIÓN

C6H12O6 + H2O 2 CH3COOH + 2 CO2 + 4H2

C6H12O6 CH3CH2CH2COOH + 2CO2+ 2H2

C6H12O6 + 2 H2O 2 CH3CH2COOH + 2H2O

FASE ACETOGÉNICA

CH3CH2COOH + 2 H2O CH3COOH + CO2 + 3H2

CH3CH2CH2COOH +2H2O 2CH3COOH +2H2

FASE METANOGÉNICA

Bacterias matanogénicas acetoclásticas

CH3COOH + H2O CH4 +H2CO3 G0= -7,44 kcal/mol

Bacterias metanogénicas utilizadoras de hidrógeno

CO2 +4H2 CH4+2H2O G= -32,5 kcal/mol


1.- Células enteras como productoras de enzimas. High throughput screening (HTS) ay nuevos métodos de selección Búsqueda de nuevos microorganismos no mesófilosModificación de enzimas- Directed evolution




La tecnología microbiana presenta ventajas sobre los métodos no biológicos de recuperación de minerales, entre los que podemos

encontrar: 1)Requieren poca inversión de capital (las bacterias pueden ser aisladas a partir de aguas ácidas de minas).

Recuperación de minerales de minas pobres

2)Bajos costes de operación necesarios para las operaciones hidrometalúrgicas en comparación con los procesos convencionales. 3)Relativa ausencia de polución o contaminación ambiental durante el proceso. 4)El tratamiento del creciente cúmulo de minerales de baja ley en las minas que no pueden ser económicamente procesados por los métodos tradicionales.

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La fase acuosa es el medio en el que se producen una gran cantidad de procesos:1.- Crecimiento de los microorganismos.2.- Encuentro de los sustratos sólidos con los microorganismos.3.- Encuentro de los sustratos sólidos con productos químicos activos.4.- La liberación de los iones metálicos.5.- Distribución uniforme y disolución efectiva del oxigeno y el dióxido de carbono.

Los sustratos sólidos sirven como fuente de energía para la biosíntesismicrobiana (crecimiento microbiano y continua liberación de los iones de metal y azufre en su forma oxidada)

Zonas del proceso de biolixiviación

la fase gaseosa aporta el oxigeno necesario para los procesosde oxidación y el dióxido de carbono que el microorganismo usa pararealizar su biosíntesis.

Biolixiviación- Extracción de metales contenidos eb diferentes tipos de minerales por la acción de microroganismos

Thiobacillus feroxidansThiobacillus thiooxidansLeptospirillum ferroxidans

CaracterísticasGram(-)Acidófilos: pH 1.5 --- 2,0 M ófil T 40ºCMesófilas: Temperaturas < 40ºCAutótrofas : Fuente de C------CO2

Quimiolitotróficas (fuente de energía inorgánica)S y sus compuestos reducidos ( Thiobacilli)Fe(II) (L. ferroxidans, T. ferroxidans)

Aeróbicas ( T. ferroxidans puede ser anaerobio y fijar O2)Fisiología inusual.- soportan altas concentraciones de metales pesadosSe aíslan de aguas ácidas de drenaje de minas (Screening ecológico)

Descontaminación de metales de azufre y gases sulfurosos

Lixiviación indirecta de metales T. ferroxidans

proceso aerobio

FeS2 + 7/2 O2 + H2O Fe SO4 + H2SO4

2 FeSO4 + 1/2 O2 + H2 SO4 Fe2(SO4)3 + H2O

proceso anaerobioCuFeS2 + 2 Fe2(SO4)3 CuSO4 + 5 FeSO4 + 2S

Necesita Fe(II)

2 2( 4)3 4 4

Cu2S + 2Fe2(SO4)3 2 CuSO4+ 4FeSO4 + 2 S

produccion de ácido sulfúrico

2S + 3O2 + 2H2O 2H2SO4

Se realiza en presencia de Fe2(SO4)3 y se realiza en ausencia de oxígeno o de las propias bacteriasDepende mucho de la capacidad de regeneración biológica del sulfato férrico(2ª reacción).El S elemental producido en R-3 y R-4 lo transforma la bacteria en ac. sulfúrico

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Tabla 1.- Producción de aminoacidos empleando células enteras inmovilizadas___________________________________________________________________________Aminoácido Uso (MTm/año) Microorganismo__________________________________________________________________________D,L-alanina aromatizante 150-200 Pseudomonas cachunae

alimentosL-arginina terapéutico 200-300 Corynebacterium glutamicumL-aspartato sustituto

del azúcar 80-100 Escherichia coliL-lisina aditivo 15.000 -

alimentario - 25.000 Corynebacterium glutamicumL-serina cosmética 10 -50 Corynebacterium glycinophylumL-glutámico aromatizante 40 -50 Corynebacterium glutamicum

de alimentos___________________________________________________________________________

Tabla 2.-Producción de antibióticos empleando células inmovilizadas___________________________________________________________________________Antibiótico Microorganismo Técnica de inmovilización___________________________________________________________________________Bencilpenicilina Penicillium chrysogenum Atrapado en poliacrilamidaAmpicilina (acilación 6 APA) Kluyvera citrophyla Atrapada en poliacrilamida(acilación 6-APA) Kluyvera citrophyla Atrapada en poliacrilamida

Bacitracina Bacillus sp. Atrapado en poliacrilamidaCandicidina Streptomyces gryseus Atrapado colágenoCefalosporina C Streptomyces clavuligenus Unido covalentemente a

poliacrilamida_________________________________________________________________________

Reduction of C=OThe reduction of C=O to CH-OH is the most traditional reaction catalyzed by a whole-cells because in the process, one mol of coenzyme – NAD(P)H, FADH2, etc- is consumed by mol of substrate transformed The high price of coenzymes, especially NAD(P)H and the problems to scale up coenzyme regeneration in comparison with the low cost of whole cells recommends the use of whole-cellsrather than free enzyme-catalyzed reduction.

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The reduction is catalyzed by alcohol dehydrogenases (ADHs) (E.C. 1.1.1) which natural substratesare ethanol, lactate, glycerol etc.These enzymes require a coenzyme such as NADH or NADPH from which one hydride ion istransferred to C=O.There are four stereochemical patterns that enable the transfer of the hydride from the coenzymeto the substrate (Nakamura et al. 2003).E1 and E3 enzymes, the pro-(R)-hydride from NAD(P)H is transferred,E2 and E4 enzymes transfer the pro-(S)-hydride.

In E1 and in E2,hydride ion attacks the si- face but in E3 and E4 enzymes the attack is in re-face.

E3

E4Grupo grandeLRO

O

Cara re

O

Cara si

HHO

Cara si

H OH

N

ADPR

HRHS

N

ADPR

HRHS

E2E1 Alcohol S

Alcohol R

+

+

Grupo pequeño

cara Si

Recara

LR

Rs

Rs

RS RL e.e.(%)

Me Et S 67%

Me nBu S 82%

CF3 CH3 S > 80%

LUZ

Captura de la luz por la célula

Sistema de transferencia electrónica

NADPH NADP+

H2O O2

O

Método fotoquímico de regeneración de la coenzima

Ciclo de Calvin

O

H OH

XX

CO2Comp. Orgánicos

S 96-98%e.e.

X= o-, m-, p- Clo-, m-, p-F; o-, m-, p-MeNakamura et al. 2003, 14, 1659-2681

Cianobacteria

NAD(P)NAD(P)H/H

Sustratooxidado

Sustratoreducido

+ +

Sustrato auxiliarreducido

Sustrato auxiliaroxidado

ClO Cl

O

O OOHO H

S LReductase

NAD(P)H/H+ NAD(P)+R

Reduction of C=OUsing two enzymes

NAD(P)H/H NAD(P)

HO

O-

H+CO2 + "H2"

O

H

HO

H

HO

H

HOHH OH

OH

O

H

HO

H

HO

H

OHH O

OH

Formiate dehydrogenase

Glucose dehydrogenase

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Cl

O

OEt

O

Cl

O

OEt

HO H

Cl

O

OEt

H OH

Cl

H OHO

Naftil

Cl

HO HO

Naftil

Cl ONaftil

O

L-Enzima-1

L-Enzima-2

D-Enzima-2

L-Enzima-2

L-Enzima-1

D-Enzima-2

S

S

R

R

Tabla 6. Parámetros cinéticos de las oxido-reductasas aisladas.125

EnzimaKM (mM) Kcat

(s-1)pHopt. Tªopt.

(ºC)

D-Enzima-1 0.59 ----- 8.5 45

D-Enzima-2 4.54 303 6.5 45

L-Enzima-1 0.13 6.20 6.5 55

L-Enzima-2 0.15 4.66 5.5-6.0 40

Tabla 5. Reducción enzimática de 4-cloro-3-oxo-butanoato de etilo.

EnzimaPm (KDa) Act. total (U) Config. alcohol e.e. (%)

D-Enzima-1 25 26 S 99 %

D-Enzima-2 1600 1442 S 99 %

L-Enzima-1 32 246 R 99 %

L-Enzima-2 32 3108 R 99 %

Nakamura y cols

Figura 1.9. Alcohol deshidrogenasa de hígado de caballo. Protein Data Bank. www.pdb.org

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17

Figura 1.10 . ADH de Drosophila lebanoniensisProtein Data Bank. www.pdb.org

N

O

HO

HO

N

RNAD+

+

O

N

H

H

His 47

Tyr-48

Protón cedido al medioFigura 1.12. Mecanismo de reacción

de las alcohol deshidrogenasas Pro-47/His 47. Cesión al medio de un hidrógenomediante formación de una molécula de agua.

O

H2N

H

O

H HS

Zn+2

CyS-46

N

N

His67

SH

Cys-178

HH

O

H

R1

R2

HO

- O

H

OH

Ser 138OH

Tyr 151

His 190

2. 5 A

3.7 ApKa= 7.6

HN

N O

NH----

pKa=6.7

Figura 1.14. Estado del NAD+ en el sitio activo unidoa la enzima formando el complejo binario y unido a una molécula de agua

+ N

O

(R)

(R) O

OR

O

H2N

+H2N

H

H

Lys 155

NAD +

4.5 A

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O

OR

O

O

ORHO

2

microbialreduction

The synthesis of (R)-3-Fluoro-4-[[hydroxyl(5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl– 2 –naphthalenyl)acetyl]amino] benzoic acid (1), a retinoic acid receptor gamma-specific agonist with dermatological and anti-tumour activities can be performedby stereoselective reduction of the ketoester 2 or of the ketoacid 3 or of theketoamide 4. These processes have been performed in

Bristol Myers Squibb Research Institute (USA)

O

HN

HO F

O

OR

O

HN

F

O

OR

O

O

OH

O

O

OHHO

R= H,

1

3

4

microbialreduction

microbialreduction

Patel et al. Enantioselective microbial reduction of 2-(1’,2’,3’,4’-tetrahydro-1’,1’,4’,4’-tetramethyl-6’-naphtalenyl)acetic acid and its ethyl ester. Tetrahedron: Asymmetry 13, 349-355 (2002).

ClO O

OCH3 Cl

O

OCH3

HO

(S)

IO

OCH3

HO

(S)

N

F

OHO

Proceso Bristol-Myers Squibb para la obtención de un inhibidor de la hidroximetil-Glutaril CoA (HMG-CoA) usado como inhibidor de la síntesis de colesterol

O O

OCH3

PO

ONa

COOCH3

Condiciones de la reducción enzimática[S] = 0.066 M, 10g/lpH=6.8T=28ºCMedio acuosoCélulas de Geotrichum candidum SC 5469 en suspensión95% rendimiento96.9% e,.e.

Procesos Bristol-Myers Squibb-para obtener el cis—3-acetoxi-1-[2-(dimetilamino)etil]-1,3,4,5-tetrahidro-4-(4metoxifenil)-6-trifluorometil)-2H-1-benzazepin-2-one (DILTIAZEM®)

Bloqueante activo de los canales de calcio, usado como antihipertensivo y antiangina

N

S

O

O

CF3

OCH3

N

SCF3

OCH3

OH

CONDICIONES DE REACCIÓN

[S] = 0.006M, 2g/L

Medio acuoso OH

NO

H

N

S

OH

CF3

OCH3

OO

CH3

Medio acuoso

Células suspendidas de Nocardia salmonicolor SC6310

Conv.= 96%

99,8 e.e.

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19

Enoate reductases (1.3.1.31) are NADH or NADPH dependent enzymes that reducesα,β-unsaturated ketones to saturated ketones. When an alkyl group is present in alpha position, the enzyme shows great stereoselectivity leading to the 2-R-stereomeras in the case of the reduction of carvones where (1R,4R)-dihydrocarvone or (1R,4S)- iso-dihydrocarvone are obtained from the 4R-carvone or 4S-carvone(Shimoda et al.1998).

Enoato-reductasas

Table 9.- Yields in optically active ketones obtained by bioreduction of some enones using Rh. Rubra M18D3. 0.08 mml/enone/3g wet biomass, 3.0 mlof 0.2% glucose solutions /1.5g. wet biomass. T=30ºC. ( Zagozda and Plenkiewicz, 2006)

OO

RR

Substituent Reaction time (h) Yield (%) Isolatedproduct (%)

e.e.(%)

H- 22 64 44 46

m-MeO-C6H4- 23 66 49 71

p-MeO-C6H4- 24 55 32 38

m-Me-C6H4- 24 61 41 65

p-Me2N-C6H4- 120 --- ---- ----

Homochiral α-substituted ketones are versatile building blocks for the synthesisof pheromones (Mori and Ebata, 1986). Chemical methodologies carry to low e.e. values The reduction of α,β-disubstituted enones using whole cells such as baker’s yeast is a greenalternative because the reaction usually carries in aqueous medium with small amounts of hydrophilic solvents such as THF or 1,4-dioxane.

Kawai et al. (2001) described that the elongation of the α-substituent from methyl to ethylimproves the enantioselectivity. The substituent in the β-phenyl group is a critical factor. The reduction of enones having no-substituted or a para-substituent affords the (S)-α-substituted ketone with moderate stereoselectivity, whereas the presence of substituentin meta-position dramatically increases the enantioselectivity. Steric factor associated toortho-substitution reduces the yield and e.e .

O

O O

CH3

O

CH3

OOH

HO HO

O O

OH OH

Baker`s yeastreduction



90% e.e

60% e.e

Oxidation of alcohols

The oxidation of alcohols leading to aldehyde formation is an interesting reaction in Organic Chemistry because the aldehydes are not stable in the conventional chemical oxidation conditions of primaryalcohols.This process has been successfully developed using whole cells of Gluconobacteroxidans (Villa et al. Tet. Lett, 2002, 43,6059-6061).

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OHH

HHO

OHH

OHH

CH2OH

NH

OHH

HHO

OHH

CH2OH

NH

O

N-butylglucamine 6-deoxy-6-butylaminosorbose

Proceso Pharmacia- Síntesis de 6-deoxi-6-butilaminosorbosa

Condiciones de reacciónCondiciones de reacción[S] =0.927 K, 220g/LpH=5.5 – 6,0T= 12-15ºCCelulas humedas 14g/L de Gluconobacter oxydans ATCC 621Rendimiento 100%

Landis et al. Org.Proc.Res. Dev. 2002, 6, 547-552

Single biocatalysts T=30ºC, 24h

Recently Voss et al. (2007) reported the deracemization via inversion of rac-2-decanol bycombined one-pot oxidation/reduction sequence using lyophilized cells of Rhodococcus sp CBS717.73 or Rh. rubber DSM 44541.Reaction conditions :T= 30ºC, 10g/l substrate, 82% yield and 92% e.e. in (S)-2-decanol,using iso-propanol/acetone couple as secondary substrates

This process is a green alternative to the process in two steps. The first one is aconventional oxidation of racemic alcohol- catalyzed by a transition metal complex- to the ketonethat is stereoselectively reduced to one stereomer.

OHO OH

OOOH OH

Step1non-enantiospecificoxidation

Step 2stereoselective reduction

rac-2-decanol 2-decanone (S)- 2-decalol

Microbial Baeyer-Villiger oxidation is a valuable tool to obtain lactones from ketones in a stereoselective manThis biocatalysed reaction is a green alternative to the non stereoselective chemical process (Rudroff et al. 2007).

The process is catalyzed by a Baeyer-Villiger monoxygenase that is a flavin and NADH-dependent enzyme.Acinetobacter calcoaceticus cyclohexane monoxygenase (CMO) has been used as reference to optimizethe production of the enzyme by conventional Microbiological methodologies (Barclay et al. 2001) and to study the substrate specificity in the Baeyer-Villiger oxidation (Zambianchi et al. 2000) using racemic bicycle[3.2.0]hept-2-en-6-one as the substrate. CMO carry to (1R,2S) and (1S, 5R) lactones.

MONO-OXYGENASES- Baeyer-Villiger oxidation

HH

O

O

O

O

O

(1R,2S)

(1S,2R)

HH

HH

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O

R

O

O

H

R

O

O

H3CO

H3CO

OO

(+) enterolactone

The dependence of the coenzyme and the low thermostability complicate the utilization of isolated BVMOs.An alternative is the over expression of desired BVMO in Escherichia coli (Doig et al. 2001) highly productive and easy to handlebiocatalyst by organic chemists.

O O O

OO

OOH3CO

H3CO

H3COH3CO

H3CO

H3CO

OH

CH3

CH3

(-) butyrolactone

(+) hinokinin

(+) schizandrin

In Scheme we show how the BVMO from Brevibacterium (99%) and Comamonas (76%) expressed in E. coli produced with 100% stereoselectivity,(-) - butyrolactone that is the key intermediate in the synthesisof enterolactone (antitumor), hinokinin (cytostatic) and schizandrin(antifungi) (Rudroff et al. 2007)

NUCLEOSIDE analogous synthesis

HO

N

NN

N

NH2

OHOH

HHHH

HO

N

NN

N

OH

OHOH

HHHH

racemic aristeromycin

(+) aristeromycin

NN

NN

H2N

OH

HO OH

H HH H

NH2

The broad substrate specificity o f ADA has been usedIn the resolution of racemic aristeromycin.The deamination of (-) isomer into the correspondinghypoxanthine derivative (3h, r.T) allowed for recovering(+) aristeromycin (>99%e.e) (Secrist et al. 1987)

(+) aristeromycin

HO

N

NN

N

HH

HO

NH

N

N

O

NH2N

HH

NN

NN

H2N

OH

H H

+

NN

NN

HO

OH

H H

ADA

Phosphate buffer (pH=7.2)

T=25ºC, 72h

Phosphate buffer (pH=7.5) ADA37ºC, 72h

(-) carbovir

(+) carbovir

Table 11 Productivity of adenosine, inosine and hypoxanthine from uridineand adenine by E. amnigenus and B. subtilis cultured in standard medium andin minimal medium supplied with adenosine (0.2% w/v). Reaction condition: Temperature= 55ºC, speed agitation = 100 r.p.m, reaction time = 20 min. The values represented the media SD (n=3).

Microorganism Productivity (nmoles/106 cells.h)

Adenosine Inosine Hypoxanthine

B1

O

ROH

HO

O

ROH

HO

OPO3-2

E 1, P, -B 1 E

2 , -P, B2

B1 = pyrimidine; B2 = purineE1 = pyrimidine nucleoside phosphorylaseE2 = purine nucleoside phosphorylaseP = inorganic phosphate; R = H or OH

B2

O

ROH

HO

NUCLEOSIDE analogous synthesis

Standard mediumE. amnigenus CECT 4078B. subtilis CECT 4522Minimal mediumE. amnigenus CECT 4078B. subtilis CECT 4522

0.20 ± 0.010.11 ± 0.01

9.60 ± 0.074.5 ± 0.3

0.086 ± 0.0030.069 ± 0.003

ndnd

1.46 ± 0.050.88 ± 0.01

ndNd

nd: not detected

Fernandez-Lucas et al. Biotechnol.Bioeng. 2008: 100(2),213-222

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Dioxygenases- Dihydroxylation of arenes

Intracellular enzymes that oxidize aromatic substrates to 1,2-cis-dihydrodiol are interesting in organic synthesis because this kind of compounds are notaccessible by conventional chemical reactions. The biotransformation is catalyzed by a multienzymatic complex NADH dependentSinisterra & Dalton, 1996)

CH3 CH3 CH3HNADH/H NAD+

O

O

OH

OHH

H

H

O2 +

Dioxygenase

The biotransformations is pperformed usingPseudomonas putida UV4 and biphasic conditionsIndeed using 20% tetradecane/phosphate buffer (pH=7)(v/v), 86.5g/l can be converted to the cis-diol.

Quintana & Dalton Enz.Mic.Technol. 1998,27, 713-720

Hydroxylation of alkanes and of steroids

Asymmetric hydroxylations of unfuntionalyzed hydrocarbons provide a powerful Method to obtain potentially useful, optically active oxyfunctionalized synthons of unactivated hydrocarbons. There exist only a few classical synthetic using transition metals complexes with low stereoselectivity. Alternatively, microorganisms have already been successfully applied for theselective oxygenation of unactivated sites in hydrocarbons, for which the mild conditions and efficacy of bioreactions remain unchallenged (Johnson, 1978). The majority of the current work focuses on the hydroxylation of steroids orThe majority of the current work focuses on the hydroxylation of steroids or terpenes (Garcia-Granados et al. 2003).

For these biotransformations mostly fungi such as Rhizopus nigricans, Mortiella isabellina and Cunninghamella elegans have been employed and high regio-and enantioselectivities have been reported (Davieset al. 1997; Holland 1999)

Hydroxylation of steroids

OO

HO

O

O

H

OH

16-hydroxyprogesterone

Rhizopus spp

Streptomyces spp.

O

progesterone

O

H


H

O

O

H

HO


Rhizopus spp.

Curvularia spp.

Aspergillus spp.

Cunninghamella spp.

•Fernandes, et al. Enzyme and Microbial Technology 2003, 32, 688-705•. Mahato, S. B. and Garai, S. in. Advances in microbial steroid biotransformation. Steroids 1997, 62, 332-345

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23

Hydroxylation of steroids

The hydroxylation in C11 is for anti-inflammatory action, whereas 16α-hydroxylated steroids have increased glucocorticoid activity.

Both 11α and 11β-hydroxylationsare mainly described using filamentous fungi.

12

34

56

7

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14 1516

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2425

27

26

O

O

O

O

Curvular ia lunata NRRL 2380

O

O

O

OHO

11-hydroxy-(17-acetyloxy)-6-methyl-pregn-4-ene-3,20-dione

Medroxiprogesterone acetate17-acetyloxy-6-methyl-pregn-4-ene-3,20-

dione

Nor cadia simplex ATCC 6940

OO

O

O OHO

11-hydroxy-(17-acetyloxy)-6-methyl-pregn-1,4-diene-3,20-dione

KOH, ,MeOH

O

OHHO

11 17-dihydroxy-6-methyl-pregn-1,4-diene-3,20-dione

anhydrous Cl2 + Br2 in CH2Cl2

O

OH

O

HO

Br

21-Bromo-11 17-dihydroxy-6-methyl-pregn-1,4-diene-3,20-dione

anhydrous NaOAcDMF

anhydrous K2CO3

O

OH

O

HO

HO

6-methyl-prednisolone21-Bromo-11 17 21-trihydroxy-

6-methyl-pregn-1,4-diene-3,20-dione

celindust [modo de compatibilidad]webs.ucm.es/info/btg/personales/jvsgago/celindust [modo de...

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