modificaciÓn organocatalÍtica de almidÓn para la …
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TESIS DOCTORAL
MODIFICACIÓN ORGANOCATALÍTICA DE
ALMIDÓN PARA LA OBTENCIÓN SOSTENIBLE DE
DERIVADOS DE ALTO VALOR AGREGADO
AUTOR
MG. MARIBEL VICTORIA TUPA VALENCIA
DIRECTOR DE TESIS
DRA. MARÍA LAURA FORESTI – ITPN (UBA - CONICET)
CO-DIRECTOR DE TESIS
DRA. MARÍA LIDIA HERRERA – ITPN (UBA - CONICET)
JURADO DE TESIS
DRA. SILVIA GOYANES (FCEN - UBA - CONICET)
DRA. VERA ÁLVAREZ (UNMDP - CONICET)
DRA. NORA FRANCOIS (FIUBA)
DRA. ALBA NAVARRO (UNLP - CONICET)
LUGAR DE TRABAJO
INSTITUTO DE TECNOLOGÍA EN POLÍMEROS Y NANOTECNOLOGÍA (ITPN –
UBA – CONICET)
EN EL MARCO DE LA BECA DOCTORAL CONICET
FACULTAD DE INGENIERÍA – UNIVERSIDAD DE BUENOS
AIRES
BUENOS AIRES, MARZO DE 2019
1
A mi familia,
A mi novio Fran y a nuestra Morita .
2
3
AGRADECIMIENTOS
A María Laura Foresti, directora de la presente Tesis, por la oportunidad de
trabajar en su grupo de investigación y adquirir nuevos conocimientos. Por su apoyo,
gran paciencia y comprensión durante todo el desarrollo experimental (gracias por
enseñarme y guiarme en este proceso de aprendizaje), así como en la escritura de ésta
Tesis. Gracias por el tiempo dedicado y la motivación para mejorar cada día.
A mi codirectora, María Lidia Herrera, por su acompañamiento académico.
Gracias por la comprensión y apoyo para la realización de la Tesis.
A la Dra. Celina Bernal, por sus preciados y relevantes aportes, comentarios y
sugerencias durante el desarrollo de esta investigación.
A la Dra. Alba Navarro, por haberme ayudado con los ensayos de reología en el
CIDCA.
A Carolina Medina, por compartir sus conocmientos experimentales
desinteresadamente conmigo, incluso a distancia.
A mis compañeros del ITPN que de alguna u otra forma (cuidando mis
experimentos, enseñándome dónde encontrar algún material de laboratorio, dándome
algún punto de vista respecto a resultados experimentales, animándome a continuar,
entre otros) colaboraron en el desarrollo de mi investigación. Gracias por el
compañerismo mostrado.
A mi gran amiga Gina, por su bondad, su apoyo indondicional, sus consejos, por
escucharme, por acompañarme hasta las últimas horas hasta terminar mis ensayos.
A mis padres, por su gran esfuerzo y entera confianza en mi decisión de salir del
país para mi desarrollo profesional. Gracias por su apoyo incondicional y la orientación
para poder realizarme en todos los ámbitos de mi vida. Gracias por visitarme cada año,
4
sé que no muchos tienen ese privilegio y ustedes me dieron muchas fuerzas. Mamá,
gracias por tu paciencia, y por las palabras y mensajes que estuvieron en cada momento
justo, por ser mi amiga y enseñarme que la perseverancia y el esfuerzo son el camino
para lograr mis objetivos.
A mi familia por su comprensión y apoyo en mi decisión de elegir un camino
diferente para realizar mis estudios de posgrado lejos de casa. Familia gracias por todo
el amor mostrado y por el aliento necesario.
A mi novio Fran, por su apoyo, comprensión y compañía incondicional. Un
agradecimiento extra por ayudarme con la construcción/elaboración de materiales de
laboratorio que precisé para mis muestras. Gracias Fran por ser parte de esta
experiencia. A Morita, nuestra hija canina (y despertador matutino), que siempre me
espera y recibe con mucha felicidad.
Y por último, a Dios y a la Virgen María, que siempre me han iluminado para
darme fuerzas en cada paso. Gracias por rodearme de ángeles en éste país donde
encontré gente cálida y muy amable, y sobre todo por mantener con salud y bienestar a
todas estas personas a quienes tengo tanto que agradecer.
5
PRODUCCIÓN CIENTÍFICA
1) PUBLICACIONES EN REVISTAS INDEXADAS
Tupa, M. V., Arroyo, A., Herrera, M. L., & Foresti, M. L. (2018). Production of
esterified starches with increased resistant starch content by an α-hydroxy acid-
catalyzed route. Starch – Stärke, 70 (1700155), 1–9.
Di Filippo, S., Tupa, M. V., Vázquez, A., & Foresti, M. L. (2016). Organocatalytic
route for the synthesis of propionylated starch. Carbohydrate Polymers, 137, 198–
206.
Tupa, M., Ávila Ramírez, J. A., Vázquez, A., & Foresti, M. L. (2015). Organocatalytic
acetylation of starch: effect of reaction conditions on DS and characterisation of
esterified granules. Food Chemistry, 170, 295–302.
Foresti, M. L., Tupa, M. V., Ávila Ramírez, J. A., Cerrutti, P., & Vázquez, A. (2014).
Acetilación sostenible de biopolímeros mediada por un alfa-hidroxiácido de
origen natural. Anales de la Academia Nacional de Ciencias Exactas Físicas y
Naturales, 66, 65–73.
2) PARTICIPACIÓN EN CONGRESOS
Tupa, M. V., Navarro, A., Herrera, M. L., & Foresti, M. L. The effect of L-tartaric acid
as cross-linking agent in the production of dual modified corn starches. XVI
Simposio Latinoamericano de Polímeros, Mar del Plata – Argentina, 6 – 9 de
noviembre 2018.
Tupa, M. V., Herrera, M. L., & Foresti, M. L. Modificación organocatalítica de
almidón para la obtención sostenible de derivados de alto valor agregado.
Segundo Seminario de Vinculación y Transferencia SEVyT 2018, Buenos Aires –
Argentina, 29 – 30 de octubre 2018.
Tupa, M. V., Altuna, L., Froimowicz, P., Herrera, M. L., & Foresti, M. L. Estudio del
progreso de la reacción de esterificación en gránulos de almidones acetilados por
vía organocatalítica. XII Simposio Argentino de Polímeros, Córdoba – Argentina,
18 – 20 de octubre 2017.
6
Tupa, M. V., Arroyo, S., Herrera, M. L., & Foresti, M. L. Producción de almidón
resistente mediante la esterificación organocatalítica de almidón de maíz. 6to.
Encuentro de Jóvenes Investigadores en Ciencia y Tecnología de Materiales,
Buenos Aires – Argentina, 17 y 18 de agosto 2017.
Tupa, M. V., Ávila Rámirez, J. A., Carvallo, E., & Foresti, M. L. Esterification of
polysaccharides catalyzed by naturally occurring α-hydroxy acids. 5th EPNOE
International polysaccharide conference, Jena – Alemania, 20–24 de agosto 2017.
Tupa, M. V., Arroyo, S., Herrera, M. L., & Foresti, M. L. Obtención de almidón
resistente por propionización organocatalítica de almidón de maíz. Congreso
Internacional de Metalurgia y Materiales 16° SAM – CONAMET, Córdoba –
Argentina, 22–25 de Noviembre 2016.
Tupa, M. V., Herrera, M. L., & Foresti, M. L. Assay of different α-hydroxy acids of
natural origin for the synthesis of propionized starches. II Workshop on Bio-
degradable Polymers and Biocomposites III Workshop BIOPURFIL, Bio-based
Polyurethane Composites with Natural Fillers, Buenos Aires – Argentina, 11–13
de noviembre de 2015.
Di Filippo, S., Tupa, M. V., Zuleta A., Vázquez, A., Foresti M. L. Síntesis
organocatalítica de almidones propionizados con aplicación como fuente de
almidón resistente. XI Simposio Argentino de Polímeros – SAP 2015, Santa Fé –
Argentina, 20–23 de octubre de 2015.
Tupa, M. V., & Foresti. M. L. Acetilación sostenible de almidón mediada por un -
hidroxiácido de origen natural. 5º Encuentro de Jóvenes Investigadores en
Ciencia y Tecnología de Materiales, Tandil – Argentina, 1–2 de octubre de 2015.
Tupa, M. V., Vázquez, A., & Forest, M. L. Novel organocatalytic acetylation of starch.
Effects of reaction conditions. Congreso Internacional de Metalurgia y
Materiales SAM-CONAMET / IBEROMAT 2014, Santa Fé – Argentina, 21 al 24
octubre de 2014.
7
RESUMEN
MODIFICACIÓN ORGANOCATALÍTICA DE ALMIDÓN PARA LA
OBTENCIÓN SOSTENIBLE DE DERIVADOS DE ALTO VALOR AGREGADO
La presente Tesis de Doctorado se enfocó en la obtención de almidones
esterificados por una ruta no convencional, su caracterización general exhaustiva, y el
análisis de propiedades relevantes para dos usos concretos específicos: i) almidones
modificados para uso como aditivo de alimentos y ii) almidones esterificados con
ácidos grasos de cadena corta como fuente de almidón resistente.
En el Capítulo 1 (Introducción), se describen las características más importantes
del almidón y sus principales propiedades y aplicaciones. Seguidamente, se revisa el
estado del arte sobre los distintos tipos de modificaciones del almidón que revisten
interés industrial, abordando en particular su esterificación y entrecruzamiento. A
continuación, se describen brevemente las metodologías conocidas para llevar a cabo la
esterificación del almidón, con particular foco en una vía catalizada por α-hidroxiácidos
que ha sido muy poco explorada en la literatura, y cuya potencialidad se estudia en la
presente Tesis. Finalmente, se introducen los fundamentos de dos aplicaciones
concretas del almidón esterificado que motivan el presente trabajo. Se presentan al final
de este capítulo los objetivos de la Tesis.
En el Capítulo 2 se detallan los materiales y métodos utilizados en esta Tesis. Se
resumen allí la técnica de preparación de los almidones esterificados, la cuantificación
del nivel de modificación conferido, y la variedad de técnicas utilizadas para su
caracterización tanto general como específica para cada aplicación de interés.
En el Capítulo 3 se estudia el progreso de la reacción de acetilación de almidón
de maíz catalizada por ácido tartárico. En una primera instancia se resume el estado del
arte de las metodologías de acetilación de almidones, y se introduce la ruta de
esterificación de polisacáridos mediada por α-hidroxiácidos. A continuación, se
presentan los resultados de avance de la reacción en el tiempo bajo condiciones
8
prefijadas, y se caracterizan los productos de reacción en términos estructura química,
morfología, cristalinidad, estabilidad térmica y cambios en la polaridad del almidón
resultantes de la derivatización. Seguidamente, se analiza la posibilidad de la existencia
de reacciones simultáneas de entrecruzamiento del almidón con ácido tartárico, y por
último se analiza cómo avanza la derivatización en el volumen del gránulo. El capítulo
finaliza con la selección de potenciales usos de interés para los almidones obtenidos,
cuya caracterización específica se aborda en los siguientes capítulos.
En el Capítulo 4 se introduce la utilización de almidones acetilados,
entrecruzados y doblemente modificados como aditivo en la industria de alimentos.
Seguidamente, se preparan almidones acetilados con grado de sustitución permitido por
la FDA, y los productos se caracterizan en términos de sus propiedades funcionales. Se
evalúan así propiedades tales como poder de hinchamiento, solubilidad, claridad de la
pasta, retrogradación, propiedades térmicas de gelatinización y propiedades reológicas;
y se destacan las propiedades diferenciales de los almidones doblemente modificados
producidos.
En el Capítulo 5 se describe la importancia de los almidones químicamente
modificados como fuente de almidón resistente; y en particular se destaca la
recientemente reconocida utilidad de los almidones esterificados con grupos acetato,
propionato y butirato para entregar el ácido graso de cadena corta específico al colon. A
continuación, se describe la preparación de almidones propionizados, y se evalúa el
efecto del grado de derivatización y la cristalinidad del almidón utilizado como materia
prima en el contenido de almidón resistente de los productos. Se analiza también la
resistencia a la digestión de los almidones acetilados del Capítulo 3, y se estudia el
efecto de la cocción del almidón en la resistencia remanente. Se resume al final de este
capítulo un caso concreto de evaluación de los almidones esterificados por la ruta aquí
estudiada para vehiculizar el ácido graso esterificado al colon.
En el Capítulo 6 se resumen las conclusiones generales de este Trabajo de Tesis
y se plantea el trabajo futuro.
9
ABSTRACT
ORGANOCATALYTIC MODIFICATION OF STARCH FOR THE
SUSTAINABLE PRODUCTION OF HIGH ADDED VALUE
DERIVATIVES
This Doctoral Thesis focused on the synthesis of starches esterified by an
unconventional route, its general deep characterization, and the analysis of relevant
properties for two specific uses: i) modified starches for use as a food additive and ii)
starches esterified with short chain fatty acids as a source of resistant starch.
Chapter 1 (Introduction), reports the most important characteristics of starch and
its main properties and applications are described. In addition, the state of the art is
reviewed on the different types of starch modifications that are of industrial interest,
addressing in particular its esterification and cross-linking. Moreover, the known
methodologies to carry out starch esterification are briefly described, with particular
focus on a pathway catalyzed by α-hydroxy acids that has been very little explored in
the literature, and whose potential is studied in this Thesis. Finally, the foundations of
two specific applications of the esterified starch that motivate the present work are
introduced. The objectives of the Thesis are presented at the end of this chapter.
Chapter 2 describes in detail the materials and methods used in this Thesis. The
technique of preparing the esterified starches, the quantification of the level of
modification conferred, and the variety of techniques used for their general and specific
characterization for each application of interest are summarized therein.
Chapter 3 shows the studies on the progress of the acetylation reaction of corn
starch catalyzed by tartaric acid. Initially, the state of the art of starch acetylation
methodologies is summarized, and the polysaccharide esterification route mediated by
α-hydroxy acids is introduced. Next, the results of the reaction in time under pre-set
conditions are presented, and the reaction products are characterized in terms of
chemical structure, morphology, crystallinity, thermal stability and changes in starch
polarity resulting from the derivatization. Then, the possibility of the existence of
10
simultaneous cross-linking reactions of the starch with tartaric acid is analyzed, and
finally the progress of the derivatization inside the granule is studied. The chapter ends
with the selection of potential uses of interest for the obtained starches, whose specific
characterization is addressed in the following chapters.
Chapter 4 introduces the use of acetylated, cross-linked and doubly modified
starches as an additive in the food industry. Acetylated starches are prepared with a
degree of substitution allowed by the FDA, and the products are characterized in terms
of their functional properties. Properties such as swelling power, solubility, clarity of
the paste, retrogradation, gelatinization thermal properties and rheological properties are
thus evaluated; and the differential properties of the doubly modified starches produced
are highlighted.
Chapter 5 describes the importance of chemically modified starches as a source
of resistant starch; and in particular, the newly recognized utility of starches esterified
with acetate, propionate and butyrate groups to deliver the short-chain fatty acid specific
to the colon is highlighted. The preparation of propionized starches is also described,
and the effect of the degree of derivatization and the crystallinity of the starch used as a
raw material in the resistant starch content of the products is evaluated. The resistance
to digestion of the acetylated starches in Chapter 3 is analyzed, and the effect of the
starch cooking on the remaining resistance is studied. At the end of this chapter, a
concrete case of evaluation of starches esterified by the route studied here to transport
the esterified fatty acid to the colon is summarized.
Chapter 6 summarizes the general conclusions of this Thesis and future work is
discussed.
11
12
13
ÍNDICE GENERAL
1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS ............................................................. 19
1.1. Almidón ............................................................................................................. 21
1.1.1. Composición ............................................................................................... 22
1.1.2. Características principales ........................................................................... 25
1.1.2.1. Cristalinidad ................................................................................... 25
1.1.2.2. Gelatinización ................................................................................. 28
1.1.2.3. Retrogradación ............................................................................... 31
1.1.3. Aplicaciones ............................................................................................... 32
1.2. Almidones modificados ..................................................................................... 33
1.2.1. Modificación química ................................................................................ 34
1.2.1.1. Almidones entrecruzados................................................................ 35
1.2.1.2. Almidones esterificados.................................................................. 38
1.2.1.2.1. Generalidades ..................................................................... 38
1.2.1.2.2. Usos .................................................................................... 39
1.2.1.2.3. Formas de obtención .......................................................... 41
1.3. Objetivos ............................................................................................................. 46
1.3.1. Objetivo general .......................................................................................... 46
1.3.2. Objetivos específicos .................................................................................. 46
2. MATERIALES Y MÉTODOS....................................................................... 47
2.1. Materiales ............................................................................................................ 49
2.2. Esterificación organocatalítica de almidones ...................................................... 49
2.3. Cuantificación del nivel de esterificación alcanzado ........................................... 51
2.4. Caracterización general........................................................................................ 53
14
2.4.1. Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear 1H en estado líquido
(RMN 1H) .............................................................................................................. 53
2.4.2. Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear 13C en estado sólido
(RMN 13C) ............................................................................................................. 54
2.4.3. Espectroscopía de Infrarrojo por Transformada de Fourier ........................ 54
2.4.4. Microscopía Electrónica de Barrido............................................................ 55
2.4.5. Difracción de Rayos X ............................................................................... 55
2.4.6. Análisis Termogravimétrico........................................................................ 55
2.4.7. Ensayo cualitativo de reparto en una mezcla de líquidos inmiscibles (fase
polar/ no polar) ...................................................................................................... 56
2.5. Estudio de la gelatinización ................................................................................. 56
2.5.1. Microscopía Óptica de Luz Polarizada ....................................................... 56
2.5.2. Calorimetría Diferencial de Barrido............................................................ 56
2.6. Propiedades funcionales ...................................................................................... 57
2.6.1. Poder de hinchamiento y solubilidad .......................................................... 57
2.6.2. Claridad de la pasta ..................................................................................... 58
2.6.3. Sinéresis ...................................................................................................... 58
2.6.4. Caracterización reológica de la pasta .......................................................... 59
2.7. Contenido de almidón resistente .......................................................................... 60
3. ACETILACIÓN ORGANOCATALÍTICA DE ALMIDONES ........ 61
3.1. Introducción ......................................................................................................... 63
3.1.1. Estado del arte de la acetilación de almidones ............................................ 63
3.1.2. Esterificación de polisácaridos mediada por α-hidroxiácidos..................... 67
3.2. Resultados y discusión ......................................................................................... 69
3.2.1. Evolución de la reacción de acetilación de almidón de maíz...................... 69
3.2.1.1. Seguimiento del avance de reacción (GS) ...................................... 69
15
3.2.1.2. Caracterización general de productos ............................................ 71
3.2.1.2.1. Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear 13C en
estado sólido ...................................................................................... 71
3.2.1.2.2. Espectroscopía de Infrarrojo por Transformada de Fourier.
............................................................................................................ 76
3.2.1.2.3. Microscopia Electrónica de Barrido .................................. 79
3.2.1.2.4. Difracción de Rayos x ....................................................... 81
3.2.1.2.5. Análisis Termogravimétrico ............................................... 83
3.2.1.2.6. Ensayo cualitativo de reparto en una mezcla de líquidos
inmiscibles (fase polar/no polar) ....................................................... 92
3.2.2. Ensayos destinados a inferir entrecruzamiento ........................................... 93
3.2.2.1. Ensayos de gelatinización ............................................................... 96
3.2.2.2. Poder de hinchamiento ................................................................... 98
3.2.2.3. Algunos comentarios sobre el nivel de entrecruzamiento ............ 103
3.2.3. Inspección del avance de reacción en el volumen del gránulo ................. 104
3.3. Conclusiones del Capítulo 3 .............................................................................. 114
4. ALMIDONES ESTERIFICADOS PARA LA INDUSTRIA DE
ALIMENTOS ........................................................................................................ 119
4.1. Introducción ...................................................................................................... 119
4.1.1. Almidones acetilados para uso como aditivo alimentario ........................ 119
4.1.2. Almidones entrecruzados para uso como aditivo alimentario ................. 121
4.1.3.Almidones doblemente modificados para uso como aditivo
alimentario…………………………………………………………………..…. 122
4.2. Resultados y discusión ...................................................................................... 124
4.2.1. Preparacion de almidones modificados .................................................... 124
4.2.2. Caracterización general de productos ...................................................... 124
4.2.2.1. Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear 1H en estado
líquido ........................................................................................................ 124
16
4.2.2.2. Espectroscopía de Infrarrojo por Transformada de Fourier ........ 126
4.2.2.3. Microscopía Electrónica de Barrido ............................................ 127
4.2.2.4. Difracción de Rayos X ................................................................. 127
4.2.3. Estudio de la gelatinización ..................................................................... 128
4.2.3.1. Microscopía Óptica de Luz Polarizada ........................................ 128
4.2.3.2. Calorimetría Diferencial de Barrido ............................................ 136
4.2.4. Propiedades funcionales ............................................................................ 139
4.2.4.1. Poder de hinchamiento y solubilidad ........................................... 139
4.2.4.2. Claridad de la pasta ...................................................................... 144
4.2.4.3. Claridad de la pasta post refrigeración ........................................ 146
4.2.4.4. Sinéresis ....................................................................................... 147
4.2.4.5. Caracterización reológica de la pasta .......................................... 149
4.2.4.5.1. Ensayos rotacionales ....................................................... 150
4.2.4.5.2. Ensayos dinámicos .......................................................... 152
4.7. Conclusiones del Capítulo 4 .............................................................................. 154
5. ALMIDONES ESTERIFICADOS CON ÁCIDOS GRASOS DE
CADENA CORTA (AGCC) DE INTERÉS EN NUTRICIÓN Y
SALUD PÚBLICA .................................................................................. 159
5.1. Introducción ..................................................................................................... 159
5.1.1. Almidones resistentes ............................................................................... 159
5.1.2. Almidones esterificados con ácidos grasos de cadena corta .................... 162
5.2. Resultados y discusión ..................................................................................... 165
5.2.1. Preparación de almidones propionizados ................................................. 165
5.2.2. Caracterización general de productos ...................................................... 166
5.2.2.1. Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear en estado sólido 13C CP/MAS .............................................................................................. 167
17
5.2.2.2. Espectroscopía de Infrarrojo por Transformada de Fourier ......... 171
5.2.2.3. Microcospía Electrónica de Barrido ............................................. 172
5.2.2.4. Difracción de Rayos X ................................................................. 174
5.2.3. Contenido de almidón resistente .............................................................. 177
5.2.3.1.Contenido de almidón resistente en almidones propionizados ...... 180
5.2.3.2. Extensión a otros AGCC. Efecto de la cocción en el contenido de
almidón resistente ..................................................................................... 182
5.2.4.Utilidad de los almidones obtenidos como vehiculizantes de AGCC ...... 187
5.3. Conclusiones del Capítulo 5 ............................................................................ 189
6. CONCLUSIONES GENERALES ......................................................... 193
ANEXOS …………………………………………………………………………….195
NOMENCLATURA ..………………………………………………………………201
LISTA DE FIGURAS …………………………………………………………….....203
LISTA DE TABLAS …………………………………………………………...……211
REFERENCIAS ………………………………………………………...…………...213
18
19
Capítulo 1
INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS
20
21
1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS
1.1. ALMIDÓN
El almidón es uno de los biopolímeros naturales más abundantes de la
naturaleza. El mismo ha sido ampliamente estudiado debido a su bajo costo,
biodegradabilidad y disponibilidad. Se encuentra distribuido en diferentes órganos de
las plantas como carbohidrato de reserva, con la posibilidad de ser aislado a partir de
cereales (ej. maíz, arroz, trigo), tubérculos (papa), raíces (mandioca, batata),
leguminosas (arvejas, lentejas) y, dependiendo de la concentración y estado de madurez,
a partir de algunas frutas (banana, manzana, tomates verdes). Desde el punto de vista
nutricional el almidón es el componente mayoritario en la dieta humana, siendo una
fuente de energía esencial para el hombre.
Figura 1.1. Micrografías obtenidas por Microscopía Electrónica de Barrido (por sus siglas
en inglés SEM) de gránulos de almidón de diferentes fuentes botánicas. Fuente: Khalid,
You, Liu, & Ali, 2017.
Maíz Arroz Trigo
Mandioca Papa Batata
22
En la naturaleza el almidón se encuentra organizado en partículas discretas
denominadas gránulos. Según su fuente botánica los gránulos de almidón tienen distinto
tamaño (≈ 1 - 200 μm), forma (elíptica, esférica, angular, poligonal), composición
(relación amilosa/amilopectina, contenido de lípidos, proteínas y minerales), y
estructura supramolecular. En la Figura 1.1 se muestran micrografías electrónicas de
gránulos de algunos almidones de diverso origen.
1.1.1. COMPOSICIÓN
El almidón está compuesto por cadenas de unidades anhidroglucosa (D-glucosa)
de seis carbonos. La estructura del monosacárido D-glucosa puede ser representada
como una cadena abierta o como una forma de anillo (piranosa), con configuración o
ß (Figura. 1.2). En el almidón los anillos de D-glucopiranosa se encuentran unidos por
enlaces glucosídicos (14) y (16).
Figura. 1.2. Cadena abierta y estructura del anillo de piranosa de la D-glucosa. Fuente:
Thomas & Atwell, 1998.
O
H
OH
OH
OH
H
HO C
C
C
OH
C
C
H
CH2OH
H
H
OH
OH H
H
C
C
C C
C
H
CH2OH
O
H
HO
ß
6
4
HC = O
HCOH
HOCH
HCOH
HCOH
CH2OH
1
2
3
5
H
C
HO
H
C 2
C
H
3
4 OH
CH2OH
OH
1C
O
H C
5
6
H
OH
H
ó
23
Los gránulos de almidón están esencialmente compuestos por dos polímeros de
glucosa de diferente estructura: la amilosa y la amilopectina. La amilosa es un polímero
esencialmente lineal, mientras que la molécula de amilopectina es mucho más grande y
ramificada (Fennema, 2000). Además de estas dos moléculas, los gránulos de almidón
suelen contener pequeñas cantidades de lípidos, proteínas y minerales.
La amilosa consta esencialmente de una cadena lineal compuesta por unidades
D-glucopiranosa unidas por enlaces (14) (Figura 1.3). Las moléculas de amilosa
tienen un peso molecular medio de 106 Da.
Figura. 1.3. Molécula de amilosa. Fuente: Cui, 2005.
A pesar de ser ilustrada como una cadena recta, en solución a temperatura
ambiente la amilosa adopta una disposición helicoidal en la que cada vuelta de hélice
consta de seis moléculas de glucosa. La abundancia de grupos hidroxilo situados en el
exterior de la hélice le imparte propiedades hidrofílicas al polímero.
La amilopectina, por su parte, es una de las moléculas más grandes de la
naturaleza, y en general la más predominante en el almidón. Es un polímero altamente
ramificado, mucho más grande que la amilosa y con un peso molecular de entre 107 y
5x108 Da. La molécula de amilopectina consta de una cadena principal de unidades
glucopiranosa unidas por enlaces glucosídicos (14). Cada 20 - 30 residuos de
glucopiranosa ocurre un punto de ramificación donde una cadena lateral (compuesta
también por unidades de glucopiranosa) se une a un grupo hidroximetilo en la posición
O O
O
O
O
O
O O
CH2OH CH2OH CH2OH CH2OH
OH OH OH OH
Enlace (14)
OH
OH
OH
OH
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
24
C6 de un residuo de glucosa de la cadena principal a través del enlace glucosídico
(16) (Figura. 1.4). Las cadenas laterales le otorgan a la amilopectina una estructura
altamente ramificada y compleja que puede variar entre diferentes almidones con
respecto a la ubicación y longitud de las ramas (Copeland, Blazek, Salman, & Tang,
2009).
Figura. 1.4. Molécula de amilopectina. Fuente: Cui, 2005.
Según se observa en la Tabla 1.1, las cantidades relativas de amilosa y
amilopectina en los gránulos de almidón dependen de su origen botánico. El contenido
de amilosa representa normalmente entre el 15 y el 30% del almidón. Sin embargo, se
conocen variedades de almidón de maíz (amilomaíz) cuya proporción de amilosa llega a
ser superior al 50%. El contenido de amilopectina representa normalmente entre el 75-
80% del almidón. En ciertos casos, sin embargo, el contenido de amilopectina alcanza
niveles de hasta un 98-99% (almidón ceroso o waxy).
Enlace (16)
O O
O
O
O
O
O O
CH2OH CH2OH CH2 CH2OH
OH OH OH OH
Enlace (14)
CH2OH
O
O
OH
O
CH2OH OH
O
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
OH
OH
OH
OH
OH
OH
H
H
H
H
H
H
H
H
25
Tipo de
almidón
Contenido de
amilosa (%)
Contenido de
amilopectina
(%)
Maíz 25 75
Maíz waxy < 1 > 99
Mandioca 17 83
Papa 20 80
Amilomaíz 55 - 70 45 - 30
Trigo 25 75
Arroz 19 81
Tabla 1.1. Contenido aproximado de amilosa y amilopectina en distintos tipos de almidón.
Fuente: Thomas & Atwell, 1998.
La proporción y la organización física de estos dos polímeros dentro de la
estructura del gránulo le confieren propiedades fisicoquímicas y funcionales propias a
cada tipo de almidón.
1.1.2. CARACTERÍSTICAS PRINCIPALES
Las propiedades funcionales del almidón dependen de un número de factores que
incluyen fundamentalmente la composición del polímero, la distribución de peso
molecular de la amilosa y la amilopectina, la organización molecular de estos polímeros
dentro del gránulo, y sus interacciones con otros componentes (Rincón, Rached,
Aragoza, & Padilla, 2007). A continuación se describen las propiedades del almidón de
mayor relevancia para este trabajo.
1.1.2.1. CRISTALINIDAD
Las propiedades físicas, estabilidad y transformaciones de los almidones son
muy dependientes de la naturaleza amorfa y cristalina de las regiones presentes en los
gránulos.
26
Figura 1.5. Representación esquemática de la estructura del gránulo de almidón: (a) un
gránulo con anillos de crecimiento amorfos y semicristalinos, (b) vista expandida de la capa
semicristalina de un anillo de crecimiento, (c) estructura de la amilopectina dentro de la
capa semicristalina. Fuente: Jacobs & Delcour, 1998.
Dentro de los gránulos de almidón la amilosa y la amilopectina se organizan en
una estructura en capas en las que se alternan regiones amorfas y semicristalinas de baja
y alta densidad denominadas anillos de crecimiento (Figura 1.5). El carácter cristalino
de los gránulos de almidón surge de la organización de las moléculas de la amilopectina
(específicamente a partir de las cadenas de la amilopectina estructuradas en racimos),
mientras que la región amorfa está conformada por los puntos de ramificación de la
amilopectina y por la amilosa (Jane, Wong, & McPherson, 1997). Las regiones amorfas
del almidón son especialmente susceptibles a la reacción química. De este modo, se
pueden eliminar preferencialmente por tratamiento ácido o pueden reaccionar
incorporando grupos funcionales. Además, las regiones amorfas son los principales
elementos estructurales hinchables del gránulo de almidón nativo (Liu et al., 2009).
La investigación del carácter cristalino del almidón se realiza por distintos
métodos físicos, entre ellos Difracción de Rayos X (DRX) y Resonancia Magnética
Nuclear (RMN). A partir de los estudios de DRX se conoce que el almidón presenta una
27
estructura semicristalina ordenada, siendo los tipos de cristalinidad más frecuentes del
almidón nativo los tipos A, B y C (difractogramas ilustrados en la Figura 1.6).
Figura 1.6. Patrones de difracción de rayos X de distintos almidones: (A) tipo A típico de
los almidones de cereales, (B) tipo B de almidones de tubérculos, (C) tipo C de almidones
procedentes de leguminosas y semillas, (V) tipo V de complejo de amilosa helicoidal.
Fuente: Cui, 2005.
El patrón de difracción tipo A es el más común en almidones de cereales como el
maíz, trigo y arroz; mientras que el patrón tipo B es característico de almidones de
tubérculos y frutas como los almidones de papa y banana, y de almidones retrogradados.
El patrón tipo C se trata de una forma mixta y se ha observado en mezclas de almidón
de papa y maíz, así como en distintos almidones de leguminosas, de ciertos tubérculos y
semillas (Fraser-Reid, Tatsuta, & Thiem, 2008; Bellitz, Grosh, & Schieberle, 2009). El
patrón tipo V resulta de complejos entre la amilosa y sustancias tales como ácidos
grasos, alcoholes o emulsificantes (Putseys, Lamberts, & Delcour, 2010).
La estructura semicristalina del almidón puede ser alterada por fenómenos como
la gelatinización del almidón que se dan a temperaturas de calentamiento específicas, y
que conllevan a una desorganización de la conformación estructural de la amilosa y la
amilopectina, resultando en una pérdida de la estructura semicristalina del almidón
procesado.
28
1.1.2.2. GELATINIZACIÓN
El almidón es esencialmente insoluble en agua fría. Sin embargo, una
combinación de agua y temperatura causa cambios únicos e irreversibles en la molécula
de almidón. Cuando el almidón se calienta en presencia de suficiente agua, se produce
imbibición o incorporación de agua en el gránulo y gradualmente se rompen los puentes
de hidrógeno entre las moléculas de almidón. De esta manera, el agua es capaz de
penetrar más profundamente en el gránulo de almidón, lo que da lugar a su
hinchamiento que se ve acompañado de la difusión de algunas cadenas cortas de
amilosa que salen hacia el medio líquido. Se cree que esto se produce primero en las
regiones amorfas del gránulo, donde los enlaces de hidrógeno son menos numerosos y
es además la región del polímero más susceptible a disolverse (Vaclavik & Christian,
2002). Con el continuo calentamiento, los gránulos de almidón hinchados ocupan más
espacio y la mezcla espesa a medida que los gránulos se agrandan, colapsan y liberan
los componentes moleculares del almidón al medio continuo resultando en la formación
de una pasta. El producto final generalmente consta de una dispersión de componentes
moleculares y/o gránulos hinchados y/o gránulos lixiviados en el medio acuoso. La
composición de la pasta resultante define sus propiedades (por ejemplo su viscosidad y
claridad). El proceso descrito es llamado gelatinización y conlleva a la pérdida de la
estructura ordenada del almidón.
La gelatinización del almidón es un proceso complejo que puede describirse
como una transición de fase en el que la estructura del polímero pasa de un estado
ordenado a uno desordenado. Esto se manifiesta con la pérdida de la birrefringencia, en
donde la suspensión de almidón es claramente más translúcida porque el índice de
refracción del gránulo expandido está próximo al del agua. Este proceso requiere de una
gran cantidad de energía que promueva la pérdida de la organización molecular del
almidón, y en consecuencia la pérdida de su cristalinidad (Ratnayake & Jackson, 2006).
La presencia y el contenido de agua define principalmente la forma en que éste
fenómeno ocurre (Matignon & Tecante, 2017). Generalmente se requiere un porcentaje
de agua mayor al 30% (dependiendo de la fuente botánica) para que la gelatinización se
lleve a cabo. Cuando el agua es limitada no ocurre una gelatinización completa en el
intervalo usual de temperatura. Sin embargo, conforme la temperatura se incrementa,
29
los gránulos de almidón se vuelven progresivamente más móviles y eventualmente las
regiones cristalinas se disuelven (Slade & Levine, 1989). Otros factores como la fuente
botánica, la concentración del almidón, la presencia de otros solutos, y la temperatura y
condiciones de agitación durante el calentamiento, influyen también en la gelatinización
del almidón. El intervalo de temperatura en el que ocurre la gelatinización de este
polímero también varía ampliamente dependiendo de su fuente botánica.
Tipo de almidón Temperatura
inicial (°C)
Temperatura
pico (°C)
Temperatura
final (°C)
Entalpía
(J/g)
Maíz 64.0 69.0 75.5 13.0
Maíz de alta
amilosa (70 %
amilosa)
68.9 80.5 106.1 11.5
Maíz waxy 66.0 70.7 78.4 15.5
Trigo 57.1 61.6 66.2 10.7
Arroz (15 % de
amilosa) 61.5 70.0 78.6 7.1
Arroz waxy 76.1 81.1 87.0 19.2
Papa 61.6 65.9 79.4 17.0
Batata 67.3 72.7 79.6 13.6
Mandioca 63.9 70.5 82.7 8.5
Frijol negro 66.9 76.5 83.0 12.4
Garbanzo 59.4 64.7 71.1 9.7
Lentejas 60.7 66.1 76.1 12.6
Amaranto 63.0 70.0 78.0 10.5
Tabla 1.2. Parámetros de gelatinización del almidón (en exceso de agua) obtenidos por
DSC. Fuente: Ratnayake & Jackson, 2009.
Las propiedades térmicas de gelatinización del almidón pueden determinarse
rutinariamente usando instrumentos en los que se definen ciclos de temperatura
programados y que registran el flujo de calor requerido a medida que ocurren los
eventos térmicos. Para tal fin, son bien reconocidas las técnicas de Análisis Térmico
Diferencial (por sus siglas en inglés DTA) y Calorimetría Diferencial de Barrido (por
sus siglas en inglés DSC), siendo esta última la técnica más empleada para determinar
las temperaturas de inicio y final de la gelatinización y determinar la entalpía del
30
proceso. En la Tabla 1.2 se reportan las propiedades térmicas de gelatinización de
almidones de diversos orígenes medidas por DSC.
Debido a la importancia de la gelatinización sobre el procesamiento de muchos
productos a base de almidón, a menudo se requiere estudiar las propiedades asociadas a
la gelatinización del polímero incluyendo: la medición del punto final de birrefrigencia
(que se observa como la desaparición de la cruz de Malta cuando el almidón se observa
bajo la luz polarizada de un microscopio óptico), la solubilidad y el poder de
hinchamiento de los gránulos, y la viscosidad, textura y claridad de la pasta, entre otros.
Los valores de estas propiedades pueden variar considerablemente con la fuente de
almidón y con la proporción de amilosa/amilopectina. Asimismo, pueden ser alteradas
por modificaciones químicas o enzimáticas de los gránulos, y por la adición de solutos a
la dispersión.
Comenzando por el poder de hinchamiento, el mismo refleja la capacidad de
hidratación del almidón en agua. La solubilidad, por su parte, expresa la cantidad
porcentual de componentes de almidón lixiviados en el medio acuoso. Ambos
parámetros proporcionan evidencia de la magnitud de la interacción entre las cadenas de
almidón dentro de los dominios amorfos y cristalinos (Hoover, 2001). Como se
anticipó, el alcance de esta interacción se ve influenciada por la proporción de
amilosa/amilopectina, y por las características de los dos polímeros en términos de
distribución de peso molecular, y en el caso de la amilopectina, del grado de
ramificación y longitud y conformación de las ramificaciones (Singh et al., 2003).
Además del hinchamiento de los gránulos, con el incremento de la temperatura la
viscosidad del medio también aumenta. En las primeras etapas de calentamiento de una
suspensión de almidón en agua el aumento de la viscosidad se debe principalmente a la
alta proporción de gránulos hinchados y liberación de amilosa que conlleva a un pico
máximo de viscosidad de la suspensión. Una vez que el gránulo está completamente
hidratado, éste generalmente colapsa debido a que la red micelar se separa y difunde
hacia el medio acuoso disminuyendo la viscosidad. El aumento y la disminución de la
viscosidad durante la gelatinización pueden ser monitoreados mediante amilógrafos de
31
Brabender, analizadores rápidos de viscosidad (ARV) y viscosímetros rotacionales. Las
propiedades viscoelásticas de las pastas de almidón pueden ser evaluadas en reómetros.
La capacidad de las pastas de almidón para transmitir la luz cuando son
sometidas al paso de un haz radiante determina su claridad (Craig, Maningat, Seib, &
Hoseney, 1989; Aristizábal & Sánchez, 2007). La claridad de la pasta es un atributo
importante del almidón que indica el grado de transparencia de las pastas, y está
directamente relacionado con el estado de dispersión de los solutos y con la tendencia a
la retrogradación de los almidones.
1.1.2.3. RETROGRADACIÓN
La textura, viscosidad y color de la pasta de almidón cambian cuando el almidón
gelatinizado es enfriado y almacenado como consecuencia de su retrogradación.
Durante la retrogradación del almidón las cadenas moleculares del polímero
gelatinizado comienzan a reasociarse para formar nuevamente una estructura ordenada
(Sandhu & Singh, 2007). El proceso es acompañado por un incremento gradual de la
rigidez, dándose la formación de un gel, y posteriormente se inicia la separación de
fases entre el polímero y el solvente (sinéresis).
Un gel es un sólido elástico con un sistema de dos fases: una fase continua sólida
y una fase dispersa. La fase continua está compuesta principalmente por polímeros de
amilosa que forman una red tridimensional para retener la fase dispersa líquida. En el
enfriamiento del almidón gelatinizado se forman puentes de hidrógeno intermitentes
entre las moléculas de amilosa que se reasocian formando el gel. Las moléculas de la
amilopectina del gránulo de almidón tienen menos tendencia que la amilosa a
reasociarse, debido a que las moléculas altamente ramificadas no forman fácilmente
enlaces o geles. La poca reasociación de la amilopectina se da predominantemente en
las ramas cortas ultraperiféricas (Sandhu & Singh, 2007). A medida que la
retrogradación ocurre la pasta se vuelve opaca. Con el tiempo este gel, que ha sido
enfriado y mantenido en reposo, produce más asociación de tipo cristalino procedente
32
de la amilosa y se manifiesta claramente la pérdida de agua contenida en la red
tridimensional de la amilosa y la retracción del gel.
El agua expulsada es referida como agua de sinéresis, y la misma se libera
cuando la amilosa sufre retrogradación, cuando el gel se ha formado inapropiadamente,
y especialmente cuando el gel se ha expuesto a los efectos de ciclos de congelación-
descongelación. La estructura de amilosa resultante es frágil, perdiendo fácilmente el
agua atrapada.
La retrogradación es generalmente una propiedad indeseable en geles de almidón
porque afecta profundamente la calidad, aceptabilidad, y la vida útil de productos que
contienen este polímero, principalmente en la industria de alimentos. En consecuencia,
es necesario estudiar el nivel de retrogradación de los geles de almidón para evaluar la
estabilidad del gel. Como la retrogradación del almidón es un proceso complejo que
involucra una serie de eventos moleculares y fisicoquímicos, se han aplicado una
diversidad de métodos para investigar los cambios que tienen lugar en las propiedades
del almidón cuando ésta ocurre, incluyendo técnicas térmicas, reológicas,
espectroscópicas y cromatográficas, y difracción de rayos X (Karim, Norziah, & Seow,
2000; Wang et al., 2015).
1.1.3. APLICACIONES
El almidón se extrae de la materia prima vegetal mediante un proceso de
molienda por vía seca o húmeda y se comercializa como polvo. En la Argentina la
mayor producción de almidón procede de la industrialización del maíz con un constante
crecimiento a partir de 1990, alcanzando una producción de 115.000 toneladas en el
2014 (Informe Sectorial de las Cadenas Agroalimentarias, 2014). Actualmente, las
empresas con mayor producción de almidón de maíz a nivel nacional son ARCOR,
Productos de Maíz, Ledesma, y Glutal. También se produce en el país almidón de trigo
y de mandioca, aunque en mucha menor proporción. En nuestro país el almidón de maíz
es una importante materia prima para la obtención de jarabes (jarabe de glucosa, jarabe
de fructosa, etc.).
33
Como se describió previamente, el almidón es la principal fuente de
carbohidratos en la dieta humana y es un componente importante de muchos alimentos.
Como tal, este polisacárido es utilizado en diversas industrias debido a su bajo costo,
disponibilidad y habilidad para impartir una variedad de propiedades funcionales tanto a
productos de la industria de alimentos como de la no alimentaria.
El uso del almidón nativo en la industria alimentaria se debe a que constituye
una excelente materia prima para modificar la textura y consistencia de los alimentos
(Mason, 2009). Diversos almidones son agregados como aditivos en la elaboración de
sopas, salsas, alimentos infantiles, productos de panadería, productos lácteos, confituras,
snacks y productos cárnicos. Las aplicaciones no alimentarias del almidón se dan sobre
todo en el campo de los productos farmacéuticos, textiles, adhesivos y combustibles a
base de alcohol, entre otros. Los almidones nativos también se utilizan en sustitutos
bajos en calorías y en materiales de embalaje biodegradables (Kaur, Ariffin, Bhat, &
Karim, 2012).
Sin embargo, el almidón en su estado nativo presenta ciertas limitaciones que
restringen algunos usos, como por ejemplo su baja resistencia al esfuerzo de corte
durante el mezclado, baja estabilidad térmica, y alta tendencia a la retrogradación y
sinéresis que inducen la pérdida de textura del alimento (Chiu & Solarek, 2009; Kaur et
al., 2012). Asimismo, la hidrofilicidad del almidón nativo reduce su aplicabilidad en
determinados usos como por ejemplo aquellos que requieren su compatibilización con
medios no polares o que se ven limitados por la absorción de humedad.
1.2. ALMIDONES MODIFICADOS
La enorme variedad de productos alimentarios y no alimentarios comerciales que
involucran al almidón en su formulación exigen que éste sea capaz de tolerar una amplia
gama de técnicas de procesamiento, almacenamiento y condiciones finales de
utilización. En este contexto, algunas de las limitaciones funcionales del almidón nativo
pueden ser superadas modificando su estructura, para lo que se han desarrollado
modificaciones tanto físicas (tratamientos bajo diferentes combinaciones de
34
temperatura/humedad, presión, desgaste mecánico, irradiación, etc.) aplicados a cambiar
la estructura granular de los almidones y regular su hinchamiento, gelatinización y
solubilidad en agua fría); como enzimáticas (hidrólisis con diversas enzimas de calidad
alimentaria), y químicas (reacciones de derivatización o descomposición). Además, en
los últimos años se va tomando en cuenta cada vez más la llamada modificación
genética de los almidones, que a diferencia de las modificaciones físicas, enzimáticas y
químicas mencionadas, concierne a la ingeniería genética del ADN de la planta de la
que se obtiene el almidón y no al post-procesamiento o tratamiento de los gránulos de
almidón (Robinson, 2003).
La modificación del almidón nativo se orienta a mejorar una o más propiedades
fisicoquímicas específicas, como por ejemplo la resistencia a la degradación, el
hinchamiento de los gránulos, el mejoramiento de la fluidez, la compactación de las
pastas, etc. El objetivo de estas modificaciones es facilitar el proceso de fabricación de
un producto en un momento dado, o generar productos con propiedades específicas
deseables que no tienen los almidones nativos. Estas modificaciones dan origen a
numerosos derivados de almidón que encuentran aplicación en una amplia variedad de
productos industriales que van más allá de las aplicaciones alimentarias. En este
contexto, la modificación de almidones ha representado una evolución en las
tecnologías de procesamiento y las tendencias del mercado. A continuación se describen
algunas modificaciones químicas de almidones de interés para esta Tesis.
1.2.1. MODIFICACIÓN QUÍMICA
Entre los diferentes tipos de modificación del almidón, la modificación química
es la vía más común para obtener almidones con características deseables para la
aplicación industrial (Chiu & Solarek, 2009). En general, la modificación química
redunda en una mayor estabilidad molecular al cizallamiento mecánico y a la hidrólisis
ácida y térmica, se puede modular la viscosidad de las pastas y, entre otros beneficios,
se reduce la tasa de retrogradación respecto de la del almidón nativo.
35
Modificación
química del almidón Objetivo Beneficios
Tratamiento ácido Incrementar la temperatura de
gelatinización, disminuir la
viscosidad y aumentar la
resistencia del gel.
Mejora las propiedades
de textura con el
incremento de la
concentración de
almidón empleado.
Oxidación Introducir grupos carbonilo y
carboxilo que aumentan la claridad
y reducen la retrogradación de las
pastas de almidón cocidas.
Proporcionar una menor
viscosidad y estabilidad a baja
temperatura.
Mejora la adhesión de
recubrimientos.
Crea geles blandos y
estables.
Entrecruzamiento Fortalecer el gránulo de almidón.
Retrasar el desarrollo de la
viscosidad al retardar la hinchazón
de los gránulos.
Mejora la tolerancia a
medios ácidos y
tratamientos térmicos.
Esterificación Proporcionar estabilidad a bajas
temperaturas.
Disminuir la temperatura de
gelatinización.
Mejora la resistencia al
frío y a la congelación /
descongelación para
prolongar la vida útil.
Tabla 1.3. Procesos de modificación química de almidones más comunes. Fuente: Singh,
Kaur, & McCarthy, 2007.
La modificación química del almidón es generalmente alcanzada a través de
reacciones de derivatización tales como eterificación, esterificación, entrecruzamiento
(cross-linking) y polimerización por injerto del almidón; o de descomposición, como la
hidrólisis ácida u oxidación del almidón. En la Tabla 1.3 se describen algunos de los
principales métodos de modificación química del almidón, y a continuación se
comentan en mayor detalle el entrecruzamiento y la esterificación de almidones, ambos
de interés para esta Tesis.
1.2.1.1. ALMIDONES ENTRECRUZADOS
El entrecruzamiento químico del almidón involucra la formación de enlaces
covalentes entre los grupos hidroxilo del almidón y compuestos multifuncionales que
36
actúan como puentes intermoleculares para generar una molécula más grande, más
estable y de gran resistencia (Figura 1.7).
Figura 1.7. Esquema de la estructura típica de un almidón entrecruzado.
Los almidones entrecruzados se producen generalmente cuando los gránulos
nativos se dispersan en sistemas acuosos (en medios alcalinos y bajo condiciones
adecuadas) con reactivos capaces de reaccionar con al menos dos de los grupos
hidroxilo de moléculas vecinas. El tipo de reactivo utilizado y las condiciones de
entrecruzamiento determinan la relación de enlaces de tipo mono- y di- causados por el
mecanismo de reacción de entrecruzamiento y los hidroxilos de almidón disponibles
(Koch, Bommer, & Koppers, 1982).
Los reactivos entrecruzantes más comúnmente empleados para la producción
comercial de almidones entrecruzados son el cloruro de fosforilo (POCl3), el
trimetafosfato de sodio (SMTP), mezclas de trimetafosfato de sodio y tripolifosfato de
sodio (STPP), mezclas de anhídrido de ácido mixto acético/adípico, y, en menor
medida, epiclorhidrina (Cui, 2005). Más recientemente, ciertos ácidos orgánicos
policarboxílicos como el ácido cítrico, el ácido málico y el ácido tartárico, también se
han utilizado como agentes entrecruzantes del almidón (Seidel et al., 2001; Reddy &
Yang, 2010; Assaleh et al., 2014; Azeredo & Waldron, 2016).
H H
x
H
H H
H
H x
H
37
Las condiciones de reacción óptimas para el entrecruzamiento varían según el
tipo de compuesto entrecruzante. Por ejemplo, para reacciones con SMTP y STPP, el
almidón generalmente se contacta con el agente entrecruzante en medio alcalino y la
reacción procede para dar un fosfato de dialmidón. El entrecruzamiento con STPP y
SMTP se favorece aumentando el pH a valores superiores a 8 y 10, respectivamente
(Lim & Seib, 1993; Liu, Ramsden & Corke, 1999; Muhammad et al., 2000). Las
reacciones de entrecruzamiento con POCl3 y con anhídrido de ácido mixto
acético/adípico son rápidas y se llevan a cabo eficientemente también en condiciones
básicas, a valores de pH 11 y 8 para formar fosfato y adipato de dialmidón,
respectivamente. Para llevar a cabo las reacciones de entrecruzamiento con compuestos
orgánicos policarboxílicos como los ácidos cítrico y tartárico, el almidón se pone en
contacto con el agente entrecruzante en medio alcalino usando generalmente como
catalizador hipofosfito de sodio. En general, el entrecruzamiento se lleva a cabo a
temperaturas de entre 100 y 165 °C durante intervalos de 10 min y 5 h (Reddy & Yang,
2008; Assaleh et al., 2014).
Los almidones entrecruzados se usan en aliños para ensalada para dar viscosidad
estable a pH bajo y alto cizallamiento durante el proceso de homogeneización. Los
almidones entrecruzados con una velocidad de gelatinización lenta se usan también en
alimentos enlatados donde se aplica la esterilización en autoclave. Además, estos
almidones son usados en panificación para dar estructura y disminuir la actividad de
agua de la masa con lo cual aumenta la vida útil del producto final y se ha reportado que
se produce un mayor rendimiento en el batido (Neelam, Vijay, & Lalit, 2012). Otros
autores observaron que el uso de almidones entrecruzados genera panes con mayor
volumen y mayor resistencia y extensibilidad de la masa (Van Hung & Morita, 2005).
Los almidones altamente entrecruzados, que no gelatinizan, se utilizan típicamente de
manera directa como un polvo (Chiu & Solarek, 2009). Por ejemplo, almidones
entrecruzados con epiclorhidrina han sido utilizados como carga en películas de
almidón para mejorar las propiedades mecánicas del film (Lan et al., 2010). Los
almidones entrecruzados con ácido tartárico se han propuesto como agentes
superdesintegrantes de tabletas para mejorar la velocidad de disolución de las tabletas y
así aumentar la biodisponibilidad de los fármacos (Assaleh et al., 2014).
38
En la industria de alimentos los almidones entrecruzados también son de especial
interés para alimentos congelados, sobre todo si el tratamiento se combina con
modificaciones adicionales tales como hidroxipropilación o acetilación para mejorar las
características indeseables del almidón entrecruzado como la reducción de la
transparencia. A estos almidones se los conoce como almidones doblemente
modificados, y su producción se enfoca a dotar al producto de propiedades específicas.
La revisión bibliográfica sobre almidones entrecruzados-esterificados da cuenta de la
modificación doble del almidón mediante el entrecruzamiento con hasta 0.1% de
cloruro de fosforilo respecto del almidón, seguido de la acetilación del producto con
hasta un 8% de anhídrido acético (Van Hung & Morita, 2005; Raina, Singh, Bawa, &
Saxena, 2006; López, Zaritzky, & García, 2010; Lee et al., 2015). Alternativamente,
este tipo de almidones entrecruzados-esterificados se pueden obtener en una sola etapa
con bajos niveles de anhídrido de ácido mixto acético/adípico en combinación con
anhídrido acético, alcanzando no más de 0.135% de grupos adipato y 2.5% de grupos
acetilos, respectivamente (FAO, 2016).
1.2.1.2. ALMIDONES ESTERIFICADOS
1.2.1.2.1. GENERALIDADES
Los almidones sustituidos de interés industrial son principalmente producidos
por esterificación, siendo esta la reacción que involucra la sustitución de grupos
hidroxilos por grupos éster. Los almidones pueden ser esterificados usando diferentes
tipos de acilantes como ácidos inorgánicos y orgánicos, anhídridos y cloruros de acilos
(Aristizábal & Sánchez, 2007). Un tipo de esterificación de almidón muy común es la
acetilación, que implica la introducción de grupos acetilos (-COCH3) más hidrofóbicos
a lo largo de la cadena del almidón (Figura 1.8).
39
Figura 1.8. Representación de la reacción de acetilación de almidón con anhídrido acético
en condiciones alcalinas. Inicialmente se forma un complejo de almidón alcalino que luego
interactúa con el anhídrido carboxílico para formar un éster de almidón con la eliminación
del ion carboxilato. Fuente: Korma et al., 2016.
Tras la incorporación de grupos éster a la molécula de almidón se alcanzan
nuevas propiedades que se encuentran muy relacionadas con el nivel de sustitución
conferido. Para almidones esterificados el nivel de modificación alcanzado en general se
reporta en términos del grado de sustitución (GS), definido como el número promedio
de grupos éster incorporados por molécula de anhidroglucosa. Partiendo de que cada
molécula de anhidroglucosa tiene 3 grupos hidroxilos disponibles para la sustitución en
las posiciones C2, C3 y C6, el máximo GS alcanzable es 3. El nivel de sustitución de
los almidones esterificados se puede determinar por saponificación y titulación por
retroceso. Las técnicas de RMN 1H y/o RMN 13C también pueden ser utilizadas para
determinar los grupos CH3 y C=O (según sea el caso) y el GS de manera cuantitativa y
cualitativa (Heins, Kulicke, Kauper, & Thielking, 1998). Otros métodos utilizados con
este fin reportados en la bibliografía son la cromatografía gas-líquido, la cromatografía
líquida de alta resolución (HPLC), y algunos métodos enzimáticos y colorimétricos
(Elomaa et al., 2004).
1.2.1.2.2. USOS
Los usos potenciales de los almidones esterificados están generalmente
relacionados con el grado de sustitución alcanzado y, por supuesto, con la naturaleza del
sustituyente incorporado. Entre los almidones esterificados los más utilizados son los
almidones acetilados que, dotados de un GS adecuado, encuentran aplicaciones varias
en la industria alimentaria. En particular, se encuentra aprobada por la FDA (Food and
40
Drug Administration) y por el Código Alimentario Argentino (Capítulo XVIII de
Aditivos Alimentarios, Res 101, 8.8.75) la utilización de almidones acetilados con
anhídrido acético con un máximo de 2.5% de grupos acetilo; que corresponde a un GS
de 0.1. Estos almidones se usan para mejorar la unión, el engrosamiento, la estabilidad y
la textura de los alimentos. La incorporación de grupos acetilos disminuye o previene la
re-asociación de las cadenas de almidón hacia una estructura ordenada luego de la
gelatinización y enfriado del producto (retrogradación), al interrumpir la linealidad de la
amilosa o segmentos de amilopectina. Lo mencionado presenta un valor práctico en la
industria alimentaria porque, como ya se describió, las re-asociaciones de las cadenas de
almidón pueden causar sinéresis del producto elaborado y pérdida de textura, afectando
la consistencia durante el almacenamiento del producto terminado (Kaur et al., 2012;
Neelam et al., 2012). Los almidones esterificados se distinguen también por su menor
temperatura de gelatinización, mayor solubilidad y estabilidad de las pastas. La
acetilación de almidones se puede combinar con otros tratamientos como el
entrecruzamiento para proporcionar una gama de productos con gran variedad de
propiedades (Bertolini, 2010).
Otra aplicación de los almidones esterificados de interés para esta Tesis es como
fuente de almidón resistente. En general, el almidón que se ingiere en la dieta se digiere
y se absorbe progresivamente como D-glucosa libre en el intestino delgado (Nugent,
2005). Sin embargo, hay una porción de almidón definida como almidón resistente
(AR) que no es degradado por las enzimas humanas en el intestino delgado y llega al
intestino grueso de las personas sanas. Allí el almidón resistente se convierte en una
fuente de carbono para la microflora colónica, a través de cuya fermentación se
producen metabolitos importantes (Fuentes-Zaragoza, Riquelme-Navarrete, Sánchez-
Zapata, & Pérez-Álvarez, 2010; Birt et al., 2013). Los principales productos finales del
metabolismo bacteriano del AR en el intestino grueso humano son los ácidos grasos de
cadena corta (AGCC), predominantemente acetato, propionato y butirato. Diversos
estudios han demostrado que estos AGCC contribuyen sustancialmente a la salud del
intestino grueso, jugando un papel importante en la prevención de la producción y
absorción de posibles carcinógenos (Topping & Clifton, 2001; Huth et al., 2010).
41
El almidón resistente ha sido clasificado (según la estructura o la fuente) en
cuatro tipos principales, a saber: AR1 (almidón físicamente inaccesible para las enzimas
digestivas por la presencia de paredes celulares intactas), AR2 (almidón granular natural
no digerible), AR3 (almidones retrogradados con enlaces glucosídicos α (1→4)
inaccesibles para las enzimas digestivas), y AR4 (almidón químicamente modificado
que contiene enlaces atípicos que no reconocen las enzimas digestivas). En este último
grupo de almidones resistentes se ubican los almidones esterificados, entrecruzados y/o
eterificados. Entre ellos, revisten especial interés los almidones esterificados con
AGCC, ya que se ha demostrado que al alcanzar el intestino grueso los residuos tienen
el potencial de suministrar cantidades significativas del AGCC esterificado específico
para fines terapéuticos, clínicos y aplicaciones de salud pública (Annison, Illman, &
Topping, 2003; Morita et al., 2005; Clarke, Bird, Topping, & Cobiac, 2007). El AGCC
esterificado es liberado en el colon por esterasas y lipasas bacterianas ubicuas, y se ha
reportado que la fermentación subsecuente del almidón residual contribuye aún más al
aumento de los niveles totales de AGCC (Bajka, 2007).
1.2.1.2.3. FORMAS DE OBTENCIÓN
En lo que respecta a las rutas de obtención de almidones esterificados, la mayoría
de los ésteres de almidón comerciales, -y también los más referidos en las publicaciones
científicas-, son producidos por reacción del almidón en medio acuoso con anhídridos,
utilizando hidróxido de sodio como catalizador a pH controlado (pH 7-9) (Singh,
Chawla, & Singh, 2004; Sodhi & Singh, 2005; Lopez-Rubio et al., 2009; Prieto-Méndez
et al., 2010; Colussi et al., 2015). Esta ruta de esterificación en general genera grandes
cantidades de aguas residuales y acetato de sodio que se produce como subproducto a
partir de la hidrólisis del anhídrido acético por el hidróxido de sodio y el agua
(Peñaranda Contreras, Perilla Perilla, Algecira Enciso, 2008). Una variación a esta
metodología también ampliamente reportada en la literatura es la que fuera inicialmente
descripta por Mark & Mehltretter en 1972 para la preparación de almidón acetilado a
mayor temperatura y sin agregado de agua al medio de reacción (a excepción de lo
incorporado a través de la solución acuosa de NaOH que se usa como catalizador). La
ruta implica temperaturas por encima de los 90 °C y permite alcanzar valores de GS en
42
todo el rango posible. Otras rutas de esterificación de almidón descriptas en la
bibliografía incluyen las vías catalizadas por piridina, ácidos minerales, iodo, ácidos
fuertes de Lewis, enzimas de la familia de las lipasas y líquidos iónicos (Rajan &
Abraham, 2006; Chi et al., 2008; Diop, Li, Xie, & Shi, 2011; Garg & Jana, 2011; Singh,
Nath & Guha, 2011; Luo & Zhou, 2012;).
Por otro lado, en el año 2005 Hafrén & Córdova propusieron el uso de
catalizadores orgánicos del tipo α-hidroxiácidos para la esterificación de celulosa en
medios sin cosolventes agregados. En su trabajo propusieron la polimerización por
apertura de anillo de ε-caprolactona usando ácido tartárico como catalizador y celulosa
procedente de algodón y papel como iniciadores. Los autores también aplicaron la ruta
para esterificar fibras de algodón con ácido hexadecanoico y pentinoico utilizando ácido
tartárico como catalizador. Posteriormente, en 2009 los autores publicaron una patente
en el tema (US 2009/0111980 A1, Hafrén & Córdova, 2009) que concierne a la
modificación de aminas y alcoholes con diversos tipos de agentes modificantes
(acilantes) como lactonas, ésteres, poliésteres, carbonatos, policarbonatos y mono-
nucleótidos, polímeros alifáticos y aromáticos, anhídridos, ácidos, tioésteres, y
carbamatos; en presencia de un catalizador orgánico como el ácido tartárico. En la
patente se declara que el proceso de modificación presentado es adecuado para la
modificación de oligo y polisacáridos, y entre ellos se nombra al almidón.
En la última década el enfoque de organocatálisis alimentó al desarrollo de un
gran número de catalizadores y aplicaciones. Muchas moléculas orgánicas han sido
estudiadas como catalizadores de polimerizaciones por apertura de anillo y
transesterificaciones para sintetizar y modificar biopolímeros (Domínguez de María,
2010). En la Figura 1.9 se presentan las estructuras de los catalizadores orgánicos más
estudiados, tales como ácidos -hidroxicarboxílicos o α-hidroxiácidos, aminoácidos, 4-
dimetilaminopiridina, carbenos N-heterocíclicos, guanidinas y amino-tiourea
(Domínguez de María, 2010).
43
Figura 1.9. Organocatalizadores de polimerización por apertura de anillo y
transesterificaciones. Fuente: Domínguez de María, 2010.
En 2010, Domínguez de María relevó la utilización de algunos ácidos -
hidroxicarboxílicos de origen natural como organocatalizadores para polimerizaciones y
esterificación de polisacáridos, particularmente celulosa. Muchas de estas moléculas
tales como el ácido láctico, cítrico y tartárico presentadas en la Figura 1.10, pueden ser
producidas a gran escala por fermentación, de una manera sencilla y rentable. Estas
moléculas son biodegradables y no tóxicas.
Figura 1.10. Ácidos -hidroxicarboxílicos o α-hidroxiácidos de origen natural usados
como organocatalizadores para polimerizaciones por apertura de anillo y esterificación de
material celulósico. Fuente: Domínguez de María, 2010.
Hidroxiácidos 4-dimetilaminopiridina Carbenos N-heterocílicos
Aminoácidos 1,4,7 - Triazabiciclodeceno Amino-tiourea bifuncionalizada
44
La necesidad de una transición hacia una química más sostenible hace que los
investigadores no cesen en el intento de obtener catalizadores reutilizables más baratos,
eficaces, y menos tóxicos (Pascual, Sardon, Hedrick, & Mecerreyes, 2013). En este
contexto, se presenta como muy atractiva la ruta de esterificación de polisacáridos
catalizada por α-hidroxiácidos, muchos de los cuales (ej. ácido tartárico, cítrico y
láctico) son utilizados a diario como aditivos en la producción de alimentos (Pascual et
al., 2013).
El ácido tartárico, en particular, es un compuesto de origen natural que se
encuentra en forma libre y/o combinada en frutas como uvas, plátanos y tamarindos. Se
utiliza como aditivo alimentario popular en bebidas gaseosas, y en el vino como
acidificante y conservante natural. En algunas de sus formas el ácido tartárico es
utilizado como aditivo en comidas, sobre todo en repostería, donde se lo conoce como
crémor tártaro (Chin, Pang, & Lim, 2012).
A pesar de las citadas ventajas de los ácidos -hidroxicarboxílicos como
catalizadores para la derivatización de polisacáridos y el antecedente en esterificación
de celulosa (Hafrén & Córdova, 2005), su uso en la esterificación de almidones es un
campo que no había sido reportado. En base a estudios exploratorios previos realizados
en el grupo que pusieron en evidencia la capacidad de la ruta para acetilar y butirilizar
almidones (Tupa, Maldonado, Vázquez, & Foresti, 2013), se estudia en esta Tesis la
utilidad de la metodología para obtener almidones esterificados para dos aplicaciones
concretas: la producción de almidones modificados con propiedades funcionales
distintivas para uso como aditivo de alimentos, y la preparación de almidones
esterificados con ácidos grasos de cadena corta (AGCC) como fuente de almidón
resistente.
Las aplicaciones elegidas para explorar en esta Tesis se seleccionaron no sólo en
base a la reconocida utilidad de los almidones esterificados en estos usos, sino al
potencial aporte adicional que en los dos casos podría resultar del entrecruzamiento
simultáneo de los almidones. Si bien en el trabajo original de Hafrén & Córdova (2005)
se indicó explícitamente que el ácido tartárico no se injertó en el sustrato empleado, esta
molécula orgánica es un ácido dicarboxílico que podría, -en condiciones adecuadas-
45
esterificar y entrecruzar en distinto grado al almidón. En la bibliografía reciente existen
algunos antecedentes al respecto, si bien en todos los casos la
esterificación/entrecruzamiento del almidón de parte del ácido tartárico requirió el uso
de catalizadores. Assaleh et al. (2014) esterificaron almidón de papa con ácido tartárico
empleando hipofosfito de sodio como catalizador. El almidón modificado con ácido
tartárico presentó propiedades de compresión adecuadas para la aplicación específica
como desintegrante de tabletas. Por su parte, Chin y colaboradores (2012) prepararon
nanopartículas de tartrato de almidón mediante la esterificación de almidón de sagú con
ácido tartárico usando DMSO como disolvente y 2-dimetilamino piridina (DMAP)
como catalizador a 100 °C, alcanzando un GS máximo de 0.04.
En este sentido, el potencial entrecruzamiento simultáneo de los almidones
esterificados a obtener en el presente trabajo de Tesis es un tema a estudiar, con
implicancias de interés sobre todo en lo que respecta a la producción de almidones
acetilados-entrecruzados de uso en alimentos, y a la obtención de almidones resistentes
en los que el entrecruzamiento podría sumar resistencia adicional a la acción de las
enzimas digestivas. En el contexto descripto, en todos los casos a lo largo de esta Tesis
se obtienen los almidones modificados seleccionados, se caracterizan en términos de
estructura química, morfología, cristalinidad, y propiedades térmicas; y se llevan
adelante ensayos específicos que buscan evaluar la utilidad de los almidones obtenidos
en las aplicaciones concretas planteadas.
46
1.3. OBJETIVOS
1.3.1. OBJETIVO GENERAL
El objetivo general de esta Tesis se encuadra en la intención de desarrollar procesos
sostenibles que permitan obtener derivados de biopolímeros naturales con mayor valor
agregado.
1.3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Los objetivos particulares de esta Tesis son:
Incrementar el conocimiento sobre la vía organocatalítica de esterificación de
almidones y sus potencialidades. Estudiar la evolución de la reacción en el volumen
del gránulo y evaluar el aporte de reacciones de entrecruzamiento.
Obtener almidones acetilados con propiedades funcionales adecuadas para su
uso como aditivo de alimentos.
Obtener almidones esterificados con contenido de almidón resistente
incrementado.
Caracterizar los productos obtenidos en términos de morfología, estructura
química, propiedades térmicas, y cristalinidad.
Desarrollar ensayos específicos que permitan caracterizar los ésteres de almidón
obtenidos para la aplicación concreta que resulta de interés.
47
Capítulo 2
MATERIALES Y MÉTODOS
48
49
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1. MATERIALES
En la esterificación organocatalítica de almidón se empleó almidón de maíz
nativo (Buffalo 4301) y almidón de maíz pregelatinizado (Amidex G 2100) que fueron
amablemente donados por Ingredion (Argentina). Para la determinación de contenido de
almidón resistente se emplearon las enzimas α-amilasa pancreática de páncreas de cerdo
(Pancreatina, 3 Ceralpha U/mg) y amiloglucosidasa de Aspergillus niger (3300 U/mL
en almidón soluble a pH 4.5 y 40 °C), las cuales fueron adquiridas en Megazyme
(Granotec, Argentina).
Los reactivos usados en la esterificación de almidón fueron anhídrido acético
(Cicarelli, ≥ 97.0%) y ácido propiónico (Cicarelli, 94.5%). El catalizador fue en todos
los casos ácido L(+)tartárico (Biopack, ≥ 99.0%). Para la determinación del contenido
de acilo (%) y el grado de sustitución (GS) se utilizaron ácido clorhídrico (30 – 34%) e
hidróxido de sodio, que fueron reactivos de grado analítico adquiridos en Cicarelli y
Biopack, respectivamente. El biftalato de potasio y el carbonato de sodio usados para
valorar las soluciones de titulación fueron comprados en Laboratorios Cicarelli y
Mallinckrodt, respectivamente. El éter de petróleo utilizado en los ensayos de
evaluación de hidrofobicidad se compró a Cicarelli. Para la determinación de almidón
resistente se emplearon ácido maleico (Sigma Aldrich, ≥ 99%), cloruro de calcio
dihidratado (Stanton), azida de sodio (Stanton), hidróxido de potasio (Biopack) y
alcohol etílico (Stanton).
2.2. ESTERIFICACIÓN ORGANOCATALÍTICA DE ALMIDONES
La metodología de obtención de almidones acetilados con grado de sustitución
variable aplicada en el curso de esta Tesis se describe a continuación. La misma fue
adaptada a partir del trabajo inicial de Hafrén & Córdova (2005) en el que se esterificó
celulosa con ácido pentinoico y ácido hexadecanoico usando ácido tartárico como
catalizador.
50
En un balón se añadieron cantidades definidas de ácido tartárico, almidón
comercial de maíz y el acilante elegido (anhídrido acético o ácido propiónico) según el
caso. Las cantidades de reactivos y de almidón empleadas en la reacción se detallan en
el contenido de cada capítulo. El balón se conectó a un condensador con sistema de
reflujo para evitar pérdidas del acilante durante la reacción (Figura 2.1). La mezcla
completa fue calentada hasta alcanzar los 130 °C en un baño de aceite termostático bajo
agitación magnética continua. Cuando se alcanzó la temperatura deseada se garantizó
una completa disolución del ácido tartárico y se consideró éste como el inicio de
reacción. Según el caso, se evaluaron distintos tiempos de reacción.
Figura 2.1. Equipo experimental para la esterificación organocatalítica de almidón de maíz.
Agua
1.- Balón de vidrio
2.- Mezcla de reacción (Almidón,
acilante, catalizador)
3.- Agitador magnético
4.- Cristalizador
5.- Baño de aceite
6.- Platina calefactora
7.- Regulador de calefacción
8.- Regulador de agitación
9.- Controlador de temperatura
10.- Termocupla
11.- Condensador
4
9
Agua
130 °C
6
2 5 3
1
7
7
10
11
8
51
Transcurrido el tiempo de reacción seleccionado se retiró el balón que contenía
la mezcla de reacción de la fuente de calor, y la mezcla fue filtrada con vacío en un
embudo buchner usando papel de filtro N° 102 (filtrado medio). El producto sólido
recuperado fue lavado con etanol 96% tres veces seguidos de lavados continuos con
agua destilada hasta pH neutro a efectos de garantizar la remoción del catalizador y del
acilante en exceso. Los lavados se hicieron siempre con agitación magnética. En el caso
de la propionización de almidón, previo al filtrado se agregaron 20 mL de etanol a la
mezcla de reacción para facilitar la operación.
Los productos recuperados fueron secados en estufa a 40–50 °C por 12 h y
molidos para su almacenamiento. Se asignó a cada muestra un código de identificación
y se elaboró una base de datos (fecha de análisis, código de muestra, tiempo de
reacción, etc.).
2.3. CUANTIFICACIÓN DEL NIVEL DE ESTERIFICACIÓN ALCANZADO
El contenido de acilo (%) y el grado de sustitución (GS) de los productos fueron
determinados por saponificación heterogénea y valoración por retroceso con HCl. La
metodología involucra la hidrólisis básica completa de los enlaces éster y titulación del
exceso de álcali con HCl. El método fue adaptado a almidón a partir del protocolo
ASTM D817-12 “Standard Test Methods of Testing Cellulose Acetate” desarrollado
para acetato de celulosa, y se evaluó su validez contra almidones y celulosa con GS
conocidos en todo el rango posible.
En detalle: se colocaron aproximadamente 0.1 g de muestra seca (2 h - 105 °C)
en un matraz de 100 mL al que se añadieron 20 mL de alcohol etílico (75%). Los
matraces fueron tapados con papel aluminio y llevados a un baño de agua a 55 °C por
30 min. Posteriormente, las suspensiones fueron llevadas a pH ligeramente básico por
adición de unas gotas de NaOH 0.1N utilizando fenoftaleína como indicador. A
continuación, se añadieron 20 mL de NaOH 0.1N a cada matraz y se colocaron
nuevamente en un baño de agua a 55 °C durante 15 min. Finalmente, los matraces
fueron nuevamente tapados con papel aluminio y mantenidos en forma estática a
52
temperatura ambiente durante 48 h. Al final de este tiempo el exceso de NaOH presente
en los matraces se valoró con HCl 0.1N utilizando fenoftaleína como indicador. En
todos los casos se realizó un blanco (almidón de maíz nativo) que se trató con el mismo
procedimiento que las muestras de almidón modificadas. Las soluciones de NaOH y
HCl se estandarizaron utilizando biftalato de potasio y carbonato de sodio previamente
secados (2 h - 110 °C), respectivamente. El contenido de grupos acilo se calculó según
la ecuación 2.1:
donde VB (mL) es el volumen de HCl requerido para la titulación del blanco, VS (mL)
es el volumen de HCl requerido para valorar la muestra; N HCl es la normalidad de la
solución de HCl, M acilo es el peso molecular del grupo acilo (43 para muestras
acetiladas y 57 para muestras propionizadas), y W (g) es la masa de la muestra seca
utilizada en la determinación.
El grado de sustitución (GS) del almidón esterificado se define como el número
promedio de grupos hidroxilo sustituidos por unidad de anhidroglucosa del polímero de
almidón. Como se anticipó, debido a que una unidad de anhidroglucosa posee tres
grupos hidroxilos reactivos, el valor máximo de GS es 3. El grado de sustitución de los
almidones estudiados se calculó según la ecuación 2.2:
donde 162 es el peso molecular de la unidad de anhidroglucosa.
Acilo (%) = (VB – VS) x N HCl x M acilo x 0.1 (2.1)
W
GS = 162 x Acilo % (2.2)
M acilo x 100 – ((M acilo – 1) x Acilo %)
53
2.4. CARACTERIZACIÓN GENERAL
2.4.1. ESPECTROSCOPÍA DE RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR 1H EN
ESTADO LÍQUIDO (RMN 1H)
Aproximadamente 10 g de cada muestra se disolvieron en 0.5 mL de
dimetilsulfóxido (DMSO) -d6 a 95ºC para obtener soluciones claras. Estas soluciones se
colocaron en sondas para líquidos SmartProbe 1H/BBO (1H/X) de 5 mm. En todos los
casos las mediciones se llevaron a cabo a 25 °C en un espectrómetro Bruker UltraShield
600 Plus de 14.1 Tesla, con frecuencia de resonancia para hidrógeno de 600 MHz,
consola AVANCE-III 600 disponible en la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la
Universidad de Buenos Aires.
Además de emplear esta técnica como herramienta para el análisis de la
estructura química de los productos, en algunos casos también se empleó para
determinar el GS de las muestras de almidón modificado y validar los resultados de
saponificación para muestras solubles en DMSO. Con este fin se utilizó la ecuación 2.3
(Teramoto & Shibata, 2006):
GS = 4A (2.3)
(3B + A)
donde A es la suma de las áreas de protones metílicos presentes en la región 1.8 – 2.2
ppm, y B es la suma de las áreas de protones OH y H-1 provenientes de la unidad
residual de anhidroglucosa observados a más de 4.5 ppm.
54
2.4.2. ESPECTROSCOPÍA DE RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR 13C EN
ESTADO SÓLIDO (RMN 13C)
Los espectros de RMN de 13C en estado sólido de alta resolución fueron
obtenidos usando la rampa {1H} {13C} CP/MAS (CP polarización cruzada del
inglés “cross polarization” / MAS rotación del ángulo mágico del inglés “magic angle
spinning”). En todos los casos, los experimentos fueron desarrollados a temperatura
ambiente en un espectrómetro Bruker Avance II-300 equipado con una sonda MAS de 4
mm disponible en la Facultad de Matemática, Astronomía y Física de la Universidad
Nacional de Córdoba. La frecuencia de operación para protones y carbonos fue 300.13 y
75.46 MHz, respectivamente. Se usó glicina como referencia externa para establecer la
condición de Hartmann-Hahn en los experimentos de polarización cruzada. El tiempo
de reciclaje varió de 5 a 6 s de acuerdo a la muestra. El tiempo de contacto durante CP
fue de 2 ms. La secuencia SPINAL 64 (pequeña fase que se alterna con incremento de
64 pasos) fue usada para el acoplamiento heterogéneo durante la adquisición con un
campo de protón H1H. La rotación del ángulo mágico fue de 10 KHz.
2.4.3. ESPECTROSCOPÍA DE INFRARROJO POR TRANSFORMADA DE
FOURIER (FTIR)
Los espectros infrarrojo se obtuvieron por transmitancia en un espectrofotómetro
IR Afinnity-1 Shimadzu utilizando pastillas de bromuro de potasio (250 mg). Las
muestras (2.5 mg) se secaron antes del análisis a 105 °C por 2 h y se mezclaron con
bromuro de potasio en una relación almidón/KBr 1:100. La mezcla sólida se prensó a ≈
7 ton/cm2 y se realizó la adquisición del espectro IR en modo de absorbancia. Los
espectros fueron recogidos con 40 barridos en el intervalo de 4000-700 cm-1 y con una
resolución de 4 cm-1. Finalmente, todos los espectros obtenidos se trataron de la
siguiente manera: corrección atmosférica, línea de base, y normalización utilizando la
intensidad de la señal a ≈1020 cm-1 (Hampe & Heinze, 2014).
55
2.4.4. MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE BARRIDO (SEM)
Se prepararon suspensiones de almidón en agua al ≈ 1% (porcentaje p/p siempre
que no se mencione lo contrario). Se depositó una pequeña gota (≈20 µL) de la
suspensión de cada muestra sobre un portaobjeto y se la secó a 40 °C por 15 min. Las
muestras secas se cubrieron con una fina capa de oro utilizando un dispositivo de
recubrimiento catódico de iones, y se observaron a 3kV con magnificaciones de 5KX y
10KX en el microscopio electrónico de barrido Zeiss Supra 40 con cañón de emisión de
campo disponible en la Facultad de Ciencias Exactas de la UBA.
2.4.5. DIFRACCIÓN DE RAYOS X (DRX)
Se analizaron los patrones de difracción de las muestras secas (1 h - 105 °C) en
un difractómetro de rayos X D/Max-C Rigaku disponible en el Laboratorio de Sólidos
Amorfos del INTECIN, Facultad de Ingeniería, UBA. Las muestras se analizaron en el
rango de 2 de 10 - 45° con un paso de 0.02° y una velocidad de 0.6°/min. La longitud
de onda de la fuente de radiación Cu/K utilizada fue 0.154 nm generada con un voltaje
de aceleración de 40 kV y una emisión de filamento de 30 mA.
2.4.6. ANÁLISIS TERMOGRAVIMÉTRICO (TGA)
El análisis termogravimétrico de las muestras fue llevado a cabo en un TGA-50
Shimadzu. Aproximadamente 6 mg de las muestras secas (1 h - 105 °C) fueron
analizadas con un programa de temperatura en el intervalo de 25 °C a 650 °C y a una
velocidad de 10 °C/min bajo atmósfera de nitrógeno (30 ml/min) con el fin de evitar la
degradación termo-oxidativa de las muestras.
56
2.4.7. ENSAYO CUALITATIVO DE REPARTO EN UNA MEZCLA DE
LÍQUIDOS INMISCIBLES (FASE POLAR/ NO POLAR)
Se colocaron 1.5 mL de éter de petróleo (fase superior) y 1.5 mL de agua
destilada (fase inferior) en tubos transparentes a los que se agregaron 5 ± 0.5 mg de
cada muestra. Se observó cualitativamente como, dependiendo de su GS, las muestras
se distribuyeron preferentemente en una u otra fase líquida, y se hizo un registro
fotográfico.
2.5. ESTUDIO DE LA GELATINIZACIÓN
2.5.1. MICROSCOPÍA ÓPTICA DE LUZ POLARIZADA
Se prepararon suspensiones acuosas de los almidones al 3% que se colocaron en
un baño de aceite termostatizado bajo agitación magnética continua. Las suspensiones
se sometieron a una rampa de calentamiento desde temperatura ambiente hasta 96 °C en
un tiempo de 25 min. A temperaturas seleccionadas se tomaron 15 µL de la suspensión
de almidón. Cada muestra se colocó sobre un portaobjeto y se observó en un
microscopio óptico AXIO Scope.A12 (Carl Zeiss, Jena, Germany) equipado con luz
polarizada y con una cámara fotográfica de vidrio AxioCam 105 color. Entre los
parámetros evaluados se encuentran la temperatura de pérdida de la birrefringencia, el
progreso del hinchamiento de los gránulos de almidón, y los constituyentes de la pasta
(gránulos fantasmas, fragmentos de gránulos, etc.).
2.5.2. CALORIMETRÍA DIFERENCIAL DE BARRIDO (DSC)
Las propiedades térmicas de gelatinización de los almidones se evaluaron en un
calorímetro de barrido diferencial Shimadzu modelo DSC-60. A tal fin, se pesaron 2 mg
de muestra seca en una cápsula de aluminio previamente pesada y se le adicionó agua
destilada en relación 1:3 p/v (almidón/agua). La cápsula se selló herméticamente y la
misma se dejó equilibrar a temperatura ambiente por 1 h con el fin de garantizar una
57
hidratación completa y uniforme de los gránulos de almidón antes de ser calentados en
la celda de DSC. Como referencia se usó una cápsula vacía. La muestra equilibrada se
sometió a un programa de calentamiento en el intervalo de 25 a 90 °C, con velocidad de
calentamiento de 10 °C/min bajo atmósfera de nitrógeno (30 mL/min).
Las temperaturas de inicio (Ti, °C), pico (Tp, °C) y final (Tf, °C), y la entalpia de
gelatinización (∆H, J/g) se obtuvieron directamente con el programa TA-60 versión
2.20. Los valores de entalpías se calcularon sobre una base de peso seco de almidón.
Las determinaciones fueron realizadas por triplicado.
2.6. PROPIEDADES FUNCIONALES
2.6.1. PODER DE HINCHAMIENTO Y SOLUBILIDAD
El poder de hinchamiento y la solubilidad de los almidones se determinaron
siguiendo la metodología descripta por Garg & Jana (2011). Se prepararon suspensiones
acuosas de almidón al 1% que se colocaron en tubos de centrífuga con tapa y se
calentaron a 55, 65, 75, 85, y 95 °C durante 1 hora agitándolos cada 5 min. Luego de
este tiempo se dejaron enfriar las muestras hasta temperatura ambiente y los tubos se
centrifugaron a 3000 rpm durante 15 min para separar las partículas de almidón
insolubles. El almidón insoluble se separó del sobrenadante y se pesó (Mp) sin secado
previo. Ambas fases luego se secaron a 105 °C durante 24 h y se registraron sus masas
en seco como Mps para el almidón insoluble y Ms para el sobrenadante.
El poder de hinchamiento se calculó como la relación entre la masa del almidón
insoluble hidratado (g) y la masa del almidón insoluble seco (g), es decir:
Poder de hinchamiento = Mp (2.4)
Mps
58
La solubilidad se calculó como el porcentaje de masa seca del sobrenadante (fase
soluble) respecto de la masa seca de la muestra de almidón inicial (Mo).
Solubilidad = Ms x 100 (2.5)
Mo
2.6.2. CLARIDAD DE LA PASTA
Para determinar la claridad de las pastas se empleó la técnica propuesta por
Piyachomkwan y colaboradores (2002). Se prepararon suspensiones acuosas de almidón
al 1% y se gelatinizaron durante 30 min en un baño de agua hirviendo. Las muestras
gelatinizadas se enfriaron a temperatura ambiente y se midió a 650 nm el porcentaje de
transmitancia contra agua destilada en un espectrofotómetro PG Instruments Limited
modelo T-80.
2.6.3. SINÉRESIS
Para determinar la estabilidad de las pastas de almidón durante la refrigeración se
utilizó la metodología basada en López et al. (2010). Se prepararon suspensiones
acuosas de almidón al 10% y se gelatinizaron a 90 °C durante 30 min en un baño
termostático. Posteriormente, se pesaron ≈10 g de las suspensiones gelatinizadas en
tubos de centrífuga previamente pesados. Los tubos que contenían las muestras (Mo,
masa inicial total igual a tubo + muestra) se almacenaron a 4 °C por 50 días. A
diferentes tiempos de ensayo (designados como ciclos a partir del ciclo 0 -día 0- hasta el
ciclo 50 -día 50-) se tomaron tubos que fueron acondicionados a temperatura ambiente
durante 1 hora antes de ser analizados.
Para determinar el grado de sinéresis los tubos se centrifugaron a 3000 rpm
durante 15 min, el líquido sobrenadante se removió cuidadosamente y el tubo con el
59
sedimento (M´) se pesó en una balanza analítica. El grado de sinéresis (%) se determinó
como el porcentaje de agua liberada acorde a la ecuación 2.6.
% Sinéresis = Mo – M´ x 100 (2.6)
Mo
donde Mo - M´ corresponde a la masa del sobrenadante (agua liberada).
2.6.4. CARACTERIZACIÓN REOLÓGICA DE LA PASTA
Los ensayos reológicos se realizaron en un reómetro Rheo Stress 600
ThermoHaake (Haake, Alemania) instalado en el Centro de Investigación y Desarrollo
en Criotecnología de Alimentos (CIDCA) de la Universidad Nacional de La Plata
usando un sistema plato-plato PP35 a temperatura controlada (25 ºC). Se trabajó con
suspensiones acuosas de almidón (10%) las cuales fueron gelatinizadas a 90 ºC durante
20 min. La concentración utilizada corresponde a la mínima concentración que permite
la formación de geles de las muestras derivatizadas en estudio. Para investigar el
comportamiento de flujo de las suspensiones de almidón se utilizó el modo rotacional.
El mismo fue modelado matemáticamente con el modelo Herschel-Bulkey (almidón
nativo) o el de Ostwald de Waele (muestras modificadas), calculándose la viscosidad
aparente a 500s-1. Para evaluar la dependencia con el tiempo se determinaron los índices
de tixotropía o reopexia (según sea el caso), que corresponden al área de histéresis entre
las curvas ascendente y descendente.
Para caracterizar el comportamiento viscoelástico de las suspensiones de
almidón no Newtonianas se realizaron ensayos en modo dinámico. En primer lugar, se
realizaron barridos de esfuerzo (0-20 Pa) a frecuencia constante (1 Hz) para determinar
el rango de viscoelasticidad lineal. Luego se realizaron barridos de frecuencia (0.01 a 10
Hz) a un valor de esfuerzo constante. Los parámetros reológicos dinámicos registrados
fueron el módulo de almacenamiento (G´) y el módulo de pérdida (G´´).
60
2.7. CONTENIDO DE ALMIDÓN RESISTENTE
Las muestras de los almidones previamente secas (100 mg, 2 h - 110 °C) se
colocaron en tubos de polipropileno de 15 mL con 4 mL de α-amilasa pancreática
conteniendo 3 U/mL de amiloglucosidasa. Los tubos tapados se colocaron de manera
horizontal en un baño de agua termostatizado y se incubaron con agitación continua
(200 golpes/min) por 16 h a 37 °C. La hidrólisis se terminó con 4 mL de etanol, y la
fracción de almidón resistente fue recuperada por centrifugación (3000 rpm, 10 min).
Los pellets se lavaron con etanol 50% dos veces seguidos de centrifugación (3000 rpm,
10 min), y se secaron a 45 °C hasta peso constante.
37 C
200 golpes/min
Figura 2.2. Equipo experimental para la hidrólisis enzimática de las muestras de almidón
(16 h – 37 °C).
61
Capítulo 3
ACETILACIÓN ORGANOCATALÍTICA DE
ALMIDONES
62
63
3. ACETILACIÓN ORGANOCATALÍTICA DE ALMIDONES
3.1. INTRODUCCIÓN
El interés por modificar químicamente el almidón surge del hecho de que a pesar
de los múltiples usos del almidón nativo, para determinadas aplicaciones se requiere de
la modificación del polisacárido a los fines de, por ejemplo, aumentar su solubilidad en
agua fría, reducir su tendencia a la retrogradación (responsable del endurecimiento de
los productos) y su sinéresis, disminuir su alta tasa de absorción de agua, aumentar su
resistencia al esfuerzo de corte durante el mezclado, aumentar su estabilidad térmica,
reducir su carácter hidrofílico, incrementar la flexibilidad de las películas de almidón,
compatibilizarlo con matrices/medios hidrofóbicos, y/o conferirle funcionalidades
específicas, entre otros (Shogren, 1996; Kaur et al., 2012).
La esterificación, y en particular la acetilación del almidón, es una de las
modificaciones del polisacárido más utilizadas. Tras la incorporación de grupos éster a
la molécula de almidón se alcanzan nuevas propiedades que se encuentran muy
relacionadas con el grado de sustitución logrado. En la bibliografía se encuentran
diferentes metodologías propuestas para la acetilación de almidones que se describen
brevemente a continuación.
3.1.1. ESTADO DEL ARTE DE LA ACETILACIÓN DE ALMIDONES
El primer reporte de la preparación de almidón acetilado es el de Schutzenberger
(1865), quien propuso el uso de ácido acético glacial, anhídrido acético o cloruro de
acetilo en ausencia de catalizador y operando a temperaturas de entre 140 y 160 °C para
acetilar almidón. Posteriormente, Cross & Traquair en 1904 patentaron el primer
proceso comercial para fabricar acetatos de almidón, el cual consistió en calentar el
polímero seco con ácido acético glacial para producir un éster soluble en agua (N° 778,
173).
64
Actualmente, la mayoría de los almidones acetilados comerciales (destinados
sobre todo a la industria de alimentos) y de los reportados en la bibliografía son
producidos por reacción del almidón en medio alcalino (pH 7–9 con NaOH ≈ 3%) con
anhídrido acético como acilante. En general se usan temperaturas bajas (< 60 °C) y
tiempos de reacción cortos (10 – 15 min) (Singh, Kaur, & Singh, 2004; Sodhi & Singh,
2005; Lopez-Rubio et al., 2009; Prieto-Méndez et al., 2010; Colussi et al., 2015). El
NaOH se usa como catalizador de la sustitución nucleofílica de los grupos hidroxilos
del almidón y el medio acuoso promueve el hinchamiento de los gránulos y acceso de
los reactivos (Peñaranda Contreras et al., 2008; Ali & Hasnain, 2011). El inconveniente
de esta ruta radica en la producción de grandes cantidades de aguas residuales y acetato
de sodio que se produce como subproducto (Peñaranda Contreras et al., 2008). Por esta
vía se obtienen en general almidones acetilados con valores de GS bajos, de interés para
su aplicación en el sector alimentario (GS ≤ 0.1).
A modo de ejemplo puede citarse el trabajo de Prieto-Méndez et al. (2010)
quienes acetilaron almidón de cebada empleando la metodología descripta, obteniendo
en 10 min de reacción y a 25 °C el producto modificado con un GS de 0.07. Más tarde,
Colussi et al. (2015) emplearon la misma ruta de acetilación por 15 min a temperatura
ambiente para producir almidón de arroz acetilado para su aplicación en la industria de
alimentos. Los autores evaluaron el efecto de la concentración de anhídrido acético
(5 g/100g, 10 g/100g y 20 g/100g respecto del almidón) sobre las propiedades
funcionales del polímero modificado, alcanzando un GS máximo de 0.1 con la mayor
concentración de acilante evaluada.
La esterificación de almidón en medio de anhídrido acético empleando NaOH
como catalizador pero llevada a cabo a mayor temperatura también ha sido ampliamente
descripta en la literatura (Xu, Miladinov, & Hanna, 2004; Bello-Pérez et al., 2010;
Colussi et al., 2014; El Halal et al., 2015). Este método fue inicialmente postulado por
Mark & Mehltretter en 1972 para la preparación de almidón acetilado sin agregado de
agua al medio de reacción, a excepción de lo incorporado a través de la solución acuosa
de NaOH al 50 % usada como catalizador. La ventaja de esta metodología, y a
diferencia de la ruta de acetilación en medio acuoso descripta anteriormente, es que se
pueden lograr niveles de sustitución en todo el rango de GS sin la necesidad de
65
controlar el pH durante la reacción. Se usan, sin embargo, temperaturas que
generalmente superan los 90 °C y mayores tiempos de reacción. Oportunamente, Mark
& Mehltretter (1972) produjeron almidones con valores de GS entre 2.5 y 3 utilizando
76 mL de anhídrido acético como reactivo y medio, y 4.4 g de solución acuosa de
NaOH 50% como catalizador (22 % respecto del almidón) por lapsos de entre 2 y 5 h a
123 °C. Más recientemente, Guerra-DellaValle et al. (2008) esterificaron almidón de
maíz y de plátano con anhídrido acético (120 mL) y NaOH 50% como catalizador (11
% respecto del almidón) a 120 °C. Estos autores estudiaron el avance de la reacción de
acetilación a diferentes tiempos (0.5 – 6 h), observando un efecto significativo de la
fuente de almidón sobre el GS (almidón de maíz GS entre 0.9 y 2.8, almidón de plátano
GS entre 0.1 y 2.6).
Más allá de que los métodos de acetilación de almidón más usados en general
implican el uso de NaOH como catalizador, la acetilación de almidón catalizada por
piridina es también bien conocida (Mullen & Pacsu, 1942; Whistler & Hilbert, 1944;
Wolff, Olds & Hilbert, 1951; Owaga et al., 1999; Singh et al., 2011). En general, por
esta vía se han logrado altos grados de sustitución, sobre todo si se utilizan
pretratamientos con dimetilsulfóxido (DMSO) o agua (con fines de pre-gelatinizar al
polímero). Por ejemplo, Owaga et al. (1999) obtuvieron almidones de maíz
esterificados en todo el rango del GS (GS= 0.08 – 2.62) variando apropiadamente las
cantidades de anhídrido acético en presencia de piridina -empleado como catalizador y
medio-, y pregelatinizando el almidón de maíz nativo en agua previo a la reacción.
Singh et al. (2011) también pregelatinizaron el almidón antes de esterificar el polímero
con anhídrido acético variando la temperatura y tiempo de reacción para alcanzar
valores de GS entre 0.4 y 2.4. Sin embargo, el pre-tratamiento del almidón, los costos y
la dificultad asociada a la manipulación de la piridina han limitado el desarrollo
comercial de esta tecnología (Xu et al., 2004; Ali & Hasnain, 2011).
En la literatura se reportan también otras rutas menos convencionales de
acetilación de almidón, entre ellas las esterificaciones de almidón catalizadas por ácidos
minerales, bases, iodo y ácidos fuertes de Lewis (Shogren, 2008). Feuer (1997) y
Lepeniotis & Feuer (1997) emplearon ácido metanosulfónico y ácido sulfúrico,
respectivamente, como catalizadores en la acetilación de almidón con ácido
66
acético/anhídrido acético llevada a cabo entre 80 y 100 °C. Las condiciones de reacción
tuvieron que ser cuidadosamente controladas debido a la pérdida del peso molecular por
la rápida degradación del polímero en presencia de ácidos minerales muy fuertes. Chi et
al. (2008) emplearon ácido metanosulfónico como catalizador y anhídrido acético como
agente acilante para acetilar almidón de maíz obteniendo un amplio rango GS (0.85 –
2.89).
El empleo de enzimas es otra ruta alternativa que ha sido estudiada para la
esterificación de almidones con ácidos orgánicos. Los biocatalizadores comúnmente
usados para esterificar almidones son las lipasas, un tipo de enzimas que en su ambiente
natural catalizan la síntesis y la hidrólisis de ésteres (Rajan & Abraham, 2006;
Peñaranda Contreras et al., 2008). Sin embargo, el empleo de biocatalizadores en estas
reacciones de polisacáridos demanda un mayor control de la reacción (como el medio
de reacción, el pH, la actividad de agua presente, temperatura, entre otros), sus tiempos
de reacción suelen ser extensos y se logran valores de GS bajos. En 2010, Alissandratos
et al. (2010) reportaron la acilación de almidón de mandioca con ácido decanoico
usando como catalizador la lipasa de Thermomyces lanuginosus, alcanzando valores de
GS cercanos a 0.02. Por otro lado, Rajan & Abraham (2006) estudiaron la modificación
enzimática de almidón de mandioca con ácido palmítico usando como catalizador la
lipasa de B. cepacia y calentamiento por microondas para minimizar el tiempo de
reacción y alcanzar niveles de sustitución superiores (GS= 0.96). Sin embargo, se
requirió un control adicional del calentamiento por microondas para preservar la
actividad de la enzima.
La acetilación de almidón empleando iodo como catalizador también ha sido
informada. Biswas et al. (2008) estudiaron los efectos del calentamiento por
microondas, la relación acilante/almidón p/p y la carga de catalizador sobre los GS de
almidones acetilados obtenidos usando iodo (0.16 – 2.5 mol %) como catalizador y
anhídrido acético como acilante en reacciones llevadas a cabo a 100 °C por 2 min. Los
autores encontraron que los niveles de sustitución aumentaron cuando la relación
iodo/almidón y anhídrido acético/almidón se incrementó, alcanzando valores de GS
cercanos a 3. Por otro lado, Diop et al. (2011) estudiaron la influencia de las relaciones
molares de ácido acético/anhídrido acético en la acetilación de almidón de maíz cuando
67
fue asistida por microondas y catalizada con iodo. Los niveles de modificación logrados
se encontraron entre 0.25 y 2.93.
Como alternativa, en los últimos años diversos ácidos orgánicos han sido
estudiados como catalizadores de polimerizaciones por apertura de anillo y
transesterificaciones para sintetizar y modificar biopolímeros (Domínguez de María,
2010) a través de la denominada vía organocatalítica. En la siguiente sección se
introduce el empleo de catalizadores orgánicos, específicamente los que se encuentran
en el grupo de los α-hidroxiácidos, en la esterificación de polisacáridos.
3.1.2. ESTERIFICACIÓN DE POLISACÁRIDOS MEDIADA POR α-
HIDROXIÁCIDOS
El término organocatálisis describe la aceleración de las reacciones químicas
mediante la adición de una cantidad subestequiométrica de un compuesto orgánico
(Dalko & Moison, 2001). Los avances iniciales en la organocatálisis involucran
predominantemente el empleo de la prolina y sus análogos como catalizadores
orgánicos (Eder, Sauer, & Wiechert, 1971; Hajos, Parrish, & Oliveto, 1974; Ahrendt,
Borths, & MacMillan, 2000). Más tarde, algunos ejemplos de rutas organocatalíticas
han sido reportados en el campo de las polimerizaciones por apertura de anillo de
lactonas así como para algunas transesterificaciones, utilizando, por ejemplo,
aminoácidos y α-hidroxiácidos (ej. ácidos cítrico, láctico y tartárico) como catalizadores
orgánicos (Persson et al., 2004; Hafrén & Córdoba, 2005). En 2010, Domínguez de
María destacó la posibilidad de utilizar compuestos derivados de recursos naturales, en
particular los ácidos -hidroxicarboxílicos o α-hidroxiácidos, para actuar como
organocatalizadores en polimerizaciones y esterificación de polisacáridos como
celulosa. Muchas de estas moléculas tales como los ácidos láctico, cítrico y tartárico,
pueden ser producidas a gran escala por rutas biotecnológicas, de una manera sencilla y
rentable. El empleo de estas moléculas orgánicas pequeñas no tóxicas tiene el potencial
de permitir condiciones de reacción ambientalmente amigables y el desarrollo de una
química sostenible (Domínguez de María, 2010).
68
En 2005 Hafrén & Córdova propusieron la polimerización por apertura de anillo
de -caprolactona (-PCL) utilizando como iniciador celulosa procedente del algodón y
papel, y usando ácido tartárico como catalizador. Los autores también aplicaron la ruta
para esterificar fibras de algodón con ácido hexadecanoico y pentinoico con ácido
tartárico como catalizador. Posteriormente, en el 2009 se publicó una patente en base a
la metodología anteriormente descripta (US 2009/0111980 A1, Hafrén & Córdova,
2009) que concierne a la modificación de aminas y alcoholes con diversos tipos de
agentes modificantes como lactonas, ésteres, poliésteres, carbonatos, policarbonatos y
mono-nucleótidos, polímeros alifáticos y aromáticos, anhídridos, ácidos, tioésteres, y
carbamatos en presencia de un catalizador orgánico (aminoácidos, péptidos, α-
hidroxiácidos como los ácidos láctico, cítrico, tartárico y mandélico); y en donde se
manifiesta que el proceso de modificación presentado es también adecuado para la
modificación de diversos polímeros, entre ellos el almidón.
En este marco, nuestro grupo de investigación adaptó e implementó la vía de
esterificación de celulosa catalizada por ácido tartárico propuesta para la esterificación
de almidón, y la misma se utilizó en esta Tesis para la obtención de almidones
esterificados para usos específicos. El ácido tartárico es un α-hidroxiácido de origen
natural que se encuentra en forma libre y/o combinada en frutas como uvas, plátanos y
tamarindos y que se utiliza como aditivo alimentario en bebidas y comidas (Chin et al.,
2012).
En el presente capítulo se estudia la acetilación de almidón de maíz en presencia
de ácido tartárico, y se caracterizan los productos (AAT) en comparación con los
almidones acetilados obtenidos por la ruta convencional propuesta por Mark &
Mehltretter (1972) catalizada por hidróxido de sodio (AANaOH). A efectos de facilitar la
lectura, el capítulo se divide en tres secciones destinadas a estudiar primeramente la
evolución de la reacción de acetilación y caracterizar los productos, luego se analiza la
hipótesis de que existan reacciones simultáneas de entrecruzamiento del almidón por
parte del ácido tartárico, y finalmente se estudia cómo avanza la reacción en el volumen
de los gránulos de almidón.
69
3.2. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.2.1. EVOLUCIÓN DE LA REACCIÓN DE ACETILACIÓN DE ALMIDÓN DE
MAÍZ
En esta sección se estudia la esterificación de almidón en presencia de ácido
tartárico en función de la investigación de Hafrén & Córdova (2005). Con este
propósito, se prepararon almidones acetilados variando el tiempo de reacción (0.5 h – 6
h) para modular el nivel de sustitución. Se trabajó con almidón de maíz con y sin secado
previo (HR 0.06% y 15.0%, respectivamente) manteniendo las condiciones de reacción
restantes constantes (condiciones en el epígrafe de la Figura 3.1), y se determinó el
nivel de modificación por saponificación.
3.2.1.1. SEGUIMIENTO DEL AVANCE DE REACCIÓN (GS)
En la Figura 3.1 se ilustra la evolución del grado de sustitución de los almidones
acetilados en ausencia/presencia de ácido tartárico a partir de almidón seco (Figura 3.1,
A) y almidón húmedo (Figura 3.1 B) como función del tiempo de reacción.
0 1 2 3 4 5 6
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0 A) ALMIDÓN SECO
(HR= 0.06 %)
AAT
AA
GS
Tiempo (h)
0 1 2 3 4 5 6
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0 B) ALMIDÓN HÚMEDO
(HR 15 %)
AAT
AA
GS
Tiempo (h)
Figura 3.1. Evolución de la acetilación de almidón de maíz A) almidón seco (10 g, HR
0.06%) y B) almidón húmedo (10 g, HR 15.0%). Valores de GS alcanzados en presencia de
ácido tartárico (AAT) y en la reacción no catalizada blanco (AA). 130 °C, 60 mL de
anhídrido acético, 7.4 g ácido tartárico.
70
Como se ilustra en la Figura 3.1, en las condiciones elegidas en presencia de
ácido tartárico (AAT), el nivel de sustitución alcanzado aumenta con el tiempo de
reacción, lográndose en un intervalo de 6 h un GS máximo de 1.97 y 2.62 a partir de
almidón de maíz seco y húmedo, respectivamente. En la reacción no catalizada (AA), en
cambio, se alcanzaron valores de GS muy inferiores, con un máximo de 0.02 y 0.15
cuando se usaron almidones secos y húmedos, respectivamente.
En lo que respecta al efecto del secado previo del almidón, en la bibliografía de
esterificación de almidón a menudo se utiliza el polisacárido previamente seco
(Shogren, 1996; Xu et al., 2004; Han et al., 2013; Colussi et al., 2015). Lo anterior se
enfoca a evitar la hidrólisis del anhídrido acético a ácido acético (menos reactivo) y del
éster generado al introducir agua al medio de reacción. Sin embargo, de los resultados
resumidos en la Figura 3.1 A y B se extrae que bajo las mismas condiciones de
reacción, la introducción de agua a través del contenido de humedad inicial del almidón
no solo no dio lugar a una reducción neta en el avance de la esterificación, sino que se
lograron niveles de sustitución mayores a los obtenidos con almidón previamente
secado y asintóticos al máximo GS posible (GS a las 6 h igual a 2.80). Estos resultados
se pueden explicar en términos de la contribución de humedad inicial del almidón en el
hinchamiento de los gránulos, y con ello la accesibilidad del acilante y del catalizador al
interior de los mismos. En la acetilación de almidón de maíz con anhídrido acético y
Sc(OTf)3 como catalizador, Shogren (2008) obtuvo almidón acetilado con un GS total
bajo pero con alto GS superficial. El resultado se atribuyó a la baja permeabilidad de los
gránulos de almidón al anhídrido acético en una metodología de acetilación en el que no
había agua presente para el hinchamiento de los gránulos.
El amplio rango de GS alcanzado en la acetilación de almidón de maíz mediante
la variación del tiempo de reacción sugiere la potencialidad de esta ruta para obtener en
forma sencilla almidones acetilados con el nivel de sustitución que la aplicación lo
requiera. En el caso de la industria alimentaria, la FDA (Food and Drug Administration)
admite almidones acetilados con GS en el rango de 0.01 a 0.1, utilizados estos para dar
consistencia, textura y estabilidad a las pastas. Otra aplicación de creciente interés para
los almidones esterificados tiene que ver con el cuidado de la salud del colon humano, a
partir de la reconocida capacidad de los almidones esterificados para entregar en el
71
intestino grueso ácidos grasos de cadena corta (AGCC) específicos. Para esta aplicación
puntual, si bien no está aún regulado por la FDA, se han evaluado mediante ensayos in
vitro e in vivo la potencialidad de entrega del AGCC específico a partir de almidones
esterificados con valores de GS de hasta 0.97 (Annison et al., 2003; Morita et al., 2005).
Por otro lado, los ésteres con mediano a alto grado de sustitución (GS 0.5 – 2.5) son
comúnmente utilizados como aglutinantes de tabletas, adhesivos de fusión en caliente,
filtros de cigarrillos y materiales de recubrimiento (Biswas & Shogren, 2008; Chi et al.,
2008; Lopez-Rubio et al., 2009; Garg & Jana, 2011).
3.2.1.2. CARACTERIZACIÓN GENERAL DE PRODUCTOS
Los almidones acetilados se caracterizaron mediante los análisis de Resonancia
Magnética Nuclear en fase sólida (RMN 13C CP/MAS) y Espectroscopía de Infrarrojo
por Transformada de Fourier (FTIR) con la finalidad de confirmar la acetilación del
polímero. La observación de los cambios en la forma y aspecto superficial de los
gránulos de almidón debido a la modificación química se realizó mediante Microscopía
Electrónica de Barrido (SEM). El análisis termogravimétrico (TGA) se utilizó para
evaluar la estabilidad térmica de los almidones luego de la acetilación. Finalmente, se
aplicó la técnica de Difracción de Rayos X (DRX) para estudiar cambios en la
cristalinidad de los almidones esterificados con la evolución del grado de sustitución. A
continuación se resumen los resultados de la caracterización de los almidones acetilados
obtenidos a partir de almidón de maíz seco (HR 0.06%, 2 h – 110 °C) (Figura 3.1, A).
Los resultados correspondientes a los almidones acetilados a partir de almidón de maíz
con una humedad relativa del 15 % (Figura 3.1, B) se resumen en el Anexo I.
3.2.1.2.1. ESPECTROSCOPÍA DE RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR 13C
EN ESTADO SÓLIDO
La acetilación de almidón de maíz empleando la vía organocatalítica fue
confirmada por Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear de 13C de estado
72
sólido con Rotación en el Ángulo Mágico y Polarización Cruzada (RMN 13C CP/MAS).
En la Figura 3.2 se presenta el espectro del almidón de maíz sin modificar.
Figura 3.2. Espectro RMN 13C CP/MAS del almidón de maíz nativo.
El almidón nativo mostró 4 señales importantes en la región de 90–105 ppm para
C-1, un clúster para C-2,3,5 en 65–80 ppm, una señal en el intervalo de 79 a 87
asignable al C-4, y otra en el rango de 56 a 65 ppm asociada al C-6; todas ellas señales
típicas de los carbonos de la unidad glucopiranosa del almidón de maíz nativo. Estas
señales son comparables con las obtenidas para almidones nativos de maíz en otras
investigaciones (Cheetham & Tao, 1998; Chi et al., 2008; Khatoon et al., 2009).
Los espectros RMN 13C en estado sólido con CP/MAS también proporcionan
información acerca de la cristalinidad del almidón y simetría de la hélice de las cadenas
a partir de la multiplicidad de la señal C-1, mediante la cual se pueden inferir los
distintos tipos de conformaciones del almidón (A, B, V y amorfo) (Veregin, Fyfe,
Marchessault, & Taylor, 1986; Gidley & Bociek, 1988). Las conformaciones A y B se
encuentran en los almidones de cereales y tubérculos, respectivamente, y consisten en
disposiciones de doble hélice de cadenas de almidón con diferencias en la asociación y
200 190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
ppm
C1
C4
C6
Clúster 2,3,5
73
simetría de cristales. Por el contrario, la conformación V consiste en cadenas de
almidón en una disposición helicoidal simple con una cavidad hidrófoba cilíndrica que
puede incluir moléculas tales como lípidos, iodo, y cadenas alquílicas de surfactantes
(Morgan, Furneaux, & Larsen, 1995). Para la conformación A, que presenta tres
residuos de glucosa no idénticos, la región de C-1 en el RMN 13C sólido se conoce que
se exhibe como un clúster en tres picos (≈ 102, 101 y 100 ppm). Para la conformación
B, que tiene dos residuos de azúcar no idénticos, por el contrario, la señal C-1 tiene dos
máximos (≈ 101 y 100 ppm) (Gidley & Bociek, 1988). Para la conformación V, por su
parte, la señal C-1 aparece como un único pico centrado en 103–104 ppm. Los
materiales amorfos, en cambio, exhiben una única señal en la resonancia de C-1 a
valores de ppm más bajos que las estructuras tipo V (Gidley & Bociek, 1988; Therien-
Aubin et al., 2007).
En el caso del almidón de maíz nativo utilizado en esta Tesis, la señal C-1 en el
espectro RMN 13C del polímero sin modificar se presenta como un triplete con máximos
en 102.4, 101.1 y 99.7 ppm que, en línea con lo expuesto anteriormente corresponde, a
un patrón tipo A típico de almidón de cereales.
La Figura 3.3 presenta el espectro RMN 13C CP/MAS en estado sólido de la
muestra de almidón acetilado empleando NaOH como catalizador (AANaOH), usada
como referencia, en comparación con el espectro del polímero sin modificar (AN). Esta
muestra se obtuvo usando 0.5 g de NaOH 50 % a 130 °C durante 30 min de reacción
con 12 mL de anhídrido acético y 2 g de almidón nativo de maíz (base seca, 2 h – 110
°C). El espectro de la muestra AANaOH mostró seis señales, cuatro de ellas
correspondientes a los carbonos del polímero de almidón nativo ya descriptas (90–105
ppm para C-1, 70–80 ppm para C-2,3,5; 82 ppm para C-4, y 63 ppm para C-6). Las dos
nuevas resonancias de carbono en el espectro, una de ellas situada en la región 166–178
ppm (centrada en 170.9 ppm), y la otra señal ubicada entre 17 y 25 ppm (y centrada en
20.9 ppm), corresponden al carbonilo C=O y al CH3 del grupo acetilo insertado en la
molécula de almidón, respectivamente, confirmando que la acetilación efectivamente
ocurrió (Copinet, Bliard, & Couturier, 2000; Shogren & Biswas, 2006).
74
200 190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
CH3
Clúster 2,3,5
C6
C4C1
C=O
ppm
AN
AANaOH
- GS= 0.41
Figura 3.3. Espectros RMN 13C CP/MAS del almidón de maíz nativo (AN) y almidón
acetilado en medio alcalino según Mark & Mehltretter (1972) (AANaOH - GS= 0.41).
A continuación se comparan en la Figura 3.4 los espectros RMN del almidón
acetilado por la ruta catalizada por NaOH recién descripto (AANaOH - GS= 0.41) con el
espectro del almidón acetilado por la vía organocatalítica (AAT - GS= 0.40). Se incluye
también el espectro RMN del almidón nativo como referencia. Como se observa, los
espectros de los almidones acetilados por las dos rutas, con iguales GS determinados
por saponificación, prácticamente se superponen. El espectro RMN de AAT (línea azul)
presenta las cuatro señales correspondientes a las resonancias de los carbonos del
almidón nativo y las dos resonancias de carbono, compatibles con grupos acetato,
observadas en el espectro RMN de AANaOH (línea roja). Las mismas aparecen en la
región de 162–179 ppm (centrada en 170.5 ppm) para C=O y en 17–25 ppm (centrada
en 20.5 ppm) para CH3, y provienen del grupo éster introducido. La similitud en los
espectros de las muestras comparadas indica que la acetilación en presencia de ácido
tartárico efectivamente ocurrió. Además, una comparación relativa de las áreas de las
señales características de la acetilación da cuenta de la similitud del nivel de
modificación de ambas muestras, en concordancia con los resultados de la
saponificación. Sin embargo, haciendo un análisis más minucioso, se observa en el
espectro de la muestra AAT un pequeño hombro en la región de los carbonilos que
75
podría sugerir la presencia en el producto de algún éster o anhídrido adicional en bajas
proporciones.
Figura 3.4. Espectros RMN 13C CP/MAS del almidón de maíz nativo (AN) y almidones
acetilados con GS ≈ 0.40 (AANaOH - GS= 0.41, AAT - GS= 0.40).
En la Figura 3.5 se presentan los espectros RMN en estado sólido de muestras
seleccionadas de AAT con GS creciente (0.40, 0.97 y 1.63), nuevamente en
comparación con los espectros del almidón nativo y el almidón acetilado control
(AANaOH - GS= 0.41). En la Figura 3.5 se observa que la intensidad de las señales
correspondientes a los grupos acetilos introducidos en las muestras AAT se incrementa a
medida que aumenta el nivel de modificación del polímero (determinado por
saponificación). A pesar de que la técnica de RMN con polarización cruzada (CP) no es
un método cuantitativo, al tratarse de muestras estrechamente relacionadas se puede
inferir que, en línea con el incremento del GS de las muestras AAT determinado
analíticamente, un aumento en el área de las resonancias presentes en las regiones
atribuidos a carbonos de C=O y CH3 provendría de un mayor número de grupos acetilo
introducidos en la molécula de almidón. Por otra parte, y en forma concomitante se
200 190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
ppm
AN
AAT -GS= 0.40
AANaOH
- GS= 0.41
C=O
CH3
C1
C4
C6
Clúster 2,3,5
180 178 176 174 172 170 168 166 164 162 160
26 24 22 20 18 16
76
observa un incremento de la pequeña señal centrada en la zona de los C=O (≈ 166 ppm),
tema sobre el que se volverá más adelante en este capítulo.
Por último, se observa en la Figura 3.5 que la señal asignable al C-1 se presenta
como un único pico en el espectro de AAT GS= 1.63. Lo anterior refleja la progresiva
pérdida de la estructura cristalina del almidón como consecuencia de la acetilación hasta
valores de GS elevados, en línea con lo que se mostrará más adelante con el estudio de
Difracción de rayos X.
200 190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
AANaOH
- GS= 0.41
AAT - GS= 1.63
AAT - GS= 0.97
AAT - GS= 0.40
ppm
AN
C=O
CH3
C1C4
C6
Clúster 2,3,5
Figura 3.5. Espectros RMN 13C CP/MAS del almidón de maíz nativo (AN) y almidones
acetilados (AANaOH - GS= 0.40; AAT - GS= 0.40, 0.97 y 1.63).
3.2.1.2.2. ESPECTROSCOPÍA DE INFRARROJO POR TRANSFORMADA DE
FOURIER
El análisis por FTIR se realizó con la finalidad de identificar cambios en la
estructura química de los almidones luego de la acetilación que puedan asociarse a la
efectividad de la modificación química.
77
La Figura 3.6 presenta los espectros IR de almidones acetilados obtenidos en
presencia de ácido tartárico (AAT) con GS en el intervalo entre 0.07 y 1.97, comparados
con el del almidón sin modificar (AN). Se incluye también el espectro del almidón
acetilado durante 6 h en ausencia de catalizador (AA – GS= 0.15). El espectro de FTIR
del almidón nativo mostró señales características de los principales grupos de la
molécula sin modificar. Entre ellas, una banda amplia en el intervalo de 3700 y 3000
cm-1 asignada a las vibraciones por estiramiento y vibraciones por flexión de los grupos
O-H inter e intramoleculares (Xu et al, 2004; Garg & Jana, 2011; Han et al., 2012), una
banda en la región de 3000 a 2800 cm-1 atribuida a la vibración por estiramiento del
enlace C-H de la unidad de anhidroglucosa de la molécula de almidón (Santha et al.,
1990; Xu et al., 2004; Diop et al., 2011), y una banda alrededor de 1645 cm-1 asignada a
la vibración por flexión del grupo O-H de las moléculas de agua absorbidas en las
regiones amorfas de los gránulos de almidón (Santha et al., 1990; Kizil, Irudayaraj, &
Seetharaman, 2002; Diop et al., 2011). La región entre 1500 y 1300 cm-1 mostró bandas
altamente superpuestas, entre las cuales se han descrito las vibraciones típicas por
flexión C-O-H, torsión CH2, flexión CH2 y estiramiento C-O-O (Cael, Koenig, &
Blackwell, 1975; Kizil et al., 2002; Cyras, Tolosa, & Vázquez, 2006).
En la región conocida como la huella digital, -que comprende a aquella con
números de onda entre 400 cm-1 y 1250 cm-1 (la región que se muestra es la que posee
números de onda entre 650 y 1250 cm-1)-, también se observaron las bandas
características del almidón nativo (Zamudio-Flores, Vargas-Torres, Gutiérrez-Meras, &
Bello-Pérez, 2010). La presencia de señales en 1158 cm-1, 1084 cm-1 y 1055 cm-1,
pueden asignarse al modo de acoplamiento C-O y de estiramiento C-C, al modo de
flexión C-O-H y a la banda debida a la vibración de estiramiento C-O, respectivamente
(Cael et al., 1975; Garg & Jana, 2011). Las bandas de absorción encontradas en el
espectro del almidón nativo a bajos números de onda se atribuyen al modo de
vibraciones del esqueleto de los enlaces glicosídicos (14) (923 cm-1), a la
deformación C-H y CH2 (857 cm-1), y al estiramiento C-C (763 cm-1) (Kizil et al.,
2002).
78
4000 3600 3200 2800 2400 2000 1600 1200 800
AA - GS= 0.02
(C-H3)
(O-H)
(C-O-C)
AAT - GS= 1.97
AAT - GS= 1.87
AAT - GS= 1.63
AAT - GS= 0.97
AAT - GS= 0.40
AAT - GS= 0.24
AAT - GS= 0.07
Absorb
ancia
Número de onda (cm-1)
AN
(C=O)
Figura 3.6. EspectroS FTIR de almidones acetilados en presencia de ácido tartárico (AAT).
Se incluyen también los espectros de almidón nativo (AN) y almidón acetilado en ausencia
de catalizador alguno (AA) obtenido en 6 h de reacción.
Los espectros de las muestras AAT proveen evidencia de que ocurrió la
acetilación por la aparición de bandas características de este grupo éster centradas en
1748 cm-1, 1376 cm-1 y 1244 cm-1 (Chi et al., 2008; Rivas-González, Zamudio-Flores,
& Bello-Pérez, 2009; Diop et al., 2011; Han et al., 2012). La señal más importante se
encontró en 1748 cm-1, asignada al estiramiento del grupo carbonilo C=O del éster. Esta
banda se utiliza comúnmente como evidencia cualitativa de que el grupo éster está
presente en la estructura de los almidones esterificados. La intensidad de esta señal es
altamente dependiente del grado de sustitución y es generalmente utilizada como
evidencia de esterificación (Diop et al., 2011). Para almidones acetilados de maíz por
rutas convencionales, se ha reportado la presencia de esta banda asignada al grupo
carbonilo C=O centrada en 1754 cm-1 (Chi et al., 2008), 1740 cm-1 (Lopez-Rubio et al.,
2009), 1750 cm-1 (Diop et al., 2011), 1749 cm-1 (Garg & Jana, 2011), y 1733 cm-1 (Han
et al., 2012).
Además de la absorbancia asignable al estiramiento C=O, ha sido reportado que
las bandas en 1376 cm-1 y 1244 cm-1 también están relacionadas con la acetilación y que
79
su intensidad a menudo presenta un incremento significativo con el GS (Lopez-Rubio et
al., 2009). Mano, Koniarova, & Reis (2003), Diop et al. (2011), y Prieto-Méndez et al.
(2010) reportaron que las bandas en 1376 cm-1 y 1244 cm-1 en almidones acetilados se
atribuyen al grupo CH3 y al enlace C-O-C del grupo acetilo, respectivamente.
Por otro lado, se observó en la Figura 3.6 que a medida que el nivel de
esterificación determinado por saponificación aumentó, las bandas asignadas al
estiramiento de los grupos hidroxilo del almidón (3700 – 3000 cm-1) y a las vibraciones
por flexión de los enlaces OH de las moléculas de agua absorbidas por el polímero
(1641 cm-1) disminuyeron notoriamente. La primera como consecuencia del creciente
número de hidroxilos que se sustituyeron por grupos éster, y la segunda asociada a la
menor higroscopicidad de la muestra como consecuencia de la esterificación.
Finalmente, el espectro IR de la muestra de almidón acetilado sin catalizadores
agregados (AA) presenta bandas de acetilación apenas visibles, en concordancia con el
bajo valor de GS de la muestra determinado por saponificación, y evidenciando el rol
que juega el ácido tartárico en la promoción de la acetilación del almidón.
3.2.1.2.3. MICROSCOPIA ELECTRÓNICA DE BARRIDO
El análisis por microscopía electrónica de barrido de los almidones esterificados
por vía organocatalítica se realizó con el objetivo de examinar cambios en la
morfología, integridad y aspecto superficial de los gránulos modificados con el avance
de la reacción.
Los gránulos de almidón de maíz nativo (Figura 3.7 A) mostraron una forma
poliédrica con diámetros nominales en el rango de 2-20 µm y superficies mayormente
lisas. En unos pocos gránulos se observaron pequeños poros que pueden atribuirse a los
procesos naturales que tienen lugar en el tejido dentro de la planta, a los procesos que se
producen durante el tratamiento mecánico de los granos (Niemann & Whistler, 1992),
y/o a la acción in situ de amilasas (Sujka & Jamroz, 2007). Se ha demostrado que la
presencia de poros, canales y cavidades aumenta el área superficial de los gránulos, lo
80
que los hace potencialmente más disponibles para las reacciones químicas y enzimáticas
(Huber & BeMiller, 2001; Sujka & Jamroz, 2007). Transcurridos 30 min de reacción no
se observaron cambios significativos en la forma o en la superficie de los gránulos
modificados respecto del almidón nativo (Figura 3.7 B, GS= 0.07).
Figura 3.7. Micrografías SEM del almidón nativo (AN) y almidones acetilados en
presencia de ácido tartárico (AAT - GS= 0.07 – 0.97). 2000X.
A) AN
B) AAT – GS= 0.07 C) AAT – GS= 0.24
D) AAT – GS= 0.40 E) AAT – GS= 0.97
30 μm
81
Después de la primera hora de reacción (Figura 3.7 C, GS = 0.24), los gránulos
mostraron una superficie más rugosa. El incremento en la rugosidad de la superficie de
los gránulos modificados es una característica común que se observa para los almidones
acetilados (Singh, Kaur, & Singh, 2004, Rincón et al., 2007). Algunos autores han
propuesto que el aumento de la rugosidad de los gránulos observado después de la
acetilación puede mejorar la adhesión del almidón a los polímeros sintéticos, debido a la
mayor área superficial para la unión y anclaje mecánico (Garg & Jana, 2011).
Con el avance de la reacción (GS crecientes) una fracción de los gránulos mostró
deformación y/o la aparición de ranuras. Este patrón se fue intensificando con el
aumento del nivel de modificación a partir del GS= 0.40 (Figura 3.7 D-E). La
deformación de los gránulos ha sido previamente informada para los almidones de maíz
acetilados con GS inferiores (Lopez-Rubio et al., 2009). En ningún caso, sin embargo,
se perdió la estructura granular del sustrato, a diferencia de lo que en general se ha
observado para los almidones acetilados con GS elevados obtenidos por ejemplo por la
metodología convencional de acetilación catalizada con NaOH a temperaturas elevadas
(Xu et al, 2004; El Halal et al., 2015).
3.2.1.2.4. DIFRACCIÓN DE RAYOS X
La técnica de difracción de rayos X fue utilizada con el fin de determinar el
efecto de la acetilación sobre la cristalinidad del almidón. Como ya se anticipó,
dependiendo de su origen botánico y composición, los gránulos de almidón presentan
un modelo de difracción característico. Los modelos de difracción de rayos X de tipo A
y B se asocian con las formas polimórficas cristalinas del almidón nativo. La A se
encuentra principalmente en los almidones de cereales, y la B en almidones de
tubérculos y frutas (Karim et al., 2000; Copeland et al., 2009; Lopez-Rubio et al.,
2009). La C, por su parte, se trata de una forma mixta y se encuentra principalmente en
distintos almidones de leguminosas y de ciertos tubérculos y semillas (Bellitz et al.,
2009).
82
10 15 20 25 30 35 40 45
AAT - GS= 1.97
AAT - GS= 1.87
AAT - GS= 1.63
AAT - GS= 0.97
AAT - GS= 0.40
AAT - GS= 0.24
AAT - GS= 0.07
Inte
nsid
ad
(u.a
.)
2(°)
AN
Figura 3.8. Difractogramas de rayos X del almidón nativo (AN) y almidones acetilados
en presencia de ácido tartárico (AAT).
La Figura 3.8 muestra los patrones de difracción de rayos X del almidón nativo
y acetilados obtenidos en esta Tesis. El almidón de maíz nativo exhibe picos de
difracción en valores de 2 de 14.9°, 17.0°, 17.8°, 19.8° y 22.8°, que son característicos
de un patrón de difracción tipo A de almidón de cereales, en concordancia con lo
concluido a partir del correspondiente espectro RMN 13C CP/MAS (Figura 3.2).
Los almidones acetilados AAT con valores de GS hasta 0.40 presentaron
patrones similares en términos del número y posición de los picos comparados con el
patrón del almidón sin modificar. Sin embargo, la intensidad de los picos característicos
sí mostró una reducción gradual con el aumento del GS, atribuida a que la incorporación
de los grupos ésteres redujo progresivamente la cristalinidad de los almidones. Esta
última observación se acentuó en los patrones de difracción de los almidones altamente
sustituido, cuyos difractogramas mostraron notables cambios respecto de su contraparte
nativa hasta obtenerse patrones propios de un material amorfo.
Los resultados obtenidos sugieren que la acetilación conlleva a la pérdida
gradual de la estructura cristalina del almidón con el avance de la reacción, en
83
concordancia con la literatura de acetilación de almidones. La revisión de los datos de
difracción de rayos X de almidones acetilados por otras metodologías muestra que con
el progreso de la esterificación normalmente se destruye la estructura cristalina del
almidón nativo (Xu et al., 2004; Chen, Li, Li, & Guo, 2007, Diop et al., 2011, Garg &
Jana, 2011, Han et al., 2013). Por ejemplo, Chi y su grupo (2008) reportaron resultados
similares en la acetilación de almidón de maíz catalizada por ácido metasulfónico. Los
autores obtuvieron almidones acetilados con diversos niveles de sustitución (GS= 0.85,
1.78 y 2.89). El patrón de difracción de la muestra de almidón acetilado con GS de 0.85
mostró que los picos cristalinos del almidón de maíz nativo aún existían pero con
mucha menor intensidad, como se ilustra en la Figura 3.8 para las muestras con GS de
0.40 y 0.97 obtenidos en este capítulo. Sin embargo, para las muestras con GS de 1.78 y
2.89 los autores concluyeron que las estructuras ordenadas se perdieron.
La fracción cristalina en los almidones nativos se ha atribuido en gran medida a
la formación de dobles hélices por puentes hidrógeno intermoleculares dentro de los
segmentos de amilopectina. Sin embargo, en los almidones esterificados el reemplazo
parcial de los grupos hidroxilos por grupos ésteres más voluminosos restringe la
formación de puentes hidrógeno inter e intramoleculares, resultando en la progresiva
destrucción de la estructura cristalina ordenada original (Zhang et al., 2009; Diop et al,
2011). Entonces, a medida que el grado de sustitución de los almidones esterificados
aumenta, el patrón original propio de un material semicristalino se va volviendo más
amorfo (Singh et al., 2011).
3.2.1.2.5. ANÁLISIS TERMOGRAVIMÉTRICO (TGA)
El análisis termogravimétrico de las muestras se realizó con el fin de estudiar el
impacto de la modificación química en el patrón de la descomposición térmica de los
almidones. La Figura 3.9 muestra la curva TG del almidón de maíz nativo, donde se
reporta la masa residual (%) en función de la temperatura.
.
84
0 100 200 300 400 500 600
0
20
40
60
80
100
Masa r
esid
ual (%
)
Temperatura (°C)
Figura 3.9. Curva TG del almidón de maíz nativo.
La curva TG del almidón de maíz sin modificar mostró una pérdida de masa en
dos etapas (Figura 3.9). La primera tuvo lugar desde temperatura ambiente hasta ≈ 130
°C, y se la asigna a la deshidratación del almidón (Garg & Jana, 2011; Colussi et al.,
2014). La segunda etapa de pérdida de masa se observó en el intervalo aproximado de
275 a 350 °C, y se la asigna a la descomposición térmica del almidón. La
descomposición del almidón es el resultado de la condensación entre los grupos
hidroxilos que forman uniones éter y de la deshidratación de los hidroxilos vecinos en el
anillo de glucosa que causan ruptura del anillo y/o formación de enlaces dobles (Zhang,
Golding, & Burgar, 2002; Cyras et al., 2006). El calentamiento adicional resultó en la
carbonización y formación de cenizas (Mano et al., 2003). El patrón de descomposición
térmica descripto es similar al reportado para el almidón de maíz por Xu et al. (2004),
Garg & Jana (2011) y entre otros.
A partir de la curva TG del almidón de maíz nativo, y a fines de permitir
comparaciones cuantitativas con los almidones acetilados, se calculó la Tonset
extrapolada. Este valor es una forma estandarizada de determinar la temperatura a la
cual se considera que comienza la descomposición (ASTM®, http://www.astm.org/ e
ISO, http://www.iso.org). Según esta convención, la Tonset extrapolada es obtenida a
85
partir de la intersección entre el valor de la ordenada de pre-descomposición y una línea
tangencial trazada hasta el punto de mayor pendiente de la curva de pérdida de masa en
la región de descomposición, tal como se ilustra en la Figura 3.10 para la curva TG del
almidón de maíz nativo. La Tonset extrapolada del almidón nativo fue de 309 °C, lo que
es consistente con la literatura (Paiva et al., 2018)
0 100 200 300 400 500 600
0
20
40
60
80
100
Masa r
esid
ual (%
)
Temperatura (°C)
Tonset
= 309 °C
Figura 3.10. Obtención de la Tonset extrapolada a partir de la curva TG del almidón de maíz
nativo.
La Figura 3.11 muestra los resultados del análisis termogravimétrico para el
almidón nativo en términos de la primera derivada de las señales de TG (DTG)
normalizado respecto de la masa inicial de la muestra. A partir de la curva DTG se
obtuvo el valor de Tmax (°C) que corresponde a la temperatura a la que se da la
velocidad máxima de pérdida de masa. Para el almidón nativo la Tmax fue de 326 °C.
86
0 100 200 300 400 500 600
DT
G
Temperatura (°C)
Tmax
= 326 °C
Figura 3.11. Curva DTG del almidón de maíz nativo.
A continuación se describen los resultados del análisis termogravimétrico de las
muestras acetiladas en presencia de ácido tartárico. La Figura 3.12 muestra las curvas
TG de los almidones AAT en comparación con la curva del almidón nativo, a partir de
las cuales se obtuvieron los porcentajes de humedad remanente para todas las muestras.
0 100 200 300 400 500
0
20
40
60
80
100
Masa r
esid
ual (%
)
Temperatura (°C)
AN
AAT - GS= 0.07
AAT - GS= 0.24
AAT - GS= 0.40
AAT - GS= 0.97
AAT - GS= 1.63
AAT - GS= 1.87
AAT - GS= 1.97
Figura 3.12. Curvas TG para almidón nativo (AN) y almidones acetilados obtenidos en
presencia de ácido tartárico (AAT - GS= 0.07 – 1.97).
87
El almidón de maíz nativo usado en esta Tesis presentó originalmente una de
humedad inicial del ≈ 15%. Sin embargo, el acondicionamiento previo de todas las
muestras a 105 °C durante 1 h antes de realizar el análisis termogravimétrico resultó en
un contenido de humedad inicial más bajo. En el caso del almidón nativo, su humedad
estuvo en torno al 7 %. Este valor se redujo con el aumento del GS para las muestras
acetiladas hasta alcanzar un valor de ≈ 1.6% para la muestra AAT con un GS de 1.97, lo
que confirma la disminución gradual en la higroscopicidad del almidón cuando los
grupos hidroxilos son reemplazados progresivamente por grupos acetilo más
hidrofóbicos. El mismo patrón fue encontrado por Colussi et al. (2014), quienes
hallaron un 6% de pérdida inicial de agua en almidones acetilados (GS = 0.38 – 0.49)
con contenidos bajo y medio de amilosa, en comparación con el valor de 10%
determinado para sus contrapartes nativas.
La Figura 3.13 resume los valores de Tonset de las muestras acetiladas AAT en
función del GS. Los resultados ilustran una reducción importante en la temperatura de
inicio de la descomposición del polímero acetilado que se podrían sugerir la existencia
de reacciones de degradación del almidón durante la esterificación (Zhang et al., 2002;
Garg & Jana, 2011).
0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0
260
265
270
275
280
285
290
295
300
305
310
To
nse
t (°
C)
GS
Figura 3.13. Valores de Tonset (°C) en función del GS de las muestras AAT (GS= 0.07 –
1.97).
88
Antes de determinar la Tmax de los almidones acetilados como función del GS a
partir de las curvas de DTG, vale la pena destacar que, -como se observa en la Figura
3.12-, en los termogramas de los almidones acetilados se observó una tercera etapa de
pérdida de masa adicional a las etapas mencionadas para el almidón nativo. La
contribución de esta tercera etapa fue especialmente significativa para los almidones
modificados con GS mayor a 0.40. Estos resultados se tradujeron en una lomada
asociada a la pérdida de humedad seguida de dos picos de descomposición solapados en
los datos DTG (Figura 3.14).
100 200 300 400 500
Tmax2
AN
AAT - GS= 1.97
AAT - GS= 1.87
AAT - GS= 1.63
AAT - GS= 0.97
AAT - GS= 0.40
AAT - GS= 0.24
DT
G
Temperatura (°C)
AAT - GS= 0.07
Tmax1
Figura 3.14. Curvas DTG para el almidón nativo (AN) y almidones acetilados obtenidos en
presencia de ácido tartárico (AAT - GS= 0.07 – 1.97).
A partir de los datos DTG se calculó la Tmax para los dos picos observados de
descomposición de los almidones acetilados, designados como Tmax1 y Tmax2. La Figura
3.15 muestra la evolución de la Tmax1 y Tmax2 en función del GS de las muestras
acetiladas en presencia de ácido tartárico. En la figura citada se observa una
disminución progresiva de Tmax1 con el GS, resultado que está en concordancia con la
disminución de la Tonset con el GS y que se atribuyó a la posible existencia de reacciones
de degradación del almidón durante la esterificación. La posición de Tmax1 con los
89
menores GS se asemeja a la Tmax del almidón nativo, lo que indicaría que este primer
pico de descomposición correspondería a la condensación térmica de grupos hidroxilos
remanentes en el almidón después de la acetilación y depolimerización de los anillos de
glucosa. La Tmax2 del segundo pico de descomposición, por su parte, se mantuvo
aproximandamente constante con el GS de las muestras (Tmax2 = 380 – 384 °C), con
valores más de 50 °C superiores a la Tmax del almidón nativo. El comportamiento
descripto para ambas temperaturas características se refleja en el distanciamiento de los
picos de descomposición en la curva DTG a medida que aumenta el grado de
sustitución.
0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0
290
300
310
320
330
340
350
360
370
380
390
Tmax
- AN
Tmax1
- AAT
Tmax2
- AAT
Tm
ax1,
Tm
ax2 (
°C)
GS
Figura 3.15. Valores de Tmax1 y Tmax2 calculados para muestras de almidón nativo (AN) y
almidones acetilados obtenidos en presencia de ácido tartárico (AAT - GS= 0.07 – 1.97).
El patrón de descomposición del almidón acetilado en dos etapas fue también
descripto previamente por Aziz et al. (2004) y Zhang et al. (2009) empleando, ambos,
una mezcla de anhídrido acético/ácido acético como acilante y ácido sulfúrico como
catalizador a partir de almidón de sagú y almidón de jengibre amarillo, respectivamente.
Aziz et al. (2014) encontraron que los valores de Tmax1 y Tmax2 en el almidón acetilado
de sagú con GS= 0.83 fueron de 301 °C y de 383 °C, respectivamente. Por otro lado,
90
Zhang et al. (2009), evaluaron la descomposición térmica del almidón acetilado en un
rango más amplio de modificación (GS= 0.09 – 2.67). Los autores encontraron que para
las muestras parcialmente sustituidas con GS entre 0.09 y 1.51 la primera región de
pérdida de masa ocurrió a una temperatura más baja que lo ocurrido en el almidón
nativo, mientras que para el almidón acetilado altamente sustituido (GS= 2.67) la
intensidad del primer pico prácticamente desapareció observándose un único pico de
descomposición con Tmax en 380 °C. Un patrón similar se observó en las muestras de
almidón AAT preparadas a partir de almidón húmedo (HR 15.0%), las cuales alcanzaron
valores de GS cercanos a 3 y un único pico de descomposición con una Tmax más de 50
°C mayor que la del almidón nativo (Anexo I).
El mismo tipo de patrón en dos etapas de descomposición también fue
encontrado por Elomaa et al. (2004), cuando analizaron las curvas DTG de diez
muestras de almidón de papa acetilado con GS creciente (GS entre 0.5 y 2.8). Las
muestras acetiladas se obtuvieron por reacción del almidón de papa con exceso de
anhídrido acético empleando NaOH 50 % como catalizador (11% respecto del almidón)
y variando el tiempo de reacción (10 min – 5 h) a 125 °C. Elomaa et al. (2004),
empleando un IR con celda de gases acoplado al TGA, determinaron que el segundo
pico de descomposición (ubicado entre ≈ 330 °C y 385 °C para almidones acetilados
con un GS de entre 0.5 y 3, respectivamente y cuya área aumentó con el GS de la
muestra) correspondía al desprendimiento de ácido acético como producto de
descomposición de los grupos acetilo introducidos durante la acetilación. Por otra parte,
la combinación del análisis termogravimétrico con espectrometría de masas para
analizar los gases generados durante un TGA del etilenvinilacetato también permitió
atribuir el pico centrado alrededor de 380 °C del DTG al ácido acético (The Analysis of
Ethylene Vinyl Acetate by TG-MS, PerkinElmer, http://
www.perkinelmer.com/CMSResources/Images/44-74009ABR EVAbyTG-MS.pdf). De
la discusión anterior se puede interpretar que el segundo pico de descomposición que se
observó entre 350 y 420 °C en la Figura 3.14 correspondería a la descomposición de
regiones ricas en grupos acetato, más estables que el almidón de partida (Garg & Jana,
2011, Colussi et al., 2014).
91
Finalmente, y en vistas de la evolución de las áreas de los dos picos de
descomposición ilustrado en las curvas de DTG en la Figura 3.14 (con el aumento del
GS el área del segundo pico aumenta en claro desmedro del área del primero), y de las
observaciones similares realizadas por Elomaa et al. (2004) y Zhang et al. (2009) para
otros almidones acetilados; en la Figura 3.16 se grafica el área del segundo pico de
descomposición (A2) en función del GS medido por saponificación para todas las
muestras AAT obtenidas. El aislamiento de la contribución del área del segundo pico de
descomposición de las curvas DTG de los almidones AAT evaluados en esta sección se
realizó mediante la deconvolución de la zona de picos superpuestos en las curvas DTG
utilizando la función del área de Pearson VII para muestras AAT con valores de GS
hasta 0.97, y la función del área de Lorentz para muestras AAT con GS entre 1.63 y
1.97. Finalmente, se calcularon las contribuciones porcentuales de las áreas de ambos
picos de descomposición, A1 y A2.
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
0
20
40
60
80
100 A
2 AA
T
A2 AA
NaOH
A2 (
%)
GS
r2= 0.99
Figura 3.16. Área porcentual del segundo pico de descomposición de muestras de AAT
versus GS medidos por saponificación (GS= 0.07 – 1.97). Se incluyen los valores de A2
para las muestras de AANaOH (GS= 0.40 – 1.17).
Los resultados de A2 versus el GS de las muestras muestran una fuerte
correlación lineal, en concordancia con un análisis similar realizado por Elomaa et al.
92
(2004) para almidones acetilados de papa con GS variable. En el trabajo citado los
autores determinaron el área porcentual del segundo pico de descomposición (que se dio
en intervalos de temperatura compatibles con el desprendimiento de ácido acético como
producto de descomposición de los grupos acetatos), y hallaron una correlación lineal
con muy buen ajuste con el valor de GS determinado por saponificación y confirmado
por RMN 1H (r2= 98.1 y 97.9, respectivamente). Al igual que en el artículo citado, estos
resultados sugieren la posibilidad de estimar el nivel de modificación de los almidones
obtenidos en esta Tesis a partir de un sencillo y rápido ensayo de TG, lo que se presenta
como muy atractivo en comparación con los tiempos y cantidad de muestra asociados a
la saponificación y los costos que implica el RMN. En la Figura 3.16 también se
incluyeron los valores de las áreas porcentuales del segundo pico de descomposición de
almidones acetilados mediante la ruta convencional catalizada por NaOH con grados de
sustitución en el rango de 0.40 a 0.92 (AANaOH). Estas muestras también mostraron dos
picos de descomposición en su DTG, en este caso con Tmax1 entre 308 – 321 °C y Tmax2
en 360 °C. La relación de los valores de A2 con el GS para estas muestras guarda
estrecha relación con la hallada para almidones acetilados en presencia de tartárico.
3.2.1.2.6. ENSAYO CUALITATIVO DE REPARTO EN UNA MEZCLA DE
LÍQUIDOS INMISCIBLES (FASE POLAR/NO POLAR)
En la presente sección se analizó cualitativamente el cambio en la polaridad de
los almidones modificados a partir de observar su posicionamiento preferencial en tubos
de ensayo que contenían volúmenes iguales de agua destilada (índice de polaridad =
10.2) y éter de petróleo (índice de polaridad = 0.1). El índice de polaridad corresponde a
una medida numérica de la polaridad relativa de cada disolvente, siendo este valor
mayor para solventes con mayor polaridad.
Cuando el almidón nativo fue añadido al sistema bifásico, el mismo descendió a
la fase acuosa (zona polar) absorbiendo agua y hundiéndose inmediatamente. Por el
contrario, los almidones acetilados permanecieron en la fase no polar superior y se
mantuvieron flotando en la interfase polar/no polar sin descender a la fase acuosa. Los
tubos de ensayo fueron luego agitados manualmente durante 30 segundos, y una vez
93
que las fases líquidas se separaron se observó la distribución de los sólidos en las fases
inmiscibles. Como se ilustra en la Figura 3.17, el almidón nativo se distribuyó en la
fase acuosa (fase inferior), que se volvió opaca; mientras que los almidones acetilados
permanecieron preferentemente en la zona más baja de la fase orgánica superior, y no
alcanzaron nunca la fase acuosa. A pesar de su simplicidad el ensayo descrito ilustró
cualitativamente el cambio significativo en la polaridad del almidón inducida tras la
acetilación organocatalítica, aún para los GS más bajos.
Figura 3.17. Fotografía que muestra la distribución de los almidones de maíz nativo (AN) y
acetilados en presencia de ácido tartárico (AAT) con el incremento del GS en mezclas
bifásicas de agua destilada / éter de petróleo. Fotografía tomada inmediatamente después de
la agitación.
3.2.2. ENSAYOS DESTINADOS A INFERIR ENTRECRUZAMIENTO
Tal como se mencionó anteriormente, el método de esterificación empleado en
la presente Tesis se basó en la publicación de Hafrén y Córdova (2005), en la que los
autores propusieron el empleo de ácido tartárico como catalizador α-hidroxiácido de la
polimerización por apertura de anillo de ε-caprolactona utilizando como iniciador
celulosa procedente de algodón y papel. En el mismo artículo, los autores reportaron la
esterificación de fibras de algodón con ácidos hexadecanoico y pentinoico catalizada
por ácido tartárico. A partir de ensayos de hidrofobicidad (ángulo de contacto), Hafrén y
Córdova concluyeron que la PCL, y no el ácido tartárico, fue la principal molécula de
injerto en la celulosa ya que la superficie de la muestra se volvió hidrófoba (Hafrén y
Córdova, 2005).
AN AAT
GS= 0.07
AAT
GS= 0.24
AAT
GS= 0.40
AAT
GS= 0.97
AAT
GS= 1.63
Agua destilada
(Zona polar)
Éter de petróleo
(Zona NO polar)
94
Sin embargo, más tarde los autores presentaron una patente extendiendo el
método organocatalítico descripto, donde manifestaron la posibilidad que los
catalizadores de tipo α-hidroxiácido actúen también como agentes modificadores sobre
el sustrato empleado (US 2009/0111980 A1, Hafrén & Córdova, 2009). Esta propuesta,
y ciertas observaciones experimentales realizadas durante el trascurso de esta Tesis
asociadas a la insolubilidad de las muestras AAT (Figura 3.18), sugirieron que el ácido
tartárico (además de promover la incorporación de grupos acetilo según se demostró en
la Figura 3.1), podría haber entrecruzado el almidón.
Si bien en general en la bibliografía de entrecruzamiento de almidón en forma
granular con este tipo de ácidos orgánicos de origen natural (como los ácidos tartárico y
cítrico) se ha informado el uso de catalizadores específicos, como por ejemplo
hipofosfito de sodio (Assaleh et al., 2014; Reddy & Yang, 2008), así como temperaturas
de curado elevadas; en la presente sección se analizan propiedades de los gránulos
modificados que darían cuenta de la posibilidad de que en la ruta de acetilación
propuesta se den reacciones simultáneas de reticulado del almidón.
Figura 3.18. Ensayo de “disolución” de almidón acetilado en DMSO a 100 °C por 15 min.
A) AAT – GS= 0.40, B) AANaOH – GS= 0.41.
La Figura 3.18 ilustra la dificultad para disolver la muestra AAT con GS= 0.41
en DMSO a 100 °C como se hizo referencia en el párrafo previo. Esta muestra formó
una dispersión turbia en DMSO y con el tiempo se formó un precipitado (con gránulos
aparentemente hinchados), indicando la no disolución de la muestra en DMSO bajo las
condiciones de ensayo realizadas. Por el contrario, y a modo de comparación, la muestra
de AANaOH se disolvió completamente en DMSO a 100 °C, formando una solución
AAT
GS= 0.40
AANaOH
GS= 0.41
Precipitado
95
transparente y viscosa (vale destacar que la posibilidad de disolver la muestra AANaOH
en DMSO permitió validar la técnica de saponificación utilizada a lo largo de la Tesis
contrastándola con los resultados obtenidos por RMN 1H (sección 2.4.1)).
Los almidones modificados químicamente se han estudiado durante muchos
años. Como se introdujo oportunamente, en el caso de los almidones esterificados la
determinación del nivel de sustitución alcanzado se ha llevado a cabo usando diversas
técnicas como la saponificación, RMN 1H en estado líquido y menos frecuentemente
HPLC. En cambio, la determinación del grado de entrecruzamiento en los almidones
entrecruzados es a menudo una tarea difícil. De hecho, la revisión bibliográfica al
respecto revela que la evaluación de las propiedades de los almidones entrecruzados se
reporta en general como función de la concentración del agente entrecruzante empleado,
y no del nivel de entrecruzamiento conferido. En vista de esta dificultad, el nivel de
entrecruzamiento a menudo se estudia en forma indirecta midiendo ciertas propiedades
de los almidones tratados con el reactivo con capacidad entrecruzante. Entre los
métodos experimentales encontrados en la literatura a través de los cuales se intenta
determinar el grado de entrecruzamiento de almidones pueden citarse: (1) el volumen de
sedimentación (≈ poder de hinchamiento) de los gránulos de almidón, (2) algunas
propiedades de la pasta (viscosidad máxima, viscosidad final a 95 ° C, viscosidad final),
y (3) determinación del nuevo elemento o del nuevo grupo que se incorporó con el
agente entrecruzante (ej. contenido de fósforo en almidones entrecruzados con fosfato).
Una vez confirmada la incorporación de grupos acetilo en la sección 3.2.1, y
dado que los tartratos de almidón no presentan elementos químicos nuevos respecto de
los que tienen los almidones acetilados que permitirían identificar directamente su
presencia en los almidones modificados (como sí es el caso de los almidones
entrecruzados con agentes que contienen fósforo, por ejemplo, que se determina por
RMN 31P); a continuación se presentan resultados de algunas técnicas indirectas
utilizadas en la presente Tesis para evaluar la hipótesis del entrecruzamiento del
almidón con ácido tartárico en simultáneo con su acetilación.
96
3.2.2.1. ENSAYOS DE GELATINIZACIÓN
Los almidones acetilados por la vía organocatalítica propuesta en esta Tesis se
sometieron a condiciones de gelatinización. Para tal fin, suspensiones de almidón AAT
en agua (5%) fueron calentadas con agitación magnética continua a 96 °C por 30 min.
La muestra de almidón AAT con GS= 0.07 obtenida en media hora de reacción generó
una pasta de almidón con consistencia viscosa, la cual tuvo la capacidad de formar un
film. Sin embargo, con el incremento del GS no se formaron pastas estables, y se pudo
apreciar que una porción de la muestra precipitó (AAT, GS 0.24 – 1.97). Considerando
esta observación, luego del tiempo objetivo de calentamiento de la suspensión de
almidón, las mezclas resultantes (Figura 3.19 A) se centrifugaron y se separaron en dos
fases (Figura 3.19 B): un sobrenadante, correspondiente a la fracción capaz de
gelatinizar de la muestra que tras un proceso de secado por evaporación formó un film
(Figura 3.19 C); y un precipitado (porción que no gelatiniza) que se recuperó en forma
granular luego de dos lavados con etanol (Figura 3.19 D).
Figura 3.19. A) Suspensión de almidón AAT sometida a condiciones de gelatinización, B)
muestra luego de la centrifugación, C.1) sobrenadante en bandeja para evaporación, C.2)
film seco producido (50 °C - 24 h), D.1) precipitado seco recuperado (antes de molienda),
D.2) precipitado recuperado en forma granular (micrografía SEM).
A)
C.2) C.1)
D.1)
80 μm
D.2)
B)
97
Posteriormente, se determinaron las masas recuperadas de sobrenadante y
precipitado en función del incremento del GS global de las muestras. De los datos
resumidos en la Figura 3.20 se puede apreciar que con el incremento del GS (mayores
tiempos de reacción) la masa porcentual de la fracción soluble del almidón disminuyó
en favor de un incremento de la masa de la fase que no gelatiniza y que precipita.
En condiciones de temperatura y contenido de agua adecuados los almidones
gelatinizan formando una pasta viscosa. Por otra parte, es bien conocido que la
acetilación conduce a disminuir la temperatura a la cual el proceso de gelatinización
ocurre (Garg & Jana, 2011; Colussi et al., 2014). Sin embargo, las muestras de almidón
acetilado en presencia de ácido tartárico mostraron notable dificultad para gelatinizar en
su totalidad con el incremento del GS. De hecho, en las muestras AAT obtenidas a partir
de las 4 h de reacción (GS ≥ 1.63) más del 90 % de la masa inicial de las muestras no
gelatinizó en las condiciones de calentamiento ensayadas (96 °C, 30 min) y se recuperó
como un precipitado.
1 2 3 4 5 6
0
20
40
60
80
100
Ma
sa
re
cu
pe
rad
a (
%)
Tiempo (h)
Porción insoluble
(Precipitado)
Porción soluble
(Película de almidón)
Figura 3.20. Masa recuperada (%) en la porción soluble y precipitados de muestras de AAT
obtenidas a distintos tiempos de reacción (1h - GS= 0.24; 2h – GS= 0.40; 3h – GS= 0.97; 4h
– GS= 1.63; 5h – GS= 1.87; 6h – GS= 1.97).
98
La dificultad del almidón para gelatinizar se ha observado en almidones
entrecruzados con diversos agentes entrecruzantes, lo que se atribuye a la reducida
movilidad de las cadenas en el gránulo de almidón como resultado de los puentes
intermoleculares generados (Neelam et al., 2012). Por ejemplo, Juansang et al. (2012)
observaron que el almidón de caña entrecruzado con trimetafosfato de sodio requirió
mayor tiempo para gelatinizar (40 min) respecto de lo requerido para el almidón nativo
(5 min). Los autores atribuyeron la resistencia del polímero modificado a los enlaces
covalentes del almidón entrecruzado que permitieron soportar la temperatura de
gelatinización (96 °C), sin perder la integridad de los gránulos.
Por su parte, los resultados aquí obtenidos demostraron que con el incremento
del GS de las muestras los almidones acetilados AAT presentan una creciente resistencia
a gelatinizar a temperaturas cercanas a la ebullición, sugiriendo firmemente que el ácido
tartárico podría estar esterificando el almidón y promoviendo su entrecruzamiento en
simultáneo con la incorporación de grupos acetilo ya verificada (RMN 13C CP/MAS y
FTIR).
3.2.2.2. PODER DE HINCHAMIENTO (PH)
Como ya se describió en la introducción general, cuando se calienta una
suspensión de almidón en agua los gránulos de almidón experimentan un hinchamiento
progresivo. El poder de hinchamiento (PH) se define como la masa del sedimento
hinchado por unidad de masa de almidón seco. La evaluación de este parámetro es
importante porque permite medir la capacidad de hidratación de los gránulos de
almidón, siendo esta una forma indirecta generalmente empleada para medir grado de
entrecruzamiento.
Heebthong et al. (2006) evaluaron el efecto del grado de entrecruzamiento sobre
las propiedades físicas del almidón de mandioca entrecruzado con trimetafosfato de
sodio, y clasificaron los productos de reacción según el grado de entrecruzamiento (alto
>90%, medio 70-90%, bajo 50-70%) el cual fue determinado en base a las propiedades
reológicas de los productos. Los autores demostraron que el poder de hinchamiento
99
aumentaba con la temperatura pero disminuía con el grado de entrecruzamiento. A la
mayor temperatura evaluada, 80 °C, el PH del almidón entrecruzado con grado bajo
(PH= 8.03 g/g) y medio (PH= 7.52 g/g) fue ligeramente mayor que en el almidón nativo
(PH= 6.84 g/g). Sin embargo, el mayor grado de entrecruzamiento condujo a una
reducción de la capacidad de hinchamiento (PH= 5.65 g/g) respecto del almidón no
modificado. Estos resultados se atribuyeron, en primer lugar al tipo de agente
entrecruzante empleado, debido a que a un nivel bajo de entrecruzamiento la repulsión
de la carga negativa del fosfato en la cadena de almidón pudo haber mejorado la
hidratación. Por otro lado, cuando el grado de entrecruzamiento fue alto, la unión entre
las moléculas adyacentes fue más densa y con ello el hinchamiento e hidratación de los
gránulos de almidón se restringió, resultando en menores valores de PH.
El efecto del entrecruzamiento de almidón con ácidos α-hidroxicarboxílicos
sobre el poder de hinchamiento de los gránulos modificados también ha sido reportado.
Diversos autores observaron que la capacidad de hinchamiento de los gránulos de
almidón entrecruzado con ácido cítrico disminuye significativamente con el aumento
del GS del polímero (Mohamad, Ismail, & Othman, 2011; Mei et al., 2015; Kim, Lee &
Chang, 2017). En la investigación más reciente, Kim y colaboradores (2017) produjeron
almidones entrecruzados con ácido cítrico logrando valores de GS entre 0.01 y 0.27, que
mostraron valores de PH entre 11.30 g/g y 4.07 g/g, respectivamente. Estos valores
fueron considerablemente menores que lo encontrado para el almidón nativo (16.30 g/g)
cuando evaluaron la capacidad de hinchamiento de las muestras a 70 °C. Los hallazgos
se interpretaron en términos de que el entrecruzamiento de las moléculas de almidón
con el ácido cítrico pudo fortalecer la red de almidón tanto química como físicamente,
inhibiendo así la absorción de agua y dando como resultado un menor poder de
hinchamiento. Dastidar & Netravali (2012) tuvieron los mismos resultados cuando
entrecruzaron almidón con ácido malónico.
A continuación, en la Figura 3.21 se presentan los resultados de PH de los
almidones AAT en comparación con los obtenidos para tres muestras de almidón
acetilado usando NaOH como catalizador, AANaOH. Como se observa en la Figura 3.21,
la capacidad de hidratación del almidón de maíz nativo a 55 °C fue de 2.12 g/g. Este
100
valor coincidió con lo hallado por otros autores para el almidón de maíz (Lopez et al.
2010; Garg & Jana, 2011).
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
6 h5 h
4 h3 h
2 h
1 h
AN
AAT
AANaOH
Poder
de h
incham
ien
to (
g/g
)
GS
0.5 h
Figura 3.21. Poder de hinchamiento de los gránulos de almidón luego de 1 h de
calentamiento a 55 °C de almidón de maíz nativo (AN) y muestras de AAT y de AANaOH.
Por su parte, los almidones acetilados control (AANaOH) con valores de GS de
0.40, 0.92 y 1.17 presentaron valores de PH de 3.74 g/g, 4.44 g/g y 4.40 g/g,
respectivamente. Estos valores fueron significativamente superiores a lo determinado
para la contraparte nativa, lo que indica que la capacidad de hidratación del almidón
control acetilado en medio alcalino mejoró luego del tratamiento de acetilación. De la
Figura 3.21 también se extrae que el PH de las muestras de AANaOH se incrementó
significativamente con el aumento del GS de 0.40 a 0.92, no observándose mejoras para
el almidón con GS=1.17.
En coincidencia con estos resultados, la revisión bibliográfica sobre el poder de
hinchamiento de gránulos de almidón acetilado por otras vías de esterificación muestra
que luego del tratamiento químico la capacidad de hidratación del gránulo mejora. Por
ejemplo, Han et al. (2012) acetilaron almidón de maíz empleando NaOH como
catalizador. El poder de hinchamiento evaluado a 90 °C de los almidones acetilados con
101
GS entre 0.057 y 0.159 estuvo en el rango de 20.70 g/g a 30.36 g/g, respectivamente.
Estos valores fueron significativamente mayores que lo hallado para el almidón de maíz
nativo (PH= 10.67 g/g) (vale la pena destacar que los valores determinados por estos
autores fueron mayores a los obtenidos en esta Tesis debido a la mayor temperatura
empleada (90 °C versus 55 °C) y se incrementaron en función del GS. Han y sus
colaboradores atribuyeron estos resultados a la introducción de grupos acetilos en la
molécula de almidón, que causaron un efecto estérico y la disrupción de los enlaces de
hidrógeno facilitando el ingreso de agua a las regiones amorfas del polímero.
Sin embargo, la revisión de la literatura respecto al tema indica que la mejora del
poder de hinchamiento en almidones acetilados con el incremento del GS no continúa
en todo el rango de modificación, sino que en general a partir de cierto nivel de
sustitución el ingreso de agua al gránulo durante su calentamiento se ve restringido por
el carácter hidrofóbico que adquiere la molécula de almidón tras la inserción de grupos
ésteres. Lo anterior se ilustra por ejemplo en la contribución de Garg & Jana (2011) en
donde se evaluó la capacidad de hinchamiento de gránulos de almidón acetilado en
presencia de piridina con valores de GS de 0.60 y 2.55. Los autores observaron que
luego del tratamiento químico el PH del almidón con GS= 0.60 medido a 65 °C fue de
9.1 g/g, un valor significativamente mayor al registrado para el almidón nativo en
iguales condiciones (PH= 3.1 g/g). Sin embargo, cuando los autores evaluaron la
muestra altamente sustituida (GS= 2.55) el PH a 65°C fue de 3.3 g/g, un valor similar a
lo hallado en el almidón sin modificar (PH= 3.1 g/g), y muy inferior al de la muestra
con GS bajo (GS= 0.60, PH= 9.1 g/g). Los autores concluyeron que a un nivel de
sustitución relativamente bajo, la mejora en la capacidad de absorción de agua se
atribuye principalmente a la presencia de grupos éster voluminosos que debilita los
enlaces de hidrógeno intermoleculares y genera la apertura de la estructura del almidón,
haciéndola más accesible al agua, sin alterar significativamente el carácter hidrofílico
del almidón nativo. En cambio, en la muestra altamente sustituida los grupos éster
reemplazaron a la mayoría de los grupos hidroxilo en el almidón, disminuyendo su
interacción con el agua. En estos casos, con el aumento del GS el creciente carácter
hidrofóbico de las cadenas del polímero se convierte gradualmente en el efecto
predominante sobre el PH. Resultados similares fueron reportados por Shogren &
Biswas (2006), quienes prepararon almidón de maíz acetilado con GS de 0.1 a 1.5 por
102
calentamiento por microondas de almidón de maíz con ácido acético y anhídrido
acético. Los autores observaron que el PH de las muestras acetiladas se incrementó
hasta un GS de 0.33; sin embargo, mayores incrementos del nivel de sustitución
condujeron a la disminución del PH de los almidones acetilados.
Continuando ahora con los almidones acetilados obtenidos en presencia de ácido
tartárico AAT, en la Figura 3.21 se evidencia que la capacidad de hidratación de estos
almidones registró dos patrones distintos dependiendo del intervalo de GS evaluado. El
primero de ellos se manifiesta para las muestras cuyos valores de GS estuvieron en el
rango de 0.07 y 0.24; y el segundo para las muestras de AAT con valores de GS en el
intervalo de 0.40 y 1.97. El poder de hinchamiento de los gránulos de almidón de maíz
luego de la modificación organocatalítica con GS entre 0.07 y 0.24 resultó en valores de
PH= 2.81 g/g y PH= 3.09 g/g, respectivamente. Como se observa, en el intervalo de GS
mencionado la capacidad de hinchamiento de los gránulos AAT se incrementó respecto
del PH del almidón nativo (PH= 2.12 g/g). Estos resultados concuerdan con la tendencia
observada en la Figura 3.21 para los almidones acetilados AANaOH control, y con lo
informado por otros autores para almidones acetilados por otras metodologías.
Sin embargo, el almidón acetilado con GS= 0.40 registró una disminución
significativa en su capacidad de hinchamiento con un valor de PH igual a 2.15 g/g,
similar al del almidón nativo; y, a su vez, muy inferior a lo exhibido por la muestra de
AANaOH con el mismo valor de GS (muestra AANaOH con GS= 0.41; PH= 3.74 g/g).
Incrementos posteriores del nivel de modificación redundaron en valores de PH
similares.
La disminución de la capacidad de hinchamiento de los gránulos de AAT a partir
de GS ≥ 0.40 suma elementos a la hipótesis de entrecruzamiento del almidón con ácido
tartárico, cuyos enlaces estarían restringiendo el hinchamiento de los gránulos.
103
3.2.2.3. ALGUNOS COMENTARIOS SOBRE EL NIVEL DE
ENTRECRUZAMIENTO
Hasta aquí, los ensayos realizados en esta sección enfocados a inferir si ocurren
reacciones de entrecruzamiento del almidón en paralelo con la acetilación, sugieren que
efectivamente el ácido tartárico promovería cierto grado de reticulación del almidón.
Si bien un estudio cuantitativo exhaustivo del tema excede los objetivos de esta
Tesis, ciertas observaciones realizadas sugerirían una contribución menor del
entrecruzamiento al GS determinado por saponificación, entre ellas: (1) la evidente
similitud de áreas de las señales características de la acetilación cuando se compararon
los espectros RMN 13C CP/MAS en estado sólido del almidón AAT y AANaOH con GS ≈
0.4 (Figura 3.4); (2) la coincidencia de las áreas porcentuales del segundo pico de
descomposición (que corresponde a la descomposición de grupos acetato) de las curvas
DTG de los almidones AAT y AANaOH (Figura 3.16); (3) el hecho que, según la
bibliografía, la descomposición térmica del almidón esterificado con ácido tartárico
debería observarse entre 240 y 270 °C (Assaleh et al., 2004; Kapuśniak, 2015), muy por
debajo de la región de descomposición de grupos acetato observada en las muestras
AAT que aparece centrada en ≈ 380 °C; y (4) los valores de poder de hinchamiento para
las muestras AAT que, si bien son inferiores a los del AANaOH para GS ≥ 0.40, no se
reducen respecto del almidón nativo.
Sin embargo, la insolubilidad de los AAT que limita la utilización de algunas
técnicas analíticas, y la superposición de señales en el espectro RMN 13C en estado
sólido que registrarían los ésteres de ácido tartárico con las señales de los almidones
acetilados, impide hacer una estimación directa y sencilla del nivel de entrecruzamiento
alcanzado.
Por otro lado, la existencia de reacciones simultáneas de entrecruzamiento del
almidón de parte del ácido tartárico podría justificar la aparición de la pequeña señal
extra en la región de los carbonilos en los espectros RMN 13C en estado sólido de los
almidones AAT (Figura 3.5, en sección 3.2.2.1).
104
3.2.3. INSPECCIÓN DEL AVANCE DE REACCIÓN EN EL VOLUMEN DEL
GRÁNULO
En las secciones anteriores se comprobó que el método de esterificación de
almidón propuesto en la presente Tesis efectivamente permite introducir grupos acetilo
(RMN, FTIR) y conferir hidrofobicidad al polímero derivatizado (sección 3.2.1); y que
estos almidones presentan comportamientos típicos de almidones entrecruzados, lo que
permite suponer que el entrecruzamiento ocurre en simultáneo a la acetilación (Sección
3.2.2). Por otro lado, siendo el propuesto un sistema en el que durante la reacción el
almidón se mantiene en suspensión (sin disolverse) en el medio de reacción, la forma en
la cual procede la derivatización en el interior del gránulo definirá la distribución de los
grupos funcionales en estas partículas discretas y afectará sus propiedades. En este
sentido, Huang et al. (2007) postularon que la acetilación de almidón de garbanzo
llevada a cabo en medio alcalino procede más homogéneamente en todo el volumen del
gránulo cuando se usa acetato de vinilo como reactivo que cuando se emplea anhídrido
acético, reativo con el cual la reacción se concentraría en las láminas externas del
gránulo. Los autores reportaron que la distribución de los grupos ésteres introducidos en
el gránulo de almidón repercutió en la viscosidad del polímero, siendo mayor en
almidones acetilados de forma más homogénea; es decir, en el almidón acetilado con
acetato de vinilo. Por otra parte, en la acetilación de almidón de maíz con anhídrido
acético y un ácido fuerte de Lewis usado como catalizador (Sc(OTf)3), Shogren (2008)
obtuvo un almidón acetilado con un GS total bajo (medido por saponificación) pero con
alto GS superficial (medido por Espectroscopía Fotoelectrónica de Rayos X, XPS). Los
autores atribuyeron el alto GS superficial del almidón acetilado y la heterogeneidad con
que procede la reacción en el volumen del gránulo a la baja permeabilidad de los
gránulos de almidón al anhídrido acético, en una metodología de acetilación en la que
no había agua presente para promover el hinchamiento de los gránulos.
Dado que en la metodología bajo estudio en esta Tesis el almidón permanece
durante la reacción en una fase diferente a la del acilante y el catalizador (disuelto en el
acilante), y que el medio no contiene agua para hinchar los gránulos y facilitar así el
acceso de éstos últimos, en la presente sección se estudia cómo procede la
derivatización en el volumen de las partículas de almidón.
105
En el caso de la acetilación convencional de almidones en medio alcalino, es
conocido que el agua y el NaOH inducen al hinchamiento de los gránulos facilitando el
ingreso del acilante a las láminas más internas del gránulo. De hecho, los resultados de
la Figura 3.1 ilustraron que la introducción de agua al sistema de reacción bajo estudio
a través del contenido de humedad del almidón (HR= 15 %) condujo a valores de GS
más altos que los obtenidos a partir de almidón seco (HR= 0.06 %) producidos bajo las
mismas condiciones de reacción (sección 3.2.1.1). Por el contrario, en reacciones de
acetilación en donde se restringe el ingreso de agua, y en las cuales generalmente el
medio de reacción es el mismo reactivo, como es el caso estudiado en esta Tesis, la
introducción de grupos ésteres se ha visto limitada a las capas más externas del gránulo.
Si bien la técnica de XPS sería la más apropiada para determinar el GS
superficial de los gránulos (y compararlo con el GSglobal de la muestra derivatizada para
inferir cuán homogénea/heterogénea es la reacción en el volumen del gránulo), se
realizó la consulta a los operadores del XPS de Santa Fe. Sin embargo, su uso no resultó
viable por restricciones asociadas a las temperaturas de descomposición de las muestras
AAT. Sin embargo, y aprovechando que en simultáneo con la acetilación se confirmaron
reacciones de entrecruzamiento que impiden la gelatinización de una fracción de las
muestras, se propuso utilizar ese ensayo para intentar inferir cómo avanza la
derivatización (acetilación + entrecruzamiento) en el volumen del gránulo. A tal fin,
primero se avaluó el GS de las dos fracciones obtenidas (la parte que gelatiniza y que se
recupera como film, y la que no gelatiniza y se aísla como un precipitado).
En la Tabla 3.1 se reportan los valores de GS de los films y de los precipitados
obtenidos luego que las muestras AAT fueran sometidas a condiciones de gelatinización
(detalles en sección 3.2.2.1). En la Figura 3.22 se resume la nomenclatura utilizada para
denominar a los GS de las distintas fracciones (GSglobal, GSfilm, GSprecipitado).
Como se observa en la Tabla 3.1, en el sobrenadante la presencia de grupos
ésteres detectables por saponificación fue prácticamente nula en todos los casos (GSfilm
≈ cero), indicando que en esta fracción soluble no tiene lugar la esterificación para
ningún tiempo de reacción, y corresponde al almidón sin modificar. Por su parte, los
precipitados de AAT presentaron valores de GSprecipitado significativos y muy superiores
106
incluso a los valores de GSglobal de las muestras correspondientes; sugiriendo que las
reacciones de acetilación y entrecruzamiento se concentran en esta fracción.
Tiempo
(h) GSglobal GSfilm GSprecipitado
1 0.24 0.01 0.83
2 0.4 0.00 1.13
3 0.97 0.00 1.63
4 1.63 0.02 2.21
5 1.87 0.02 2.41
6 1.97 0.05 2.59
Tabla 3.1. Valores de GSglobal, GSfilm, y GSprecipitado de las muestras de AAT.
Figura 3.22. A) Almidón (AAT) previo a la gelatinización (GSglobal), B) suspensión de
almidón AAT sometida a condiciones de gelatinización, C) muestra luego de la
centrifugación, D) film seco producido (GSfilm), E) precipitado recuperado en forma
granular (micrografía SEM) (GSprecipitado).
B)
A)
GSglobal
C)
80 μm
E)
GSprecipitado
D)
GSfilm
B)
107
La Figura 3.23 exhibe el espectro RMN 13C de la muestra entera de 4 h
(GSglobal= 1.63) versus el espectro de la fracción precipitada de AAT de 3 h de reacción
que tiene igual GS (GSprecipitado= 1.63, ver valores sombreados en Tabla 3.1).
200 190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
ppm
AN
AAT - 4h
(GSglobal
= 1.63)
Precipitado de AAT - 3h
(GSprecipitado
= 1.63)
CH3
C6C4C1
C=O
Clúster 2,3,5
Figura 3.23. Espectros RMN 13C CP/MAS del gránulo entero de AAT – 4 h (GSglobal=
1.63, espectro azul) y del precipitado de AAT – 3 h (GSprecipitado= 1.63, espectro verde).
Se incluye el espectro del almidón nativo (AN).
El espectro RMN del precipitado recuperado de AAT - 3 h (línea verde) mostró
las señales típicas del almidón (C-1: 90-105 ppm, C-2,3,5: 70-80 ppm, C-4: 82 ppm y
C-6: 63 ppm) y dos señales adicionales asignables a las resonancias de los carbonos de
los grupos acetato formados (C=O: 173 ppm y CH3: 20 ppm). La superposición del
espectro con el del gránulo entero de AAT – 4 h con igual GS revela la coincidencia de
las áreas de las señales características de la acetilación, confirmando el GS equivalente
determinado por saponificación.
A continuación las partículas recuperadas como precipitado se observaron por
microscopía electrónica de barrido. Las correspondientes micrografías SEM se muestran
en la Figura 3.24.
108
Figura 3.24. Micrografías SEM de A) el gránulo entero de almidón nativo y B-F) la
porción insoluble (recuperada como precipitado) de las muestras AAT luego de la
gelatinización. El valor de GS mostrado corresponde al de la muestra original (antes de la
gelatinización; es decir GSglobal). 5000X.
Lo primero que surge de las observaciones es que la fracción insoluble que da
origen al precipitado está conformada por gránulos de almidón con tamaño conservado
respecto de los gránulos originales (Figura 3.24 A); pero que tras ser sometidos a
condiciones de gelatinización se presentan en su mayoría agrietados/colapsados
pudiendo observarse, en muchos casos, el interior hueco de los gránulos. Estas
“cáscaras” remanentes del calentamiento de las suspensiones pueden observarse en la
Figura 3.24 (B-F) para GS crecientes. Las micrografías SEM de la Figura 3.24
también revelan que el espesor de las cáscaras (señalado con flechas) pareciera
incrementarse con el GSglobal de la muestra correspondiente (y también por supuesto con
el GS de la cáscara, GSprecipitado).
A partir de estas observaciones se extrae que durante la gelatinización de las
muestras AAT lo que ocurre es que se drena el interior no modificado del gránulo
(GSfilm ≈ 0.00), y se recupera como precipitado una cáscara resistente e hidrofóbica que
es el resultado del entrecruzamiento y de la introducción de grupos acetilo.
B) 2 h (GSglobal= 0.40)
E ) 5 h (GSglobal= 1.87)
C) 3 h (GSglobal= 0.97)
F) 6 h (GSglobal=1.97)
10 μm
D) 4 h (GSglobal= 1.63)
A) AN
109
Con la finalidad de determinar el espesor de las “cáscaras” de los almidones
derivatizados y evaluar su relación con el GS de las muestras, las partículas precipitadas
fueron microtomadas. Los gránulos de almidón nativo también fueron microtomados
previo a la gelatinización con el propósito de ilustrar cómo luce al SEM el interior del
gránulo no modificado antes de los tratamientos (Figura 3.25).
Figura 3.25. Micrografía SEM de almidón de maíz nativo microtomado.
En la Figura 3.26 se puede ver la sección de las partículas precipitadas
confirmando que se trata de estructuras tridimensionales huecas con espesores que
efectivamente se incrementan con el aumento del GSglobal (Tabla 3.2).
Figura 3.26. Micrografías SEM de las partículas precipitadas de las muestras AAT
microtomadas. El valor de GS mostrado corresponde al de la muestra original (antes de
la gelatinización).
GSglobal= 0.24
Interior lleno
5 μm
GSglobal= 0.24 GSglobal= 1.63 GSglobal= 0.97 GSglobal= 1.97
5 μm
110
GSglobal Espesor
AAT - GSglobal= 0.24 0.4 – 0.5 μm
AAT - GSglobal= 0.97 1.2 – 1.4 μm
AAT - GSglobal= 1.63 1.6 – 1.8 μm
AAT - GSglobal= 1.97 2.5 – 3.5 μm
Tabla 3.2. Rango de espesores de las cáscaras de almidón AAT (GS= 0.24 – 1.97).
Para completar el análisis en la Figura 3.27 se muestran dos micrografías SEM
de partículas precipitadas de una muestra AAT con GS igual a 2.86 (2 g de almidón de
maíz 15% HR, 60 mL de anhídrido acético, 7.4 g de ácido tartárico, 6 h, 130 °C). A
pesar de que esta muestra no fue microtomada, la inspección exhaustiva de las
partículas bajo el microscopio electrónico reveló que el interior de las mismas se
encontraba sistemáticamente conservado, sugiriendo que para GS cercanos al máximo
(GS= 3) todo el gránulo resiste la gelatinización.
Figura 3.27. Micrografías SEM de las partículas precipitadas de la muestra AAT con
GSglobal= 2.86.
Observaciones similares fueron hechas para almidones entrecruzados por otros
investigadores. Por ejemplo, Fannon & BeMiller (1992) desarrollaron un método rápido
para obtener y estudiar las estructuras remanentes de las pastas de almidón (fragmentos
4μm 4μm
Interior lleno
debido a la
resistencia de la
muestra a la
gelatinización
111
de gránulos residuales obtenidos luego de la gelatinización denominados por los autores
como “gránulos fantasmas”); y las correlacionaron con las propiedades funcionales del
almidón de maíz nativo y almidón de maíz entrecruzado con anhídrido succínico. Los
autores observaron que los gránulos fantasmas aislados de los almidones entrecruzados
diferían significativamente de los correspondientes a los almidones nativos. Las paredes
de los gránulos remanentes de almidones entrecruzados eran mucho más gruesas y más
substanciales. En concordancia con lo observado en esta sección, estos residuos
presentaban forma de globos, tanto en el gel como luego de que los aislaran; y con el
incremento del grado de entrecruzamiento estas estructuras fueron más pronunciadas.
Por otro lado, Chatakanonda, Varavinit, & Chinachoti (2000) evaluaron el efecto del
entrecruzamiento del almidón de arroz empleando tripolifosfato de sodio (STPP) y
trimetafosfato de sodio (SMTP) como agentes entrecruzantes en las transiciones
térmicas del polímero. El estudio reveló que con el incremento del grado de
entrecruzamiento (logrado con cantidades variables de SMTP entre 0.1 – 2%) no se
alcanzó la disrupción ni el colapso del gránulo incluso a la temperatura más alta de
evaluación (100 °C).
El análisis microscópico de la fracción precipitada llevada a cabo a lo largo de
esta sección evidenció que la derivatización (introducción de grupos acetilo +
entrecruzamiento) ocurre progresivamente de afuera hacia adentro del gránulo,
generando una cáscara que resiste la gelatinización y cuyo espesor se incrementa con el
GSglobal de la muestra; mientras que el interior de los gránulos conserva su naturaleza y
puede removerse. Estos resultados corroboran las observaciones de otros investigadores
que evaluaron el progreso de reacción en modificaciones químicas del almidón llevadas
a cabo en un medio que no promueve el hinchamiento de los gránulos. En la Figura
3.28 se esquematiza la propuesta de cómo procedería la derivatización estudiada en esta
Tesis en el volumen de los gránulos de almidón de maíz.
112
Figura 3.28. Propuesta del progreso de reacción (acetilación + entrecruzamiento) en
presencia de ácido tartárico dentro de los gránulos de almidón.
Por último, y a los fines de analizar la resistencia a la gelatinización de los
grupos introducidos durante la derivatización se calculó la masa de los grupos acetilos
presentes antes (gránulo entero) y después de la gelatinización (cáscaras + film) con un
sencillo balance de masa. Las estimaciones se llevaron a cabo a partir de la masa inicial
del almidón modificado que se empleó para gelatinizar, las masas del precipitado y del
film recuperados, los valores del GS y acilo (%) de cada fracción (≈ cero para los films)
y el GS y acilo (%) global.
Los valores calculados de masa de grupos acetilo presentes en el gránulo entero
antes (columna “Entero original”) y después de la gelatinización (columna “Entero
P+F”) se reportan en la Tabla 3.3. Comparando los valores calculados de masa de
grupos acetilo de la columna “Entero original” versus “Entero P+F” (y considerando
pérdidas durante la recuperación del precipitado), los resultados confirman que la gran
mayoría de los grupos acetilo introducidos a la molécula de almidón, y que se
encuentran concentrados en la superficie externa del gránulo (cáscara), se conservan
post gelatinización, con implicancias de interés por ejemplo para aditivos de alimentos
cuya funcionalidad debe resistir la cocción.
113
Tiempo
(h) GSglobal
Masa de grupos
acetilo (g)
Entero
original
Entero
P+F
1 0.24 0.17 0.15
2 0.4 0.28 0.27
3 0.97 0.62 0.59
4 1.63 0.91 0.80
5 1.87 1.00 0.92
6 1.97 1.04 1.00
Tabla 3.3. Masa de acetilos total de muestras AAT (Entero original) y masa de acetilos total
remanentes luego de la gelatinización (Entero P+F).
Figura 3.29. Difractogramas de rayos X de gránulos enteros (línea azul; 1h – GSglobal=
0.24, 3h – GSglobal= 0.97, 4h – GSglobal= 1.63, 6h – GSglobal= 1.97) y de las cáscaras de
AAT (línea verde; 1h – GSprecipitado= 0.83, 3h – GSprecipitado= 1.63, 4h – GSprecipitado= 2.21,
6h – GSprecipitado= 2.59).
Además de la observación por microscopía electrónica, las cáscaras
correspondientes a cada precipitado fueron caracterizadas por RMN 13C (descripto
anteriormente para el precipitado de la muestra AAT – 3 h, Figura 3.23), FTIR, TGA y
DRX. Para no extender demasiado la discusión, se presentan aquí únicamente, los
difractogramas de rayos X de las cáscaras versus los gránulos enteros correspondientes
10 15 20 25 30 35 40 45
AAT - 6h
AAT - 4h
AAT - 3h
AAT - 1h
Inte
nsid
ad
(u.a
.)
2(°)
Gránulo entero AAT
Cáscara de AAT
AN
114
(Figura 3.29), donde queda expuesto que la cáscara donde se concentra la
derivatización es mayormente amorfa y que el carácter semicristalino que se observó
oportunamente en la Figura 3.8 (para GS= 0.97 en los gránulos enteros) resulta de la
contribución del interior semicristalino del gránulo que no ha sido derivatizado y aún
conserva su cristalinidad original. Los espectros RMN y FTIR, por su parte,
confirmaron la concentración de grupos acetato en las cáscaras y los resultados de TG
evidenciaron patrones similares a los de los gránulos enteros en función del GS. Las
figuras que muestran los resultados de FTIR y TGA se incluyen en el ANEXO II.
3.3. CONCLUSIONES DEL CAPÍTULO 3
En el presente capítulo se utilizó una ruta no convencional organocatalítica para
la preparación de almidones acetilados con diferentes grados de sustitución. La
metodología se adaptó del protocolo oportunamente propuesto por Hafrén y Córdova
(2005) para la esterificación de celulosa empleando ácido tartárico como catalizador.
Los resultados obtenidos en la primera parte del capítulo confirmaron el rol del ácido
tartárico en la promoción de la incorporación de grupos acetilo en la molécula de
almidón. Los ensayos de caracterización de los productos, por su parte, dieron cuenta de
los cambios en la estructura química, morfología, cristalinidad, estabilidad térmica y
polaridad del almidón que resultaron de la modificación química impuesta, y que fueron
a su vez función del nivel de modificación alcanzado.
Si bien en la publicación original que inspiró este trabajo no se reportaron
reacciones simultáneas de esterificación/entrecruzamiento del polisacárido de parte del
ácido tartárico (cumpliendo éste únicamente el rol de catalizador), y a pesar de que las
reacciones de entrecruzamiento del almidón con este tipo de ácidos orgánicos a menudo
requiere de catalizadores específicos, los resultados resumidos en la segunda parte de
este capítulo pusieron de manifiesto que en simultáneo con la incorporación de grupos
acetilo tuvo lugar cierto grado de entrecruzamiento del almidón.
En la tercera parte del capítulo se estudió cómo procede la derivatización en el
volumen de los gránulos de almidón. Los resultados indicaron que la acetilación (y el
115
entrecruzamiento) proceden en forma heterogénea desde el exterior hacia el interior de
los gránulos, formándose una cáscara derivatizada resistente cuyo espesor aumenta con
el nivel de modificación, mientras que el corazón de los gránulos permanece sin
modificar y podría removerse fácilmente dando origen a estructuras granulares huecas.
Globalmente, el estudio resumido en este capítulo permitió ampliar el
conocimiento sobre la acetilación de almidones catalizada por ácido tartárico, e
identificar reacciones de entrecruzamiento simultáneas que amplían el horizonte de
aplicación de los almidones doblemente modificados obtenidos. Dos de ellas se
abordarán en los capítulos que siguen.
116
117
Capítulo 4
ALMIDONES ESTERIFICADOS PARA LA
INDUSTRIA DE ALIMENTOS
118
119
4. ALMIDONES ESTERIFICADOS PARA LA INDUSTRIA DE
ALIMENTOS
4.1. INTRODUCCIÓN
Hoy en día la enorme variedad de productos alimentarios disponibles en el
mercado requiere que el almidón sea capaz de tolerar una amplia gama de técnicas de
procesamiento, almacenamiento y condiciones de preparación final del alimento. En
este sentido, la modificación química del almidón se realiza con el fin de conferir al
polímero propiedades funcionales que le permitan contrarrestar las deficiencias de su
estado nativo durante el procesamiento de los alimentos. Los almidones modificados
químicamente se emplean en la industria alimentaria como espesantes, estabilizadores,
aglomerantes, entre otros. En el sector alimentario los modificadores químicos
empleados en la modificación del almidón son de dos tipos, monofuncionales y di o
polifuncionales.
En el presente capítulo se utiliza la acetilación organocatalítica estudiada en la
Sección 3 para la preparación de almidones doblemente modificados (acetilados -
entrecruzados) y se analizan las propiedades funcionales de interés. Los almidones
descriptos en este capítulo son los que tienen potencial para aplicaciones como aditivo
alimentario.
4.1.1. ALMIDONES ACETILADOS PARA USO COMO ADITIVO
ALIMENTARIO
La acetilación fue la primera forma de monosustitución utilizada en los
almidones dirigidos a la industria de alimentos (Mason, 2009). La acetilación de
almidones se usa principalmente para reducir la sinéresis y los cambios de textura en los
almidones que se utilizan en alimentos refrigerados y congelados. También se usa para
aumentar la facilidad de cocción de los alimentos a base de almidón porque se reducen
120
las temperaturas de gelatinización, lo cual es importante en sistemas con alto contenido
de sólidos o donde se prefiere evitar el uso de altas temperaturas.
En general, la acetilación del polímero para uso en la industria alimentaria se
logra por reacción del almidón con anhídrido acético. Las regulaciones de la FDA
estipulan que el almidón acetilado con estos reactivos no debe superar el 2.5% de
grupos acetato (GS ≤ 0.1) con el fin de mejorar la unión, el engrosamiento, la
estabilidad y la texturización de los alimentos (de Graaf, Broekroelofs, & Janssen,
1998).
Las propiedades de los almidones acetilados de un determinado origen botánico
están controladas y reguladas por su grado de sustitución. Por ejemplo, en términos de
la gelatinización de los almidones con GS permitido para la industria de alimentos
cuanto mayor su GS más se debilita el gránulo de almidón y, como consecuencia de
ello, se induce la hidratación y gelatinización del polímero a temperaturas más bajas
(López et al., 2010; Ai & Jane, 2015). Colussi et al. (2015) acetilaron almidón de arroz
(GS= 0.05 – 0.1) utilizando diferentes concentraciones de anhídrido acético. Con este
tratamiento, y a medida que incrementaron el GS, los autores lograron aumentar el
poder de hinchamiento y solubilidad del almidón, la viscosidad máxima y la viscosidad
final de la pasta; y reducir la temperatura de gelatinización, entalpía, y la retrogradación
respecto del almidón nativo. Resultados similares obtuvieron Ayucitra (2012) cuando
prepararon almidones de maíz acetilados con diversos grados de sustitución (GS= 0.08
– 0.21) a partir de múltiples tratamientos con anhídrido acético en condiciones alcalinas.
Los almidones acetilados mostraron menor retrogradación y mejoras en la solubilidad,
poder de hinchamiento y transparencia de las pastas con el aumento del GS de las
muestras.
A raíz de las propiedades específicas descriptas, los almidones acetilados
encuentran diversas aplicaciones en la industria de alimentos, donde se los usa como
espesantes, estabilizadores, agentes de encapsulación y en la conformación de películas.
Estos ésteres se utilizan en una amplia gama de alimentos, como productos horneados,
rellenos de pasteles, enlatados, salsas, sopas condensadas, alimentos congelados,
121
alimentos para bebés, productos cárnicos, productos lácteos, aderezos para ensaladas y
bocadillos (Thomas & Atwell, 1998).
4.1.2. ALMIDONES ENTRECRUZADOS PARA USO COMO ADITIVO
ALIMENTARIO
Los fosfatos y adipatos de dialmidón son los almidones entrecruzados más
comúnmente empleados en la industria de alimentos. Los agentes entrecruzantes
generalmente usados con ese fin son el cloruro de fosforilo (oxicloruro de fósforo), el
trimetafosfato de sodio (SMTP) y el anhídrido de ácido mixto acético/adípico. En los
almidones entrecruzados con estos reactivos las reglamentaciones de la Food and Drug
Administration (FDA) estipulan que no se debería exceder de 0,1% de cloruro de
fosforilo, 1% de STMP y 0,135% de anhídrido mixto acético adípico en base al peso del
almidón respectivamente. Debido a la naturaleza covalente de los enlaces resultantes del
entrecruzamiento, solo un pequeño grado del mismo (típicamente un enlace cruzado por
100-3000 unidades de anhidroglucosa del almidón) es necesario para producir efectos
suficientes en los productos. En términos generales, a medida que aumenta el número de
enlaces entrecruzados el almidón se vuelve más resistente a la gelatinización. En
consecuencia, los alimentos que contienen almidón entrecruzado son menos propensos a
descomponerse con tiempos de cocción prolongados en medios ácidos o con agitación
severa, siendo reconocidos por su estabilidad al ácido, al calor y al corte (Singh et al.,
2016). En este contexto, los almidones entrecruzados encuentran diversas aplicaciones
en la elaboración de pan, galletas, panqueques/waffles, tartas frescas para hornear,
corteza de pizza, barras nutritivas, cereal, pasteles, muffins, tortillas, pretzels, pastas, y
verduras enlatadas.
El entrecruzamiento de almidón con compuestos orgánicos policarboxílicos es
también un tema de investigación relevante actualmente. En los últimos años las
investigaciones sobre almidón entrecruzado con ácido cítrico han generado interés por
su aplicación potencial como fuente de fibra dietaria en la industria de alimentos (Mei et
al., 2015; Kim et al., 2017). Kim et al., (2017); evaluaron el contenido de almidón
resistente (AR) de almidón de arroz entrecruzado con ácido cítrico en función del GS,
122
alcanzando valores de AR de aproximadamente 68% para almidones entrecruzados con
GS ≈ 0.3. En otra investigación, Wepner et al. (1999) emplearon almidón entrecruzado
con ácido cítrico en formulaciones de alimentos (pastas, panes, wafers) como fuente de
almidón resistente. A pesar de que el uso de estos almidones entrecruzados no está aún
reglamentado por la FDA (FDA, 172.892 - Food starch-modified), el hecho de que se
use como entrecruzante un ácido orgánico de origen natural incluido en la lista de
aditivos alimentarios permitidos por la FDA y usado frecuentemente como acidulante,
sugiere que es factible que oportunamente se permita su empleo como entrecruzante de
almidones.
Si bien no se han encontrado en la bibliografía reportes ni reglamentación sobre
almidones entrecruzados con ácido tartárico para uso en alimentos, el mismo también es
una sustancia de uso habitual en la industria alimentaria, sobre todo como acidulante.
En el CODEX Alimentarius se estipula el empleo del ácido tartárico o tartrato como
regulador de acidez en la preparación de pasta de soja fermentada -con un nivel máximo
de 0.1%- (CODEX STAN 298R-2009); en fideos instantáneos (máximo 0.75%,
CODEX STAN 249-2006), salsa de ají (máximo 0.5%, CXS 306R-2011); leches
fermentadas (máximo 0.2%, CODEX STAN 243-2003), y duraznos en conserva
(máximo 0.13%, CXS 242-2003).
4.1.3. ALMIDONES DOBLEMENTE MODIFICADOS PARA USO COMO
ADITIVO ALIMENTARIO
Con el objetivo de mejorar determinadas propiedades de los almidones y ampliar
aún más sus usos, a menudo se implementa una doble modificación química del
polímero. La misma combina dos tipos de modificación química de los almidones,
como por ejemplo acetilación/oxidación, entrecruzamiento/acetilación o
entrecruzamiento/hidroxipropilación.
Puntualmente, y de interés para esta Tesis, la combinación de la acetilación de
almidones con el entrecruzamiento es una forma efectiva para obtener derivados con
propiedades adecuadas de gelatinización, viscosidad y textura para su aplicación en la
123
industria de alimentos (Thomas & Atwell, 2003; Cui, 2005). Esta doble modificación se
logra generalmente en un proceso de dos etapas, la primera involucra el
entrecruzamiento con hasta 0,1% de cloruro de fosforilo respecto del almidón, seguido
de una segunda etapa de acetilación del producto con hasta un 8% de anhídrido acético.
Recientemente, Lee et al. (2015) evaluaron las propiedades de almidón de arroz
acetilado, entrecruzado y doblemente modificado (entrecruzado-acetilado). La doble
modificación se llevó a cabo realizando primero el entrecruzamiento con 0.1% POCl3
seguido de la acetilación con anhídrido acético (5%). El almidón de arroz doblemente
modificado mostró propiedades combinadas de ambos tratamientos (temperatura de
gelatinización menor que la del almidón acetilado y mayor que la del almidón
entrecruzado, así como menor poder de hinchamiento y solubilidad respecto del
almidón acetilado). Un patrón similar fue observado por Raina et al. (2006) y López et
al. (2010) cuando evaluaron almidones acetilados, entrecruzados y doblemente
modificados.
Alternativamente, el almidón doblemente modificado se puede preparar en una
sola etapa como es el caso del adipato de dialmidón acetilado. El método convencional
para producir el adipato de dialmidón acetilado implica la reacción del almidón con una
mezcla de ácido adípico y anhídrido acético en un medio de reacción alcalino entre 20 y
60 °C. En general, se introducen no más de 0.135% de grupos adipato y 2.5% de grupos
acetilos, respectivamente (FAO, 2016). Se ha reportado que estos productos
entrecruzados/acetilados a menudo tienen la resistencia necesaria al calor, ácido y/o
condiciones de corte que pueden encontrarse durante el procesamiento o aplicación del
producto a base de almidón. Estas propiedades, sumado a la resistencia a la
retrogradación hace que los almidones doblemente modificados de tipo
entrecruzado/acetilado se usen ampliamente en aderezos para ensaladas, alimentos
enlatados y alimentos congelados (Wurzburg, 1986). Por ejemplo, Mali & Grosmann
(1999) produjeron adipato de dialmidón acetilado con alto índice de absorción de agua,
alta viscosidad en frío y sin sinéresis; todas propiedades funcionales de interés para la
formulación de postres, postres instantáneos y alimentos sometidos a almacenamiento a
baja temperatura.
124
4.2. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.2.1. PREPARACION DE ALMIDONES MODIFICADOS
Pensando en la aplicación potencial en la industria de alimentos de los almidones
acetilados obtenidos y caracterizados en el Capítulo 3, se preparó un almidón con GS <
0.1. Para tal fin, se realizaron ensayos con diferentes cargas de catalizador hasta lograr
limitar la esterificación a valores aptos para la industria alimentaria. De esta manera, se
obtuvo una muestra de AAT con GS igual a 0.06. Por otra parte, se preparó una muestra
control de almidón acetilado (AA) con GS similar igual a 0.07 en un sistema sin ácido
tartárico.
La posibilidad de hallar un conjunto de condiciones en las que pueda inducirse la
acetilación y el entrecruzamiento del almidón con un ácido orgánico de origen natural y
en una sola etapa resulta de interés en vista de los antecedentes recientes que muestran
que los almidones acetilados/entrecruzados podrían tener propiedades distintas respecto
de los almidones únicamente acetilados o entrecruzados.
4.2.2. CARACTERIZACIÓN GENERAL DE PRODUCTOS
4.2.2.1. ESPECTROSCOPÍA DE RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR 1H
EN ESTADO LÍQUIDO
La Figura 4.1 muestra los espectros RMN 1H en estado líquido del almidón de
maíz nativo y las muestras modificadas. El espectro RMN 1H del almidón de maíz
nativo presenta las señales correspondientes a los protones de la unidad de
anhidroglucosa visibles en la región comprendida entre 3.50 y 5.60 ppm. Las señales
corresponden a los desplazamientos químicos de los protones de la molécula, a saber:
H-4 en 3.35 ppm, H-3 en 3.65 ppm, H-2 en 3.30 ppm, H-5 en 3.58 ppm, H-4 (grupo
terminal) en 3.07 ppm, H-6,6’ en 3.64 y 3.46 ppm respectivamente, y H-1 en 5.10 ppm.
Los desplazamientos químicos de OH-2,3,6 se centraron en 5.39 ppm, 5.49 ppm, y 4.58
ppm, respectivamente. Estas señales son comparables con las obtenidas para almidones
125
nativos en otras investigaciones (Chi et al., 2008; Muljana, Picchioni, Heeres, &
Janssen, 2010).
6 5 4 3 2
H-2
H-4
(gru
po t
erm
inal)
AAT
GS= 0.06
AA
GS= 0.07
CH3
DMSO-d6
DMSO-d6
H-4
H-3,5,6
OH
-6H-1O
H-2
ppm
OH
-3
AN
Figura 4.1. Espectro RMN 1H del almidón de maíz nativo (AN), almidón acetilado (AA –
GS= 0.07) y almidón acetilado obtenido en presencia de ácido tartárico (AAT – GS= 0.06).
El espectro RMN 1H del almidón acetilado AA mostró las señales ya descriptas
para el almidón nativo, y una señal adicional entre 2.01 ppm y 2.08 ppm que
corresponde a la resonancia del protón del grupo CH3 del grupo éster insertado. La
presencia de esta señal indica que la acetilación efectivamente ocurrió (Elomaa et al.,
2004; Chi et al., 2008; Zhang, Zheng, Kuang & Edgar, 2014).
En el caso del espectro RMN 1H del almidón acetilado obtenido en presencia de
ácido tartárico, AAT, se observaron las mismas señales que las presentadas en el
espectro RMN de AA. Sin embargo, en forma adicional a las evidencias de acetilación,
esta muestra evidenció una mayor dificultad para su solubilización completa DMSO -
d6, sugiriendo una vez más la existencia de reacciones concomitantes de
entrecruzamiento.
2.3 2.2 2.1 2.0 1.9 1.8 1.7
AA-T
AA
AN
126
4.2.2.2. ESPECTROSCOPÍA DE INFRARROJO POR TRANSFORMADA DE
FOURIER
En la Figura 4.2 se presentan los espectros IR de los almidones obtenidos en
comparación con el espectro del almidón de maíz nativo. Los espectros IR de almidones
acetilados otorgaron evidencia cualitativa de la acetilación con la aparición de bandas
características del grupo acetato centradas en 1748 cm-1, 1376 cm-1 y 1244 cm-1;
asignadas al estiramiento del grupo carbonilo C=O del éster, a la deformación del grupo
C-H del CH3 del acetato, y al enlace C-O-C del grupo acetato, respectivamente. Por su
parte, las bandas centradas en torno a 3400 cm-1 asignadas a los grupos hidroxilos del
almidón, y en 1645 cm-1 correspondiente a vibraciones por flexión de agua absorbida de
la muestra, disminuyeron en los almidones modificados, corroborando que los grupos
hidroxilo fueron progresivamente reemplazados por grupos ésteres menos polares.
4000 3600 3200 2800 2400 2000 1600 1200 800
(O
-H)
AA - GS= 0.07
AAT - GS= 0.06
Absorb
ancia
Número de onda (cm-1)
AN
(C
-H3
)
(O-H)
(C
-O-C
)
(C
=O
)
Figura 4.2. Espectro FTIR del almidón de maíz nativo (AN), almidón acetilado (AA – GS=
0.07) y almidón acetilado obtenido en presencia de ácido tartárico (AAT – GS= 0.06).
127
4.2.2.3. MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE BARRIDO
La Figura 4.3 muestra imágenes de los gránulos de almidón de maíz nativo
(AN) y acetilados (AA y AAT) observados por SEM. Las micrografías indican que no se
observan cambios significativos en la forma, el tamaño o la apariencia externa de los
gránulos de almidón de maíz después de la acetilación. Este resultado está en línea con
el GS de las muestras.
Figura. 4.3. Micrografías SEM del almidón de maíz nativo (AN), almidón acetilado (AA –
GS= 0.07) y almidón acetilado obtenido en presencia de ácido tartárico (AAT – GS= 0.06).
4.2.2.4. DIFRACCIÓN DE RAYOS X
La difracción de rayos X se utilizó para evaluar los cambios en la estructura
cristalina de los almidones que pudieran resultar de la modificación química inducida.
Como se muestra en la Figura 4.4, y como se indicó previamente (Capítulo 3) el
almidón de maíz exhibe un patrón de tipo A, característico de cereales (2 de 14.9°,
17.0°, 17.8°, 19.8° y 22.8°).
Se conoce que tras la acetilación, el reemplazo parcial de los grupos hidroxilos
por grupos ésteres más voluminosos a menudo restringe la formación de enlaces de
hidrógeno inter e intramoleculares, resultando en la progresiva destrucción de la
estructura cristalina ordenada original del almidón. Sin embargo, los difractogramas de
rayos X de las muestras modificadas fueron muy similares a los del almidón de maíz
A) AN C) AAT - GS= 0.06
30 μm
B) AA – GS= 0.07
128
nativo, lo que se explica en función del bajo GS de las muestras que indicarían que la
modificación no afectó las regiones cristalinas de los gránulos.
10 15 20 25 30 35 40
AN
AA
GS= 0.07
Inte
nsid
ad
(u
.a.)
2°()
AAT
GS= 0.06
Figura 4.4. Difractograma de rayos X del almidón de maíz nativo (AN), almidón acetilado
(AA – GS= 0.07) y almidón acetilado obtenido en presencia de ácido tartárico (AAT – GS=
0.06).
4.2.3. ESTUDIO DE LA GELATINIZACIÓN
4.2.3.1. MICROSCOPÍA ÓPTICA DE LUZ POLARIZADA
El proceso de gelatinización del almidón nativo y de los almidones modificados
se monitoreó en un microscopio óptico. Las muestras se fotografiaron con y sin
polarización. La microscopía de la luz polarizada es la técnica más efectiva para el
estudio de muestras ricas en materiales birrefringentes, como es el caso de los gránulos
de almidón. Las regiones cristalinas intactas en el almidón generan la refracción de la
luz polarizada y proporcionan patrones característicos de "cruz de Malta" en cada
gránulo. De este modo, el seguimiento del calentamiento de la suspensión acuosa de
almidón bajo el microscopio de luz polarizada permite estimar la temperatura a la cual
129
los gránulos de almidón pierden su birrefringencia; así como examinar cambios en la
morfología, integridad y tamaño de los gránulos durante el progreso de la
gelatinización.
Para seguir la evolución del proceso de gelatinización de las muestras, se calentó
una suspensión al 3% de almidón en agua desde temperatura ambiente hasta 96 °C con
agitación continua en un erlenmeyer tapado. Durante el calentamiento se tomaron gotas
de cada muestra a temperaturas puntuales, y se observaron en el microscopio óptico
oportunamente. Cuando el almidón se calienta en exceso de agua se rompen los puentes
de hidrógeno que son los responsables de la cohesión de los gránulos, y el agua penetra
al interior del gránulo de almidón aumentando en gran medida su volumen. Al mismo
tiempo, la amilosa y pequeñas cantidades de amilopectina comienzan a salir del gránulo
hacia el medio acuoso, hasta que eventualmente la solubilización del interior del
gránulo causa la ruptura de los mismos liberando su contenido a la fase continua
(Ratnayaque & Jackson, 2006; Li et al., 2015). La disrupción de la estructura cristalina
que tiene lugar durante la gelatinización del almidón se traduce en la desaparición de la
cruz de Malta de los gránulos observados bajo el microscopio de luz polarizada.
Las imágenes de microscopía óptica adquiridas con y sin luz polarizada de las
suspensiones de almidón de maíz nativo se presentan en la Figura 4.5 (42 °C – 90 °C).
A las temperaturas más bajas, en la suspensión de almidón de maíz (Figura 4.5, hasta
54 °C) no se observó variación en la estructura, morfología, tamaño y birrefringencia de
los gránulos de almidón, indicando que hasta los 54 °C la estructura semicristalina del
almidón no se vio significativamente alterada. Luego, con el incremento de la
temperatura, el tamaño de los gránulos de almidón aumentó progresivamente, lo que se
vio acompañado de la desaparición gradual de la cruz de Malta (Figura 4.5, 60 – 66
°C). A los 66 °C se observa claramente que gran parte de los gránulos perdieron su
birrefringencia.
Con el continuo hinchamiento de los gránulos, la pérdida total de la
birrefringencia se alcanzó a los 72 °C. La pérdida de la birrefringencia durante la
gelatinización refleja la desaparición de la organización radial de las cadenas de
amilopectina y amilosa (Cui, 2005), lo que a su vez indica la pérdida de orden cristalino
130
en la estructura del almidón. En un estudio similar, ya en 1974 Goering, Fritts, & Allen
observaron bajo la luz polarizada de un microscopio óptico que los gránulos de almidón
de maíz pierden el 100% de su birrefringencia a los 75°C.
Posteriormente, con el continuo incremento de la temperatura se observa la
disrupción del gránulo (Figura 4.5, 82 °C). Este proceso es acompañado de la salida de
los componentes macromoleculares del almidón que difunden hacia el medio acuoso
(Goering et al., 1974). Finalmente, a los 90 °C se forma una red molecular,
caracterizada por la presencia de residuos granulares suspendidos en el medio continuo
(señalados con flechas rojas en la Figura 4.5, 90°C). Craig y colaborados (1989)
describieron la composición de las pastas de distintas especies de almidón, e informaron
que la pasta de almidón de maíz presenta gránulos remanentes de diversos tamaños. Los
gránulos remanentes son también llamados gránulos fantasmas, y corresponden a la
envoltura granular vacía de los gránulos de almidón luego de haberse hinchado y haber
lixiviado su contenido molecular al medio continuo (Fannon & BeMiller, 1992; Atkin
Abeysekera & Robards, 1998). Los gránulos fantasmas son difíciles de solubilizar en
condiciones de bajo esfuerzo de corte, incluso después de una cocción extensa, por lo
que es frecuente encontrar estructuras fantasmas (enteras o fragmentadas) dispersas en
la fase continua de distintas pastas de almidón gelatinizado, sobre todo en las pastas de
almidón de cereales normales como el almidón de maíz, trigo y arroz (Hoseney &
Atwell, 1977; Glenn et al., 2008). Una representación gráfica de los posibles
constituyentes de las pastas se muestra en la Figura 4.6. Conocer el estado físico de los
gránulos remanentes en las pastas de almidón es importante debido a que la presencia de
estos componentes puede repercutir en las propiedades de las pastas de los almidones
gelatinizados (Fannon & BeMiller, 1992; Matignon & Tecante, 2017). El proceso de
gelatinización y las características de los gránulos del almidón de maíz nativo descriptos
en el presente capítulo concuerdan con lo informado por otros autores (Fannon &
BeMiller, 1992; Ratnayaque & Jackson, 2006; Núñez-Santiago et al., 2011).
131
66 °C 66 °C
72 °C 72 °C
82 °C 90 °C
42 °C 42 °C
48 °C 48 °C
54 °C 54 °C
60 °C 60 °C Figura 4.5. Micrografías de suspensiones (3% p/p) de almidón
de maíz nativo (AN) observadas a diferentes temperaturas de
calentamiento. Las micrografías vistas bajo luz polarizada se
presentan a la derecha hasta los 72 °C, que es cuando los
gránulos de AN perdieron totalmente su birrefringencia.
132
Figura 4.6. Modelos de pastas de almidón. Adaptado de Matignon & Tecante (2017).
En la Figura 4.7 se presentan las micrografías que ilustran la evolución de la
gelatinización del almidón acetilado control sin el agregado de ácido tartárico al medio
de reacción (AA). La evaluación evidenció que tanto el hinchamiento de los gránulos de
almidón acetilado como su gelatinización ocurrieron a temperaturas más bajas que en el
almidón nativo. Este resultado es esperable, pues se ha informado por otras técnicas de
caracterización, como el DSC, que las temperaturas de transición de los almidones
acetilados disminuyen respecto del almidón nativo debido al hinchamiento anticipado
del gránulo de almidón asociado con la incorporación de grupos éster a la molécula de
almidón que debilitan su estructura facilitando el ingreso del agua al interior del gránulo
(Adebowale & Lawal, 2003; López et al., 2010).
Dispersión de gránulos hinchados
en un sistema acuoso.
Dispersión de gránulos hinchados
en un sistema acuoso compuesto
de amilosa lixiviada.
Dispersión de gránulos hinchados y residuos de
gránulos fantasmas en un sistema acuoso compuesto
por componentes macromoleculares de
almidón.
Dispersión acuosa de componentes
macromoleculares de almidón.
Gránulo de almidón crudo
Gránulo de almidón hinchado
Residuos de gránulos fantasmas
Tratamiento térmico
HINCHAMIENTO
133
42 °C 42 °C
48 °C
54 °C
60 °C
48 °C
54 °C
60 °C
66 °C
72 °C 82 °C
90 °C
66 °C
Figura 4.7. Micrografías de suspensiones (3% p/p) de almidón de
maíz acetilado (AA) observadas a diferentes temperaturas de
calentamiento. Las micrografías vistas bajo luz polarizada se
presentan a la derecha hasta los 66 °C, que es cuando los gránulos
de AA pierden totalmente su birrefringencia.
134
En la Figura 4.7 se muestra que los gránulos de AA evidenciaron un incremento
en el tamaño granular desde los 48 °C, que es alrededor de 8 °C menos que la
temperatura observada para el comienzo del hinchamiento de los gránulos nativos. El
hinchamiento anticipado de los gránulos acetilados estuvo acompañado en mayor
medida por la pérdida simultánea de la birrefringencia, lo cual se manifestó con la
desaparición de la cruz de Malta en la mayoría de los gránulos de AA a los 48 °C. Con
el continuo calentamiento de la suspensión de almidón se incrementó aún más el
volumen de los gránulos y la birrefringencia se perdió totalmente a los 66 °C, 6 °C antes
que en el almidón nativo. Con el incremento de la temperatura se observó la disrupción
de los gránulos de AA (Figura 4.5, 72 °C) hasta la formación de una pasta estable
(Figura 4.7, 90 °C) constituida por residuos fragmentados de gránulos remanentes.
Observaciones similares fueron hechas por Núñez-Santiago et al. (2011) cuando
gelatinizaron almidón de maíz acetilado usando anhídrido acético como acilante y
NaOH como catalizador, alcanzando un GS de 0.16. La pasta de almidón acetilado
resultante también contenía residuos granulares y la birrefringencia se perdió alrededor
de 7 °C antes que en los gránulos de almidón nativo.
Finalmente, en la Figura 4.8 se presenta el curso de la gelatinización del
almidón acetilado obtenido en presencia de ácido tartárico en el medio de reacción
(muestra AAT) monitoreado con el microscopio óptico de luz polarizada. El estudio
evidenció que el hinchamiento de los gránulos de AAT y gelatinización ocurrió a
temperaturas más bajas que en el almidón nativo. De igual modo que lo expuesto para
AA anteriormente, la birrefringencia óptica del almidón AAT experimentó una
disminución desde los 48 °C, acompañado del hinchamiento de los gránulos hasta su
desaparición total a los 66 °C. Con el continuo calentamiento se alcanzó la disrupción
de los gránulos y la formación de una pasta a los 90 °C compuesta principalmente por
fragmentos de almidón remanente.
De acuerdo al análisis realizado, se observa que el proceso de gelatinización y
los cambios en la morfología de los gránulos y en la apariencia de la pasta resultante de
AAT es en general similar a lo observado para AA.
135
42 °C
48 °C
54 °C
42 °C
48 °C
60°C
54 °C
60°C
66 °C
72 °C 82 °C
90°C
66 °C
Figura 4.8. Micrografías de suspensiones (3 % p/p) de almidón de
maíz acetilado obtenido en presencia de ácido tartárico (AAT)
observadas a diferentes temperaturas de calentamiento. Las
micrografías vistas bajo luz polarizada se presentan a la derecha
hasta los 66 °C, que es cuando los gránulos de AAT pierden
totalmente su birrefringencia.
136
4.2.3.2. CALORIMETRÍA DIFERENCIAL DE BARRIDO
El proceso de gelatinización del almidón depende de varios factores, entre ellos
la fuente botánica del almidón, la arquitectura molecular de la región cristalina, la
relación amilosa/amilopectina y la distribución de la longitud de las cadenas, el
contenido de agua, y la velocidad de calentamiento, entre otros (López et al., 2010). En
la gelatinización del almidón las transiciones que ocurren durante el calentamiento de la
suspensión acuosa de los gránulos de almidón están representadas por las temperaturas
de inicio (To), temperatura de pico (Tp), temperatura final (Tc), y la entalpía de
gelatinización (ΔH). Todos estos parámetros son característicos de cada fuente botánica
de almidón. La entalpía da una medida general de la cristalinidad (calidad y cantidad)
del almidón y refleja principalmente la pérdida del orden molecular dentro del gránulo
(Cooke & Gidley, 1992).
La Tabla 4.1 muestra los parámetros térmicos de gelatinización determinados
por DSC del almidón nativo y de los productos modificados estudiados en este capítulo.
Al analizar las propiedades térmicas de transición del almidón de maíz nativo se
encontró que su gelatinización comenzó a los 64.5 °C y finalizó a los 77.4 °C,
requiriendo 10.5 J/g de energía para llevar a cabo el proceso. Estos valores se
encuentran dentro del rango informado por otros autores para almidones de maíz
calentados en exceso de agua (la relación almidón:agua empleada para la medición de
las muestras fue de 1:3). Por ejemplo, se han informado valores de Tp para el almidón
de maíz en el rango de 69.4 °C a 72.8 °C y entalpías en el intervalo de 10.6 J/g a 13 J/g
(Liu, Ramsden & Corke, 1997; Li & Yeh, 2001; López et al., 2010; Han et al., 2012; Li
et al., 2015). Sandhu & Singh (2007) postularon que la alta temperatura de
gelatinización del almidón de maíz nativo puede resultar de una estructura granular
rígida y de la presencia de lípidos.
137
Muestra To (°C) Tp (°C) Tc (°C) ΔH (J/g)
AN 64.5 ± 0.3a 71.1 ± 0.2a 77.4 ± 0.1a 10.5 ± 0.8a
AA – GS= 0.07 58.5 ± 0.5b 65.0 ± 0.4b 73.7 ± 0.1b 4.4 ± 0.2b
AAT – GS= 0.06 58.6 ± 1.2b 66.0 ± 0.1b 73.7 ± 0.7b 4.9 ± 0.6b
Tabla 4.1. Temperaturas de inicio, de pico y final (To, Tp y Tf) y entalpía de
gelatinización (ΔH) del almidón nativo y almidones de maíz modificados. Los valores
informados corresponden al promedio de dos determinaciones ± desviación estándar.
Relación almidón:agua de 1:3.
Tras la acetilación del almidón las temperaturas de transición de fase y la
entalpía registradas cambiaron significativamente. En el caso de la muestra control AA,
su gelatinización comenzó a los 58.5 °C y finalizó a los 73.7 °C, requiriéndose 4.4 ± 0.2
J/g para llevar a cabo el proceso. Diversos autores reportaron que la acetilación de
almidón con GS de grado alimentario redujo los parámetros térmicos de gelatinización
(Mirmoghtadaie, Kadivar, & Shahedi, 2009; López et al., 2010; Han et al., 2012;
Colussi et al., 2015; El Halal et al., 2015).
La reducción de las temperaturas de gelatinización del almidón acetilado se ha
atribuido a que el tratamiento químico debilita los gránulos de almidón al introducir
grupos ésteres voluminosos a lo largo de la cadena de almidón. Esto mejora la
flexibilidad estructural y genera una ruptura anticipada de las dobles hélices de la
amilopectina en el polímero acetilado respecto del nativo, lo que finalmente facilita la
gelatinización del almidón acetilado a menores temperaturas (Adebowale & Lawal,
2003). Además, dado que la entalpía muestra una medida general de la cristalinidad y su
disminución principalmente indica la pérdida del orden molecular (Singh et al., 2007),
la reducción de ΔH sugiere que hay un porcentaje menor de estructuras cristalinas
organizadas o menos estables por la incorporación de grupos acetilo a la molécula de
almidón. Algunos autores han informado que luego de la acetilación hay menos cristales
dentro del gránulo debido a que parte de los mismos resultaron dañados durante el
proceso químico y por tanto su fusión ocurrió a menores temperaturas (Adebowale &
Lawal, 2003; Han et al., 2012; Colussi et al., 2015). Esto lo relacionaron con los
menores índices de cristalinidad determinados para el almidón de maíz luego de la
acetilación.
138
Por su parte, diversos autores ponen de manifiesto que el entrecruzamiento
también altera las características de transición térmica del almidón, aunque de manera
contraria a lo que ocurre con la acetilación. El efecto del entrecruzamiento sobre las
propiedades térmicas de gelatinización depende de la concentración y el tipo de reactivo
entrecruzante, las condiciones de reacción y la fuente botánica del almidón (Singh et al.,
2016). Choi & Kerr (2004) observaron que el almidón entrecruzado con una
concentración relativamente baja de POCl3 (0.03 %) registró valores de temperaturas de
gelatinización y entalpía similares a las del almidón nativo; mientras que con
concentraciones más altas de reactivo entrecruzante (0.1% y 0.2%) el cambio más
significativo fue el incremento de la entalpia como función de la concentración de
POCl3 empleado. Los autores atribuyeron estos resultados a la mayor estabilidad del
gránulo de almidón entrecruzado con el aumento del grado de entrecruzamiento del
almidón. Estos resultados también son consistentes con lo reportado por Yeh & Yeh
(1993), y más tarde por Mirmoghtadaie et al. (2009), quienes informaron que a niveles
bajos de modificación las temperaturas de gelatinización no se vieron afectadas por el
entrecruzamiento, pero que la entalpía asociada con la gelatinización del almidón
aumentó al incrementar la concentración del entrecruzante. Estos resultados se han
atribuido al refuerzo de las cadenas de almidón que restringe su movilidad molecular, y
en consecuencia el polímero reticulado gelatiniza a temperaturas más altas y con mayor
requerimiento de energía (Gunaratne & Corke, 2007; Mirmoghttadaie et al., 2009; Kim
& Yoo, 2010).
Distinto es el caso de los almidones doblemente modificados
(acetilados/entrecruzados). Por ejemplo, López et al. (2010) evaluaron las propiedades
térmicas de los almidones de maíz nativo, acetilado y acetilado entrecruzado (agente
entrecruzante: cloruro de fosforilo). Los parámetros térmicos del almidón doblemente
modificado exhibieron valores intermedios entre los del almidón nativo y el acetilado,
pues mientras la acetilación redujo la temperatura de gelatinización, el entrecruzamiento
la incrementó debido a la disminución de la movilidad de las cadenas como resultado de
la formación de enlaces intermoleculares.
En el caso de la muestra acetilada en presencia de ácido tartárico AAT, el análisis
de DSC exhibió temperaturas de transición de fase entre 58.6 °C y 73.7°C, requiriendo
139
4.9 ± 0.6 J/g de energía para que se lleve a cabo la gelatinización (Tabla 4.1). En
concordancia con la bibliografía sobre el efecto del entrecruzamiento de almidones en
su ΔH, este valor es un 10% superior al del almidón acetilado AA, pero todavía muy
inferior al valor correspondiente al almidón nativo (10.5 ± 0.8 J/g). En términos de
temperaturas características, no se observaron cambios entre el AAT y el almidón
acetilado control AA.
Finalmente, se destaca que las temperaturas de pico de gelatinización de todos
los almidones reprodujeron muy bien las correspondientes temperaturas a las cuales las
muestras evaluadas perdieron su birrefringencia (sección 4.2.3.1).
4.2.4. PROPIEDADES FUNCIONALES
4.2.4.1. PODER DE HINCHAMIENTO Y SOLUBILIDAD
El poder de hinchamiento y solubilidad del almidón cumplen un rol muy
importante en el comportamiento reológico de las suspensiones de almidón. Durante el
calentamiento, el agua ingresa a las regiones amorfas más accesibles de los gránulos de
almidón, lo que produce la hidratación e hinchamiento de los gránulos acompañado por
la solubilización de sus constituyentes (López et al., 2010; Han et al., 2012). El poder
de hinchamiento refleja la capacidad de hidratación del almidón en agua y se expresa en
gramos de agua absorbida por gramo de almidón total. Por su parte, la solubilidad
refleja el grado de disolución durante el proceso de hinchamiento del almidón (logrado
durante el calentamiento a través de la lixiviación de material soluble del gránulo
hinchado al medio acuoso) y se expresa como el porcentaje del material soluble
respecto del almidón total (López et al., 2010; Han et al., 2012; Sahoré & Amani,
2013).
El poder de hinchamiento del almidón nativo (AN), y los almidones modificados
AA y AAT se ilustra en la Figura 4.9 en función de la temperatura. Para temperaturas
entre 55 °C y 95 °C, el poder de hinchamiento del almidón nativo se encontró en el
intervalo de 2.3 g/g a 22.8 g/g. Resultados similares fueron reportados por López et al.
140
(2010) al evaluar el poder de hinchamiento del almidón de maíz nativo en el mismo
rango de temperatura analizado en esta sección, obteniendo valores de PH entre 3 g/g y
18 g/g. De la misma manera, Sandhu & Singh (2007) informaron un aumento en el
poder de hinchamiento de los gránulos con el incremento de la temperatura para nueve
variedades de almidón de maíz. Estas observaciones se atribuyen a que con el
calentamiento de la suspensión de almidón se produce un mayor debilitamiento de las
fuerzas de unión intragranular y, por lo tanto, se mejora la capacidad de los gránulos de
almidón para retener agua. Como consecuencia, a mayores temperaturas se genera un
mayor hinchamiento de los gránulos (Ali & Hasnain, 2011).
0
5
10
15
20
25
30
95 °C85 °C75 °C65 °C
AAT - GS= 0.06
AA - GS= 0.07
Po
de
r d
e h
inch
am
ien
to (
g/g
)
AN
55 °C
Figura 4.9. Poder de hinchamiento de gránulos de almidón de maíz nativo (AN), almidón
acetilado (AA), almidón acetilado obtenido en presencia de ácido tartárico (AAT).
Mediciones realizadas luego de 1 h de calentamiento a diferentes temperaturas.
Los gránulos del almidón acetilado control (AA, Figura 4.9), por su parte,
presentaron valores de PH entre 10.5 g/g y 28.4 g/g. Estos valores fueron superiores que
los correspondientes para el almidón nativo en todo el rango de temperatura evaluado.
La misma tendencia ha sido reportada anteriormente para almidones acetilados de maíz
y de otras fuentes botánicas que presentaron un nivel de sustitución adecuado para la
industria alimentaria (GS ≤ 0.1). A la máxima temperatura evaluada de 95 °C, las
141
muestras de AA presentaron valores de PH en el rango de 22.05 a 28.35 g/g (González y
Pérez, 2002; Singh, Chawla, & Singh, 2004; Adebowale, Afolabi y Olu-Owolabi, 2006;
López et al., 2010; Garg & Jana, 2011; Han et al., 2012; Luo & Shi, 2012; Colussi et
al., 2014; Osundahunsi, Seidu y Mueller, 2014). La revisión de la bibliografía en el
tema de almidones acetilados con niveles de sustitución de grado alimenticio variable
refleja como el poder de hinchamiento de los almidones acetilados se ve influenciado
por el grado de modificación alcanzado (Lawal, 2004; López et al., 2010; Ayucitra,
2012; Zaman, Seruji, & Sarbini, 2015). Ayucitra (2012), encontraron que la capacidad
de hinchamiento a 90°C de almidones acetilados con GS en el rango de 0.08 a 0.21
aumentó con el incremento de GS de 17.4 g/g a 27.8 g/g, en comparación con 15.15 g/g
para el almidón nativo.
La mayor capacidad de hinchamiento de los gránulos acetilados se ha atribuido
al tratamiento químico efectuado. La introducción de grupos acetilos voluminosos a la
molécula de almidón es responsable de la ruptura de los enlaces de hidrógeno entre las
cadenas, lo que causa una reducción de las fuerzas asociativas en las regiones amorfas
de los gránulos de almidón. En consecuencia, se facilita una mayor percolación de agua
en los gránulos que se manifiesta con una considerable mejora en el poder de
hinchamiento del gránulo acetilado (Lawal, 2004; López et al., 2010; Ali & Hasnain,
2011).
Por otro lado, y como se anticipó en la sección 3.2.3.3 del capítulo previo, en el
caso de los almidones entrecruzados los mismos muestran en general valores de PH que
disminuyen con el grado de entrecruzamiento y, a su vez, son menores que los
correspondientes para sus equivalentes nativos, incluso para grados de entrecruzamiento
muy bajos.
El poder de hinchamiento de los gránulos de almidón acetilado en presencia de
ácido tartárico (AAT, Figura 4.9) se encontró en el intervalo de 11.05 g/g a 17.49 g/g. A
temperaturas bajas (entre 55 °C y 65 °C) el poder de hinchamiento de AAT resultó
semejante al de la muestra acetilada control AA. Sin embargo, con el incremento de la
temperatura (75 °C – 95 °C) la capacidad de absorción de agua de los gránulos de AAT
fue significativamente menor que para los gránulos de la muestra acetilada control. Esta
142
diferencia se acentuó especialmente a las temperaturas más altas de calentamiento (85
°C y 95 °C); con valores de PH que, incluso, fueron menores que los correspondientes
para el almidón nativo (AAT= 14.6 g/g y 17.8 g/g; AN= 18.0 g/g y 22.8 g/g,
respectivamente). La misma tendencia fue observada por López et al. (2010) cuando
evaluaron el poder de hinchamiento de un almidón doblemente modificado de tipo
acetilado-entrecruzado. En este caso, la acetilación del almidón se realizó usando
anhídrido acético como acilante y en presencia de un catalizador alcalino, mientras que
el entrecruzamiento del almidón fue realizado con oxicloruro de fósforo. El GS de la
muestra determinado por saponificación fue de 0.07, similar al de la muestra AAT en
este capítulo. Los autores observaron que el PH de la muestra doblemente modificada
no evidenció diferencias significativas en comparación al PH de una muestra de
almidón acetilado (GS= 0.08) durante las primeras temperaturas de calentamiento de 65
°C y 75 °C; mientras que a mayores temperaturas los valores de PH de la muestra
acetilada-entrecruzada disminuyeron significativamente respecto de lo exhibido por el
almidón acetilado. El valor de PH a 95 °C para el almidón doblemente modificado fue
incluso inferior al del almidón nativo. Los autores atribuyeron este patrón al
entrecruzamiento del almidón, como consecuencia de los enlaces entre las cadenas de
almidón que limitan la absorción de agua al restringir su movilidad en la región amorfa
del polímero (Gunaratne & Corke, 2007; Mirmoghttadaie et al., 2009; Kim & Yoo,
2010).
Durante el calentamiento, el hinchamiento de los gránulos de almidón se ve
acompañado de la lixiviación de la amilosa y componentes moleculares solubilizados
del almidón hacia el medio acuoso. La Figura 4.10 ilustra la evolución de la solubilidad
(%) para AN, AA y AAT en función de la temperatura de calentamiento de cada ensayo
individual. Tal como se observa, la solubilidad de todas las muestras exhibió un patrón
ascendente con la temperatura.
143
0
10
20
30
40
50
60
70
So
lub
ilid
ad
(%
)
55 °C 65 °C 75 °C 85 °C 95 °C
AAT - GS= 0.06
AA - GS= 0.07AN
Figura 4.10. Solubilidad (%) del almidón de maíz nativo (AN), almidón acetilado (AA) y
almidón acetilado obtenido en presencia de ácido tartárico (AAT). Mediciones realizadas
luego de 1 h de calentamiento a diferentes temperaturas.
El almidón de maíz nativo evidenció valores de solubilidad entre 0.1 y 12.6 %, lo
que resulta acorde a lo descripto en la literatura para almidón de maíz nativo (López et
al., 2010; Garg y Jana, 2011; Ayucitra, 2012). Los valores de solubilidad de la muestra
acetilada control AA, por su parte, fueron superiores a los valores de solubilidad del
almidón nativo en todo el rango de temperatura evaluado. Una vez más, lo anterior
puede explicarse en función del debilitamiento de los gránulos de almidón luego de la
acetilación, el cual facilita la difusión de los componentes moleculares del almidón al
medio continuo de manera anticipada, generando así valores de solubilidad superiores.
En el caso de AAT, por su parte, este almidón presentó valores de solubilidad que
no difirieron significativamente de lo obtenido por la muestra control, a pesar del menor
grado de hinchamiento de sus gránulos respecto de AA; sugiriendo que la difusión de
los componentes moleculares hacia el medio acuoso no se vio restringida. Lee et al.,
(2015) obtuvieron resultados similares al comparar el efecto de la modificación simple
(acetilación) y doble (acetilación-entrecruzamiento) de almidón de arroz sobre sus
propiedades fisicoquímicas. La acetilación se llevó a cabo empleando anhídrido acético
(5%) y NaOH como catalizador; mientras que la modificación doble se llevó a cabo
144
entrecruzando primero el almidón con oxicloruro de fósforo (0.02 %), seguido de la
acetilación. La solubilidad del almidón con doble modificación no fue
significativamente menor que la del producto sólo acetilado. Los autores atribuyeron
estos resultados a la prevalencia de la porción acetilada del almidón que condujo al
debilitamiento del gránulo y permitió el suficiente ingreso de agua para que se lleve a
cabo la solubilización y salida del contenido interno del gránulo al medio continuo.
4.2.4.2. CLARIDAD DE LA PASTA
La claridad de la pasta de almidón varía considerablemente con la fuente de
almidón y puede alterarse por modificación química del gránulo. La claridad de una
solución de almidón diluido (1%) se determina comúnmente midiendo el porcentaje de
transmitancia (% T) a una longitud de onda de 650 nm (Bello-Pérez & Paredes-López,
1996). La Tabla 4.2 muestra los valores de porcentaje de transmitancia (T %) obtenidos
para las pastas de almidón nativo y almidones modificados medidos en el día de
preparación (día 1).
Muestra Transmitancia %
Día 1
AN 2.5
AA – GS= 0.07 10.3
AAT – GS= 0.06 4.7
Tabla 4.2. Claridad de la pasta de almidón de maíz nativo (AN), almidón acetilado (AA) y
almidón acetilado obtenido en presencia de ácido tartárico (AAT). Mediciones realizadas el
mismo día de preparación.
En general, la claridad de una solución de almidón depende del origen botánico
del polímero, de algunas de sus propiedades tales como cristalinidad y contenido de
amilosa/amilopectina, y de la conformación de la pasta resultante que dependerá
145
también del tipo de almidón. Los distintos componentes que conforman la pasta del
almidón (gránulos intactos, gránulos parcialmente hinchados, agregados de gránulos,
fragmentos y moléculas de almidón retrogradado y almidón que se ha disuelto o
precipitado) pueden modificar la trayectoria de la luz que pasa a través de la muestra
durante la medición (refractando o reflejando la luz) y dando como resultado valores de
transmitancia reducidos (Craig et al., 1989).
Como se muestra en la Tabla 4.2, el valor de la claridad de la solución de
almidón de maíz nativo recién preparada fue baja (% TAN = 2.5%), y concuerda con los
resultados de otros estudios para este cereal (López et al., 2010; Garg & Jana, 2011;
Han et al., 2012). La baja claridad en las pastas de almidón de maíz nativo se ha
atribuido principalmente a la presencia de restos de gránulos hinchados con diferentes
tamaños (tal como se observó previamente en la evaluación del curso de la
gelatinización del almidón nativo en el microscopio óptico de luz polarizada, Ítem 4.2.2,
Figura 4.5). Esto puede añadir opacidad a la suspensión obtenida debido a que la luz no
es absorbida de la misma forma cuando pasa a través de gránulos de diversos tamaños.
Los residuos mencionados no solo causan una disminución en los valores de
transmitancia, sino que también originan una pasta de almidón blanca característica del
almidón de maíz nativo (Craig et al., 1989).
Luego de la acetilación del almidón, la pasta de AA fue más clara (% TAA =
10.25%) respecto de la pasta de almidón nativo (% TAN = 2.49%). Numerosos autores
observaron una tendencia similar luego de acetilar almidones de diferentes fuentes
(Mirmoghtadaie et al., 2009; Colussi et al., 2015). Los autores atribuyeron esta
observación al hecho de que la introducción de grupos acetilo a la molécula de almidón
mejora el hinchamiento de los gránulos, por lo que más luz podría pasar a través de
gránulos más grandes en lugar de reflejarse (Craig et al., 1989; Garg y Jana, 2011). Sin
embargo, a 90 °C la pasta de AA (Figura 4.7, 90 °C) no parece estar constituida en su
mayoría de gránulos hinchados, sino de pequeños fragmentos de gránulos fantasmas.
La pasta de AAT presentó un valor de %T de 4.65 %. Este valor fue mayor que el
correspondiente al almidón nativo. Sin embargo, y a pesar de la mejora en la claridad de
146
las pasta luego de la acetilación en presencia de ácido tartárico, los resultados también
muestran que la pasta de AAT es menos translúcida que la pasta obtenida en AA.
Se ha reportado que las pastas de almidones doblemente modificados
(acetilación-entrecruzamiento) generalmente son más opacas que las pastas de
almidones acetilados. La investigación al respecto informa que la fracción entrecruzada
del polímero doblemente modificado es la responsable de disminuir la claridad de sus
pastas (Van Hung & Morita, 2005; López et al., 2010; etc.). Esto se atribuye a la
presencia de nuevos enlaces -producto del entrecruzamiento- que generan gránulos de
almidón más compactos y densos que los gránulos de almidón nativo; por lo que en vez
de que la luz pase, ésta se refleja (Craig et al. 1989; Van Hung & Morita, 2005; Kim et
al., 2017). En este contexto, la menor claridad de la pasta de AAT respecto de la pasta
de AA se podría atribuir a la presencia de enlaces adicionales –producto del
entrecruzamiento con ácido tartárico- en los fragmentos de gránulos fantasmas
residuales en la pasta de AAT.
4.2.4.3. CLARIDAD DE LA PASTA POST REFRIGERACIÓN
En general, la transparencia de la pastas de almidón disminuye durante su
almacenamiento a baja temperatura debido al proceso de retrogradación del polímero
que tiene lugar en los geles formados. Durante la retrogradación los componentes
desordenados de los geles de almidón tienden a reorganizarse en una estructura
ordenada por agregación de cadenas y recristalización que generalmente causa
inestabilidad en las pastas de almidón (Matignon & Tecante, 2017). Esta reorganización
conlleva a la obtención de agregados y precipitados en la pasta que desvían la luz
originando pastas más opacas respecto de las pastas recién preparadas. La Tabla 4.3
muestra los valores de porcentaje de transmitancia obtenidos para las pastas de almidón
nativo y almidones modificados medidos en este caso siete días después de haber sido
almacenadas a 4 ° C.
147
Muestra Transmitancia %
(Día 7)
AN 1.2
AA – GS= 0.07 8.3
AAT – GS= 0.06 4.1
Tabla 4.3. Claridad de la pasta del almidón de maíz nativo (AN), almidón acetilado (AA) y
almidón acetilado obtenido en presencia de ácido tartárico (AAT). Mediciones realizadas 7
días después de que las muestras hayan sido almacenadas a 4 °C.
En comparación con los resultados informados en la Tabla 4.2 para la pasta
recién preparada, la claridad de las pastas de todos los almidones disminuye después de
almacenarlas a 4 °C durante una semana (Tabla 4.3). En el caso de la pasta del almidón
nativo, la transmitancia de la luz después del tiempo de almacenamiento se redujo en un
≈ 50%. Por otro lado, las transmitancias de las muestras AA y AAT se redujeron en
menor medida durante el período de refrigeración con valores de 19% y 13%,
respectivamente; lo que permite inferir una menor tendencia a la retrogradación en los
almidones modificados, sobre todo en el AAT doblemente modificado. La menor
tendencia a la retrogradación en los almidones modificados se ha atribuido a los grupos
funcionales introducidos en la molécula de almidón que evitan el alineamiento y la
asociación entre las macromoléculas (Han et al., 2012).
4.2.4.4. SINÉRESIS
La sinéresis es otro parámetro importante para evaluar el grado de retrogradación
y la estabilidad de un gel. Este fenómeno concierne a la formación de una fase líquida
en la parte superior del gel, que se origina durante el almacenamiento en frío como
resultado de la retrogradación del polímero. Durante este proceso se reemplazan las
uniones amilosa-H2O por uniones amilosa-amilosa con la consecuente pérdida de agua.
De ahí que la sinéresis de los geles de almidón se mide como la fracción de agua
exudada durante el almacenamiento a baja temperatura.
148
0 10 20 30 40 50
0
10
20
30
40
50
60 AN
AA - GS= 0.07
AAT - GS= 0.06
Sin
ére
sis
(%
)
Número de ciclos (días)
Figura 4.11. Sinéresis del almidón de maíz nativo (AN), almidón acetilado (AA) y
almidón acetilado obtenido en presencia de ácido tartárico (AAT) evaluado durante 50 días.
En la Figura 4.11 se ilustra la fracción de agua liberada en función del tiempo de
refrigeración a 4 °C de los geles de las muestras estudiadas en este capítulo. El ensayo
se realizó por sacrificio durante 50 días. En este tiempo, la muestra de almidón nativo
evidenció un alto incremento en el porcentaje de agua separada del gel alcanzando un
valor de 52 ± 2 % hacia el final del ensayo. El aumento en el porcentaje de sinéresis
durante el almacenamiento se ha atribuido principalmente a la interacción entre las
cadenas de amilosa lixiviadas que conduce a la recristalización de las cadenas hacia una
estructura ordenada (Matignon & Tecante, 2017). Este resultado refleja el alto grado de
retrogradación del almidón nativo. Resultados similares fueron informados por López et
al 2011, Han et al., 2012, Kapelko, Zięba, & Michalski, 2012.
Por otro lado, el gel obtenido a partir de AA exhibió porcentajes de agua
eliminada durante todo el tiempo de refrigeración significativamente menores al AN, tal
como se observa en la Figura 4.11. Esta muestra de almidón acetilado evidenció la
mayor resistencia a la sinéresis reflejada en el menor porcentaje de agua liberada a lo
largo de todo el período ensayado (1.08 ± 0.5 % luego de 50 días de refrigeración). La
alta capacidad de retención de agua de los geles de almidones de maíz acetilados se
149
atribuye a que con la acetilación se logra interrumpir la linealidad de la amilosa o
segmentos de las ramas de amilopectina, reduciendo la sinéresis y la pérdida de textura
y consistencia durante el almacenamiento del producto terminado (Cui, 2005; Saartrat,
Puttanlek, Rungsardthong, & Uttapap, 2005). En el mismo sentido, Gonzales & Pérez
(2002) informaron que la menor tendencia a la retrogradación en el almidón de arroz
acetilado se debe a la prevención de la alineación y asociación entre macromoléculas
por los grupos acetilo debido a un impedimento estérico. Por su parte, Singh, Kaur, &
Singh (2004) postularon que la alteración en las propiedades de retrogradación de los
almidones acetilados puede deberse al aumento en la capacidad de retención de agua de
las moléculas de almidón debido a la presencia de grupos acetilo en los geles
almacenados refrigerados.
En el caso del almidón acetilado en el medio de anhídrido acético conteniendo
ácido tartárico (AAT), la evaluación de la retrogradación de la pasta estuvo limitada
debido a la baja viscosidad de la muestra, a pesar de la alta concentración de la pasta
elaborada (10 % p/p). La consistencia inicial de la pasta restringió la formación de un
gel y recién a partir de las 2 semanas de almacenamiento en frío se formaron geles
firmes (es decir que se podía voltear el tubo que contenía la muestra y ésta no se
deslizaba). Los valores de sinéresis para esta muestra se presentan a partir del ciclo 14
hasta el ciclo 50, tiempo en el que el porcentaje de agua exudada alcanzó 8.5 ± 1 %,
valor que superó al de AA pero aún muy inferior al del almidón nativo.
4.2.4.5. CARACTERIZACIÓN REOLÓGICA DE LA PASTA
La reología estudia la manera en la cual los materiales responden a un esfuerzo o
deformación aplicados. El estudio de las propiedades reológicas de las pastas de
almidón tiene un alto impacto tecnológico en el desarrollo de alimentos, ya que
determinan las condiciones de procesamiento de los mismos. A continuación, se
describen las propiedades reológicas estudiadas en soluciones gelatinizadas al 10 % p/p
de almidón nativo, acetilado y acetilado en presencia de ácido tartárico para la
caracterización reológica de las muestras. Se trabajó con una concentración de 10 % p/p
porque concentraciones menores generaron pastas blandas de las muestras modificadas
150
y con baja viscosidad aparente, dificultando la medición de las propiedades reológicas
en el reómetro rotacional.
4.2.4.5.1. ENSAYOS ROTACIONALES
Los ensayos rotacionales permiten analizar el comportamiento reológico de las
pastas sometidas a condiciones cercanas a las de procesamiento industrial como altos
esfuerzos de corte (López et al., 2011). En la Figura 4.12 se muestran las curvas de
comportamiento de flujo de las suspensiones gelatinizadas de los almidones evaluados
(AN, AA y AAT). La suspensión gelatinizada del almidón nativo presentó un
comportamiento con esfuerzo umbral típico de un comportamiento plástico descrito
matemáticamente por el Modelo de Herschel-Bulkey. Los altos índices de consistencia
(k) y comportamiento de flujo (n), así como un valor elevado de viscosidad aparente en
la pasta de almidón nativo presentados en la Tabla 4.4 se atribuyen a la elevada
concentración de almidón en la suspensión (Navarro, 1996). La composición de la pasta
y concentraciones de amilosa liberada al medio durante el calentamiento se han
relacionado directamente con la viscosidad de las pastas de almidón (Chen et al., 1998;
Saartrat et al., 2005). Los valores resumidos en la Tabla 4.4 para la pasta de almidón
nativo se encuentran próximos a lo informado por Navarro (1996) en la solución
gelatinizada de almidón de maíz común preparada al 10 % p/p.
Almidón
Índice de
consistencia (k)
(Pa/sn)
Índice de
comportamiento
de flujo (n)
Viscosidad aparente
a 500 s-1 (mPa s)
AN 20.1 ± 1.7 0.4 ± 0.01 836 ± 74.8
AA - GS= 0.07 3.6 ± 0.4 0.6 ± 0.01 234 ± 5.0
AAT - GS= 0.06 0.3 ± 0.1 0.8 ± 0.02 60 ± 4.2
Tabla 4.4. Comportamiento reológico rotacional de suspensiones gelatinizadas al 10% p/p
del almidón nativo AN y almidones acetilados AA y AAT.
151
0 100 200 300 400 500 6000
50
100
150
200
250
300
350
400
450
Esfu
erz
o d
e c
ort
e (
Pa
)
Velocidad de corte (1/s)
AN
AA - GS= 0.07
AAT - GS= 0.06
Figura 4.12. Curvas de comportamiento de flujo de suspensiones al 10 % p/p gelatinizadas
para almidón de maíz nativo (AN), almidón acetilado (AA) y almidón acetilado obtenido en
presencia de ácido tartárico (AAT).
Los almidones modificados presentaron un comportamiento pseudoplástico
(n<1) modelado satisfactoriamente por el modelo de Ostwald de Waele (Figura 4.12,
Tabla 4.4). Las modificaciones llevadas a cabo en esta Tesis disminuyeron
significativamente la viscosidad aparente de las suspensiones (Tabla 4.4), así como los
parámetros de la ley de la potencia respecto a lo hallado en la pasta de almidón nativo.
Diversos estudios han demostrado la reducción de la viscosidad de las pastas formadas a
partir de almidón acetilado de distintos orígenes botánicos (Navarro, 1996; Saartrat et
al., 2005; Colussi et al., 2014). Esta disminución se ha atribuido a la incorporación de
grupos acetilo en la molécula de almidón que obstaculizan las interacciones entre las
fuerzas inter- e intragranulares (es decir, que evitan los alineamientos paralelos de las
cadenas de amilosa), lo que limita la generación de una consistencia altamente viscosa
de la pasta formada en comparación con el almidón nativo (Colussi et al., 2014). Si bien
los parámetros incluidos en la Tabla 4.4 se han calculado a partir de dos modelos
diferentes, es claro en la Figura 4.12 que el esfuerzo de corte realizado en el AN fue
muy superior al que fue necesario en AN y AA por lo que las diferencias mostradas en
la Tabla 4.4 son esperables a partir de los datos experimentales.
152
En el caso de la pasta de AAT, la viscosidad aparente de la muestra fue aún
menor que la correspondiente al AA poniendo una vez más en relevancia el efecto del
entrecruzamiento simultáneo a la acetilación. Para ejemplificar este concepto, la pasta
formada por AAT presentó al tacto una consistencia de pasta blanda y delicada y tal
como se informó en la Sección 4.2.4.4 la formación del gel se produjo en un tiempo
mayor que el que se necesitó para la pasta de AA, que presentó mayor consistencia
desde un comienzo.
4.2.4.5.2. ENSAYOS DINÁMICOS
Los ensayos oscilatorios evalúan el comportamiento viscoelástico dentro del
rango de viscoelasticidad lineal donde la muestra no sufre daño estructural. A partir de
los barridos de esfuerzo se determinó que el rango de viscoelasticidad lineal se extendió
hasta 1.1 Pa para todos los almidones evaluados (AN, AA y AAT) por lo que se
seleccionó un esfuerzo de corte de 1 Pa para los barridos de frecuencia que se ilustran
en la Figura 4.13.
A partir de los resultados de los ensayos mecánicos del almidón nativo se
concluye que en la pasta resultante prevaleció el componente elástico (siendo G’ > G’’)
a lo largo del rango analizado, denotando así la mínima contribución del componente
viscoso. El comportamiento viscoelástico del almidón de maíz nativo puede variar
según la concentración de la pasta generada. Por ejemplo, López et al. (2010)
obtuvieron soluciones gelatinizadas de almidón de maíz nativo al 4% p/p evidenciando
un comportamiento típico de un fluido viscoso, es decir que G’’ > G’. Sin embargo, con
el incremento de la concentración de la solución Navarro (1996) observó un incremento
en la componente elástica G’. Este comportamiento ha sido anteriormente asociado a
una mayor concentración de amilosa liberada a la fase continua, a los diferentes grados
de hinchamiento de los gránulos, así como a un mayor contacto gránulo-gránulo (Katz,
Desai, & Seiberlich, 1938)
153
0.1 1 10
0.01
0.1
1
10
100
1000
G', G
'' (P
a)
(rad/s)
AN
G' en Pa
G'' en Pa
0.1 1 10
1
10
100
G', G
'' (P
a)
(rad/s)
AA - GS= 0.07
G' en Pa
G'' en Pa
0.1 1 10
1E-3
0.01
0.1
1
10
100
G', G
'' (P
a)
(rad/s)
AAT - GS= 0.06
G' en Pa
G'' en Pa
Figura 4.13. Comportamiento viscoelástico de las suspensiones al 10 % p/p gelatinizadas
para almidón de maíz nativo (AN), almidón acetilado (AA) y almidón acetilado obtenido en
presencia de ácido tartárico (AAT).
El almidón acetilado (AA) mostró un comportamiento similar al del almidón
nativo ya que el valor de G´ fue significativamente más alto que el de G´´ y permaneció
constante en todo el rango de frecuencias analizado, comportándose como un gel
(Figura 4.13). Este valor superior de G' indicó la prevalencia del comportamiento
elástico. El almidón AAT presentó un comportamiento diferente al del AN y AA. A
bajas frecuencias prevaleció el componente viscoso denotando la mayor fluidez del
sistema mientras que a altas frecuencias el componente mayor fue el componente
elástico indicando un comportamiento semejante al de los materiales sólidos. Sin
embargo, ambos componentes tuvieron valores más cercanos que en AN y en AA con lo
que el comportamiento en todo el rango se puede considerar viscoelástico. Este
154
comportamiento está de acuerdo con el hecho que el tiempo de gelificación para AAT es
más largo que para AN y AA.
4.7. CONCLUSIONES DEL CAPÍTULO 4
En el presente capítulo se prepararon almidones acetilados (AA) y almidones
acetilados-entrecruzados (AAT) con grado de modificación compatible con lo requerido
por la FDA para almidones acetilados para uso como aditivo alimentario.
El almidón acetilado blanco obtenido sin el agregado de ácido tartárico al medio
de reacción (AA) presentó propiedades funcionales coincidentes con lo descripto en la
literatura para almidones acetilados en este rango de GS. En este sentido, el almidón AA
mostró mejoras en el poder de hinchamiento, solubilidad y claridad de la pasta con
respecto al almidón nativo. Estos resultados se atribuyen a la introducción de grupos
acetilo que condujo a una reorganización estructural debido al impedimento estérico y
que facilitó la filtración del agua. Asimismo, se observó una clara reducción de la
tendencia a la retrogradación de las pastas obtenidas.
Por otra parte, y a pesar de sus valores de GS prácticamente iguales y sus
espectros RMN 1H y FTIR, apariencia al SEM y cristalinidad tan similares, la
comparación de las propiedades funcionales de AA y AAT confirman que la acetilación
en presencia de ácido tartárico redunda en almidones con propiedades funcionales
diferentes (y muchas veces con valores intermedios) respecto de las del almidón nativo
y de las del almidón acetilado control. Esto se atribuye al rol del ácido tartárico como
entrecruzante del almidón, permitiendo así obtener un producto con características
distintivas propias de almidones acetilados-entrecruzados.
Se destaca como ventaja de la metodología propuesta que la doble modificación
(es decir, la acetilación y el entrecruzamiento) se logra en una única etapa, a diferencia
de los protocolos convencionales utilizados para obtener almidones doblemente
modificados en los que los procesos se llevan a cabo generalmente uno a continuación
155
del otro. La integración de la acetilación y el entrecruzamiento de almidones usando un
agente entrecruzante de origen natural y de uso habitual en alimentos como es el ácido
tartárico, se presenta como una vía prometedora a seguir explorando para obtener
almidones con propiedades distintivas de potencial interés para aplicaciones en
alimentos.
156
157
Capítulo 5
ALMIDONES ESTERIFICADOS CON ÁCIDOS
GRASOS DE CADENA CORTA (AGCC) DE
INTERÉS EN NUTRICIÓN Y SALUD PÚBLICA
158
159
5. ALMIDONES ESTERIFICADOS CON ÁCIDOS GRASOS DE
CADENA CORTA (AGCC) DE INTERÉS EN NUTRICIÓN Y
SALUD PÚBLICA
5.1. INTRODUCCIÓN
5.1.1. ALMIDONES RESISTENTES
El almidón es el principal carbohidrato digerible y la fuente de energía más
importante para la nutrición humana. La digestión de carbohidratos como el almidón en
humanos se inicia en la cavidad oral tanto mecánicamente, debido a la acción ejercida
por los dientes, lengua y músculos orofaciales; como bioquímicamente a través de la
actividad enzimática de la α-amilasa salival. La amilasa salival (hidrolasa) corta los
enlaces α (1→4) presentes en las cadenas de amilosa y amilopectina, generando como
producto maltosas, oligosacáridos simples y dextrinas (oligosacáridos con secuencia
lineal y ramificada). A continuación, los carbohidratos simplificados alcanzan el lumen
del intestino delgado (duodeno), que es donde tiene lugar la mayor parte de la digestión
y absorción del polímero, pues el objetivo es la eventual obtención de monómeros de
glucosa que puedan ser enviados al torrente sanguíneo (Nugent, 2005).
Sin embargo, no todo el almidón que se ingiere es degradado a glucosa y
absorbido en el intestino delgado, sino que hay fracciones de almidón que escapan de la
digestión y por ello se las denomina almidón resistente (AR, en inglés RS). El AR
refiere a la porción de almidón que pasa a través del intestino delgado sin ser digerida y
alcanza el intestino grueso de las personas sanas. El almidón resistente se clasifica de
acuerdo a los factores intrínsecos del alimento o al proceso usado en su preparación en
cuatro tipos principales, a saber: AR1, AR2, AR3 y AR4 (en inglés RS1, RS2, RS3 y
RS4).
El AR1 incluye a los almidones que son físicamente inaccesibles para las
enzimas digestivas del hombre debido a que poseen una envoltura de material fibroso
con paredes celulares intactas (Fuentes-Zaragoza et al., 2010). Este tipo de almidón
160
resistente se encuentra en alimentos a base de almidón que no han sido fraccionados o
refinados, y mayormente en legumbres y algunos cereales.
El AR2 concierne a los gránulos de almidón nativos no cocidos con resistencia
enzimática inherente en virtud a su estructura cristalina (B o C) y en almidones con alto
contenido de amilosa. La longitud de las cadenas de las ramificaciones y el tipo de
empaquetamiento de las cadenas de doble hélice en almidones con estructura tipo B o C
les confiere una alta cristalinidad y limitan el acceso de varias amilasas (Fuentes-
Zaragoza et al., 2010; Jiang, Blanco, Campbell, & Jane, 2010). El AR2 se encuentra,
por ejemplo en la papa cruda y en la banana verde.
El AR3 es el almidón que está asociado sobre todo a la amilosa recristalizada
(almidón retrogradado). Este tipo de almidón se encuentra principalmente en almidones
que fueron cocidos y enfriados antes del consumo (pan, papa cocida y enfriada). El
mecanismo actualmente aceptado por el cual el AR3 resiste la digestión es que los
segmentos lineales de amilosa en el polímero retrogradado se alinean en estructuras de
doble hélice, que aumenta la rigidez del polímero. Este arreglo hace que los enlaces
glucosídicos α (1→4) sean inaccesibles para las enzimas digestivas y esta fracción de
almidón no sea digerida en el intestino delgado (Zhang & Jin, 2011).
El AR4 reúne a un grupo de almidones que han sido químicamente modificados.
Se incluyen en este grupo almidones que fueron eterificados, esterificados o
entrecruzados con agentes químicos de forma tal que disminuye su digestibilidad. La
resistencia a la hidrólisis enzimática del AR4 se debe a cambios químicos en la
estructura del almidón con uniones atípicas que no son reconocidas por las enzimas
bloqueando su acceso (Zhang & Jin, 2011).
Muchas de las autoridades de la salud pública y organizaciones internacionales
como la Organización de Alimentos y Agricultura (FAO), la Organización Mundial de
la Salud y la Academia Nacional Estadounidense de las Ciencias, reconocen al almidón
resistente como un carbohidrato provechoso a partir de reconocidos beneficios
nutricionales significativos. El almidón resistente generalmente promueve una serie de
acciones fisiológicas en los seres humanos comparables a los de la fibra dietaria que
161
incluyen, entre otros, la disminución del tiempo de tránsito intestinal, saciedad
mejorada, niveles reducidos de glucosa y/o insulina en la sangre postprandial,
concentraciones disminuidas de colesterol total y/o lipoproteína de baja densidad, y
sobre todo fermentabilidad de la fracción resistente a cargo de la microbiota colónica
para generar ácidos grasos de cadena corta (AGCC) (Shi & Maningat, 2013).
En tal sentido, los beneficios del almidón resistente se deben principalmente a
los productos de fermentación bacteriana en el intestino grueso. Las bacterias del colon,
con sus numerosas enzimas de gran actividad metabólica, pueden digerir el almidón en
mayor o menor medida dependiendo de su estructura (Fuentes-Zaragoza et al., 2011;
Birt et al., 2013). Este proceso de digestión se produce en condiciones anaerobias, por
lo que se denomina fermentación. Los principales productos finales del metabolismo
bacteriano en el intestino grueso humano son los ácidos grasos de cadena corta
(AGCC), cuya concentración se da generalmente en el siguiente orden: acetato >
propionato ≥ butirato. Estos AGCC son reabsorbidos rápidamente en más del 90% por
los colonocitos (células que recubren el epitelio del intestino grueso o colon, y que
participan en la absorción de AGCC), e interactúan en algunas rutas metabólicas y
eventos de tumorogénesis (Macfarlane & Macfarlane, 1995; Chung, Donner & Liu,
2011; Zhang & Jin, 2011).
La velocidad y el nivel de producción de AGCC dependen de las cepas y
cantidades de la microflora presente en el colon, la fuente del sustrato y el tiempo de
tránsito intestinal. El acetato es el principal AGCC en el colon y, después de su
absorción se conoce que puede inhibir la colesterolgenesis (síntesis del colesterol), y
disminuir la disponibilidad de ácidos grasos libres (las altas concentraciones de ácidos
grasos libres son perjudiciales para la salud humana ya que se asocian con una
disminución de la sensibilidad a la insulina y una disminución en la captación de
glucosa). El propionato es en gran medida absorbido por el hígado y principalmente
disminuye los niveles de colesterol porque actúa como un inhibidor natural de la enzima
clave para la síntesis de colesterol en el hígado (Adam et al., 2001; Delzenne &
Williams, 2002). El butirato, por su parte, es la principal fuente de energía para los
colonocitos. Este AGCC ha sido muy estudiado por su papel en la nutrición de la
mucosa del colon y en la prevención del cáncer de colon, mediante la promoción de la
162
diferenciación celular, la detención del ciclo celular y la apoptosis de los colonocitos
modificados, la inhibición de la enzima histona desacetilasa, y la disminución de la
transformación de los ácidos biliares primarios a secundarios como resultado de la
acidificación del colon. En este contexto, todos estos AGCC se reconocen como capaces
de reducir el riesgo de desarrollar trastornos gastrointestinales, cáncer y enfermedades
cardiovasculares (Topping & Clifton, 2001; Huth et al., 2010). De allí el interés
nutricional y en temas de salud pública de la ingesta de almidones resistentes.
5.1.2. ALMIDONES ESTERIFICADOS CON ÁCIDOS GRASOS DE CADENA
CORTA
Entre las fuentes de almidón resistente descriptas los almidones químicamente
modificados (AR4), especialmente los resultantes de la esterificación del almidón con
grupos acetato, propionato y butirato, son de particular interés ya que se ha demostrado
que al alcanzar el intestino grueso los AGCC esterificados son liberados por enzimas
bacterianas (esterasas y lipasas), teniendo así el potencial de suministrar cantidades
significativas del AGCC esterificado específico para fines terapéuticos, clínicos y de
salud pública (Annison et al., 2003; Morita et al., 2005; Clarke et al., 2007). Bird,
Brown & Topping (2006) estudiaron los efectos del tipo de almidón (almidones de maíz
de bajo y alto contenido de amilosa, y almidón de maíz waxy) sobre los índices de
fermentación del intestino grueso luego de alimentar a ratas con almidones acetilados
(GS= 0.2). Los resultados de la determinación de la concentración de AGCC
demostraron que el mayor aumento se produjo en el acetato, es decir, en el AGCC que
estaba esterificado en la molécula de almidón. Además se observó un aumento
significativo de los AGCC totales respecto de los generados con almidón de maíz
nativo, lo que se atribuyó al suministro de más almidón total no digerible para la
fermentación. Resultados similares fueron obtenidos por Clarke et al. (2007), quienes
suministraron a ratas dietas basadas en almidones acetilados, propionizados y
butirilizados con GS entre 0.23 y 0.25, y observaron que la ingesta de los polímeros
esterificados proporcionaron entre el 73 y el 76 % del ácido esterificado específico al
intestino grueso. Posteriormente, y en base a estos resultados, Clarke et al. (2011)
evaluaron el estudio previo en humanos. Los voluntarios consumieron y toleraron bien
163
dietas con cantidades conocidas de almidón butirilizado y sin modificar (control), no
observándose ningún efecto colateral. Luego, se recogieron las heces de los individuos y
se calculó la proporción de ácido esterificado eliminado. Los autores también
cuantificaron la cantidad de AGCC liberado en el colon (79 – 90%). Con estos
resultados, los autores determinaron que a través de la ingesta del almidón butirilizado,
el ácido graso específico fue liberado y usado en el intestino grueso de voluntarios
saludables. En otro estudio que cubrió todos los AGCC objetivo, Annison et al. (2003)
acilaron almidón de maíz con anhídrido acético, propiónico y butírico en
dimetilsulfóxido caliente, logrando valores de GS en el intervalo de 0.16 a 0.20. Los
autores evaluaron los efectos del tipo de AGCC in vivo, determinando que los
almidones acilados efectivamente llegaron al intestino grueso, donde la actividad
enzimática de la flora colónica liberó el AGCC específico. Los resultados indicaron que
las cantidades del AGCC con el que se había esterificado el almidón se incrementaron
respecto de los producidos por la simple fermentación de almidones nativos. Por su
parte, otros estudios en los que se suministró almidón de maíz butirilizado con alto
contenido de amilosa a ratas, también demostraron que el AGCC liberado protege la
mucosa colónica del ADN dañado al observarse una disminución en la incidencia y
números de tumores colónicos. Más recientemente, Toden et al. (2014), examinaron el
efecto de distintos contenidos de dietas (0 – 40 %) compuestas por almidón de maíz
butirilizado con alto contenido de amilosa en la incidencia de cáncer de colon en ratas.
Los resultados demostraron que el incremento de ácido butírico en el intestino grueso
redujo significativamente los niveles de daño del ADN y aumentó la tasa de apoptosis
(muerte celular) de células epiteliales dañadas. El ADN dañado está muy relacionado al
riesgo de carcinogénesis, por lo que el incremento en la tasa de apoptosis de las células
dañadas probablemente repercuta en la posibilidad de padecer cáncer colorrectal.
El relevamiento previo pone en evidencia que los almidones esterificados con
AGCC se presentan como un sistema de entrega efectiva del AGCC específico al colon.
En este contexto, en el presente capítulo se muestra el análisis de la idoneidad de la ruta
de esterificación propuesta para producir almidones esterificados con grupos propionato
con contenido de almidón resistente incrementado. Este AGCC se seleccionó en base a
que sus efectos sobre la salud humana se extienden más allá del epitelio intestinal.
Además de reducir la lipogénesis y los niveles de colesterol en suero, disminuye la
164
carcinogénesis en otros tejidos. El propionato alcanza la circulación en una
concentración mucho más alta que el butirato, y es absorbido significativamente por el
hígado (alrededor del 60 %) (Cummings et al., 1987). Debido a las altas
concentraciones de estos aniones en el hígado, no es improbable que afecten las células
cancerosas locales, así como otras células cancerosas típicas que causan metástasis en el
hígado, como el cáncer de mama y colon (Chambers, Groom, & MacDonald, 2002 ; Jan
et al., 2002; Li & Elsasser, 2005). Además, porque a nivel experimental (y como
sistema modelo para estudiar la aplicabilidad de la ruta para producir AR con AGCC
específicos), la manipulación del ácido o anhídrido propiónico se prefiere frente al ácido
o anhídrido butírico debido al olor desagradable y penetrante de éste último.
A pesar de la importancia del ácido propiónico en salud, las contribuciones sobre
la propionización del almidón son escasas. Entre ellas se encuentran las metodologías
de propionización catalizadas por 1-metilimidazol (GS= 0.16) (Annison et al., 2003),
hidróxido de sodio (GS ≤ 0.94) (Lopez-Rubio et al., 2009; Hong, Chen, Lee & Peh,
2015), y piridina (GS ≤ 2.51) (Rivard et al., 1995; Santayanon & Wootthikanokkhan,
2003; Garg & Jana, 2011). Sin embargo, algunos de estos catalizadores tienen
limitaciones relacionadas con su manejo, toxicidad, producción de grandes cantidades
de aguas residuales o etapas de preactivación requeridas. Garg & Jana (2011)
obtuvieron almidón propionizado empleando anhídrido propiónico (en distintas
concentraciones) como acilante y piridina como catalizador. Antes de agregar el acilante
a la mezcla de almidón/piridina, esta fue agitada por 2 h a 90 °C para pre-activar el
almidón. Posteriormente, la reacción se llevó a cabo por 22 h logrando valores de GS
entre 0.61 a 2.61.
De los resultados presentados en el Capítulo 3 se puede concluir que en la
metodología implementada puede ocurrir de manera simultánea con la esterificación del
almidón con el acilante elegido, la esterificación del polímero con el mismo ácido
tartárico y su entrecruzamiento. La posibilidad de aportar resistencia adicional por el
entrecruzamiento a los almidones esterificados con AGCC en una misma etapa resulta
atractiva para la aplicación como fuente de AR descripta, y es el foco de este capítulo.
La producción de almidones resistentes por entrecruzamiento con ácidos
policarboxílicos como el ácido cítrico ha sido descripta. Xie & Liu (2004) obtuvieron
165
contenidos de AR de 78.8 % cuando entrecruzaron almidón de maíz con ácido cítrico a
140 °C por 7 h. Kim et al. (2017) emplearon diferentes concentraciones de ácido cítrico
(0.1, 10 y 30 % p/p) para entrecruzar almidón de arroz logrando valores de GS igual a
0.01, 0.15 y 0.27, operando a 140 °C por 4 h. Los almidones entrecruzados fueron
menos susceptibles a la hidrólisis enzimática con contenidos de AR que se
incrementaron significativamente con el aumento del GS desde 17.4 % hasta 63.8 %
respecto de lo hallado en el almidón de arroz nativo (AR= 11.3 %).
5.2. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.2.1. PREPARACIÓN DE ALMIDONES PROPIONIZADOS
Con el objetivo de producir almidones propionizados con GS variable, se llevó a
cabo la esterificación del almidón de maíz con ácido propiónico catalizada por ácido L-
tartárico durante tiempos de reacción variables (1 a 5 h), manteniendo constantes las
demás condiciones de reacción en 2 g de almidón de maíz (base seca, 2h – 110 °C), 12
mL de ácido propiónico, 1 g de ácido tartárico y 130 °C (siguiendo la metodología de
esterificación descripta en la sección 2.2). Se ensayaron como sustratos almidón de maíz
nativo y almidón de maíz pregelatinizado (ambos disponibles comercialmente) para
evaluar en forma explícita el efecto de la estructura inicial del almidón de maíz sobre
los valores de GS alcanzados. En la Figura 5.1 se muestran los resultados obtenidos en
función del tiempo de reacción habiéndose denominado como APT a los almidones de
maíz propionizados en presencia de ácido tartárico, APPT a los almidones de maíz
pregelatinizados propionizados en presencia de ácido tartárico y AP al producto de la
reacción no catalizada.
Como se muestra en la Figura 5.1 para ambos almidones de maíz el aumento en
el tiempo de reacción dentro del intervalo elegido resultó en un incremento continuo en
el nivel de modificación alcanzado, lográndose en 5 h valores de GS de 0.46 y 0.69 para
el almidón de maíz nativo y pregelatinizado, respectivamente. La mayor susceptibilidad
del almidón pregelatinizado sobre el almidón nativo fue evidente para todos los
166
intervalos de tiempo analizados, y se puede atribuir al mayor acceso del acilante y el
catalizador disuelto a las regiones de bajo orden cristalino. En la esterificación de
almidón con anhídrido butírico como acilante y 1-metilimidazol como catalizador,
Bajka (2007) también reportó valores de GS superiores en almidones que fueron
parcialmente gelatinizados antes de la esterificación.
0 1 2 3 4 5
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0 AP
APT
APP
T
GS
Tiempo (h)
Figura 5.1. Evolución de la propionización de almidón de maíz nativo (APT) y de almidón
de maíz pregelatinizado (APPT) obtenidos en presencia de ácido tartárico y la reacción no
catalizada (AP) como blanco. 130 °C, 12 mL de ácido propiónico, 1 g de ácido tartárico.
Por otro lado, la reacción no catalizada y llevado adelante por el máximo tiempo
de reacción evaluado (5 h) condujo a un valor de GS de 0.05, el cual fue
significativamente inferior a lo alcanzado durante la reacción en presencia de ácido
tartárico, poniendo de manifiesto su participación en la catálisis de la propionización.
5.2.2. CARACTERIZACIÓN GENERAL DE PRODUCTOS
Para conocer los efectos de la derivatización en la estructura del almidón y su
impacto en la fracción resistente resultante se emplearon técnicas de caracterización en
167
donde se analiza al polímero en estado sólido. Esto se debe a que, en consonancia con lo
observado en el Capítulo 3 para almidones acetilados, las muestras de almidón
propionizado evaluadas en este capítulo tampoco se disolvieron completamente en
diversos solventes orgánicos como el DMSO (solvente orgánico tradicional para el
almidón). Lo anterior se ilustra en la Figura 5.2, donde se observa que luego de calentar
la mezcla se obtuvo una dispersión turbia y con el tiempo se formó un precipitado con
gránulos aparentemente hinchados.
Figura 5.2. Ensayo de disolución de almidón propionizado APT (GS= 0.36) en DMSO a
100 °C por 15 minutos.
Las técnicas de caracterización empleadas en esta sección apuntaron a conocer la
estructura química (RMN 13C CP/MAS de estado sólido y FTIR), la morfología (SEM),
y la cristalinidad (DRX) de los productos de la propionización organocatalítica en
función del GS.
5.2.2.1. ESPECTROSCOPÍA DE RESONANCIA MAGNÉTICA
NUCLEAR EN ESTADO SÓLIDO 13C CP/MAS
La incorporación de grupos propionilo en los almidones de maíz nativo y
pregelatinizado en presencia de ácido tartárico fue confirmada por resonancia magnética
nuclear de 13C en estado sólido con Rotación al Ángulo Mágico y Polarización Cruzada
(13C CP/MAS). En la Figura 5.3 se muestran en primera instancia los espectros de
Precipitado
168
RMN 13C CP/MAS del almidón de maíz nativo (AN) y almidón de maíz pregelatinizado
(ANP).
200 190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
AN
ANP
ppm
C6
Clúster
C2, C3, C5
C4C1
Figura 5.3. Espectros RMN 13C CP/MAS del almidón de maíz nativo (AN) y almidón de
maíz pregelatinizado (ANP).
Como se observa en la Figura 5.3, los espectros de los almidones puros
mostraron las señales correspondientes a las resonancias de los carbonos característicos
de la unidad de D-glucopiranosa del almidón, entre ellos, C-1 en el rango de 90 a 110
ppm, C-4 en el intervalo de 79 a 87 ppm, la región altamente superpuesta de C-2,3,5 en
65-80 ppm, y C-6 en el rango de 56 a 65 ppm.
La intensidad de la señal entre 93 y 100 ppm observada en los espectros de
almidones no modificados se atribuye a la contribución del material amorfo (Gidley &
Bociek, 1988). En el caso del almidón de maíz nativo semicristalino (AN), la señal de
C-1 se muestra como un triplete con picos en 102.4, 101.1 (máximo) y 99.7 ppm, lo que
indica un polimorfo cristalino tipo A de doble hélice típico de almidones de cereales
(Gidley & Bociek, 1988; Therien-Aubin et al., 2007). Por otro lado, en el almidón
pregelatinizado original (ANP) la resonancia C-1 apareció como un único pico en 103.2
ppm, que puede resultar de estructuras tipo V que dan lugar a señales en 103-104 ppm,
169
o de materiales amorfos que tienen una intensidad substancial en la señal C-1 en el
mismo rango (ver imagen magnificada en la Figura 5.4). El almidón de maíz, como
todos los demás almidones de cereales que contienen amilosa, presenta un porcentaje
pequeño (<1,2%) pero significativo de lípidos, que se asocian fácilmente con el
componente de amilosa del almidón para formar complejos conocidos como estructuras
de tipo V. Las estructuras de V-amilosa son hélices simples que presentan una cavidad
interna donde el complejo puede residir. Se forman estructuras similares en presencia de
una amplia variedad de otros agentes complejantes tales como yodo, alcoholes, cetonas,
etc. (Gidley & Bociek, 1988; Putseys et al., 2010).
110 99 88 77 66 55
ppm
AN
ANP
C6
Clúster
C2, C3, C5
C4
C1
Figura 5.4. Espectros de RMN 13C CP/MAS del almidón de maíz nativo (AN) y almidón de
maíz pregelatinizado (ANP). Zoom en la región de 50 - 110 ppm.
En la Figura 5.4 se muestra una imagen ampliada de los espectros RMN
superpuestos de las muestras de almidón no modificados en el rango de 50 a 110 ppm.
En comparación con el almidón de maíz nativo (espectro negro), el almidón
pregelatinizado (espectro gris) evidenció una mayor intensidad en el sitio C-4, que se
asocia con una mayor contribución de material amorfo o estructuras de tipo V helicoidal
simple, que dan lugar a señales centradas en 82-84 ppm. Morgan et al. (1995) y Primo-
170
Martín, van Nieuwenhuijzen, Hamer, & van Vliet (2007) también observaron un
aumento en la intensidad relativa de los picos en 82 y 103.3 ppm tras la gelatinización
del almidón. Adicionalmente, el almidón de maíz pregelatinizado también evidenció
una disminución relativa en la intensidad del sitio C-6, que se ha asociado con una
mayor movilidad rotacional de este grupo lateral en el almidón gelatinizado que hace
que la polarización de los protones a los átomos de 13C sea menos eficiente (Primo-
Martín et al., 2007).
200 190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
ppm
C6
Cluster
C2, C3, C5
C4C=O
C1
CH3
CH2
AN
ANP
APT - GS= 0.36
APP
T - GS= 0.62
Figura 5.5. Espectros de RMN 13C CP/MAS de almidones de maíz no modificados (AN
y ANP) y almidones propionizados en presencia de ácido tartárico (APT – GS= 0.36 y
APPT – GS= 0.62) obtenidos en 4 h.
En la Figura 5.5 se exhiben los espectros de RMN 13C CP/MAS de almidones
propionizados seleccionados (4 h de reacción) obtenidos en presencia de ácido tartárico
(APT y APPT) en comparación con los espectros de ambos almidones no modificados
(AN y ANP). Los espectros de los almidones propionizados mostrados en la Figura 5.5
presentaron tres nuevas señales en 173, 27 y 9 ppm, las cuales fueron compatibles con
las resonancias de carbono de los grupos propionilo insertado. En función de la
literatura, las señales se atribuyeron a los carbonos de los grupos C=O (173 ppm), CH2
171
(27 ppm) y CH3 (9 ppm) del nuevo éster confirmando la propionización exitosa de
ambos almidones de maíz.
5.2.2.2. ESPECTROSCOPÍA DE INFRARROJO POR TRANSFORMADA
DE FOURIER
La introducción de grupos propionilo en los almidones de maíz también fue
confirmada por Espectroscopía Infrarroja por Transformada de Fourier. En la Figura
5.6 se muestran los espectros IR de las muestras de almidones sin modificar y
propionizados con GS variable.
4000 3600 3200 2800 2400 2000 1600 1200 800
Absorb
an
cia
Número de onda (cm-1)
APT - GS= 0.46
APT - GS= 0.36
APT - GS= 0.29
APT - GS= 0.13
APT - GS= 0.05
AN
(C-O-C)Éster
(O
-H)
(C=O)
(C-H)
(O-H)A)
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000
B)
Ab
so
rba
ncia
Número de onda (cm-1)
ANP
APP
T - GS= 0.69
APP
T - GS= 062
APP
T - GS= 0.39
APP
T - GS= 0.24
APP
T - GS= 0.15
(C-O-C)Éster
(O
-H)
(C=O)(C-H)
(O-H)
Figura 5.6. Espectros FTIR de A) almidón de maíz nativo (AN) y almidones propionizados
obtenidos en presencia de ácido tartárico (APT); y B) almidón de maíz pregelatinizado
(ANP) y almidones pregelatinizados propionizados obtenidos en presencia de ácido tartárico
(APPT).
Los espectros de las muestras de almidón modificado mostraron las bandas
características del polisacárido nativo (descriptas en detalle en el Capítulo 3), y nuevas
señales asociadas a las vibraciones de los grupos éster introducidos que evidenciaron
claramente que la reacción de esterificación tuvo lugar. La nueva señal más significativa
se observó alrededor de 1740 cm-1 (1739 cm-1 para APT y 1745 cm-1 para APPT); que
172
corresponde a la vibración de estiramiento del grupo carbonilo del grupo éster
introducido. La intensidad de esta nueva señal aumentó con el incremento del GS
principalmente en los almidones propionizados a partir de almidón nativo. La reacción
de esterificación también se confirmó por la aparición de una señal en 1205 cm-1,
atribuida a la vibración de estiramiento C─O─C de los grupos éster introducidos
(Lopez-Rubio et al., 2009). El aumento de la banda con la evolución del GS
previamente mencionado fue especialmente notable para almidones propionizados
obtenidos a partir de almidón nativo. Finalmente, los espectros de los almidones
propionizados evidencian un pequeño hombro adicional centrado en 2984 cm−1
atribuido a las vibraciones de estiramiento de los grupos C-H de los ésteres
introducidos.
5.2.2.3. MICROCOSPÍA ELECTRÓNICA DE BARRIDO
Se usó Microscopía Electrónica de Barrido para estudiar los efectos de la
propionización en la morfología e integridad de los gránulos de almidón de maíz nativo
y pregelatinizado en función del GS. La Figura 5.7 muestra las micrografías SEM del
almidón nativo y sus derivados luego de la propionización en presencia de ácido
tartárico. Como se muestra en la Figura 5.7, en la primera hora de reacción (Figura 5.7,
B), los gránulos de almidón mostraron un aspecto similar al AN (Figura 5.7, A), con
una estructura granular conservada. Sin embargo, en tiempos de reacción más
prolongados se evidenció la fusión y deformación progresiva de los gránulos y la
agregación de los mismos (Figura 5.7, D-F). La fusión/agregación de los gránulos de
almidón esterificados se ha atribuido previamente a la alteración parcial de la superficie
del gránulo como consecuencia del procedimiento de modificación química, así como a
la introducción de grupos de ésteres voluminosos que desorganizan la estructura interna,
y debilitan el gránulo (Singh, Kaur & Singh, 2004; Lopez-Rubio et al., 2009; Bello-
Pérez et al., 2010; Han et al., 2012).
173
Figura 5.7. Micrografías SEM del almidón de maíz nativo (AN) y almidones propionizados
obtenidos en presencia de ácido tartárico (APT – GS= 0.05 – 0.46).
Figura 5.8. Micrografías SEM del almidón de maíz pregelatinizado (ANP) y almidones
pregelatinizados propionizados obtenidos en presencia de ácido tartárico (APPT – GS= 0.15
– 0.69).
Con el sistema presentado en esta Tesis, los cambios progresivos observados
para los almidones propionizados con un nivel de sustitución creciente se consideran
una consecuencia no solo del mayor contenido de los grupos éster voluminosos
E) APPT - GS= 0.62 D) APPT - GS= 0.39
A) ANP B) APPT - GS= 0.15 C) APPT - GS= 0.24
100 μm
F) APPT - GS= 0.69
E) APT - GS= 0.36
A) AN C) APT - GS= 0.13
D) APT - GS= 0.29 F) APT - GS= 0.46
30 μm
B) APT - GS= 0.05
174
introducidos a la molécula de almidón, sino también al efecto del acilante ácido. Lo
anterior se refuerza con el hecho de que se ha informado previamente que los
reactivos/catalizadores ácidos pueden desorganizar la estructura cristalina de los
gránulos de almidón tras inducir la gelatinización del polímero (Cheetham & Tao, 1998;
Mei et al, 2015).
La Figura 5.8 muestra las micrografías SEM del almidón pregelatinizado y sus
derivados luego de la propionización en presencia de ácido tartárico. El almidón
pregelatinizado comercial se obtiene generalmente mediante un procedimiento de
secado que produce modificaciones fisicoquímicas de los gránulos de almidón. Este
proceso consiste básicamente en la dispersión de una pasta de almidón caliente entre
tambores, generando un producto floculado seco en forma de película delgada. Luego
de un proceso de molienda, el polvo obtenido es conocido como almidón
pregelatinizado que se caracteriza por no requerir un posterior calentamiento para
adquirir sus propiedades espesantes. Como se observa en la Figura 5.8 A, la
pregelatinización del almidón destruyó la estructura granular del almidón nativo. En su
lugar, se observó un material continuo sin partículas que confirma que todos los
gránulos de almidón se gelatinizaron durante el proceso (Majzoobi et al., 2011). La
pérdida de la estructura granular del almidón pregelatinizado y un aspecto similar al
ilustrado en la Figura 5.8 A fueron descriptos por otros autores (Anastasiades et al.
2002; Ratnayake & Jackson, 2007; Majzoobi et al., 2011).
Después de la reacción de propionización, y a partir de la adición de etanol al
vial de reacción finalizado el tiempo correspondiente, los almidones esterificados
obtenidos a partir de almidón pregelatinizado se recuperaron como agregados sin una
morfología particular (Figura 5.8, B-F).
5.2.2.4. DIFRACCIÓN DE RAYOS X
La Figura 5.9 recoge los resultados del efecto de la propionización sobre la
estructura cristalina de los almidones en función de su GS. Como se describió en el
Capítulo 3, el almidón de maíz nativo (Figura 5.9, A) mostró picos de difracción en
175
valores de 2θ de 15°, 17.0°, 17.8°, 19.8° y 22.7°, que en línea con el correspondiente
espectro de RMN 13C CP/MAS (Figura 5.3), indicaron un patrón tipo A característico
de los almidones de cereales (Ratnayake & Jackson, 2009).
Figura 5.9. Difractogramas de rayos X de A) almidones propionizados obtenidos a partir de
almidón de maíz nativo (AN) en presencia de ácido tartárico (APT), y B) almidones
propionizados obtenidos a partir de almidón de maíz pregelatinizado (ANP) en presencia de
ácido tartárico (APPT).
Como se muestra en la Figura 5.9 A, la intensidad de los picos cristalinos del
almidón de maíz nativo disminuyó con el incremento del grado de esterificación. El
fenómeno fue particularmente evidente para los valores de GS ≥ 0.13 en concordancia
Inte
nsid
ad
(u
.a.)
APT - GS= 0.46
APT - GS= 0.36
APT - GS= 0.29
APT - GS= 0.13
APT - GS= 0.05
AN
A)
10 15 20 25 30 35 40
ANP
ANP
- etanol
B)
Inte
nsid
ad (
u.a
.)
2(°)
APP
T - GS= 0.69
APP
T - GS= 0.62
APP
T - GS= 0.39
APP
T - GS= 0.24
APP
T - GS= 0.15
176
con las micrografías SEM (Figura 5.7) que evidenciaron una pérdida progresiva de la
forma poliédrica original de los gránulos. Los grupos hidroxilos del polímero nativo son
los responsables de formar enlaces de hidrógeno intermoleculares dentro de los
segmentos de amilopectina originando la formación de dobles hélices y generando la
estructura semicristalina del polímero nativo. Los cambios en los patrones de difracción
observados con el continuo aumento del GS en almidones propionizados a partir de
almidón nativo indicaron que el progresivo reemplazo de grupos hidroxilo por grupos
éster, sumado probablemente al efecto del ácido usado como acilante, afectaron
significativamente la interacción intermolecular por puente hidrógeno, reduciendo la
cristalinidad de los gránulos.
La Figura 5.9 B recoge los datos de DRX del almidón pregelatinizado original y
esterificado como ya se discutió. El proceso de gelatinización causa cambios
substanciales en el almidón granular debido a la reorganización de los puentes de
hidrógeno intra e intermoleculares entre las moléculas de agua y almidón, lo que
provoca el colapso o la interrupción de los órdenes moleculares (disociación de las
dobles hélices) dentro del gránulo de almidón (Freitas et al., 2004). En consecuencia, y
a diferencia del patrón observado para el almidón de maíz nativo granular mostrado en
la Figura 5.9 A; el almidón de maíz pregelatinizado produce un patrón altamente
amorfo, en el que solo se detectaron picos de difracción muy débiles en 2θ= 12.0°, 12.9°
y 18° (Figura 5.9 B).
Los patrones de difracción de rayos X de las muestras propionizadas a partir de
almidón pregelatinizado APPT evidenciaron un ligero aumento en la señal en 2θ=12.9°,
así como la aparición de un pico de difracción débil en 19.7°. Ambas señales podrían
indicar la contribución de estructuras de tipo V de hélice simple resultantes de la
formación de complejos de amilosa en almidones gelatinizados (Gidley & Bociek,
1988; Godet, Bizot & Buleón, 1995; Chang, He & Huang, 2013). Además de los
complejos de amilosa-lípidos originalmente presentes en el almidón pregelatinizado no
modificado, durante las operaciones de recuperación del producto con etanol, se podrían
haber formado complejos de amilosa-etanol que justificaran a las señales débiles típicas
de una estructura de tipo V presentes en los patrones de DRX correspondientes. Lo
anterior se corroboró al analizar el difractograma de una muestra de almidón
177
pregelatinizado comercial que fue calentada en agua a 96 °C y posteriormente
precipitada con etanol. En el difractograma correspondiente incluido en la Figura 5.9 B
como “ANP-etanol” se observa la aparición de la reflexión mencionada en 12.9° y 19.7°.
Estudios previos sobre el efecto de los complejos de amilosa sobre la
susceptibilidad enzimática de diferentes almidones concluyeron que la formación de
complejos de amilosa también reduciría la digestibilidad del almidón como
consecuencia del menor hinchamiento de los gránulos de almidón y el impedimento
estérico ejercido por los complejos (Crowe, Seligman & Copeland, 2000; Putseys et al.,
2010). De hecho, en una contribución reciente, Birt et al. (2013) denominaron al
complejo de amilosa como un quinto tipo de almidón resistente denominado AR5,
afirmando que cuando la cadena de almidón lineal está en una estructura helicoidal se
evita la unión y escisión del almidón por las α-amilasas.
5.2.3. CONTENIDO DE ALMIDÓN RESISTENTE
Por definición, y tal como se introdujo al inicio del capítulo, el almidón
resistente es la porción del almidón que no es hidrolizada por las enzimas humanas en el
intestino delgado e ingresa al intestino grueso donde es parcial o totalmente fermentado.
Generalmente se considera que el AR es uno de los componentes que componen la fibra
dietética total.
La presencia de una fracción de almidón que resiste la hidrólisis enzimática fue
reconocida por primera vez por Englyst, Wiggins & Cummins (1982). Este trabajo fue
extendido por Berry (1986), quien desarrolló un procedimiento para la medición de AR
incorporando el tratamiento de las muestras con α-amilasas y pululanasas empleado por
Englyst et al. 1982, pero omitiendo el paso de calentamiento inicial a 100 °C, para
simular las condiciones fisiológicas. En estas condiciones, el contenido de almidón
resistente medido de las muestras fue mucho mayor (Englyst & Cummins, 1985;
Englyst & Cummins, 1987).
178
A comienzos de la década de 1990 ya se conocía plenamente el significado
fisiológico del AR. A partir de allí se desarrollaron varios métodos nuevos o
modificaciones de los existentes durante el Programa Europeo de Investigación
EURESTA (Champ, 1992; Englyst, Kingman, & Cummings, 1992). El método de
Champ (1992) incorporó modificaciones al método de Berry (1986) y dio una medida
directa del AR. Básicamente, el tamaño de la muestra se incrementó de 10 mg a 100
mg, la muestra se digirió solamente con α-amilasa pancreática (sin pululanasa, a
diferencia de Englyst et al. (1982) y Berry (1986)); y las incubaciones se realizaron a
pH 6.9 (mayor respecto del pH de 5.2 utilizado por Englyst et al. (1982) y Berry
(1986)). Las determinaciones de AR se realizaron directamente sobre el pellet que
resistió la hidrólisis enzimática. Muir & O'Dea (1992) desarrollaron en el mismo año un
procedimiento en el que emplearon un tratamiento mecánico que simuló la masticación
de las muestras, las cuales se trataron con pepsina y luego con una mezcla de α-amilasa
pancreática y amiloglucosidasa (AMG) en un baño de agua con agitación a pH 5.0 y 37
°C durante 15 h. El sedimento residual (que contenía el AR) se recuperó mediante
centrifugación y se lavó, y el AR se digirió mediante una combinación de tratamientos
con calor, DMSO y una α-amilasa termoestable.
Más recientemente, estos métodos fueron modificados por Faisant et al. (1995);
Goñi et al., (1996); Akerberg et al. (1998) y Champ et al. (1999). Estas modificaciones
incluyeron cambios en las concentraciones de las enzimas empleadas, tipos de enzimas
utilizadas (todos usaron α-amilasa pancreática, pero se eliminó la pululanasa y, en
algunos casos, se reemplazó por AMG), pretratamiento de la muestra (masticación), pH
de la incubación, y la adición (o no) de etanol después de la etapa de incubación con α-
amilasa. Todas estas modificaciones tuvieron algún efecto en el nivel determinado de
AR. En la actualidad existen kits enzimáticos comerciales basados en los protocolos
descriptos optimizados.
A efectos de determinar el contenido de almidón resistente en los almidones
esterificados y potencialmente entrecruzados producidos en este capítulo, se seleccionó
un kit comercial indicado para determinar almidón resistente de la AOAC (AOAC
Official Method 2002.02; AACC Method 32-40.01 provisto por Megazyme). El método
se basa en incubar las muestras en un baño de agua con agitación con α-amilasa
179
pancreática y amiloglucosidasa durante 16 h a 37 °C, tiempo durante el cual se
solubiliza el almidón no resistente y se hidroliza a D-glucosa mediante la acción
combinada de las dos enzimas. La reacción se termina con la adición de un volumen
igual de etanol, y el AR se recupera como un sedimento en la centrifugación y se lava
dos veces más con etanol (50% v/v). Siguiendo el protocolo de este kit recomendado
para determinación de AR, el sedimento se disuelve en KOH 2 M agitando
vigorosamente en un baño de agua helada sobre un agitador magnético. Esta solución se
neutraliza y el almidón se hidroliza cuantitativamente a glucosa con AMG. La D-
Glucosa se mide con el reactivo de glucosa oxidasa/peroxidasa (GOPOD), y esta es una
medida del contenido de AR de la muestra. El almidón no resistente (almidón
solubilizado) se determina combinando el sobrenadante original y los lavados, ajustando
el volumen a 100 mL y midiendo el contenido de D-glucosa con GOPOD.
Sin embargo, al llevar adelante los pasos indicados en el kit se comprobó la
imposibilidad de solubilizar en KOH 2M los residuos (recuperados como pellet)
obtenidos luego de la hidrólisis enzimática. Este residuo corresponde a la fracción que
resistió la digestión enzimática. Shukri et al. (2015) tuvieron el mismo inconveniente
cuando intentaron determinar el contenido de almidón resistente en muestras de almidón
de trigo entrecruzado (fosforilado) usando el mismo kit provisto por Megazyme y
recomendado para la determinación de AR. En el trabajo mencionado, los autores
observaron la imposibilidad de solubilizar en KOH 2M la fracción de almidón
entrecruzado después de la digestión enzimática (16 h – 37 °C) por lo que no pudieron
cuantificar posteriormente el AR mediante digestión con AMG. Luego, los autores se
enfocaron en desarrollar un método adecuado para solubilizar la fracción de AR en
almidón de trigo entrecruzado (fosforilado - 0,4%). A tal fin, y tras varios intentos, se
propuso reemplazar la etapa de solubilización en medio de KOH 2M por dos
incubaciones consecutivas con α-amilasa termoestable durante 30 min a 100 ° C y pH
5.0. Finalmente, la determinación adecuada de AR con AMG se logró incubando
rápidamente a 50 ° C durante 1 hora a pH 5.0. Estos resultados son la base de un
método propuesto recientemente para cuantificar directamente, y con alta sensibilidad la
fracción de AR en alimentos que han sido fortificados con fibra dietética en forma de
almidón de trigo fosforilado (almidón entrecruzado) (Shukri et al., 2015). Por otra parte,
recientemente la AOAC ha presentado un nuevo kit de análisis de fibra dietética total
180
integrado rápido que incluye, ahora sí, la determinación de almidón resistente producto
del entrecruzamiento con grupos fosfatos, en contraposición con el kit anterior usado en
esta Tesis en donde la determinación en base a conversión a glucosa del AR4 estaba
restringida.
En este capítulo la limitación del kit original para la determinación de AR se
salvó llevando adelante los pasos presentes en el kit solo hasta la etapa de hidrólisis
enzimática inicial y recuperación del pellet insoluble conteniendo la fracción resistente
que se determinó por gravimetría. La cuantificación gravimétrica de AS es adecuada
solo para analitos libres de polisacáridos que no sean de almidón (Perera et al., 2010).
La utilidad de este procedimiento se verificó con una muestra control suministrada por
el proveedor de contenido nominal de AR de 45 % que con el método enzimático-
gravimétrico adaptado arrojó un valor de 44.6 ± 1.3.
5.2.3.1. CONTENIDO DE ALMIDÓN RESISTENTE EN ALMIDONES
PROPIONIZADOS
La bibliografía indica que la digestibilidad del almidón nativo se ve afectada por
el contenido de amilosa, tamaño del gránulo, arquitectura, patrón cristalino, grado de
cristalinidad, presencia de poros o canales en la superficie de los gránulos, grado de
polimerización y componentes del almidón (Tester & Karkalas, 2006; Noda et al.,
2008). Además, como ya se describió, la modificación química del almidón puede
afectar significativamente la velocidad y el grado de la digestibilidad del almidón en el
intestino delgado, dependiendo de la fuente del almidón, el tipo y grado de
modificación, y la extensión de la gelatinización del almidón/integridad de los gránulos
(Wolf, Bauer & Fahey, 1999; Sha et al., 2012; Shukri et al., 2015).
En esta sección se resumen los resultados de la evaluación del contenido de
almidón resistente en muestras de almidón de maíz propionizado con diferentes grados
de sustitución y con diferencias (previamente demostradas, Figura 5.1) en términos de
cristalinidad (APT y APPT).
181
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7
0
10
20
30
40
50
60 AP
T
APP
T
AN
ANP
AR
%
GS
Figura 5.10. Contenido de almidón resistente del almidón de maíz nativo (AN),
almidón de maíz pregelatinizado (ANP), y almidones propionizados en presencia de
ácido tartárico (APT y APPT, respectivamente).
La Figura 5.10 muestra el contenido de AR determinado para almidones no
modificados (AR= 0.62% y 0.48% para almidón de maíz nativo y pregelatinizado,
respectivamente) y muestras de almidón propionizado en función de su grado de
sustitución. El análisis de los datos de AR versus GS conduce a varias conclusiones. En
primer lugar, los datos confirmaron que bajo las condiciones de reacción elegidas, la
propionización/entrecruzamiento de almidones de maíz en presencia de ácido tartárico
podría aumentar significativamente su resistencia a la digestión, con valores de AR de
hasta 45%. El aumento del contenido de AR de los almidones esterificados se asocia
con un ataque estéricamente impedido de las enzimas digestivas causado por los
sustituyentes, al restringir éstos la formación del complejo enzima-sustrato y haciendo
que los enlaces vecinos sean resistentes a la degradación (Björck, Gunnarsson &
Østergård, 1989). En el colon, y en función de los resultados de bibliografía de otras
rutas de esterificación de almidones con AGCC, los ácidos esterificados serían
plausibles de ser liberados por esterasas y lipasas bacterianas ubicuas, entregando así el
AGCC específico y dejando el esqueleto de almidón residual disponible para la
182
fermentación posterior, aumentando luego también el total de niveles luminales de
AGCC (Topping & Clifton, 2001; Annison et al., 2003; Morita et al., 2005; Clarke et
al., 2007).
En segundo lugar, a partir de los datos incluidos en la Figura 5.10 para los
almidones propionizados (tanto nativos como pregelatinizados) con GS ≥ 0.1 se
encontró una correlación que se aproxima a lineal entre AR y GS, lo que sugiere que la
manipulación de las condiciones de reacción para modular el GS también permitiría
regular el contenido de AR de los almidones modificados resultantes. El aumento del
contenido de AR con el incremento del GS puede justificarse con un mayor efecto de
impedimento estérico a medida que se introduce un mayor número de grupos éster,
como lo han observado otros autores que se ocupan de la esterificación del almidón por
otras vías y con otros AGCC. Por ejemplo, en la acetilación de almidón de maíz con alto
contenido de amilosa, Pu et al. (2011) examinaron los efectos del GS en el contenido de
AR y los resultados indicaron que el contenido de AR aumentó con el incremento del
nivel de acetilación. El contenido de AR excedió el 90% cuando el GS fue mayor a 1.9,
y el contenido máximo de AR alcanzó casi el 100% cuando el GS fue 2.93.
Por último, la comparación de los resultados de contenido de AR en las muestras
propionizadas-entrecruzadas obtenidas a partir de almidón de maíz nativo semicristalino
(APT) y de almidón de maíz pregelatinizado (APPT) no evidencian un efecto substancial
de la cristalinidad del almidón con valores de AR que responderían prioritariamente al
GS de la muestra.
5.2.3.2. EXTENSIÓN A OTROS AGCC. EFECTO DE LA COCCIÓN EN
EL CONTENIDO DE ALMIDÓN RESISTENTE
En esta sección se evalúa si sería posible utilizar el método de esterificación
propuesto en la presente Tesis para la obtención de almidón resistente con otros AGCC,
específicamente grupos acetato como los incorporados al almidón en el Capítulo 3 y 4.
En este contexto, en la Figura 5.11 se muestran los valores de AR para las muestras de
almidón acetilado AAT obtenidas en presencia de ácido tartárico y caracterizadas
183
oportunamente en el Capítulo 3. Como comparación se incluyen los contenidos de AR
del almidón acetilado AANaOH y almidón de maíz nativo.
0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0
0
20
40
60
80
100 AN
AAT
AANaOH
AR
(%
)
GS
Figura 5.11. Contenido de almidón resistente del almidón de maíz nativo (AN),
almidón acetilado en presencia de ácido tartárico (AAT) y almidón acetilado obtenido
con NaOH como catalizador (AANaOH – control).
Los resultados resumidos en la Figura 5.11 muestran que la acetilación
organocatalítica también resultó útil para incrementar significativamente los contenidos
de AR en el almidón esterificado con grupos acetato. Hasta valores de GS cercanos a la
unidad los resultados indican que la resistencia en almidones acetilados-entrecruzados a
condiciones que simulan la digestión se incrementó con el nivel de modificación
alcanzado.
Los resultados resumidos en la Figura 5.11 también evidencian que la
acetilación de almidón en presencia de tartárico resultó en productos con contenidos de
AR significativamente superiores a los obtenidos para los almidones AANaOH (control
acetilados). Estos resultados dan cuenta de que la resistencia de los almidones AAT no
sólo proviene de la acetilación, sino que también habría un aporte significativo del
reticulado inducido por el ácido tartárico.
184
Hasta el momento se mostró la idoneidad de la vía de esterificación propuesta
empleando AGCC específicos (acetato y propionato) para producir almidones
modificados con contenidos incrementados de almidón resistente del tipo AR4. Sin
embargo, la mayor parte del almidón que consume el ser humano ha sufrido algún tipo
de procesamiento que generalmente implica el calentamiento en presencia de humedad,
con o sin fuerzas de cizalladura. Como ya se mencionó reiteradamente, durante el
procesamiento térmico, los gránulos de almidón se hinchan y gelatinizan. Como
resultado, el orden molecular del gránulo de almidón se destruye y el almidón se digiere
fácilmente debido al aumento de la accesibilidad de las enzimas digestivas al sustrato
redundando en valores de AR disminuidos (Eroglu & Buyuktuncer, 2017).
La reducción del contenido de AR en el almidón luego de su cocción depende de
una combinación de factores que incluyen características propias del almidón
(estructura cristalina, tipo y tamaño de gránulos), origen de la resistencia (tipo de AR),
así como de las condiciones de calentamiento como su tipo (hervor, al vapor, presión) y
el tiempo de cocción. Por ejemplo, el almidón de achira (AR2) en su estado crudo
presenta cantidades elevadas de AR (88 %). Sin embargo, una vez sometido a un
proceso de gelatinización a 100 °C por 5 min resulta en un contenido de AR de 23 %; y
en un tiempo extendido de calentamiento de 40 minutos el AR se reduce a 12.4 % en
condiciones de cocción que implican hervor. Es decir que la fracción resistente en el
almidón de achira se reduce entre el 74 y 86 % (Juansang et al., 2012). En almidones
modificados de tipo AR 4 también se ha observado una reducción de la fracción
resistente tras el procesamiento térmico, pero en menor medida que en el polímero
nativo. Juansang et al. (2012) evaluaron el contenido de AR en almidones de achira
modificados (acetilados GS= 0.06, entrecruzados con SMTP 0.2 % p/p, e
hidroxipropilados GS= 0.02) antes y después de su gelatinización. Los almidones
modificados presentaron contenidos altos de AR en su estado crudo (91 – 94 %), pero
cuando se cocinaron por 5 min a 100 °C el contenido de AR de los distintos almidones
se redujo rápidamente con el tiempo de gelatinización extendido. Por ejemplo, en el
caso de los almidones entrecruzados en 5 min de cocción el AR se redujo hasta 36.6 %
y en 40 min de cocción el AR se redujo hasta 19.8 %.
185
Con la finalidad de evaluar el efecto de la cocción sobre el contenido de AR de
las muestras AAT obtenidas en esta Tesis, a continuación se comparan los valores de
AR de las muestras crudas (AR) con los valores calculados de AR de las muestras luego
de ser sometidas a condiciones típicas de gelatinización (AR’, 30 min a 96 °C, Capítulo
3.2.2.1). Con este fin, y conociendo las masas evaluadas y cantidades de AR de cada
fracción (precipitado y film formado con el sobrenadante remanente de la cocción) se
estimó el contenido de AR del almidón modificado cocido (AR’) expresado como
porcentaje sobre la masa total de producto cocinado (Ecuación 5.1). En todos los casos,
el film generado a partir de la fracción gelatinizada (Figura 3.19) mostró un contenido
de AR nulo, propio de un almidón de maíz nativo tipo A que no ofrece prácticamente
resistencia y menos cocido, por lo que los cálculos del contenido de AR en el producto
cocinado se realizaron con la Ecuación 5.2:
(MP x ARP) + (MF x ARF) = M’ x AR’ (5.1)
0
AR’= (MP x ARP) / M’ (5.2)
donde: MP es la masa del precipitado que resiste la cocción, MF es la masa del film que
se genera con la fracción gelatinizada, M’ es la masa total de muestra recuperada (que
luego de ajustar el procedimiento de recuperación es ≈igual a M, la masa de AAT
ensayada), ARP es el contenido de almidón resistente de la fracción precipitada, ARF es
el contenido de almidón resistente del film (ARF ≈ 0). La Tabla 5.1 recoge los valores
del AR total de la muestra cocida (AR’) en comparación con el contenido inicial de AR
de la muestra cruda (AR) como función del GS. Se incluye también el AR de la fracción
precipitada que resiste la cocción (ARP).
186
Tiempo
(h)
GS ARP AR
(crudo)
AR’
(cocido)
1 0.24 51.1 23.9 15.6
2 0.40 71.5 48.2 27.4
3 0.97 87.5 82.1 56.4
4 1.63 92.9 90.2 83.7
5 1.87 97.4 89.6 88.9
6 1.97 96.0 90.7 88.6
Tabla 5.1. Contenido total de AR de las muestras de AAT crudas (AR) y cocidas (AR’).
De la Tabla 5.1 se observa que bajo las condiciones de calentamiento impuestas,
en las muestras obtenidas en las dos primeras horas de reacción (GS= 0.24 y 0.40) se
conservó más del 60 % de la fracción resistente luego de la gelatinización. Luego, con
el incremento del GS la fracción resistente preservada en las muestras AAT cocidas se
incrementó, con valores de AR para GS medios y altos que resultaron sumamente
estables frente a las condiciones de cocción impuestas. Estos resultados, que hablan una
vez más del comportamiento esperado en almidones entrecruzados, resultan interesantes
en vistas de la importancia de poder preservar la funcionalidad nutricional del
ingrediente luego de la cocción.
Por otro lado, la Tabla 5.1 también muestra explícitamente que la resistencia
porcentual del precipitado (ARP de las “cáscaras” observadas en el Capítulo 3) es
siempre superior a la de los gránulos de AAT enteros originales (AAT crudo, AR). Esto
resulta de que, como se discutió en el Capítulo 3, los grupos ésteres y el
entrecruzamiento se concentran en esa región, en comparación con el gránulo entero
que contiene su interior no modificado y por ende no resistente (recordar avance de
reacción en el Capítulo 3). De la misma manera, en la patente N° US 2006/0188631 A1
se emplea la gelatinización para disolver el interior de los gránulos de almidón
entrecruzados superficialmente con grupos fosfatos. La finalidad del proceso fue
eliminar la región interna no modificada del gránulo para así obtener un “concentrado”
resistente a la hidrólisis enzimática. Los autores de la patente propusieron el uso de
187
estos residuos resistentes en composiciones alimenticias con el propósito de incrementar
la fibra dietaria del producto elaborado (patente N° US 2006/0188631 A1).
5.2.4. UTILIDAD DE LOS ALMIDONES OBTENIDOS COMO
VEHICULIZANTES DE AGCC (Sattari Najafabadi, Nielsen & Hedemann, 2018)
Como se mencionó reiteradamente en este capítulo, la ventaja de los almidones
esterificados con AGCC está asociada a la posibilidad de utilizarlos como vehículos de
entrega del ácido graso específico en el colon. Si bien en el presente capítulo el interés
se centró en los almidones propionizados, el mismo método también fue ensayado
previamente en el grupo para la obtención de almidones butirilizados (Tupa et al., 2013)
en condiciones similares de reacción. Recientemente, y siguiendo estrictamente el
protocolo reportado en Tupa et al. (2013) para la obtención de almidones butirilizados,
un grupo especializado en Ciencia Veterinaria de la Universidad de Dinamarca obtuvo
un almidón butirilizado (GS=0.93) a partir de almidón con alto contenido de amilosa y
lo incluyeron en una dieta altamente proteica que fue suministrada a ratas para evaluar
principalmente el perfil metabolómico urinario y la composición de AGCC en el
intestino grueso (Sattari Najafabadi et al., 2018).
El experimento consistió en suministrar distintos tipos de dietas que se describen
en la Tabla 5.2 a un grupo de ratas por un período determinado siguiendo protocolos
aprobados por la inspección de Experimentos en Animales de Dinamarca y el Ministerio
de Alimentación, Agricultura y Pesca. Luego de un período de aclimatación, los
roedores fueron alimentados con las correspondientes dietas por 4 semanas, tiempo en
el cual se recolectaron las heces y la orina de los animales. Finalmente, las ratas fueron
sacrificadas y se les sustrajo la porción del ciego intestinal. El ciego intestinal es una
bolsa intraperitoneal situada en la primera porción del intestino grueso. Entre las
funciones del ciego intestinal se encuentran la absorción de agua y electrolitos,
comienzo de la formación de heces, y además alberga las bacterias que fermentan los
compuestos que no se digirieron en el intestino delgado.
188
Nombre de la
dieta Proteína
Tipo %
Grasa Almidón
butirilizado*
1. LPW Suero de leche 15% 19% 0%
2. LPM Carne cocida 15% 19% 0%
3. HPM Carne cocida 30% 19% 0%
4. HPM +
HAMSB
Carne cocida 30% 19% 10%
Tabla 5.2. Formulación de las dietas indicadas en Sattari Najafabadi et al. 2018. (*)
Almidón butirilizado (HAMSB, GS= 0.93) producido de acuerdo al método descripto por
Tupa et al. (2013), análogo al descripto en esta Tesis. LPW: dieta baja en proteína de suero,
LPM: dieta baja en proteína de carne, HPM: dieta alta en proteína de carne.
Del ciego intestinal y de las heces se determinaron las concentraciones de
butirato y ácidos orgánicos totales mediante cromatografía gaseosa; y de la orina se
obtuvo el perfil metabolómico urinario mediante cromatografía líquida de alta
resolución. La concentración de butirato en el ciego intestinal de los roedores que
consumieron la dieta 4 conteniendo el almidón butirilizado obtenido por la ruta en
estudio en presencia de ácido tartárico, fue significativamente superior (23 μmol/g peso
húmedo) que lo encontrado en el ciego intestinal de animales alimentados con las otras
dietas (6.4 – 12.1 μmol/g peso húmedo). La misma tendencia también fue reportada por
este grupo de investigación danés cuando suministraron a cerdos almidón butirilizado
obtenido por otra vía de esterificación (Nielsen et al., 2014). De esta manera, se
comprobó que la metodología descripta en esta Tesis efectivamente resultó adecuada
para vehiculizar el AGCC específico al colon.
El estudio realizado por este grupo danés se completa con un análisis de orina en
el que identificaron 51 metabolitos, a partir de los cuales fue posible hacer una
investigación exploratoria de la influencia de la fuente de proteína en las dietas, así
como de la inclusión del almidón butirilizado en la dieta altamente proteica (HPM +
HAMSB, dieta 4) sobre el perfil metabólico urinario. A partir del análisis de
metabolitos en orina los autores concluyeron que la inclusión del almidón butirilizado
(en la dieta altamente proteica) por la vía organocatalítica aquí propuesta tendría el
potencial de mejorar la salud del colon en función de: i) el incremento de la riboflavina
y ácido piridóxico, que se asocian con un menor riesgo de cáncer colorrectal; y ii) la
189
disminución de los niveles de poliaminas y piperidina (que presentan efectos negativos
sobre la salud colónica.
Finalmente, los autores también observaron que las ratas que recibieron la dieta
HPM + HAMSB (dieta 4 que incluía el almidón butirilizado) excretaron en mayor
medida en la orina ácido tartárico en comparación con el grupo HPM (dieta 3), que no
incluyó el polímero derivatizado. Estos resultados también confirman que más allá de
promoverse la incorporación de grupos éster específicos del acilante utilizado (acetilo,
propionilo y también butirilo, actuando el ácido tartárico como un catalizador según la
propuesta de Hafrén y Córdova, 2005), también parte del mismo α-hidroxiácido
esterifica y (según los resultados recopilados) entrecruza al almidón.
5.3. CONCLUSIONES DEL CAPÍTULO 5
Se sabe desde hace algunos años que la fermentación bacteriana en el colon de
humanos sanos del almidón resistente no digerido produce AGCC (principalmente
acetato, propionato y butirato), todos reconocidos por su acción colectiva para mantener
la función fisiológica normal del intestino grueso. Los almidones químicamente
modificados son fuente de almidón resistente debido a los nuevos enlaces introducidos
que no son reconocidos por las enzimas digestivas. Entre los almidones modificados
químicamente los almidones acilados con los AGCC objetivo son de especial interés, en
función de su demostrada capacidad para suministrar y liberar el AGCC esterificado
específico en el colon de los individuos que los consumen.
En este capítulo se usó el protocolo de esterificación no convencional de
almidones estudiado en el Capítulo 3 para producir almidones de maíz propionizados-
entrecruzados. Los productos se caracterizaron en términos de estructura química,
morfología, cristalinidad y contenido de almidón resistente. La evaluación de la fracción
resistente a la digestión de los almidones modificados indicó que la esterificación en
presencia de ácido tartárico ciertamente puede inducir resistencia en los almidones, una
fracción importante de la cual se mantiene después de la cocción. Los valores de
contenido de almidón resistente de los almidones modificados se incrementaron con el
190
GS de las muestras, y en el caso de los almidones propionizados se verificó que su
contenido no se vio afectado substancialmente por la cristalinidad del producto.
Finalmente, la idoneidad de la ruta de esterificación organocatalítica propuesta
en esta Tesis para producir almidones esterificados con AGCC que puedan liberarse en
el colon fue evaluada satisfactoriamente por Sattari Najafabadi et al., (2018) para
almidón butirilizado. Los autores demostraron la capacidad de entrega efectiva del
AGCC esterificado en el colon como resultado de evaluar las concentraciones de
butirato en el ciego intestinal de roedores que consumieron dietas conteniendo almidón
butirilizado obtenido por la vía propuesta. Por otro lado, el perfil metabolómico de la
orina de los roedores demostró que el AGCC entregado fue efectivo para disminuir la
producción de metabolitos potencialmente cancerígenos y aumentar la concentración de
metabolitos que se asocian con un menor riesgo de cáncer colorrectal. Si bien ya se
había reportado en la literatura la capacidad de entrega efectiva del AGCC esterificado
específico a partir del consumo de almidones acilados por otras rutas de esterificación,
la evaluación realizada por Sattari Najafabadi y colaboradores (2018) demuestra que la
esterificación organocatalítica sería también efectiva para tales propósitos.
Vale destacar por último que estos almidones modificados con AGCC distintos
del acetato y con GS variable no se encuentran aprobados aún para consumo humano,
por lo que sus aplicaciones potenciales (como la de los almidones propionizados y
butirilizados obtenidos por otras metodologías disponibles en la literatura) dependerán
por supuesto de la normativa que publiquen los organismos reguladores.
191
Capítulo 6
CONCLUSIONES GENERALES
192
193
6. CONCLUSIONES GENERALES
En el curso de la presente Tesis se utilizó una ruta no convencional catalizada
por ácido tartárico para la preparación de almidones esterificados con diferentes grados
de sustitución. Los resultados obtenidos confirmaron el rol del ácido tartárico en la
promoción de la incorporación de grupos acetilo en la molécula de almidón, pudiéndose
regular su contenido en función de variables tales como el tiempo de reacción y la carga
de catalizador.
Los ensayos de caracterización de los productos, por su parte, dieron cuenta de
los cambios en la estructura química, morfología, cristalinidad, estabilidad térmica y
polaridad del almidón que resultaron de la modificación química impuesta, y que fueron
a su vez función del nivel de modificación alcanzado. Por otro lado, ensayos indirectos
diseñados al efecto pusieron de manifiesto que en simultáneo con la incorporación de
grupos acetilo, tuvo lugar cierto grado de entrecruzamiento del almidón de parte del
ácido tartárico, cuya función no se limitó entonces a la de un catalizador de acetilación
típico. Adicionalmente, se determinó que la derivatización ocurre en forma heterogénea
en el volumen de los gránulos, dando lugar a estructuras tipo core-shell, con una cáscara
derivatizada resistente y sustancialmente hidrofóbica cuyo espesor aumenta con el nivel
de modificación, y un núcleo no modificado con las características del almidón nativo
de partida y que puede removerse fácilmente para generar estructuras huecas.
El conocimiento adquirido a partir del estudio realizado permitió seleccionar dos
aplicaciones concretas en las que los almidones doblemente modificados resultan de
interés. La primera de ellas fue la preparación de almidones acetilados-entrecruzados
para uso potencial como aditivo alimentario. La caracterización de estos almidones en
comparación con almidones meramente acetilados, confirmó que la ruta propuesta
permite obtener en una única etapa almidones con propiedades funcionales diferentes y
características de almidones acetilados-entrecruzados. Lo anterior se logra sin la
necesidad de utilizar catalizadores específicos, ni de operar a pHs alcalinos para el
reticulado del almidón que podrían inducir la saponificación de los ésteres introducidos.
194
La segunda aplicación estudiada para los almidones esterificados-entrecruzados
obtenidos estuvo asociada a la reconocida capacidad de los almidones modificados
químicamente para actuar como fuente de almidón resistente; a lo que en el caso de los
almidones esterificados con AGCC se suma su capacidad intrínseca de vehiculizar el
AGCC objetivo al colon. En este sentido, sumados a los almidones acetilados se
obtuvieron almidones propionizados en los que se pudo identificar el efecto de la
estructura y el grado de sustitución en las propiedades de los productos, entre ellos su
contenido de almidón resistente antes y después de la cocción. El estudio de resistencia
a la digestión in vitro realizado en esta Tesis se complementa con un estudio in vivo
realizado por otros autores, quienes testearon almidones butirilizados obtenidos por la
metodología aquí propuesta. En su estudio, los autores confirmaron la capacidad de los
almidones esterificados en presencia de ácido tartárico para vehiculizar el AGCC
esterificado específico al intestino grueso, y promover la disminución de metabolitos
potencialmente cancerígenos y el aumento de los metabolitos asociados a un menor
riesgo de cáncer colorrectal.
Globalmente, se puede concluir que en el marco del trabajo realizado se amplió
en forma significativa el conocimiento sobre la ruta de esterificación de polisacáridos
propuesta y aplicada en esta tesis a la obtención de almidones modificados; y que en
función de ello se pudo concretar un primer estudio general que sugiere su utilidad para
la obtención en forma sencilla de almidones acilados-entrecruzados con propiedades
distintivas de interés. La integración de la acilación y el entrecruzamiento de almidones
usando un agente reticulante de origen natural y de uso habitual en alimentos como es el
ácido tartárico, se presenta como una vía prometedora a seguir explorando.
En este sentido, como trabajo futuro que se desprende del estudio realizado
puede citarse el interés por la extensión de la ruta a otros acilantes, el ensayo de otros -
hidroxiácidos como catalizadores de la esterificación, la cuantificación del grado de
entrecruzamiento conferido a los almidones y la posibilidad de modularlo ajustando las
condiciones de reacción, la evaluación de los almidones acetilados-entrecruzados en lo
que respecta a su estabilidad en medios ácidos en los que se destacan los almidones
entrecruzados, y ahondar en los efectos de la cocción en el contenido de almidón
resistente de los almidones modificados.
195
ANEXOS
196
197
ANEXO I
4000 3600 3200 2800 2400 2000 1600 1200 800
Ab
so
rba
ncia
Número de onda (cm-1)
AAT - GS= 2.80
AAT - GS= 2.86
AAT - GS= 2.68
AAT - GS= 2.70
AAT - GS= 2.20
AAT - GS= 0.91
AAT - GS= 0.41
AN
(C-H3)
(O-H)
(C-O-C)
(C=O)
Figura A.1. Espectros FTIR de almidones acetilados en presencia de ácido tartárico (AAT)
preparados a partir de almidón nativo con 15 % HR. Se incluye también el espectro del
almidón nativo (AN).
10 15 20 25 30 35 40 45
AN
Inte
nsid
ad
(u.a
.)
2(°)
AAT- GS= 2.80
AAT- GS= 2.70
AAT- GS= 0.91
AAT- GS= 0.41
Figura A.2. Difractogramas de rayos X del almidón nativo (AN) y almidones acetilados en
presencia de ácido tartárico (AAT) preparados a partir de almidón nativo con 15 % HR.
198
0 100 200 300 400 500 600
0
20
40
60
80
100
Masa r
esid
ual (%
)
Temperatura(°C)
AN
AAT - GS= 0.41
AAT - GS= 0.91
AAT - GS= 2.20
AAT - GS= 2.70
AAT - GS= 2.68
AAT - GS= 2.86
AAT - GS= 2.80
Figura A.3. Curvas TG para el almidón nativo (AN) y almidones acetilados obtenidos en
presencia de ácido tartárico (AAT - GS= 0.41 – 2.86) preparados a partir de almidón nativo
con 15 % HR.
100 200 300 400 500 600
AN
AAT - GS= 2.80
AAT - GS= 0.41
AAT - GS= 2.86
AAT - GS= 2.68
AAT - GS= 2.70
AAT - GS= 2.20D
TG
Temperatura (°C)
AAT - GS= 0.91
Figura A.4. Curvas DTG para el almidón nativo (AN) y almidones acetilados obtenidos en
presencia de ácido tartárico (AAT - GS= 0.41 – 2.86) preparados a partir de almidón nativo
con 15 % HR.
199
ANEXO II
4000 3600 3200 2800 2400 2000 1600 1200 800
Absorb
an
cia
Número de onda (cm-1)
(O-H)
AN
6h - GSglobal
= 1.97
4h - GSglobal
= 1.63
3h - GSglobal
= 0.97
1h - GSglobal
= 0.24
6h - GSprecipitado
= 2.59
4h - GSprecipitado
= 2.21
3h - GSprecipitado
= 1.63
1h - GSprecipitado
= 0.83
(C-H3)
(C-O-C)(C=O)
Figura A.5. Espectros FTIR de los gránulos enteros (espectro azul) y de las cáscaras
correspondientes.
Figura A.6. Curvas DTG de los gránulos enteros (espectro azul) y de las cáscaras
correspondientes.
100 200 300 400 500 600
DT
G
Tempertura (°C)
Tmax2
= 382 °C
AN
6h - GSglobal
= 1.97
4h - GSglobal
= 1.63
3h - GSglobal
= 0.97
1h - GSglobal
= 0.24
6h - GSprecipitado
= 2.59
4h - GSprecipitado
= 2.21
3h - GSprecipitado
= 1.63
1h - GSprecipitado
= 0.83
200
201
NOMENCLATURA
AA Almidón acetilado obtenido en la reacción no catalizada
AANaOH Almidón acetilado obtenido en la reacción catalizada con NaOH
AAT Almidón acetilado obtenido en presencia de ácido tartárico
AGCC Ácido graso de cadena corta
AN Almidón de maíz nativo
ANP Almidón de maíz nativo pregelatinizado
AP Almidón propionizado obtenido en la reacción no catalizada
APPT Almidón pregelatinizado propionizado obtenido en presencia de
ácido tartárico
APT Almidón propionizado obtenido en presencia de ácido tartárico
AR Almidón resistente (original)
AR´ Almidón resistente de la muestra cocida
ARF Almidón resistente de la fracción gelatinizada que forma film
ARP Almidón resistente de la fracción precipitada que no gelatiniza
GS Grado de sustitución
HR Humedad relativa
PH Poder de hinchamiento
202
203
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.1. Micrografías obtenidas por Microscopía Electrónica de Barrido (por sus
siglas en inglés SEM) de gránulos de almidón de diferentes fuentes botánicas. Fuente:
Khalid, You, Liu, & Ali, 2017.
Figura. 1.2. Cadena abierta y estructura del anillo de piranosa de la D-glucosa. Fuente:
Thomas & Atwell, 1998.
Figura. 1.3. Molécula de amilosa. Fuente: Cui, 2005.
Figura. 1.4. Molécula de amilopectina. Fuente: Cui, 2005.
Figura 1.5. Representación esquemática de la estructura del gránulo de almidón: (a) un
gránulo con anillos de crecimiento amorfos y semicristalinos, (b) vista expandida de la
capa semicristalina de un anillo de crecimiento, (c) estructura de la amilopectina dentro
de la capa semicristalina. Fuente: Jacobs & Delcour, 1998.
Figura 1.6. Patrones de difracción de rayos X de distintos almidones: (A) tipo A típico
de los almidones de cereales, (B) tipo B de almidones de tubérculos, (C) tipo C de
almidones procedentes de leguminosas y semillas, (V) tipo V de complejo de amilosa
helicoidal. Fuente: Cui, 2005.
Figura 1.7. Esquema de la estructura típica de un almidón entrecruzado.
Figura 1.8. Representación de la reacción de acetilación de almidón con anhídrido
acético en condiciones alcalinas. Inicialmente se forma un complejo de almidón alcalino
que luego interactúa con el anhídrido carboxílico para formar un éster de almidón con la
eliminación del ion carboxilato y una molécula de agua. Fuente: Korma et al., 2016.
Figura 1.9. Organocatalizadores de polimerización por apertura de anillo y
transesterificaciones. Fuente: Domínguez de María, 2010.
Figura 1.10. Ácidos -hidroxicarboxílicos o α-hidroxiácidos de origen natural usados
como organocatalizadores para polimerizaciones por apertura de anillo y esterificación
de material celulósico. Fuente: Domínguez de María, 2010.
Figura 2.1. Equipo experimental para la esterificación organocatalítica de almidón de
maíz.
204
Figura 2.2. Equipo experimental para la hidrólisis enzimática de las muestras de
almidón (16 h – 37 °C).
Figura 3.1. Evolución de la acetilación de almidón de maíz A) almidón seco (10 g, HR
0.06%) y B) almidón húmedo (10 g, HR 15.0%). Valores de GS alcanzados en
presencia de ácido tartárico (AAT) y en la reacción no catalizada blanco (AA). 130 °C,
60 mL de anhídrido acético, 7.4 g ácido tartárico.
Figura 3.2. Espectro RMN 13C CP/MAS del almidón de maíz nativo.
Figura 3.3. Espectros RMN 13C CP/MAS del almidón de maíz nativo (AN) y almidón
acetilado en medio alcalino según Mark & Mehltretter (1972) (AANaOH - GS= 0.41).
Figura 3.4. Espectros RMN 13C CP/MAS del almidón de maíz nativo (AN) y almidones
acetilados con GS ≈ 0.40 (AANaOH - GS= 0.41, AAT - GS= 0.40).
Figura 3.5. Espectros RMN 13C CP/MAS del almidón de maíz nativo (AN) y almidones
acetilados (AANaOH - GS= 0.40; AAT - GS= 0.40, 0.97 y 1.63).
Figura 3.6. Espectros FTIR de almidones acetilados en presencia de ácido tartárico
(AAT). Se incluyen también los espectros de almidón nativo (AN) y almidón acetilado
en ausencia de catalizador alguno (AA) obtenido en 6 h de reacción.
Figura 3.7. Micrografías SEM del almidón nativo (AN) y almidones acetilados en
presencia de ácido tartárico (AAT - GS= 0.07 – 0.97). 2000X.
Figura 3.8. Difractogramas de rayos X del almidón nativo (AN) y almidones acetilados
en presencia de ácido tartárico (AAT).
Figura 3.9. Curva TG del almidón de maíz nativo.
Figura 3.10. Obtención de la Tonset extrapolada a partir de la curva TG del almidón de
maíz nativo.
Figura 3.11. Curva DTG del almidón de maíz nativo.
Figura 3.12. Curvas TG para almidón nativo (AN) y almidones acetilados obtenidos en
presencia de ácido tartárico (AAT - GS= 0.07 – 1.97).
Figura 3.13. Valores de Tonset (°C) en función del GS de las muestras AAT (GS= 0.07 –
1.97).
205
Figura 3.14. Curvas DTG para el almidón nativo (AN) y almidones acetilados
obtenidos en presencia de ácido tartárico (AAT - GS= 0.07 – 1.97).
Figura 3.15. Valores de Tmax1 y Tmax2 calculados para muestras de almidón nativo (AN)
y almidones acetilados obtenidos en presencia de ácido tartárico (AAT - GS= 0.07 –
1.97).
Figura 3.16. Área porcentual del segundo pico de descomposición de muestras de AAT
versus GS medidos por saponificación (GS= 0.07 – 1.97). Se incluyen los valores de A2
para las muestras de AANaOH (GS= 0.40 – 0.92).
Figura 3.17. Fotografía que muestra la distribución de los almidones de maíz nativo
(AN) y acetilados en presencia de ácido tartárico (AAT) con el incremento del GS en
mezclas bifásicas de agua destilada / éter de petróleo. Fotografía tomada
inmediatamente después de la agitación.
Figura 3.18. Ensayo de “disolución” de almidón acetilado en DMSO a 100 °C por 15
min. A) AAT – GS= 0.40, B) AANaOH – GS= 0.41.
Figura 3.19. A) Suspensión de almidón AAT sometida a condiciones de gelatinización,
B) muestra luego de la centrifugación, C.1) sobrenadante en bandeja para evaporación,
C.2) film seco producido (50 °C - 24 h), D.1) precipitado seco recuperado (antes de
molienda), D.2) precipitado recuperado en forma granular (micrografía SEM).
Figura 3.20. Masa recuperada (%) en la porción soluble y precipitados de muestras de
AAT obtenidas a distintos tiempo de reacción (1h - GS= 0.24; 2h – GS= 0.40; 3h – GS=
0.97; 4h – GS= 1.63; 5h – GS= 1.87; 6h – GS= 1.97).
Figura 3.21. Poder de hinchamiento de los gránulos de almidón luego de 1 h de
calentamiento a 55 °C de almidón de maíz nativo (AN) y muestras de AAT y de
AANaOH.
Figura 3.22. A) Almidón (AAT) previo a la gelatinización (GSglobal), B) suspensión de
almidón AAT sometida a condiciones de gelatinización, C) muestra luego de la
centrifugación, D) film seco producido (GSfilm), E) precipitado recuperado en forma
granular (micrografía SEM) (GSprecipitado).
Figura 3.23. Espectros RMN 13C CP/MAS del gránulo entero de AAT – 4 h (GSglobal=
1.63, espectro azul) y del precipitado de AAT – 3 h (GSprecipitado= 1.63, espectro verde).
Se incluye el espectro del almidón nativo (AN).
Figura 3.24. Micrografías SEM de A) el gránulo entero de almidón nativo y B-F) la
porción insoluble (recuperada como precipitado) de las muestras AAT luego de la
206
gelatinización. El valor de GS mostrado corresponde al de la muestra original (antes de
la gelatinización; es decir GSglobal). 5000X.
Figura 3.25. Micrografía SEM de almidón nativo microtomado.
Figura 3.26. Micrografías SEM de las partículas precipitadas de las muestras AAT
microtomadas. El valor de GS mostrado corresponde al de la muestra original (antes de
la gelatinización).
Figura 3.27. Micrografías SEM de las partículas precipitadas de la muestra AAT con
GSglobal= 2.86.
Figura 3.28. Propuesta del progreso de reacción (acetilación + entrecruzamiento) en
presencia de ácido tartárico dentro de los gránulos de almidón.
Figura 3.29. Difractogramas de rayos X de gránulos enteros (línea azul; 1h – GSglobal=
0.24, 3h – GSglobal= 0.97, 4h – GSglobal= 1.63, 6h – GSglobal= 1.97) y cáscaras de
muestras AAT (línea verde; 1h – GSprecipitado= 0.83, 3h – GSprecipitado= 1.63, 4h –
GSprecipitado= 2.21, 6h – GSprecipitado= 2.59).
Figura 4.1. Espectro RMN 1H del almidón de maíz nativo (AN), almidón acetilado (AA
– GS= 0.07) y almidón acetilado obtenido en presencia de ácido tartárico (AAT – GS=
0.06).
Figura 4.2. Espectro FTIR del almidón de maíz nativo (AN), almidón acetilado (AA –
GS= 0.07) y almidón acetilado obtenido en presencia de ácido tartárico (AAT – GS=
0.06).
Figura. 4.3. Micrografías SEM del almidón de maíz nativo (AN), almidón acetilado
(AA – GS= 0.07) y almidón acetilado obtenido en presencia de ácido tartárico (AAT –
GS= 0.06).
Figura 4.4. Difractograma de rayos X del almidón de maíz nativo (AN), almidón
acetilado (AA – GS= 0.07) y almidón acetilado obtenido en presencia de ácido tartárico
(AAT – GS= 0.06).
Figura 4.5. Micrografías de suspensiones (3% p/p) de almidón de maíz nativo (AN)
observadas a diferentes temperaturas de calentamiento. Las micrografías vistas bajo luz
polarizada se presentan a la derecha hasta los 72 °C, que es cuando los gránulos de AN
perdieron totalmente su birrefringencia.
Figura 4.6. Modelos de pastas de almidón. Adaptado de Matignon & Tecante (2017).
207
Figura 4.7. Micrografías de suspensiones (3% p/p) de almidón de maíz acetilado (AA)
observadas a diferentes temperaturas de calentamiento. Las micrografías vistas bajo luz
polarizada se presentan a la derecha hasta los 66 °C, que es cuando los gránulos de AA
pierden totalmente su birrefringencia.
Figura 4.8. Micrografías de suspensiones (3 % p/p) de almidón de maíz acetilado
obtenido en presencia de ácido tartárico (AAT) observadas a diferentes temperaturas de
calentamiento. Las micrografías vistas bajo luz polarizada se presentan a la derecha
hasta los 66 °C, que es cuando los gránulos de AAT pierden totalmente su
birrefringencia.
Figura 4.9. Poder de hinchamiento de gránulos de almidón de maíz nativo (AN),
almidón acetilado (AA), almidón acetilado obtenido en presencia de ácido tartárico
(AAT). Mediciones realizadas luego de 1 h de calentamiento a diferentes temperaturas.
Figura 4.10. Solubilidad (%) del almidón de maíz nativo (AN), almidón acetilado (AA)
y almidón acetilado obtenido en presencia de ácido tartárico (AAT). Mediciones
realizadas luego de 1 h de calentamiento a diferentes temperaturas.
Figura 4.11. Sinéresis del almidón de maíz nativo (AN), almidón acetilado (AA) y
almidón acetilado obtenido en presencia de ácido tartárico (AAT) evaluado durante 50
días.
Figura 4.12. Curvas de comportamiento de flujo de suspensiones al 10 % p/p
gelatinizadas para almidón de maíz nativo (AN), almidón acetilado (AA) y almidón
acetilado obtenido en presencia de ácido tartárico (AAT).
Figura 4.13. Comportamiento viscoelástico de las suspensiones al 10 % p/p
gelatinizadas para almidón de maíz nativo (AN), almidón acetilado (AA) y almidón
acetilado obtenido en presencia de ácido tartárico (AAT).
Figura 5.1. Evolución de la propionización de almidón de maíz nativo (APT) y de
almidón de maíz pregelatinizado (APPT) obtenidos en presencia de ácido tartárico y la
reacción no catalizada (AP) como blanco. 130 °C, 12 mL de ácido propiónico, 1 g de
ácido tartárico.
Figura 5.2. Ensayo de disolución de almidón propionizado APT (GS= 0.36) en DMSO a
100 °C por 15 minutos.
Figura 5.3. Espectros RMN 13C CP/MAS del almidón de maíz nativo (AN) y almidón
de maíz pregelatinizado (ANP).
208
Figura 5.4. Espectros de RMN 13C CP/MAS del almidón de maíz nativo (AN) y
almidón de maíz pregelatinizado (ANP). Zoom en la región de 50 - 110 ppm.
Figura 5.5. Espectros de RMN 13C CP/MAS de almidones de maíz no modificados (AN
y ANP) y almidones propionizados en presencia de ácido tartárico (APT – GS= 0.36 y
APPT – GS= 0.62) obtenidos en 4 h.
Figura 5.6. Espectros FTIR de A) almidón de maíz nativo (AN) y almidones
propionizados obtenidos en presencia de ácido tartárico (APT); y B) almidón de maíz
pregelatinizado (ANP) y almidones pregelatinizados propionizados obtenidos en
presencia de ácido tartárico (APPT).
Figura 5.7. Micrografías SEM del almidón de maíz nativo (AN) y almidones
propionizados obtenidos en presencia de ácido tartárico (APT – GS= 0.05 – 0.46).
Figura 5.8. Micrografías SEM del almidón de maíz pregelatinizado (ANP) y almidones
pregelatinizados propionizados obtenidos en presencia de ácido tartárico (APPT – GS=
0.15 – 0.69).
Figura 5.9. Difractogramas de rayos X de A) almidones propionizados obtenidos a
partir de almidón de maíz nativo (AN) en presencia de ácido tartárico (APT), y B)
almidones propionizados obtenidos a partir de almidón de maíz pregelatinizado (ANP)
en presencia de ácido tartárico (APPT).
Figura 5.10. Contenido de almidón resistente del almidón de maíz nativo (AN),
almidón de maíz pregelatinizado (ANP), y almidones propionizados en presencia de
ácido tartárico (APT y APPT, respectivamente).
Figura 5.11. Contenido de almidón resistente del almidón de maíz nativo (AN),
almidón acetilado en presencia de ácido tartárico (AAT) y almidón acetilado obtenido
con NaOH como catalizador (AANaOH – control).
Figura A.1. Espectros FTIR de almidones acetilados en presencia de ácido tartárico
(AAT) preparados a partir de almidón nativo con 15 % HR. Se incluye también el
espectro del almidón nativo (AN).
Figura A.2. Difractogramas de rayos X del almidón nativo (AN) y almidones acetilados
en presencia de ácido tartárico (AAT) preparados a partir de almidón nativo con 15 %
HR.
209
Figura A.3. Curvas TG para el almidón nativo (AN) y almidones acetilados obtenidos
en presencia de ácido tartárico (AAT - GS= 0.41 – 2.86) preparados a partir de almidón
nativo con 15 % HR
Figura A.4. Curvas DTG para el almidón nativo (AN) y almidones acetilados obtenidos
en presencia de ácido tartárico (AAT - GS= 0.41 – 2.86) preparados a partir de almidón
nativo con 15 % HR.
Figura A.5. Espectros FTIR de los gránulos enteros (espectro azul) y de las cáscaras
correspondientes.
Figura A.6. Curvas DTG de los gránulos enteros (espectro azul) y de las cáscaras
correspondientes.
210
211
LISTA DE TABLAS
Tabla 1.1. Contenido aproximado de amilosa y amilopectina en distintos tipos de
almidón. Fuente: Thomas & Atwell, 1998.
Tabla 1.2. Parámetros de gelatinización del almidón (en exceso de agua) obtenidos por
DSC. Fuente: Ratnayake & Jackson, 2009.
Tabla 1.3. Procesos de modificación química de almidones más comunes. Fuente:
Singh et al., 2007.
Tabla 3.1. Valores de GSglobal, GSfilm, y GSprecipitado de las muestras AAT.
Tabla 3.2. Rango de espesores de las cáscaras de almidón AAT – GS= 0.24 – 1.97.
Tabla 3.3. Masa de acetilos total de muestras AAT (Entero original) y masa de acetilos
total remanentes luego de la gelatinización (Entero P+F).
Tabla 4.1. Temperaturas de inicio, de pico y final (To, Tp y Tf) y entalpía de
gelatinización (ΔH) del almidón nativo y almidones de maíz modificados. Los valores
informados corresponden al promedio ± desviación estándar. Relación almidón:agua fue
de 1:3.
Tabla 4.2. Claridad de la pasta de almidón de maíz nativo (AN), almidón acetilado
(AA) y almidón acetilado obtenido en presencia de ácido tartárico (AAT). Mediciones
realizadas el mismo día de preparación.
Tabla 4.3. Claridad de la pasta del almidón de maíz nativo (AN), almidón acetilado
(AA) y almidón acetilado obtenido en presencia de ácido tartárico (AAT). Mediciones
realizadas 7 días después de que las muestras hayan sido almacenadas a 4 °C.
Tabla 4.4. Comportamiento reológico rotacional de suspensiones gelatinizadas al 10%
p/p del almidón nativo AN y almidones acetilados AA y AAT.
Tabla 5.1. Contenido total de AR de las muestras de AAT crudas (AR) y cocidas (AR’).
Tabla 5.2. Formulación de las dietas indicadas en Sattari Najafabadi et al. 2018. (*)
Almidón butirilizado (HAMSB, GS= 0.93) producido de acuerdo al método descripto
por Tupa et al. (2013), análogo al descripto en esta Tesis. LPW: dieta baja en proteína
de suero, LPM: dieta baja en proteína de carne, HPM: dieta alta en proteína de carne.
212
213
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