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EL USO DE NUEVAS TECNOLOGÍAS DE LA GENÓMICA PARA DEFENDER NUESTROS CULTIVOSCÉSAR AUGUSTO MEDINA CULMA, ADRIANA JIMENA BERNAL GIRALDO

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52 Hipótesis, apuntes científicos uniandinos, número especial, 2013

César Augusto Medina CulmaBiólogo, estudiante de doctorado en Ciencias Biológicas de la Universidad de los [email protected]

Adriana Jimena Bernal GiraldoPh. D., profesora asociada del Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad de los [email protected]

la biología está viviendo una era revolucionaria. Hasta hace una década, obtener la secuencia del genoma de un organismo (la serie entera de instrucciones genéticas para construir ese organismo) era aún una tarea que muy pocos laboratorios del mundo podían realizar. Hoy en día no solo es posible, sino que se ha masificado a tal nivel esta práctica que al público general se le vende la idea de secuenciar su genoma por tan solo mil dólares. esta in-formación puede ser usada para diagnosticar problemas de salud originados a nivel genético, como la predisposi-ción a enfermedades como la diabetes y la obesidad.

También nos hemos dado a la tarea de descifrar la secuencia de aDn de los millones de microor-ganismos que habitan en nuestro cuerpo para determinar su importancia para nosotros. esto ha sido posible por una disminución en más de cien mil veces el costo por cada posición secuen-ciada del aDn [1]. la meta de los mil dólares está por cumplirse, y este logro se debe princi-palmente a la fuerte competencia entre tecnologías de secuenciación [2], que fue originalmente impulsada por la medicina, pero que ahora tiene repercusiones en todas las áreas de la biología.

esta tendencia hacia la genómica viene desde los años cincuenta del siglo XX, cuando Watson y crick reportaron la estructura de doble hélice del aDn, con lo que elucidaron el papel central de esta molécula en el almacenamiento genético de la información. sin embargo, no fue sino hasta 1977 que sanger y sus colaboradores desarrollaron el método que reinó durante déca-das y que permitió obtener los primeros genomas completos. Mediante la tecnología sanger se secuenció el genoma humano a finales del siglo XX y genomas de decenas de organismos simples, y de un menor número de organismos complejos. sin embargo, el primer genoma hu-mano tardó décadas en conocerse, porque esta tecnología solo permitía obtener la secuencia de mil nucleótidos (letras del instructivo genético) a la vez (figura 1), y el genoma humano tiene aproximadamente tres mil millones de estos nucleótidos. Posteriormente se logró realizar 96 de estos procesos de manera simultánea, con lo que disminuyó aproximadamente en cien veces el tiempo requerido para obtener la secuencia de un genoma completo. no obstante, esta tecnología tenía limitantes en velocidad, escalabilidad (no fue posible paralelizarla mucho más allá), resolución y rendimiento. estos problemas han sido resueltos gracias a una revolu-ción tecnológica ocurrida en la última década con el surgimiento de las nuevas tecnologías de secuenciación (ngs, por sus siglas en inglés) (figura 1).

las ngs se basan en la complementariedad de un fragmento de aDn. así, a un nucleótido tipo a se le pega siempre uno tipo T, y a un nucleótido tipo c se le pega siempre uno tipo g.

El uso de nuevas tecnologías de la genómica para defender nuestros cultivos

Universidad de los Andes, Facultad de ciencias 53

esto permite que se emita una señal, por ejemplo, luz de un color específico, dependiendo del nucleótido unido, a medida que se va resintetizando el fragmento de aDn molde. en principio el método es igual al usado por sanger, pero la clave está en que las técni-cas de ngs permiten leer las señales de forma rápida y masiva (millones a la vez) al ir sintetizando la copia del aDn. Para ello, el aDn genómico de un organismo se corta en pequeños pedazos para conformar una librería de fragmentos que se secuencian uni-forme y agudamente millones de veces en reacciones paralelas, con lo cual se generan lecturas que pueden ser ensambladas en un computador. esto sería como tener un libro de muchas páginas sueltas y desordenadas, que el computador ordena empatando las palabras y oraciones de una página con otra contigua. el progreso que han generado las ngs es análogo a la diferencia que hay entre los primeros computadores de tarjetas y los computadores de última generación. Una de las grandes ventajas de estas nue-vas técnicas de secuenciación es la capacidad de obtener una gran cantidad de datos de manera barata y rápida (figura 1). estas características han producido importantes avances científicos y creado una revolución que ha tocado incluso áreas que tradicio-nalmente se quedaban rezagadas con respecto a la medicina.

Una de las áreas que se han visto afectadas profundamente con este avance en las tecnologías de secuenciación es la fitopa-tología, una ciencia que estudia las enfermedades de las plan-tas e intenta mejorar las probabilidades de supervivencia ante ataques de microorganismos parasíticos, con el fin de proteger la seguridad alimentaria de humanos y animales [3]. Histórica-

mente las plantas se han visto afectadas por diferentes orga-nismos patógenos, como hongos, virus y bacterias que causan enfermedades y grandes pérdidas en la agricultura. Uno de los ejemplos más notables es el de la hambruna irlandesa, causa-da por el devastador fitopatógeno Phytophthora infestans, que cambió la historia de ese país y que fue la causa directa de una migración masiva hacia estados Unidos en el siglo XiX. Recien-temente, a partir de muestras de herbario, y con el uso de ngs, se determinó cuál era el linaje del P. infestans que causó esa hambruna [4]. sorprendentemente, con base en las secuencias obtenidas se encontró que un solo linaje genético (una población genéticamente uniforme) de este patógeno fue responsable de la hambruna, y esto se debió a un fenómeno aún frecuente en nuestra agricultura: la población de plantas de papa sembradas en irlanda para alimentar a la mayoría de las personas era gené-ticamente demasiado uniforme. en otras palabras, si una planta de papa era susceptible al patógeno, todas las plantas del país lo serían, porque todas eran genéticamente iguales.

lo mismo sucede del lado del patógeno: cuando la población de un patógeno es muy diversa en determinada región o en el mundo es mucho más probable que dicho patógeno se adapte a métodos de control usados comúnmente, como variedades resistentes de plantas o la aplicación de un químico (fungicida o bactericida) que funcione para disminuir las poblaciones de patógenos que pueden causar enfermedades. Por esta razón, medir la diversidad de un fitopatógeno en una región o a nivel mundial es de primordial importancia para predecir la durabili-

Figura 1. Plataformas actuales de secuenciación. La gráfica muestra las plataformas existentes en el mercado para la secuenciación de genomas. En el eje x se encuentra la longitud de las lecturas, en el eje y la cantidad de información en gigabases por corrida, y entre paréntesis, el año de liberación al mercado de la plataforma. Fuente: imagen modificada de [8].

Avances en el secuenciación de alto rendimiento

Solid (2006)

PGM (2010)

GA (2004)

Longitud de la lectura (escala logarítmica)

1.000

100

10

1

0,1

0,01

0,001

0,0001

0,00001

Giga

base

s po

r cor

rida

(esc

ala lo

garít

mica

)

10 100 1.000 10.000

GS FLX (2008)

Sanger (1977)

PacBio RS (2010)GS Junior (2009)

MiSeq (2011)

Proton (2012)

HiSeq (2010)


Figura 2. Importancia del Xam en los cultivos de yuca. Arriba: campo con yuca antes de la aparición de CBB; abajo, pérdida en el cultivo causada por CBB. Fuente: foto cortesía de César Trujillo, LAMFU.


dad de un método de control en el campo. Y con las ngs ahora tenemos la capacidad de medir esta diversidad del modo más exacto: podemos tener la identidad de cada nucleótido en su genoma, y así diferenciar aislamientos muy cercanos que, por los métodos anteriormente usados, no podían diferenciarse.

ASEGURANDO ALIMENTO PARA MUCHAS PERSONAS

nuestro grupo investiga los mecanismos moleculares de ataque de la bacteria fitopatógena Xanthomonas axonopodis pv. mani-hotis (Xam), que causa la enfermedad bacteriana más importante en la yuca, la bacteriosis vascular (cbb, por sus siglas en inglés), así como los mecanismos de defensa de la planta, en estrecha colaboración con el grupo Manihot biotec de la Universidad nacio-nal de colombia. esta investigación surge de la necesidad de los países en desarrollo de proteger su seguridad alimentaria, ya que la yuca es el cuarto producto básico más importante en la dieta de más de mil millones de personas, y Xam ha sido una bacteria que ha arrasado con cultivos enteros y se ha convertido en un serio problema para los agricultores de todo el mundo (figura 2) [5]. De esta manera, todos los aportes en conocimiento sobre cómo ge-nerar plantas que sean resistentes a la enfermedad posibilitarán la seguridad alimentaria de millones de personas.

Recientemente participamos en la secuenciación del genoma entero de 65 cepas de Xam colectadas en diez países de tres continentes —américa, asia y África— en los que la produc-ción de yuca es de gran importancia. además del diverso ori-gen geográfico, las cepas bacterianas presentaban una gran diferenciación temporal, ya que fueron colectadas entre 1941 y 2011 (figura 3) [6]. el estudio se realizó mediante un plan

de colaboración internacional financiado por la national science Foundation, y en el mismo estuvieron involucrados científicos de la Universidad de los andes, de la Universidad de california, de berkeley, y del instituto Federal de Tecnología (eTH), de suiza. Un proyecto masivo como este, que abarca la secuenciación del genoma de tal número de cepas no se había visto antes en el área de la fitopatología, y marca un hito en el estudio epidemio-lógico de enfermedades vegetales que se han visto rezagados con respecto a los enfocados en las enfermedades humanas.

EL SISTEMA INMUNE DE LAS PLANTAS

Para entender la importancia de este estudio es necesario en-tender, primero, cómo atacan los patógenos a las plantas, cómo estas se defienden de los ataques y cómo evolucionan estas interacciones (figura 4). las plantas son capaces de diferenciar lo “propio” y lo “no propio”, y de atacar lo “no propio”, de forma similar a como lo hacen los animales. sin embargo, a pesar de no producir anticuerpos contra un patógeno específico, como ocurre en los vertebrados, las plantas tienen un sistema inmu-ne innato que reconoce patrones moleculares asociados a mi-croorganismos (MaMP, por sus siglas en inglés). los MaMP son moléculas conservadas en grandes grupos de microorganismos, pero que no son expresados por la misma planta, como, por ejemplo, el flagelo bacteriano o componentes de la pared celular bacteriana. Tras reconocer estos componentes “no propios”, las plantas desencadenan una respuesta de defensa que limita el crecimiento del patógeno y, en consecuencia, detiene la enfer-medad. esta parte de la inmunidad innata en plantas es muy parecida a la inmunidad innata en animales. Por esta razón, la mayoría de plantas es resistente al amplio rango de patógenos

Figura 3. Representación geográfica y temporal de las diferentes cepas secuenciadas de Xam. Los puntos representan el número de cepas obtenido por país, y el color representa el año de colecta. NR: No hay registro. Fuente: tomado de [6].

Colombia

Brasil

Venezuela

Congo

Camerún

Nigeria Tailandia

Indonesia

Togo

Uganda

R. D. del Congo

Key

NR 1941 1965 1973 1974 1976 1978 1980 1982 1984 1987

1988 1989 1995 1997 1998 2004 2006 2007 2009 2010 2011


existentes en la naturaleza, y la fitopatología estudia las excep-ciones en donde se da la enfermedad.

en estas “excepciones” que son las enfermedades, los patógenos son exitosos en suprimir el primer nivel de defensa que reconoce MaMP mediante proteínas que son inyectadas a la planta, y que son llamadas proteínas efectoras, porque son las que realmen-te efectúan la manipulación de la célula vegetal en beneficio del patógeno. en este proceso coevolutivo y de carrera armamen-tista con los patógenos, las plantas han desarrollado una rama de inmunidad más específica y más fuerte, que reconoce estas proteínas efectoras. estas ingresan en la célula vegetal y desen-cadenan una respuesta de defensa aún más fuerte y eficiente que la primera, lo que hace a la planta resistente. las proteínas de la planta responsables de este reconocimiento son guardianas que protegen las células vegetales y se denominan proteínas R (por re-sistencia). este sistema inmune vegetal explica, en gran parte, por qué se habla de variedades resistentes y susceptibles de arroz, yuca o fríjol a determinadas enfermedades (las primeras tienen proteínas R eficientes para ese patógeno, y las últimas, no).

Dado que esta carrera armamentista no tiene fin, el patógeno más exitoso será aquel que logre evadir o suprimir el reconoci-miento que puedan hacer de sus proteínas efectoras las plantas que tienen proteínas R. esto se puede dar por cambios o mu-taciones en los genes efectores del patógeno. esto “rompería” la resistencia en unos pocos años, y esa planta que se vendió como planta resistente será susceptible, porque la población del patógeno ha cambiado. ¿Qué tan rápido se rompe esta resisten-cia? Depende de qué tan importante es la proteína efectora para el bienestar del patógeno. si dicha proteína es muy importante para mantener al patógeno vivo, las poblaciones de bacterias que pierdan la función de esta proteína, por mutaciones en ella, no podrán sobrevivir en el campo, aun cuando la pérdida de función le ayude al patógeno a no ser reconocido por la planta. en este caso, la resistencia de la planta será muy durable en el tiempo. si esa proteína no es tan esencial, el hecho de tener la planta una proteína R que la reconozca ejercerá una presión tremenda de selección para bacterias que tengan mutaciones dentro de ella. así, podemos hacer la pregunta inversa y dejar que los patógenos la respondan: ¿cuáles de esas proteínas se mantienen en el patógeno incambiables a lo largo del tiempo y a través de distancias geográficas grandes? es muy probable que esas proteínas que no cambian sean las más esenciales, y hacia ellas debemos dirigir los esfuerzos de encontrar proteínas R en la planta, para que esa resistencia sea realmente durable.

con los 65 genomas obtenidos de cepas de Xam de todo el mun-do a lo largo de varias décadas se pudo responder a esta pregunta de manera muy rápida. se determinó que las diferentes cepas bacterianas de Xam presentan entre 14 y 22 efectores, y que mu-chas de ellas tenían efectores pseudogenes (genes con uno o más codones de parada dentro de su secuencia), de lo que se puede inferir que no son funcionales. estos últimos probablemente no

Figura 4. Sistema inmune vegetal compuesto por receptores en la membrana celular que reconocen MAMP y desencadenan una cascada de señales que produce activación de genes de defensa. Por su lado, la bacteria inyecta los efectores que van a bloquear la cascada de señales, pero la planta tiene proteínas R que van a bloquear esos efectores, con lo que se encenderán de nuevo las señales de defensa.Fuente: elaboración de los autores.

Figura 5. Figura representativa de la translocación de un efector TAL por el sistema de secre-ción tipo tres hasta el núcleo de la célula vegetal donde induce la expresión de genes blanco específicos.Fuente: elaboración de los autores.

MAMP

Efectores

Genes R reconociendo a los efectores

Encendido de respuesta inmune

Efectores bloqueando la señal de defensa

Célula vegetal

Transcrito

Efector TAL

Núcleo


son un buen blanco para encontrar proteínas R para ellos, pues las cepas los tienen mutados, y aún así son exitosas en el campo. Por otro lado, con estos genomas sabemos también que hay nueve efectores que se mantienen constantes en estas poblaciones, y estamos generando estrategias para encontrar proteínas R que los reconozcan en la yuca y otras plantas, para así generar plantas de yuca con resistencia durable a esta enfermedad y con una resistencia que funcione en muchas regiones de cultivo de yuca.

VOLVIENDO A LA EDAD DE PIEDRA

las tecnologías ngs nos han permitido, entonces, conocer gran parte de las proteínas que usan este y otros patógenos para causar enfermedad, y buscar estrategias para generar plantas eficientes y resistentes por mucho tiempo. las ngs son masi-vas, rápidas y paralelizadas, y nos permiten obtener una gran cantidad de datos en muy poco tiempo. estas bacterias se se-cuenciaron en pocos meses, y la secuenciación se maximizó hasta el punto de obtener la secuencia del genoma de entre 19 y 30 aislamientos de Xam en un solo carril de illumina, en el cual antiguamente se obtenía un genoma por vez. sin embargo, es casi imposible obtener un genoma entero con estas tecnologías. Una de las razones son las secuencias repetidas y repetitivas que existen en todos los genomas, aunque en algunos orga-nismos más que en otros. esto se debe a que las ngs obtie-nen muchas lecturas de corta longitud, y si existe más de una lectura con la misma secuencia repetitiva es difícil alinearlas y determinar cuántas repeticiones existían o qué tan larga era esa secuencia. en conclusión, las ngs no funcionan para regiones con repeticiones en los genomas.

Tal vez los efectores más importantes en Xanthomonas son las llamadas Tal (sigla del término inglés transcriptional activator-like proteins). estos efectores tienen secuencias repetitivas de gran importancia para su funcionamiento. las Tal son proteínas que no solo se inyectan en el citoplasma de las células de yuca durante la infección, sino que entran en el núcleo y activan la expresión de genes de una manera muy precisa, tal y como lo hacen los factores de transcripción nativos de la yuca. la diferencia es que la activación de genes por los Tal es ventajosa para la bacteria. así pues, los Tal son como caballos de Troya que manipulan la célula vegetal para que la bacteria pueda multiplicarse y causar enfermedad usando mecanismos que parecerían amigables para la planta (la activación de la transcripción). Para hacer esto, los Tal tienen unas repeticiones en la región central que hacen que la proteína se una específicamente a una secuencia de aDn y “prenda” ese gen para transcripción. la secuencia de estas repe-ticiones es lo que hace que un Tal active un gen y no otro, y es lo que diferencia un Tal de otro que cumpla otro papel, pues estas repeticiones actúan de manera muy específica (figura 5). Tanto que ahora, y con algunas modificaciones, prometen ser la pana-cea en la edición de genomas humanos y de otros organismos [7]. Debido a la importancia de estos efectores en la virulencia y en la identificación de genes R, era prioritario determinar cuántos

efectores Tal existían en cada cepa secuenciada y cuál era el número de repeticiones, aunque la secuenciación del genoma no fuera de gran utilidad. Para identificar el número de efectores Tal en las cepas de Xam se debieron usar técnicas “arcaicas” de biología molecular, como el southern blot, que permite iden-tificar el número y tamaño aproximado de los efectores Tal en todo el genoma y generar bibliotecas genómicas y secuencia-ción por la técnica clásica de sanger. así, no fue posible encon-trar el repertorio de Tal de todas las 65 cepas de Xam, sino tan solo de 10 cepas, y con un esfuerzo mucho mayor que el que se requirió para caracterizar el resto del genoma de estas cepas.

en conclusión, con estas investigaciones se demostró que la era de la genómica de poblaciones en fitopatología ha empezado con pie firme mediante el uso de ngs. estas tecnologías nos han permitido encontrar el repertorio de efectores y otros genes im-plicados en virulencia de un alto número de cepas de cualquier patógeno, de manera rápida y relativamente económica, lo que nos ha posibilitado revolucionar los estudios en fitopatología que se venían realizando hasta el momento. adicionalmente, la identi-ficación de los efectores más conservados entre diferentes cepas bacterianas permitirá enfocarse en ellos para encontrar proteínas R que sirvan para las diferentes cepas de determinado patógeno en cualquier parte del mundo, lo que facilitará generar en plantas una resistencia durable a los patógenos. Por último, la combina-ción de técnicas de secuenciación de nueva generación y biología computacional, sin olvidar las propias de la biología molecular clásica, marcan una nueva manera de encontrar resistencias en cultivos y permiten vislumbrar el futuro de la fitopatología en la era postgenómica como un área que puede aportar soluciones a problemas de seguridad alimentaria mundial. •

REFERENCIAS

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