toxinas marinas
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Toxinas Marinas: Química, Toxicidad, Casos y Detección, con especial referencia al caso Danés.
Arjen Gerssen 1,*, Irene E. Pol-Hofstad 2, Marnix Poelman 3, Patrick P.J. Mulder 1,
Hester J. van den Top 1 and Jacob de Boer 4
1 RIKILT, Institute of Food Safety, Wageningen UR, Akkermaalsbos 2, 6708 WB Wageningen,
The Netherlands; E-Mails: Patrick.Mulder@wur.nl (P.P.J.M.); Hester.vandentop@wur.nl (H.J.T.)
2 Microbiological Laboratory for Health Protection, National Institute for Public Health and the
Environment, A. van Leeuwenhoeklaan 9, 3720 BA Bilthoven, The Netherlands;
E-Mail: Irene.Pol@rivm.nl
3 IMARES, Wageningen UR, Korringaweg 5, 4401 NT Yerseke, The Netherlands;
E-Mail: Marnix.Poelman@wur.nl
4 Institute for Environmental Studies, VU University, De Boelelaan 1087, 1081 HV Amsterdam, The
Netherlands; E-Mail: jacob.de.boer@ivm.vu.nl
* Author to whom correspondence should be addressed; E-Mail: Arjen.Gerssen@wur.nl;
Tel.: +0031-317-480433; Fax: 0031-317-417717.
Abstract:
Varias especies de algas pueden producir toxinas marinas bajo ciertas circunstancias.
Luego, estas toxinas pueden acumularse en moluscos tales como mejillones, ostras y
vieiras. Cuando estas especies de moluscos contaminados se consumen pueden ocurrir
intoxicaciones severas. En este informe se van a discutir los diferentes tipos de síndromes
que pueden ocurrir posteriores al consumo de moluscos contaminados, las toxinas
correspondientes y la legislación relevante a estos casos. Las intoxicaciones que ocurren
alrededor de todo el mundo son las intoxicaciones amnésicas por moluscos (ASP sigla en
inglés), intoxicaciones paralizantes por moluscos (PSP), intoxicaciones diarreicas por
moluscos (DSP) e intoxicaciones azaspirácidas por moluscos (AZP). En Estados Unidos y
Nueva Zelanda, los casos se limitan a intoxicaciones neurológicas por moluscos (NSP),
mientras que las toxinas causantes de DSP y AZP ocurren mayormente en Europa. Los
últimos dos grupos de toxinas son liposolubles y por lo tanto pueden clasificarse como
toxinas marinas lipofílicas. Se entrega una visión general detallada de los métodos
analíticos oficiales utilizados en la Unión Europea (bioensayos en ratones o ratas) y el
desarrollo reciente de métodos alternativos para las toxinas marinas lipofílicas. Estos
métodos alternativos se basan en ensayos funcionales, ensayos bioquímicos y métodos
químicos. Desde la literatura se deja en claro que los métodos químicos ofrecen el mejor
potencial para reemplazar los tests en animales que aún son legislados en el mundo
entero. Finalmente, se entrega una visión sobre la situación de las toxinas marinas en
Holanda. El ensayo en ratas ha sido utilizado para monitorear las toxinas de intoxicación
diarreica (DSP) y de intoxicación azaspirácida (AZP) en Holanda desde 1970. Hoy en día, se
utiliza a menudo una combinación de métodos químicos y de bioensayo en ratas. En
Holanda, los eventos tóxicos son mayormente causados por toxinas diarreicas (DSP), que
se han encontrado en mariscos holandeses por primera vez en 1961 y que se han repetido
en intervalos irregulares y en variadas concentraciones. Desde este estudio queda claro
que se realiza un esfuerzo considerable por parte de varios grupos de investigación para el
cese gradual de los tests en animales que aún se utilizan en los programas oficiales de
rutina de monitoreo.
Palabras clave: Toxinas marinas lipofílicas; Toxinas diarreicas DSP; métodos alternativos
1. Introducción
De las 5000 especies conocidas de fitoplancton hasta la fecha, bajo ciertas
circunstancias alrededor de 300 de ellas tienen un alto porcentaje de proliferación,
dando como resultado nubes de algas de alta densidad llamadas floraciones. Las
circunstancias del desarrollo de la floración de algas aún no se comprenden por
completo, sin embargo, condiciones hidrográficas y climáticas específicas parecen
tener un rol en la formación de floraciones [1-3]. Las floraciones a veces son
beneficiosas para la acuicultura y la biología marina [4]. No obstante, de las 300
especies de fitoplancton mencionadas arriba, más de 40 especies pertenecientes a
las clases de dinoflagelados y diatomeas se conoce que producen ficotoxinas
(toxinas marinas) [5]. La abundancia de estas especies de fitoplancton tóxico
puede variar desde miles hasta unos pocos millones de células por litro. La gran
abundancia de floraciones de estas especies de fitoplancton tóxico se le llama
Floraciones de Algas nocivas (FAN/ HABs en inglés). Se ha sugerido que ciertas
especies de fitoplancton producen toxinas para competir por espacio con otras
especies de fitoplancton [6].
Las Ficotoxinas se pueden acumular en diversas especies marinas tales como
peces, cangrejos o bivalvos que se alimentan por filtración (moluscos) tales como
mejillones, ostras, vieiras y almejas. En moluscos, las toxinas se acumulan
principalmente en las glándulas digestivas sin causar efectos adversos en sí mismo.
No obstante, cuando los humanos consumen cantidades sustanciales de moluscos
contaminados esto puede causar una intoxicación severa del consumidor (Imagen
1). Alrededor del mundo, las toxinas producidas por algas (incluyendo las toxinas
de cyano de agua dulce) se les considera responsables de aproximadamente
60.000 intoxicaciones humanas por año [7]. Las toxinas de mariscos también
causan daño a la vida silvestre [8.9] y tienen un impacto económico negativo en
recreación, turismo y la industria marisquera. En Europa, una pérdida anual
estimada de 720 millones de euros (€) en la industria de recreación y turismo y 166
millones de euros en la industria marisquera se debe a los eventos de floración de
algas [10,11]. Para poder prevenir la intoxicación por toxinas de mariscos del
consumidor, se ha desarrollado una legislación y se han establecido programas de
monitoreo alrededor del mundo [12,13]. En este estudio se entrega una visión
general de los diferentes tipos de síndromes de envenenamiento, el alga
correspondiente y las toxinas. Además, se analizan algunos métodos alternativos
que han sido desarrollados para reemplazar los bioensayos animales que se están
utilizando para la detección de toxinas marinas lipofílicas.
Imagen 1. Floraciones de Algas Nocivas en la cadena alimenticia y las rutas de
exposición.
2. Síndromes de envenenamiento y sus toxinas correspondientes.
Basándose en las propiedades químicas de las toxinas marinas de mariscos, se
pueden dividir en dos clases diferentes: toxinas hidrofílicas y toxinas lipofílicas. Las
toxinas que se asocian con los síndromes de intoxicación amnésica por molusco
(ASP) e intoxicación paralizante por molusco (PSP) son hidrofílicas y tienen un peso
molecular (PM) bajo los 500 Da (Daltons). Las toxinas responsables de intoxicación
neurológica por molusco (NSP) , intoxicación diarreica por molusco (DSP) e
intoxicación azaspirácida por molusco (AZP) y otras toxinas tales como
pectenotoxinas , yesotoxinas e íminas cíclicas todas tienen como común
denominador una masa molecular superior a 600 Da ( hasta 2.000 Da). Estas
toxinas tienen fuerte propiedades lipofílicas. Por consiguiente, estas toxinas se les
llaman generalmente toxinas marinas lipofílicas.
2.1 Toxinas Hidrofílicas
2.1.1. Intoxicación amnésica por molusco (ASP)
La diatomea Pseudo- nitzschia pungens es una de las especies más importantes de
las de más de 10 productoras de ácido domoico (Imagen 2), que corresponde a la
toxina responsable de la intoxicación amnésica por molusco (ASP) (Tabla 1).
Además, un número de isómeros tóxicos de DA (ácido domoico) han sido descritos
en otras publicaciones [14]. La acción primaria del DA es en el hipocampo, el cual
está encargado de procesar la memoria y las funciones viscerales [15]. El DA es una
neurotoxina que se une con gran afinidad a los receptores de glutamato. Este
enlace lleva a abrir los canales de la membrana (permeable para el sodio). Esto, a
su vez, lleva a un influjo aumentado del sodio y a una despolarización de la
membrana. Los efectos adversos que se han informado son desórdenes
gastrointestinales, nauseas, vómitos, calambres abdominales y diarrea. Además
dolores de cabeza, mareos o vértigo y también puede ocurrir pérdida de la
memoria a corto plazo [16,17].
La intoxicación amnésica por molusco fue descrita por primera vez en 1987 en la
Isla Príncipe Eduardo, Canadá [18].Durante este episodio tóxico, tres personas
murieron y más de 100 fueron ingresados al hospital después de consumir Mejillón
común (Mytilus edulis) con altos niveles de DA [17]. La presencia de DA en
moluscos es un problema global. En los últimos años, se han descrito casos de
moluscos que contenían DA en los Estados Unidos, Canadá, Francia, Reino Unido
(UK), España, Irlanda y Portugal [18-23]. La Unión Europea (EU) ha establecido un
nivel permitido de 20mg de DA/kg de carne de molusco. En el año 2009, la
Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) publicó una opinión sobre DA
[24]. En esta opinión el panel recomendó que era seguro consumir moluscos que
contuvieran menos de 4,5 mg de DA/kg de carne de molusco para no exceder la
dosis aguda de referencia (Arfd). DG SANCO (responsable por la salud y la
protección al consumidor en la Unión Europea) discutirá la opinión de EFSA con los
diferentes estados miembros de la UE y esto resultará en una nueva legislación.
Imagen 2. Estructura química del ácido domoico (DA)
Tabla 1. Grupos de toxinas marinas y las algas responsables de cada toxina.
2.1.2. Intoxicación paralizante por molusco (PSP)
Los Dinoflagelados del género Alexandrium son los productores de las saxitoxinas
(Imagen 3), el grupo de toxinas responsables de la intoxicación paralizante por
molusco PSP (Tabla 1). Dentro del grupo de saxitoxinas se han detectado alrededor
de 30 análogos diferentes [45]. No todos los análogos exhiben la misma toxicidad y
hoy en día para los análogos más prominentes, se han establecido factores de
equivalencia tóxica (TEF) [46]. La Saxitoxina causa inhibición del canal iónico de
sodio lo que resulta en un potencial de acción reducido [47]. Los efectos adversos
de la intoxicación con saxitoxinas comienzan con un hormigueo o entumecimiento
alrededor de los labios. Estos efectos se expanden hasta el cuello y el rostro. En un
estado avanzado se pueden sentir punzadas en las yemas de los dedos, dolor de
cabeza, mareos, nauseas, vómitos y diarrea. Incluso se ha descrito ceguera
temporal [46,48]. Cuando se consumen altos niveles de saxitoxinas también se ven
afectados los nervios motores, lo que resulta en dificultades respiratorias y otros
efectos paralizantes en los músculos [49]. Finalmente, esto podría causar la muerte
[50].
Los primeras descripciones de intoxicación paralizante por molusco PSP se
remontan a 1920 en California Estados Unidos, donde al menos seis personas
murieron [51]. Hasta 1970, las toxinas de PSP solamente se detectaron en aguas
Europeas, Norteamericanas y Japonesas. Hoy en día, las saxitoxinas se han
encontrado en Chile, en Sudáfrica, en Australia así como en otros países [52,54]. En
la mayoría de los países se han establecido programas de monitoreo para proteger
a los consumidores. La Unión Europea ha establecido un nivel permitido de 800
mcg (μg) de saxitoxina 2-HCL equivalentes/kg de carne de molusco. Recientemente
(2009) la EFSA publicó una opinión sobre el grupo saxitoxina [46]. En esta opinión
se recomienda que un nivel seguro es tan reducido como 75 mcg de saxitoxina
2-HCL equivalentes/kg de carne de molusco para evitar exceder la dosis aguda
de referencia (ArfD) [46].
Imagen 3. Estructura Química de la saxitoxina (STX)
2.2. Toxinas Lipofílicas
2.2.1. Intoxicación neurológica por molusco (NSP)
La intoxicación neurológica por molusco (NSP) es causada por las brevetoxinas
(Imagen 4) Estas toxinas se producen por las especies de algas Karenia ssp (Tabla
1) [8,30]. Las Brevetoxinas causan la apertura de los canales iónicos de sodio,
permitiendo un influjo de sodio en las células y a un completo bloqueo de la
excitabilidad neuronal [55]. Los efectos adversos que se han observado son
diarrea, vómitos, calambres, una reducción rápida de la frecuencia respiratoria y
alteraciones de conducción cardíaca las que pueden llevar a un estado de coma y
finalmente a la muerte [30]. Además del consumo de moluscos contaminados con
brevetoxinas, la intoxicación puede ocurrir por la inhalación de aerosoles
producidos por las olas que rompen en la costa [56,57]. La inhalación de
aerosoles de brevetoxinas puede causar problemas respiratorios e irritación de los
ojos y la membrana nasal. Hasta ahora las intoxicaciones por NSP han estado
limitadas a las zonas de Estados Unidos (Golfo de México y Florida) y a Nueva
Zelanda [58,59]. Ya que estas toxinas no se han encontrado en Europa, no existe
legislación para estas toxinas y no se han establecido programas de monitoreo. En
los Estados Unidos, se ha establecido una legislación por medio del Food and drug
administration (FDA). El límite regulatorio actual es de 800 mcg de brevetoxina-2
(PbTx-2) equivalentes/kg de carne de molusco [60]. Al momento de escribir este
estudio, la EFSA no ha publicado una decisión sobre las toxinas del tipo NSP.
Imagen 4. La estructura química de la brevetoxina (PbTx-2)
2.2.2. Intoxicación diarreica por molusco (DSP)
El ácido ocadaico (imagen 5), la dinofisistoxina -1 (DTX1) y -2 (DTX2) así como
también las formas esterificadas de ácido ocadaico (OA), DTX1 y DTX2 son
producidas por el género Dinophysis (tabla 1) [35]. Las toxinas del grupo OA
inhiben la serina y las treoninas fosfatasas PP1 y PP2A [61]. Esta inhibición lleva a
la hiperfosforilación de proteínas involucradas en las uniones cito esqueléticas que
regulan la permeabilidad de la célula, lo que resulta en una pérdida de fluidos
celulares [62]. El consumo de moluscos contaminados con altos niveles de toxinas
del tipo OA pueden tener efectos adversos tales como desorden gastrointestinal,
diarrea, calambres abdominales, nauseas y vómitos [63]. Además, las toxinas de
OA y DTX1 han demostrado que desarrollan sustancias de tumores en tests con
animales [64].
La primera intoxicación humana documentada que fue causada por las toxinas
diarreicas DSP fue en Holanda en 1961 [65]. Hoy en día, altos niveles de toxinas del
grupo OA se informan repetidamente en moluscos o algas a lo largo de las costas
de Europa ( Reino Unido, Irlanda, Dinamarca, Suecia, Noruega, Francia, España,
Italia, Portugal, Holanda y Bélgica), Canadá, Sudamérica (Chile), Japón, Australia y
África ( Marruecos) [63.66.67]. Se han establecido los factores de equivalencia
tóxica (TEF) para OA, DTX1 y DTX2 (Tabla 2) [68,69]. Dentro de Europa, el nivel
permitido para la cantidad total de OA, DTXs y PTXs en moluscos se ha fijado en
160 mcg OA –equivalentes/kg de carne de molusco. En el año 2008, el panel de
EFSA concluyó en su decisión sobre OA y análogos que OA y DTXs no deben
exceder los 45 mcg de OA –equivalentes /kg de carne de molusco, para así no
exceder la dosis aguda de referencia (ArfD). Para los PTXs, la EFSA ha preparado
una decisión [70].
Imagen 5. Estructura química del ácido ocadaico (OA)
Las Pectenotoxinas (PTXs) (Imagen 6) son producidas por las mismas especies de
fitoplancton que las toxinas del grupo OA, el género Dinophysis [33].
Aproximadamente hasta la fecha se han descrito 15 tipos diferentes de PTXs
[71,72]. La Pectenotoxina-2 (PTX2), ácido pectenotoxina- 2 seco (PTX2sa) y ácido
7-epi-pectenotoxina-2-secoico (7-epi PTX2sa) son los análogos predominantes en
moluscos europeos [73]. La toxicidad después de una administración
intraperitoneal o por administración oral de PTXs en ratones es considerada para
ser comparable. Después de la inyección intraperitoneal de PTX2, se ha observado
daño hepático tales como la generación de vacuolas y deformación de hepatocitos
[74]. La administración oral de PTX2 resultó en cambios histopatológicos en el
hígado y el estómago de ratones pero no se observó diarrea [75]. Aún no se han
documentado intoxicaciones humanas por PTXs. Como se mencionó
anteriormente, las PTXs están recién siendo incluidas en la legislación europea en
el grupo de toxinas OA, pero EFSA ha sugerido recientemente que las PTXs
deberían clasificarse de manera individual. El panel de EFSA propuso un nivel
permitido de 120 mcg/kg de PTX2 equivalentes (tabla 2) [70].
Imagen 6: Estructura química de la pectenotoxina -2 (PTX2)
Las Yesotoxinas (YTXs) (imagen 7) se producen por dinoflagelados Proceratium
reticulatum y Lingulodinium polyedrum [39,76]. Hasta ahora solo se han
identificado hasta 90 análogos de YTX [77]. Las toxinas más abundantes
encontradas en moluscos son las YTX y los metabolitos 45-hidroxi-YTX, carboxi-YTX
y sus homologos- 1a correspondientes [78]. Algunos análogos de YTX solamente se
han encontrado en ciertas regiones tales como adriatoxinas en el mar Adriático
[79]. Cuando se inyecta intraperitoneal la toxicidad de YTX es relativamente alta,
con una dosis letal DL50 para ratones de 750 mcg/kg. Por el contrario, la
administración oral de altos niveles de YTX(7,5 y 10 mg/kg) solamente resultó en
alguna inflamación de las células del músculo del corazón de los ratones [80].
Hasta ahora, no se ha informado sobre intoxicaciones en humanos por consumo
de moluscos contaminados por YTX. Los niveles de YTXs que exceden el actual
nivel regulatorio de la Unión Europea (1mg/kg) se han encontrado ocasionalmente
en Italia, Noruega y Portugal [78, 81,82]. La EFSA ha sugerido que el consumidor
está protegido cuando el molusco no excede una concentración de 3,75 mg de
YTX-equivalentes/kg de carne de molusco [83]. La EFSA ha identificado las YTX,
1a-homo-YTX, 45-hidroxi-YTX y la 45-hidroxi-1a-homo-YTX como las Yesotoxinas
más importantes presentes en moluscos. Para estas toxinas se han establecido
factores de equivalencia tóxica (TEF) (Tabla 2) [83].
La intoxicación diarreica por molusco es causada por OA y sus análogos DTX. Las
YTXs y PTXs a menudo se incluyen en el grupo de las toxinas DSP, ya que a menudo
pueden ocurrir simultáneamente con el ácido OA y los análogos de DTX aunque no
causan diarrea. Por lo tanto, debería considerarse quitar a estas toxinas del grupo
DSP. En nuestra opinión, un mejor término para clasificar las toxinas
pertenecientes a estos grupos sería toxinas marinas lipofílicas.
Imagen 7. Estructura química de yesotoxina (YTX)
2.2.3. Intoxicación azaspirácida por molusco (AZP)
Por años, se pensaba que los azaspirácidos (imagen 8) eran producidos por la
especie Protoperidinium crassipes [85], aunque faltaba una correlación entre el
recuento de alto contenido de algas y los niveles de toxina [86]. Recientemente, se
ha descubierto que las toxinas azaspirácidas (AZAs) realmente son producidas por
un ínfimo dinoflagelado [40,86]. Este dinoflagelado, llamado Azadinium spinosum,
es más pequeño (12 a 16 mcg) que cualquiera de los otros dinoflagelados
productores de toxinas que se conocen hasta ahora. Hasta el momento se han
descrito 24 azaspirácidos (AZAs) diferentes, con azaspirácido-1 (AZA1), -2 (AZA2),
-3 (AZA3) como los tipos predominantes [87]. El mecanismo de acción aún no se
comprende del todo, pero experimentos in vitro de líneas celulares de mamíferos
mostraron alteraciones en la estructura citoesquelética y un efecto en el sistema E-
cadherina, el cual es responsable de la interacción entre células [88-90]. Esto
podría explicar los efectos tóxicos tales como desórdenes gastrointestinales,
diarrea y calambres abdominales que se observan durante la intoxicación por AZP
[85,91]. En 1995, la primera intoxicación debido a AZP se registró cuando al menos
ocho personas se enfermaron en Holanda después del consumo de mejillones
importados de Irlanda. El bioensayo en ratas, que normalmente se utiliza para
detectar toxinas del tipo OA, reveló la presencia de actividad diarreica tóxica,
donde el bioensayo en ratones careció de detecciones de estas toxinas. Desde
entonces, sucedieron varios brotes de AZP en Irlanda y hasta ahora las AZAs habían
sido detectadas en Irlanda, Reino Unido, Noruega, Francia, Portugal, África del
Norte (Marruecos), Sudamérica (Chile) y en los Estados Unidos [67,85,92-97]. De
acuerdo a la legislación actual de la Unión Europea, la cantidad total de AZAs no
deberían exceder los 160 mcg/kg de AZA1-equivalentes [98]. Recientemente, la
EFSA revisó toda la información de toxicidad disponible y sugirió que un nivel
seguro de toxinas AZA está por debajo de la dosis aguda de referencia (ARfD) de 30
mcg de AZA-1 equivalentes/kg de carne de molusco [84]. Además, la EFSA sugirió
factores de equivalencia tóxica (TEFs) para las tres AZAs más importantes (Tabla 2)
[84].
Imagen 8. Estructura química de azaspirácido- 1 (AZA1).
2.2.4. Espirolidas y Gimnodiminas ( Iminas cíclicas)
Las Espirolidadas (SPXs) (Imagen 9) y las gimnodiminas son toxinas que pertenecen
al grupo de las iminas cíclicas. Las SPXs se producen por la especie Alexandrium
ostenfeldii (Tabla 1) [41,99]. Aproximadamente, se han encontrado de 10 a 15 SPxs
diferentes (incluyendo ésteres) tanto en algas o en moluscos [100-102].
El mecanismo de acción aún no se comprende por completo, pero la inyección
intraperitonal de extractos de molusco que contienen SPxs o gimnodiminas está
causando la muerte de los tests animales en cosa de minutos [103]. Por esta razón,
estas toxinas han sido clasificadas como toxinas de rápida acción. Aún no se han
informado casos de intoxicación de humanos con iminas cíclicas. Sin embargo, se
han encontrado SPXs en algas y moluscos de Noruega, Canadá, Dinamarca, España
y Chile [95,100,104], mientras que las gimnodiminas hasta el momento solo han
sido detectadas en algas y moluscos de Nueva Zelanda [44]. Actualmente, no
existe legislación en la Unión Europea para las iminas cíclicas. Actualmente, este
grupo de toxinas está siendo analizado por la EFSA, quiénes publicarán su decisión
en el 2010.
Imagen 9: Estructura química de la 13- desmetil espirolida C (SPX1).
3. Métodos de análisis.
Para la determinación de toxinas marinas se han descrito varios métodos
biológicos ( in-vivo e in-vitro), métodos bioquímicos y métodos químicos en la
bibliografía. No obstante, por largo tiempo no estuvieron disponibles los métodos
químicos para las toxinas marinas lipofílicas. En este párrafo, se entregará un
esquema sobre los métodos oficiales indicados en la legislación europea y los
métodos alternativos desarrollados en los últimos años.
Durante la última década se ha visto un fuerte incremento en ensayos conjuntos
sobre toxinas marinas lipofílicas (Imagen 10). En general, el desarrollo del método
y la validación del método para las toxinas marinas lipofílicas estuvieron
obstaculizados por muchos años, debido a la ausencia de patrones (certificados) y
materiales de referencia (certificados). Como se muestra en las imágenes 4 a 9 las
estructuras químicas de las toxinas son complejas y por consiguiente, es muy difícil
y costoso sintetizarlas [105]. Por lo tanto, los patrones necesitan ser aislados del
molusco contaminado o bien de las algas contaminadas [106,107].En los últimos
años, se han realizado esfuerzos considerables para expandir el número de toxinas
disponibles. En el año 2005, solo estaban disponibles pequeñas cantidades de
patrones de referencia fiables de las toxinas OA y de PTX2. En el 2007, estuvieron
disponibles las toxinas YTX, AZA1 y SPX1. Desde entonces, de todos los grupos
importantes de toxinas marinas lipofílicas al menos un patrón certificado está
disponible (OA, PTX2, YTX, AZA1 y SPX1). Se espera que otros patrones de
referencia importantes tales como DTX1, DTX2, AZA2 y AZA3 estén disponibles en
el transcurso del 2010.
Imagen 10. Número de publicaciones revisadas por pares sobre toxinas marinas
lipofílicas en la última década.
3.1. Métodos oficiales actuales descritos en la legislación y sus limitaciones.
La legislación de la Unión Europea prescribe una prueba biológica para la
determinación de las toxinas OA, DTXs, YTXs, PTXs y AZAs en moluscos. Esta
prueba biológica puede ser un ratón (BER) o un bioensayo en ratas (BER). El
Bioensayo en ratones se realizó en Japón y el bioensayo en ratas en Holanda en los
años 70 [65,108]. Diversos laboratorios han ajustado el bioensayo en ratones el
cual ha resultado en diferentes protocolos [109,110]. En Europa, se ha descrito un
procedimiento detallado por el Laboratorio Comunitario de Referencia sobre
toxinas marinas (LCR-BM, Vigo, España) para estandarizar el protocolo para el
bioensayo en ratones [111]. Los extractos de moluscos son preparados con
extracción de acetona seguida de una extracción líquido-líquido con diclorometano
o dietil éter. Después de la evaporación, el extracto es reconstituido en 1% de
solución de polisorbato 20. Estos extractos son inyectados de manera
intraperitoneal dentro de tres ratones macho con un peso corporal de 20gr.
Preferentemente, el hepatopáncreas del molusco debería usarse, ya que la
mayoría de las toxinas tienden a concentrarse en ese lugar, solo en relación a las
AZAs puede haber una discusión si es que estas toxinas se difunden dentro de la
carne de molusco [91,112]. Si al menos dos de tres ratones mueren dentro de 24
horas después de la inyección, la muestra se considera positiva para toxinas
marinas lipofílicas [13]. Desafortunadamente, también bajos niveles de toxinas
SPXs pueden causar la muerte, incluso dentro de unos pocos minutos [103]. Esto
indica que los bioensayos en ratones carecen de especificidad. Un aspecto fuerte
del ensayo es que puede señalar la presencia de nuevas toxinas marinas
emergentes. El Bioensayo en ratas, un método oficial en la Unión Europea que
solamente se aplica en Holanda, se basa en el consumo de moluscos (véase
también la sección “Presencia de eventos tóxicos en Holanda”). Ratas hembras
privadas de alimento (por 24 hrs) son alimentadas con 10gr de hepatopáncreas de
molusco. Después de 16 hrs la consistencia (reblandecimiento) de las heces es
investigada. La diarrea severa coincide con los niveles de toxinas alrededor de la
legislación de la Unión Europea vigente (160 mcg/kg de toxinas OA equivalente o
160 mcg/kg de toxinas AZA1 – equivalentes) [68]. Una desventaja considerable del
bioensayo en ratas es que las toxinas YTXs y PTXs no son detectadas en el límite
regulador porque no inducen diarrea. Además, el analista necesita acumular
experiencia para hacer una interpretación precisa de los resultados de las pruebas
(textura de las heces). En forma más general, las limitaciones del bioensayo en
ratones y el bioensayo en ratas es la carencia de especificidad y sensibilidad,
carencia para dar posible un perfil de la toxina, y la producción frecuente de
resultados falsos positivos. Por estas razones, dentro de Europa, varios países
ahora usan una combinación de pruebas en animales y pruebas químicas (Tabla 3).
Además, el bioensayo en ratones en particular se está convirtiendo cada vez más
en algo inaceptable por razones éticas y esto provee un fuerte ímpetu para
eliminar gradualmente y reemplazar el bioensayo en ratones.
Tabla 3. Métodos utilizados para el control oficial de toxinas marinas lipofílicas.
Desde una perspectiva mundial, la regulación de toxinas marinas lipofílicas difiere
ampliamente. Estas diferencias están relacionadas a la presencia o ausencia de las
toxinas en regiones específicas y sobre la metodología utilizada. En los Estados
Unidos la FDA ha instalado solamente una legislación sobre las toxinas OA y DTX1,
mientras que no se han establecido aún rutinas de programas de monitoreo (Tabla
4) [60,114]. Las normas Canadienses solo mencionan niveles máximos para las
toxinas OA y DTX1 en glándulas digestivas (Tabla 4) [115]. En Japón, el nivel se ha
expresado en unidades de ratón (UR) lo cual es una forma común de expresar el
límite regulador cuando el bioensayo en ratones se aplica (Tabla 4) [114]. En
Australia y Nueva Zelanda , se ha establecido un límite regulatorio para las toxinas
OA y DTX1, DTX2 y DTX3 (Tabla 4) [116]. En Europa, la mayoría de los tipos de
toxinas marinas lipofílicas pueden encontrarse en moluscos y como resultado la
legislación de la Unión Europea contempla las toxinas OA, DTXs, PTXs, YTXs y AZAs
( Tabla 4).
Tabla 4. Niveles permitidos para toxinas marinas lipofílicas
3.2. Desarrollo de métodos alternativos
3.2.1. Ensayos In-vitro
Los ensayos funcionales actualmente están siendo desarrollados como alternativas
a los bioensayos. Los ensayos funcionales se basan en el modo toxicológico de
acción de un grupo de toxinas en un proceso biológico. Las ventajas de los ensayos
funcionales son su potencial para el rastreo de alto caudal, la detección de nuevas
toxinas, mientras que no es hay necesidad de aplicar valores de factor de
equivalencia tóxica. Aún pueden ocurrir falsos positivos o negativos debido a las
sustancias matrices presentes en el extracto o debido a activación metabólica. Es
extremadamente difícil desarrollar un ensayo funcional que comprenda todas las
toxinas lipofílicas en un solo ensayo. Hasta ahora, los ensayos funcionales se han
desarrollado para el grupo de toxinas OA, YTXs, PTXs y SPXs. Las toxinas del grupo
OA pueden determinarse por ensayos inhibidores de proteína fosfatasa 2A (PP2A)
utilizando detección fluorimétrica. Varios de estos ensayos se han publicado en los
últimos años [117-119]. En varios laboratorios se han obtenido buenas
correlaciones entre el bioensayo de ratones y el ensayo fluorimétrico de PP2A
[117,120]. Así mismo, se ha desarrollado un ensayo de citotoxicidad para el grupo
de toxinas OA y de PTXs basado en la despolimerización del filamento de actina en
una línea celular BE(2)-M17 de neuroblastoma [121]. Para las toxinas del grupo OA
y YTXs, se desarrolló un ensayo basado en la reducción de la adhesión célula-célula
en células MCF-7 y Caco-2 produciendo una acumulación de E-cadherina
[122,123]. También la toxina AZA1 mostró un efecto en la adhesión célula-célula y
el influjo E- caderina, pero estos resultados aún no han derivado en un formato
de ensayo funcional [88]. Desafortunadamente, en lo que respecta a las toxinas OA
y YTX la reproducibilidad del el ensayo era más bien pobre. Por lo tanto, el ensayo
debería hacerse más sólido previo a la rutina de aplicación. Recientemente, se ha
desarrollado un ensayo por inhibición de polarización de fluorescencia para
toxinas SPX. El ensayo utiliza membranas de receptor nicotínico de acetilcolina
enriquecido del Pez Raya eléctrico (Torpedo marmorata) y es capaz de analizar
mejillones contaminados con concentraciones de toxinas SPX en el rango de 70 a
700 mcg/kg [124]. De los ensayos funcionales desarrollados hasta ahora, los
resultados más prometedores se han obtenido con el ensayo PP2A para el grupo
de toxinas OA y con el ensayo de receptor nicotínico de acetilcolina para las
toxinas SPX. No obstante, aún falta una validación satisfactoria (individual e
interlaboratorio) de éstos métodos.
3.2.2. Métodos bioquímicos
En métodos inmunoquímicos se utilizan anticuerpos que muestran afinidad con
partes estructurales específicas de una toxina. A menudo también se pueden
detectar análogos de estas toxinas por medio de reactividad transversal, pero no
se ha ganado información sobre diferencias en toxicidad. Por lo tanto, métodos
tales como el ensayo por inmunoabsorción Ligado a Enzimas (ELISA) puede ser
solamente utilizado para examinar muestras de moluscos. Para algunos de los
grupos de toxinas marinas lipofílicas, se han desarrollado métodos
inmunoquímicos. Para el grupo de toxinas OA se ha transformado un ensayo ELISA
a un formato inmunocromatográfico de flujo lateral (LFI). La prueba de tiras
reactivas permite el análisis de las toxinas in situ sin la necesidad de utilizar
laboratorios [125]. En principio, esto podría habilitar a la industria de mariscos
para que lleven a cabo estas pruebas por sí mismos. Un estudio reciente sobre
estas pruebas de tiras reactivas demostró que un gran número relativo de
muestras (45%) fueron mal identificadas como positivas [126]. Se necesitan más
estudios para hacer que este formato LFI sea apropiado para propósitos de
monitoreo de rutina. Otros métodos bioquímicos que están actualmente bajo
desarrollo para el grupo de toxinas OA hacen uso de inmunosensores e inmuno-bio
sensores amperométricos utilizando la resonancia plasmónica de superficie
(RPS)[127,128]. Se ha desarrollado un ensayo ELISA sensible para YTX con una
buena correlación al método químico basado en cromatografía líquida y detección
de masa espectrométrica. Su rango de trabajo podría hacer que ELISA sea
apropiada para el monitoreo de rutina [129,130].La ventaja de este ensayo ELISA
para toxinas YTX es la reactividad transversal hacia varias de las toxinas análogas
de YTX [129], aunque no está claro si estos análogos son o no tóxicos. Otros
métodos bioquímicos prometedores para YTX son los biosensores basados en RPS,
un bioensayo de espejo resonante y polarización de fluorescencia [131-133].
Para las toxinas PTX, AZA y SPX no hay métodos bioquímicos disponibles aún. Los
resultados más prometedores se han obtenido con el ensayo ELISA para los grupos
de toxinas OA e YTX. Al ser prevista de una validación apropiada que se está
llevando a cabo, estos métodos bioquímicos de examinación pueden utilizarse
para análisis de elevados números de muestras de toxinas de moluscos.
3.2.3 Métodos químicos
En la década de 1980, los primeros métodos de detección química desarrollados
para las toxinas del grupo OA se basaron en cromatografía líquida (CL) pareada con
una detección fluorimétrica (CL- DFL). Como la mayoría de las toxinas marinas
lipofílicas carecen de cromóforas, se requirió de un paso de derivatización. Para
toxinas del grupo OA se ha utilizado 9-antrildiazometano (ADAM) [134] y para
toxinas PTX e YTX se ha utilizado
4-[2-(6.7dimetoxi-4-metil-3-oxo-3,4-dihidroquinoxalinil) etilo]-1,
2,4-triazolina-3,5-diona (DMEQ-TAD) como reactivos de derivatización [135,136].
Un importante desventaja de cromatografía líquida de detección de fluoración
(CL-DFL) es su selectividad limitada para las toxinas del grupo OA así como también
para las toxinas PTX e YTX. El paso de derivatización es un poco arduo y puede ser
crítico. No se han desarrollado métodos de CL-DFL para las toxinas AZA y SPX. Esto
probablemente se debe al hecho de que estas toxinas fueron descubiertas a
mediados de los años 90 cuando la Cromatorafía líquida con espectometría de
masas [CL-(EM)/EM] se volvió muy popular.
En los últimos años, se ha puesto mucho esfuerzo en el desarrollo de los métodos
de cromatografía líquida con espectometría de masas (CL-EM/EM) que están
dedicados a detectar clases específicas de toxinas marinas lipofílicas o a detectar
diferentes toxinas marinas lipofílicas como sea posible en un método de
multi-toxinas. Muchos de los métodos desarrollados para clases específicas de
toxinas marinas lipofílicas se enfocaron en la aclaración de la estructura o en el
descubrimiento de nuevas toxinas marinas lipofílicas. Por ejemplo, para el grupo
de toxinas OA las técnicas de CL-EM/EM han sido utilizadas para identificar nuevas
toxinas DTX [137-140]. Hasta ahora, alrededor de 40 toxinas diferentes
pertenecientes al grupo OA se han identificado utilizando el método CL-EM/EM
[140,141]. Varios métodos de CL-EM/EM se han desarrollado para detectar nuevas
toxinas (YTX y PTX) tanto en algas como en moluscos [71,77,142-145]. Además, el
método CL-SM/SM se ha utilizado para investigar la transformación de toxinas a
metabolitos. La conversión de toxinas YTX a 45-OH-YTX y 45-COOH-YTX y la
conversión de PTX2 a PTX2sa se ha estudiado por medio del método CL-EM/EM
[75, 78,146]. Otro método de CL-SM/SM se desarrolló para determinar hasta 24
tipos diferentes de toxinas AZA en un solo análisis [87]. Algunos métodos
dedicados se utilizaron para estudiar los procesos metabólicos que tienen lugar
cuando los mejillones contaminados con toxinas AZA se tratan con calor [147].
También, con la ayuda de los métodos CL-EM/EM , se han identificado nuevos
análogos de las toxinas SPX que se producen tanto en algas como en moluscos
[101,102].
La mayoría de los métodos descritos más arriba se utilizaron con propósitos de
estudio y no fueron pensados para programas de monitoreo. Hoy en día, varios
métodos CL-EM/EM están disponibles para determinar la mayoría o todas las
clases de toxinas pertenecientes a las toxinas marinas lipofílicas. Los primeros
métodos CL-EM/EM multi-toxinas para toxinas marinas lipofílicas se desarrollaron
en el año 2001 [148,149]. Desafortunadamente, uno de los métodos no incluye a
las toxinas YTX [148] mientras que el otro utilizó una muestra laboriosa en un
procedimiento de limpieza basado en una extracción líquido-líquido y en varios
procedimientos de fase de extracción sólida [149]. Por esta razón, estos métodos
no eran apropiados para programas de monitoreo de rutina. En el año 2005, se
desarrollaron dos nuevos métodos multi-toxinas, que incluían toxinas de todas las
clases reguladas de toxinas marinas lipofílicas en la Unión Europea [150,151]. Estos
métodos fueron validados internamente y se obtuvieron buenas características de
desempeño. Las desventajas fueron la exclusión de las espirólidas en uno de los
métodos [151] y unas cromatografías pobres para algunos de los componentes en
el otro método [150]. En el 2007, se llevó a cabo un método de cromatografía
líquida a una muy alta presión (CLMAP)-EM/ME. Con este método fue posible
analizar 21 toxinas marinas lipofílicas en solo 6,6 minutos [152]. Debería
mencionarse que la separación y la detección podrían solamente llevarse a cabo
por medio de la generación más nueva de equipos de métodos de CL y SM. Este
método (CLMAP)-EM/ME no ha sido validado aún. El método multi-toxina que se
ha llevado a cabo más recientemente fue publicado en el año 2009. Por una
elección diferente de condiciones de cromatografía, todos los problemas de
cromatografía se han resuelto y el método ha sido validado internamente [153].
Todas las toxinas marinas lipofílicas prominentes fueron incluidas en este método.
Actualmente, para este método se está preparando un estudio completamente
colaborativo de validación de acuerdo a guías internacionales.
4. Episodios de Eventos Tóxicos en Holanda (1960-2009)
En Holanda, hasta ahora solamente han sucedido episodios de DSP y los otros
síndromes tóxicos ( ASP y PSP) no han sido informados. Solo en el año 2002, una
muestra de molusco ha sido testeada positiva para ácido domoico (información no
publicada entregada por M. Poelman). Por consiguiente, esta mirada histórica solo
trata con el síndrome de DSP. Las primeras incidencias fuera de Holanda se
reportaron en Japón (1976 y 1977) [109].Los investigadores japoneses encontraron
Dinophysis fortii, el alga que producía esta toxina. Por lo tanto, la toxina se nombró
Dinofisistoxina y el síndrome de intoxicación se le llamó Intoxicación Diarreica por
molusco (DSP) [154]. En 1982, la estructura de la toxina causante, dinofisistoxina-1,
fue finalmente elucidada [155].
En Holanda, las primeras incidencias de envenenamiento asociado con el consumo
de mejillones se informó en Julio y Agosto de 1961 [65]. La gente que consumió
mejillones experimentó calambres abdominales, vómitos y diarrea severa. Al
mismo tiempo, en Scheldt del Este y en el mar Wadden se reportaron altas
concentraciones de dinoflagelados Proroentrum micans, P. triestinum, P. minimum
y Dinophysis acuminata. En los años siguientes, estas algas fueron aisladas del
tracto gastrointestinal (hepatopáncreas) de los mejillones. Siguiente a este
episodio, las intoxicaciones humanas volvieron a suceder en Holanda el año 1971
(mejillones de Scheldt del Este), 1976, 1979 (mejillones del mar de Wadden) y en
1981 ( mejillones de Scheldt del Este y del mar Wadden) [156-158]. En 1979, se
desarrolló un bioensayo en ratas para la detección de estas toxinas y para prevenir
la intoxicación humana [65] y este bioensayo en ratas se adoptó como el método
oficial de control para la detección de las toxinas causantes de diarrea en Holanda.
El programa de monitoreo para las toxinas de DSP en Holanda incluye un sistema
de alerta temprana y el análisis de pre-mercado de los moluscos en la presencia de
toxinas de ASP, PSP y DSP. El sistema de alera temprana monitorea las diferentes
algas potencialmente tóxicas en el agua marina. El bioensayo en ratas se utilizó
para testear si las especies P. micans y P. minimum eran las responsables de los
efectos adversos observados en 1961. Sin embargo, los mejillones contaminados
con cultivos de algas fueron dados a las ratas, pero no se observaron efectos
adversos [65]. Por consiguiente, permaneció en la duda si estas algas eran
responsables de la producción de toxinas. En 1981, se demostró que en Holanda,
el alga responsable de la producción de toxina en Scheldt del Este y en el mar
Wadden era la especie D. acuminata [159]. En 1986 y en 1987, las toxinas de DSP
fueron detectadas nuevamente en el mar Wadden, pero debido a un programa de
monitoreo establecido las áreas de moluscos estaban cerradas y no se reportaron
intoxicaciones humanas [160,161]. En octubre de 1989, un episodio menor de
toxicidad de DSP sucedió en el mar Wadden, y no se reportaron incidencias en
enfermedades humanas. El área de producción estuvo cerrada durante la
presencia de toxinas de DSP. En el año 2002, la especie D. acuminata causó la
presencia de toxinas DSP en mejillones del mar Wadden. Esto fue seguido por un
cierre del área de producción por varias semanas (información no publicada por M
Poelman). Por medio del método CL-SM, pudieron ser detectados bajos niveles de
toxinas en mejillones varias semanas antes que el bioensayo en ratas recogiera
niveles por sobre el límite regulatorio de la Unión Europea. En este caso, se
observó una intoxicación de pescadores locales, mientras que el bioensayo en
ratas detectó niveles de toxinas DSP después del cierre del área de pesca
(información no publicada por M. Poelman).
En el año 2005 y 2007, la presencia de D. acuminata en el mar Wadden detonó la
aplicación de un (tardío) programa de monitoreo utilizando el método CL-EM/EM.
Estos análisis mostraron la presencia de toxinas OA en mejillones a niveles muy por
debajo del límite regulatorio actual, en un rango desde 18 a 68 mcg de toxinas OA
equivalentes/kg por carne de molusco. La presencia de altos números de D.
acuminata propició el análisis de moluscos por medio del método CL-EM/EM de
nuevo en el año 2009. No se encontraron cantidades detectables de alguna toxina
DSP. Estos resultados y también aquellos obtenidos en ocasiones previas indican
que no hay una correlación clara entre las cuentas de algas potencialmente tóxicas
y los eventos tóxicos (Imagen 11). Respecto a la opinión de la EFSA hay algunas
concentraciones encontradas en el 2005 y 2007 que están por sobre la dosis aguda
de referencia de 45 mcg de toxinas OA equivalentes/kg de carne de molusco. Por
consiguiente, en caso de que la legislación cambie hacia el dictamen de la EFSA,
más muestras positivas se encontrarán en los Países Bajos. En general, en la última
década en los mariscos de las aguas holandesas sólo bajos niveles de equivalentes
de OA se han encontrado.
5. Conclusiones
Las floraciones de algas responsables de la producción de toxinas lipofílicas
ocurren muy a menudo dentro de aguas europeas. Finalmente, casi 50 años
después del primer evento de toxinas DSP en Holanda, los métodos químicos se
encuentran disponibles actualmente para la detección de todas las toxinas marinas
lipofílicas importantes en moluscos. Estos métodos pueden ayudar a decidir sobre
la clausura de áreas de cosecha de moluscos y para prevenir intoxicaciones. Debido
a cambios en el clima y el transporte de algas a través de aguas de lastre, futuras
floraciones y episodios tóxicos no se pueden descartar. Por lo tanto, debe
continuar el desarrollo de métodos y se deben mantener los programas de
monitoreo. Además, se está realizando un esfuerzo considerable por parte de
varios grupos de investigación europeos y de la Unión Europea por eliminar
gradualmente las pruebas en animales que aún se utilizan para los programas
oficiales de monitoreo de rutina.
AGRADECIMIENTOS
Queremos agradecer a Ir. H.P. van Egmond por las útiles sugerencias hechas en el
manuscrito.
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