estudio de las propiedades fisioquímicas de toxinas
TRANSCRIPT
DE TOXINAS AISLADAS DE
KARWINSKIA HUMBOLDTIANA
QUE EN DPCIQTT AL BRADO IME MAESTRO EN CIEWCIAÖ
u m m
MONTERREY, N.L. ENERO DE 1990
TM Z6658 FM 1990 MB
1020071181
M 3
\
162047
ESTUDIO DE LAS PROPIEDADES FISICOQUIMICAS
DE TOXINAS AIS-ADAS DE
Karvinskia humboldiiana
POR
Q . C . B . LAURA ESTHER MARTINEZ VILLARREAL
TESIS PRESENTADA A LA
FACULTAD DE MEDICINA
DE LA
UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NUEVO LEON
COMO REQUISITO PARCIAL PARA
LA OBTENCION DEL BRADO DE
MAESTRO EN CIENCIAS
CON ESPECIALIDAD EN QUIMICA ANALITICA BIOMEDICA
MONTERREY, N . L .
ENERO DE 1990
DRA. NOEMI WAKSMAN DE
PRESIDENTE
'of i -^ Ä
TORRES
DRA. MIRTHALA MORENO DE DE LA GARZA
SECRETARIO
EDCK PINEYRO LOPEZ
PRIMER VOCAL
DR. MARIO CESAR SALINAS CARMONA
SEGUNDO VOCAL
DRA HERMINIA SPE. MARTÍNEZ RODRIGUEZ
TERCER VOCAL
ASESOR DE TESIS: DRA NOEMI WAKSMAN DE TORRES
DEPARTAMENTO DE FARMACOLOGIA Y TOXICOLÜGIA
FACULTAD DE MEDICINA
U . A . N . L .
AGRADECIMIENTOS
D r . A l f r e d o P i f í e y r o López .
D i r e c t o r de l a F a c u l t a d de M e d i c i n a y
J e f e d e l Departamento de F a r m a c o l o g í a y T o x i c o l o g i a
de l a U . A . N . L .
Con adfli i rae i ón y r e s p e t o po r su apoyo p a r a l a cu1m inac i ón de
e s t e t r a b a j o .
D r a . Noemi Waksman de T o r r e s .
Mi s i n c e r o a g r a d e c i m i e n t o p o r su v a l i o s a a s e s o r í a y p o r
c o m p a r t i r sus c o n o c i m i e n t o s .
S r . R o g e r i o G o n z á l e z A l a n i s .
P o r su apoyo y e l a b o r a c i ó n d e l m a t e r i a l f o t o g r á f i c o de e s t a
t e s i s .
E s t a t e s i s se r e a l i z ó en p a r t e g r a c i a s a l apoyo económico de l a
SEP segCn c o n v e n i o # 86—01—371.
A mis padree
Mauro y Rebeca l e s d e d i c o con amor e s t e t r a b a j o .
A mis hermanos
L u i s , M a r i o , Mar tha , Mauro, Thelma, R o g e l i o y Fe rnanda .
Con c a r i ñ o
A mis compañeros y amigos
Por su apoyo
A mis maestros
Por sus enseñanzas
INDICE
— A b r e v i a t u r a s 10
—In t roduce i ón 11
H i p ó t e s i s 22
O b j e t i v o 23
— M a t e r i a l y métodos 24
I > Métodos g e n e r a l e s 24
I I ) Obtenc ión de l a s t o x i n a s 26
I I I ) P u r e z a de l a s t o x i n a s . . . . 26
IV) E s t u d i o s f i s i c o q u í m i c o s 28
1) S o l u b i l i d a d 28
2) C o e f i c i e n t e de p a r t i c i ó n a p a r e n t e <Kpa)
1 i p i d o / a g u a 28
3) C o n s t a n t e de a c i d e z <K > . . 29 a
A) D e t e r m i n a c i ó n d e l pK^ aprox imado 30
B) Método e s p e c t r o f o t o m é t r i c o 30
C) Método de p a r t i c i ó n . . . 33
4) Degradac ión de l a s t o x i n a s en s o l u c i o n e s acuosas . 34
—Resul tados 36
I ) S o l u b i l i d a d 36
I I ) C o e f i c i e n t e de p a r t i c i ó n a p a r e n t e (Kpa) l í p i d o / a g u a . 36
I I I ) C o n s t a n t e de a c i d e z (K ) . 36 a
1) Método e s p e c t r o f o t o m é t r i c o 42
2) Método de p a r t i c i ó n 46
IV) Deg radac ión de l a s t o x i n a s en s o l u c i o n e s a c u o s a s . . . . 50
—Discus ión 65
—Conc lus iones 72
—Bibl i o g r a f l a * 73
INDICE DE TABLAS
T a b l a I . S o l u b i l i d a d de T544, T514 y T496 en mg/ml 37
T a b l a l í a . C o e f i c i e n t e de p a r t i c i ó n a p a r e n t e íKpa)
1 i p i d o / a g u a de T544 38
T a b l a I l b . C o e f i c i e n t e de p a r t i c i ó n a p a r e n t e (Kpa)
l i p i d o / a g u a de T514 39
T a b l a I l e . C o e f i c i e n t e de p a r t i c i ó n a p a r e n t e <Kpa>
l i p i d o / a g u a de T496 40
T a b l a I I I . C á l c u l o d e l pK aprox imado 41 a
T a b l a IVa . C á l c u l o e s p e c t r o f a t o m é t r i c o d e l pK^ de T 5 4 4 . . . . 47
T a b l a IVb . C á l c u l o e s p e c t r o f o t o m é t r i c o d e l pK^ de T 5 1 4 . . . . 48
T a b l a IVc . C á l c u l o e s p e c t r o f o t o m é t r i c o d e l pK de T 4 9 6 . . . . 49 A
T a b l a V. Ecuac iones de v e l o c i d a d y de v i d a media 54
T a b l a V I . Tiempo de v i d a media de T544 y T514 57
T a b l a V I I . Tiempo de v i d a media de T49é> 61
INDICE DE FISURAS
F i g u r a i . A r b u s t o de l a humboldtiana 12
F i g u r a 2 . D i s t r i b u c i ó n de l a K. humboldtiana en l a
R e p ú b l i c a Mexicana . 13
F igu ra 3. F ru to de la hurnboldtiana 14
F i g u r a 4 . T o x i n a s de l a humboldtiana 17
F i g u r a 5 . P o s i b l e s p r e c u r s o r e s o m e t a b o l i t o s de l a s t o x i n a s
a i s l a d o s d e l f r u t o de l a K. humboldiiana 18
F i g u r a 6 . Método m o d i f i c a d o de D r e y e r . . . . . 27
F i g u r a 7a . E s p e c t r o U V - V i s i b l e de l a T544 43
F i g u r a 7b. E s p e c t r o U V - V i s i b l e de l a T514 44
F i g u r a 7c. E s p e c t r o U V - V i s i b l e de l a T496 45
F i g u r a 8 . G r á f i c a de Kpa vs Kpa/CH+D
p a r a c a l c u l a r KD y 51
F i g u r a 9a . G r á f i c a s de Ln T544 vs t i e m p o . . . . 55
F i g u r a 9b . G r á f i c a s de Ln T514 vs t iempo 56
F i g u r a 10. Cromatograma de T514. E f e c t o d e l t iempo 58
F i g u r a 11. Cromatograma de T 5 1 4 . E f e c t o de l a t e m p e r a t u r a . . . 59
F i g u r a 12. G r á f i c a de Ln T496 vs t iempo a 2 5 ° C , pH2, l u z . . . . 60
F i g u r a 13. Cromatograma de T496 a d i f e r e n t e s pH 62
F i g u r a 14. Cromatograma de T496 a d i f e r e n t e s t i e m p o s . . . . . . . . 63
F i g u r a 15. G r á f i c a de Ln T496 vs t iempo a 7 0 ° C , pH2, l u z . . . . 64
ABREVIATURAS
B /A Benceno /ace tona .
CCF C r o m a t o g r a f í a en capa f i n a .
EM E s p e c t r o de masas.
k C o n s t a n t e de v e l o c i d a d .
K Cons tan te de a c i d e z , a
KD C o e f i c i e n t e de d i s t r i b u c i ó n v e r d a d e r o .
Kpa C o e f i c i e n t e de p a r t i c i ó n a p a r e n t e .
fj F u e r z a i ó n i c a .
pK L o g a r i t m o n e g a t i v o de l a c o n s t a n t e de a c i d e z o b a s i c i d a d .
pK L o g a r i t m o n e g a t i v o de l a c o n s t a n t e de a c i d e z . ct 2
r C o e f i c i e n t e de c o r r e l a c i ó n .
Rf F a c t o r de r e t a r d o ,
rpm R e v o l u c i o n e s p o r m i n u t a .
SNP S is tema n e r v i o s a p e r i f é r i c o .
t í / 2 Tiempo de v i d a media.
INTRODUCCION
La Karuinskia humboldtiana^ también c o n o c i d a comúnmente como
t u l 1 i d o r a o coyot i l i o , es un a r b u s t o que se e n c u e n t r a
d i s t r i b u i d o en t o d o México ( 1 ) , s u r e s t e de l o s E s t a d a s Un idos y
C e n t r o América <2>. ( F i g s . 1 y 2 ) .
Humboldt , Bompland y Kunth d e s c r i b e n a l a h u m b o l d t i a n a como
un á r b o l de mucha e l e v a c i ó n (más comúnmente es un a r b u s t o ) ,
l i s o , no p r e s e n t a o l o r d e s a g r a d a b l e ; posee ramas c i l i n d r i c a s y
l a r g a s , r u g o s a s , i ne rmes , morenas; de r a m i t a s d e l g a d a s ,
l a m p i ñ a s ; h o j a s p e c i o l a d a s c o l o c a d a s en e l t a l l o de manera
a l t e r n a y o p u e s t a s ( 3 ) •
E l f r u t o de l a K' humboldiiana es una d r u p a de c o l o r v i o l e t a
o b s c u r o cuando e s t á maduro ( F i g . 3 ) , de uno a uno y medio
c e n t í m e t r o s de d i á m e t r o , de endocarpo l e ñ o s o , que e n c i e r r a
f r ecuen temente dos s e m i l l a s f é r t i l e s y dos a b o r t a d a s . T iene
a lmendra c e n t r a l a m a r i l l e n t a y g r a s o s a , no t i e n e o l o r , e l sabor
d e l mesocarpo es a g r a d a b l e , d u l z ó n , d e b i d o a l a p r e s e n c i a de
g l u c o s a y c o n t i e n e m a t e r i a c o l o r a n t e v i o l e t a , t a n i n o s y
s u s t a n c i a s p é p t i c a s .
E l f r u t o de l a AT. humbo ld t iana es t ó x i c o , su i n g e s t i ó n p rovoca
una p o l i n e u r o p a t i a ascendente , s i m é t r i c a y p r o g r e s i v a , que en
l o s casos más g r a v e s causa p a r á l i s i s r e s p i r a t o r i a y b u l b a r ( 4 ) .
i» -ÌV.
Figura 1. Arbusto de la A". humbol dt iana.
8 ft
< O X UJ
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Figura 3. Fruto de la K. humboldtiana.
Verde, maduro, y semimaduro.
La i n g e s t i ó n a c c i d e n t a l de e s t e f r u t a produce muerte en humanos
y en ganado ( 5 ) . E l g rado de p a r á l i s i s e s t á en r e l a c i ó n d i r e c t a
con e l c o n t e n i d o de tox i n a s en l o s f r u t o s de d i f e r e n t e s
p rocedenc i as < 6 >'.
Padrón (7) r e f i e r e que ya desde e l s i g l o X V I I I se c o n o c í a que e l
agente t ó x i c o de l a X. humboldtiana se e n c o n t r a b a en l a s e m i l l a
d e l f r u t o , d a t o que aparece en l a ob ra " H i s t o r i a de l a a n t i g u a a
B a j a C a l i f o r n i a " e s c r i t a p o r e l j e s u i t a D. F r a n c i s c o X a v i e r
C l a v i j e r o . Padrón supuso que l a n a t u r a l e z a q u í m i c a d e l agente
tóx i c o e r a h i d r o s o l u b l e . Trece añas más t a r d e (en 1964 ) ,
Anguiano e n c o n t r ó l o s e x t r a c t a s c l o r o f ó r m i c o s d e l f r u t o más
a c t i v o s que l o s e x t r a c t o s acuosos y po r e l l o pensó que e l agente
t ó x i c o e r a l i p o s o l u b l e ( 8 ) .
En 1972, Kim <9) r e p o r t ó e l a i s l a m i e n t o y c a r a c t e r i z a c i ó n
p a r c i a l de una s u s t a n c i a n e u r o t ó x i c a , l a c u a l f u e e x t r a í d a d e l
f r u t o con c l o r o f o r m o y se p r e c i p i t ó con n—hexano, se ob tuvo un
p o l v o a m a r i l l o . E s t e p o l v o f u e p u r i f i c a d o med iante c r o m a t o g r a f í a
en columna de s í l i c a g e l G y e l u i d o con una mezcla de B /A 2 0 / 1 ;
l o s compuestos a s í o b t e n i d o s se a n a l i z a r o n po r CCF. La f r a c c i ó n
p r i n c i p a l de c o l o r amar i l i o se e v a p o r ó y se p r e c i p i t ó con
c l o r o f o r m o / n - h e x a n o . Por medio de l a CCF se o b s e r v ó que se h a b l a
a i s l a d o un s o l o compuesto, r e a l i zándose p r u e b a s de g r u p o
f u n c i o n a l e s como l a d e l F e C l g pa ra i d e n t i f i c a r o x h i d r i l o s
f e n ó l i c o s y l a p rueba de T o l l e n s p a r a a l d e h i d o s . Además, se
r e a l i z ó e l e s p e c t r o de «nasas (EM) para conocer l a compos ic ión
e l e m e n t a l d e l compuesto, l a c u a l fue de C H O con un peso 32 32 a
m o l e c u l a r de 544. Se p r o b ó l a t o n i c i d a d de l a s u s t a n c i a a i s l a d a
en un mono capuch ino p r o v o c á n d o l e c u a d r i p l e j i a y l a muerte .
Más t a r d e ( 1 9 7 5 ) , D r e y e r y c o l a b o r a d o r e s (10) a i s l a r o n e
i d e n t i f i c a r o n c u a t r o s u s t a n c i a s t ó x i c a s . De manera semejante a
Kim, D reye r u t i l i z ó e l e x t r a c t o c l o r o f ó r m i c o d e l f r u t o de l a
ftumfeoldii ana y l a c r o m a t o g r a f l a en columna de s i l i c a g e l G p a r a
l a s e p a r a c i ó n de e s t o s compuestas. Empleó como mezclas B /A de
d i f e r e n t e p o l a r i d a d : 5 0 / 1 , 2 0 / 1 , 1 0 / 1 y 5 / 1 . Para l a
p u r i f i c a c ión de l a s t o x i n a s se r e a l i za ron v a r i a s s e p a r a c i o n e s
c r o m a t o g r á f i c a s de l a s d i f e r e n t e s f r a c c i o n e s o b t e n i d a s de l a
p r i m e r a columna. Mediante un e s p e c t r o de masas de a l t a
r e s o l u c i ó n se e s t a b l e c i ó l a composic ión e lementa l de l a s c u a t r o
s u s t a n c i a s a i s l a d a s ; se l a s l l a m ó T544, T496, T514 y T516 ( e l
núnero r e p r e s e n t a su peso m o l e c u l a r ) . Por medio de l a
e s p e c t r o f o t o m e t r l a i n f r a r r o j a y r e s o n a n c i a magnét ica n u c l e a r , se
l o g r ó c a r a c t e r i z a r l a s s u s t a n c i a s , l a s c u a l e s son d e r i v a d o s
d i an t r a c e n t ín icos y poseen una e s t r u c t u r a común como se o b s e r v a
en l a f i g . 4 .
No se ha e s t u d i a d o l a t o x i c i d a d d e l e x t r a c t o hexán ico d e l f r u t o
de l a X. ftumboldi i ana; de é l se han a i s l a d o c u a t r o compuestos:
c r i s o f a n o l , 7 - m e t o x i e l e u t e r i n a , 6 - 0 H - 7 - m e t o x i e l e u t e r i n a y e l
é t e r monometi 1 ico de l a t a r a c r i s o n a ( f i g . 5 ) . Es tos compuestos
HO O OH
CRISOFANOL
METOXIELEUTER,NA
6* OH - 7 ' METOXIELEUTERINA
ETER MONOMETILICO DE LA TARACRISONA
FIGURA 5 POSIBLES PRECURSORES O METABOUTOS DE LAS TOXINAS AISLADAS DEL FRUTO DE LA K. HUMB0LDT1ANA.
se asemejan a l o s monómeros que componen l o s d imeros de l a s
t o x i n a s y p o r e s t a r a z ó n se sospecha que pueden s e r l o s
p r e c u r s o r e s o m e t a b o l i t o s de l a s d i a n t r a c e n o n a s n e u r o t ó x i c a s
<11) .
Domínguez (5 ) a i s l ó de l a r a í z de l a K. humboldtiana, T544 y
T516, ademáis l a f l a v o n a b a i c a l e i n a y e l f l a v o n o l q u e r c e t i n a y
o t r o s dos nuevos f l a v o n o i d e s (no c a r a c t e r i zados a ú n ) . Los
e x t r a c t o s de l a s h o j a s c o n t i e n e n t r e s de l o s componentes
n e u r o t ó x i c o s e n c o n t r a d o s en e l f r u t o ( 5 ) .
As í mismo, se han a i s l a d a de l a r a í z dos compuestos c o n o c i d o s
como d i m e t i I b e n c i s o c r o m a n o s con a c t i v i d a d a n t i m i c r o b i a n a <12) .
Dada l a t o x i c i d a d que p r e s e n t a e l f r u t o de l a K. humboldiiana,
se han r e a l i z a d o v a r i o s e s t u d i o s e x p e r i m e n t a l e s en d i f e r e n t e s
e s p e c i e s de a n i m a l e s . E l l o d i o l u g a r a a l g u n a s d a t a s
i n t e r e s a n t e s r e s p e c t o de l a a c c i ó n b i o l ó g i c a d e l f r u t o y t o x i n a s
de é l a i s l a d a s .
Escobar y N i e t o (8 ) r e a l i z a r o n i n t o x i c a c i o n e s en g a t o s y r a t a s
b l a n c a s a d m i n i s t r a n d o l a s e m i l i a d e l f r u t o de l a K.
humboldi i.anam Observaron y d e s c r i b i e r o n una p o l i n e u r o p a t í a
d e s m i e l i n i zan te s e g m e n t a r i a . C h a r l t o n y c o l a b o r a d o r e s (13)
e f e c t u a r o n e s t u d i o s en s i s t e m a n e r v i o s o p e r i f é r i c a <SNP).
I n t o x i c a r o n cabras con f r u t o m o l i d o de K.humboldiiana p o r medio
de l a a d m i n i s t r a c i ó n de d i s t i n t a s d o s i s o r a l e s d i a r i a s . Las
l e s i o n e s e n c o n t r a d a s po r e l l o s en SNP r e v e l a r o n i n f 1 salación de
l a s c é l u l a s de Schwann, f r a g m e n t a c i ó n en l a v a i n a de m i e l i n a ,
d e s m i e l i n i z a c i ó n s e g m e n t a r i a y d e g e n e r a c i ó n wa l1e r i ana»
Mi t c h e l 1 y c o l a b o r a d o r e s (14) e s t u d i a r o n l a s p r o p i e d a d e s
n e u r o t ó x i c a s de l a T496 y T544 i n y e c t a n d o l a t o x i n a en e l n e r v i o
c i á t i c o de r a t a p rovocando p a r e s i a en ambos casos ; se o b s e r v ó
d e s m i e l i n i z a c i ón s e g m e n t a r i a en e l n e r v i o i n y e c t a d o .
Mucho se ha e s t u d i a d o acerca d e l daño que p roduce en e l s i s t e m a
n e r v i o s o de l o s a n i m a l e s , l a i n t o x i c a c i ó n con f r u t o y t o x i n a s de
l a K' humboldtiana. Rec ientemente se ha p r o f u n d i z a d o acerca de
l a s v a r i a d a s l e s i o n e s e x t r a n e u r o n a l e s que produce l a
i n t o x i c a c i ó n aguda de f r u t o y t o x i n a s en r a t o n e s , s i e n d o l a s más
i m p o r t a n t e s en h í g a d o y pulmón ( 1 5 ) . La T514 p roduce un mayor
daño hepatopu lmonar que l a T544 <16) .
Deb ido a l o s t r a b a j o s que se e s t á n l l e v a n d o a cabo a c t u a l m e n t e
con l a s t o x i n a s p u r a s como a g e n t e s c i t o t ó x i c o s es de g r a n
i m p o r t a n c i a e l e s t u d i o de sus p r o p i e d a d e s f i s i c o q u í m i c a s como
son su h i d r o s o l u b i 1 i d a d , 1 i p o s o l u b i 1 i d a d , p o l a r i d a d , fo rma ,
tamaño, g rado de i o n i zac i ón, pa ra p redec i r su absorc i ón ,
t r a n s p o r t e , d i s t r i b u c i ó n , metabo l i smo y e l i m i n a c i ó n en e l
o rgan ismo .
Las t o x i n a s también pueden e s t a r s u j e t a s a cambios q u í m i c o s ya
sea s u p r i m i e n d o o i n t r o d u c i e n d o c i e r t o s g r u p o s p a r a p o d e r
m o d i f i c a r su compor tamiento f a r m a c o l ó g i c o y as í f a v o r e c e r l a
d i s t r i b u c i ó n de l a s mismas e n t r e l o s d i f e r e n t e s c o m p a r t i m i e n t o s
p a r a hacer más s e l e t t i va su acc i ón . Además, e l t e n e r
c o n o c i m i e n t o de. l a s e s t r u c t u r a s q u í m i c a s de e s t e t i p o de
compuestos y de sus p r o p i e d a d e s f i s i c o q u í m i c a s , nos p e r m i t i r í a
c o m p a r a r l a s con o t r a s s u s t a n c i a s p r e s e n t e s en l a n a t u r a l e z a y
e s t a b l e c e r una e q u i v a l e n c i a b i o i s ó s t e r a . E l conocer l a r e l a c i ó n
e s t r u c t u r a — a c t i v i d a d de l a s t o x i n a s nos s e r í a ú t i 1 pa ra e l
d e s a r r o l l o de d e r i v a d o s b i o r r e v e r s i b l e s .
HIPOTESIS
D e b i d o a su e s t r u c t u r a q u í m i c a l a s t o x i n a s son á c i d o s d é b i l e s ,
1 i p o s o l u b l e s , termo y f o t o l á b i l e s , más e s t a b l e s en medio á c i d o
que a l c a l i n o . De l a s t r e s t o x i n a s p o d r í a r e s u l t a r l a T514 l a más
á c i d a , l a menos l i p o s o l u b l e y l a más i n e s t a b l e .
OBJETIVO
Conocer e l compor tamiento f i s i c o q u í m i c o de l a s t o x i n a s 544, 514
y 496 a is ladas de K> humboldtiana.
MATERIAL Y METODOS
I ) METODOS GENERALES.
Todos l o s r e a c t i v o s u t i l i z a d o s f u e r o n g rado a n a l í t i c o . Los pH se
m i d i e r o n con un p o t e n c i ó m e t r o Beckman d i g i t a l modela 3500 con
una p r e c i s i ó n de 0 . 0 1 u n i d a d e s . Los e s p e c t r o s y l a s med ic iones
UV—Vi s i b 1 e f u e r o n rea1 i zados en un e s p e c t r o f o t ó m e t r o Beckman
Acta I I I de d o b l e haz con c e l d a s de 1 cm, en e l rango e s p e c t r a l
comp rend i do ent r e 360 y 500 nm. Todas 1as evaporac i ones se
r e a l i z a r o n b a j o N^ pa ra p r e v e n i r l a descompos ic ión .
Se u t i l i z ó una c e n t r í f u g a r e f r i g e r a d a IEC CRU-5000. Los puntos
de f u s i ó n se m i d i e ron en un a p a r a t a e1ec t r a t é r m i ca marca
E l e c t r o t h e r m a l .
Las c u a n t i f i c a c i o n e s en CCF se r e a l i z a r o n p o r r e f l e c t a n c i a en un
e s p e c t r o f o t ó m e t r o modelo PMQ 3 C a r i Z e i s s de acuerdo a l a
m e t o d o l o g í a p r o p u e s t a p o r G u e r r e r o y c o l a b o r a d o r e s ( 6 ) .
Todos l o s e x p e r i m e n t o s se r e a l i z a r o n a t e m p e r a t u r a ambiente
( 22 °C ) , excepto en l o s casos en que se s e ñ a l a n o t r a s
t e m p e r a t u r a s de t r a b a j o . En e s t o s casos , l a s mismas f u e r o n
e s t a b l e c i d a s en un baño B l u e M modelo MW-1120A-1 - 2 ° C .
Las a g i t a c i o n e s se r e a l i z a r o n en
S 8 2 2 3 - 1 . Pa ra l a s med ic iones de
p i p e t a s E p p e n d o r f .
un V o r t e x M i x e r S / P modelo
vo1úmenes pequeños se usaron
I I ) OBTENCION DE LAS TOXINAS.
E l f r u t o de l a K. humboldtiana se r e c o l e c t ó en V i l l a de G a r c í a ,
Nuevo León, se secó en una e s t u f a a 3 5 - 4 0 ° C po r 12 d í a s y se
m o l i ó en un m o l i n o W i l e y M i l l s modelo 4 . Se u t i l i z ó e l método
mod i f i cado de D r e y e r p a r a l a p u r i f i c a c i ón de l a s t o x i n a s
( 6 ) . ( F i g . 6) .
I I I ) PUREZA DE LAS TOXINAS.
A) D e t e r m i n a c i ó n d e l p u n t o de f u s i ó n ( 1 7 ) .
B) C r o m a t o o r a f l a en capa f i n a
Se r e a l i z a r o n s o l u c i o n e s c u a l i t a t i v a s de l a s t o x i n a s y se
a p i i c a r o n en l a s p l a c a s de s i 1 i c a g e l 6 j u n t o con l o s
e s t á n d a r e s . Se e l u y ó con B /A 5 / 1 . Se o b s e r v ó s i e x i s t í a una s o l a
mancha, se d e t e r m i n a r o n l o s Rf y med iante una lámpara de l u z UV
a una X de 375 nm se o b s e r v ó l a f l u o r e s c e n c i a de l a s mismas.
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IV) ESTUDIOS FISICQQUIMICQ5.
1) SOLUBILIDAD,
Se pesó 1 mg de t o x i n a en tubos de v i d r i o 13 x 50 mm,
agregando p o r c i o n e s de 5 jj1 de s o l v e n t e cada vez y a g i t a n d o
has ta o b s e r v a r una s o l u c i ó n homogénea. En l o s casos en que e l mg
de t o x i n a f u e i n s o l u b l e a l a g r e g a r h a s t a 1 mi d e l s o l v e n t e , se
l l e v ó a un volumen de 5 mi , se a g i t ó po r 15 min . y se c e n t r i f u g ó
a 3500 rpm p o r 10 m i n . ; se s e p a r ó e l sob renadante d e l
p r e c i p i t a d o . E l s o b r e n a d a n t e se e x t r a j o con CHCl^ a g i t a n d o p o r
30 s e g . , se s e p a r ó l a f a s e o r g á n i c a l a c u a l se l l e v ó a sequedad
con N^, se a f o r ó con benceno a l i g u a l que e l r e s i d u o . E l
cromatograma se c u a n t i f i c ó po r r e f l e c t a n c i a .
Se u t i 1 i z a r o n l o s s i g u i e n t e s s o l v e n t e s : agua, metano1,
c l o r o f o r m o , n—hexano, n—heptano, n—octano l , d i m e t i I s u l f ó x i d o ,
s o l u c i o n e s b u f f e r de f o s f a t o s de pH 2 . 5 , é», 9 y 12 ( fj = 0 . 2 ) .
Los sob renadantes de pH b á s i c o s se a c i d i f i c a r o n con HC1
concen t rado antes de e x t r a e r .
2) COEFICIENTE DE FARTICION APARENTE <Kpa) LIPIDO/AGUA.
De una s o l u c i ó n de 0 . 2 5 mg/ml de l a t o x i n a en acetona , se
c o l o c a r o n 100 <25 fjg> en tubos de v i d r i o 13 x lOO mm y se
evaporó con c o r r i e n t e de N^ h a s t a sequedad; se a g r e g ó 1 mi de
s o l v e n t e o r g á n i c o y se a g i t ó con 1 mi de b u f f e r p o r 30 s e g . ; se
d e j ó r e p o s a r po r 5 min . Una vez r e s t a b l e c i d o e l e q u i l i b r i o se
s e p a r ó l a f a s e o r g á n i c a , se e v a p o r ó con N^, se a f o r ó con benceno
y l a t o x i n a en e l cromatograma se c u a n t i f i c ó p o r r e f l e c t a n c i a .
En e l caso d e l c o e f i c i e n t e de p a r t i c i ó n a p a r e n t e p a r a l a T496 en
b u t a n o l se r e a l i zó l a c u a n t i f i c a c ión de l a t o x i n a p o r
e s p e c t r o f o t o m e t r í a UV—Vis ib le .
La f a s e acuosa se e x t r a j o con 1 mi de CHCl^, se a g i t ó p o r 30
s e g . , se d e j ó r e p o s a r 5 min . y se s i g u i ó e l mismo p r o c e d i m i e n t o
d e s c r i t o a n t e r i o r m e n t e p a r a l a c u a n t i f i c a c i ó n de l a s t o x i n a s .
Las s o l u c i o n e s acuosas de pH b á s i c o se a c i d i f i c a r o n con HC1
p r e v i a m e n t e a l a e x t r a c c i ó n .
Se u t i l i z a r o n s o l u c i o n e s b u f f e r de f o s f a t o s <fj = 0 . 2 ) de pH 2 . 5 ,
6 , 9 y 12 y como s o l v e n t e s o r g á n i c o s b u t a n o l , c l o r o f o r m o y
n—hexano.
3) CPNSTANTE DE ACIDEZ iKaLs_
La c a n t i d a d de t o x i n a u t i 1 i z a d a en cada caso se a j u s t ó de
acuerdo con l a d i s p o n i b i l i d a d de l a misma. E l volumen de
s o l v e n t e empleado d e p e n d i ó de l a s o l u b i l i d a d de cada uno de l o s
compuestos .
A) DETERMINACION DEL qK APROXIMADO.
a) T544
Se pesaron 5 mg de t o n i n a en un tubo de v i d r i o 16 x ICO mm, se
l e s a g r e g a r o n 3 . 5 mi de acetona + 4 . 5 mi de agua, se a g i t ó y se
m i d i ó e l pH de l a s o l u c i ó n r e s u l t a n t e .
b) T514
Se pesaron 3 mg de t o x i n a en un tubo de v i d r i o 16 x 100 mm, se
l e s a g r e g a r o n 2 mi de acetona + 4 mi de agua, se a g i t ó y se
m i d i ó e l pH de l a s o l u c i ó n r e s u l t a n t e .
c) T496
Se pesaron 5 mg de t o x i n a en un tubo de v i d r i o 16 x 100 mm, se
l e s ag rega ron 4 mi de acetona + 4 mi de agua , se a g i t ó y se
m i d i ó e l pH de l a s o l u c i ó n r e s u l t a n t e .
B> METODO ESPECTRQFOTOMETRICO.
a) BARRIDO DEL ESPECTRO UV -V IS IBLE .
1) T544
i ) 500 jul de T544 a l 0.06257. ( ace tona : agua 3 . 5 : 4 . 5 ) + una g o t a
de HC1 conc. se a f o r a r o n a 10 mi con a c e t o n a - a g u a 50% .
i i > 500 fj 1 de T544 a l 0.0625% (ace tona : agua 3 . 5 : 4 . 5 ) + una g o t a
de NaOH 0 . 1 N se a f o r a r o n a 10 mi con a c e t o n a - a g u a 50% .
2 ) T514
i ) 500 ¿jI de T514 a l 0.05% (ace tona :agua 1 : 2 ) + una g o t a de HC1
conc . se a f o r a r o n a 10 mi con acetona—agua 50'/. .
i i ) 500 jul de T514 a l 0.05"/. ( acetona : agua 1 : 2 ) + una g o t a de NaOH
O.1N se a f o r a r o n a 10 mi con acetona—agua 50% .
3 ) T496
i ) 125 ¿J1 de T496 a l 0.1% en acetona + 3 mi de acetona + una
g o t a de HC1 conc. se a f o r a r o n a 10 mi can acetona—agua 50%
i i ) 125 ¿j1 de T496 a l 0.1% en acetona + 3 mi de acetona + una
g o t a de NaOH 0 . 1 N se a f o r a r o n a 10 mi con acetona—agua 50%
b) DETERMINACION DEL pK^
1) T544
Se p r e p a r ó una s o l u c i ó n de T544 a l 0.05% (acetona—agua 50%).
PROCEDIMIENTO:
i ) 500 p l de l a s o l u c i ó n + una go ta de HC1 conc. se a f o r a r o n a
10 mi con acetona -agua ( 1 : 1 ) .
i i ) 500 de l a s o l u c i ó n + una g o t a de NaOH 0 .1N se a f o r a r o n a
10 mi con acetona—agua ( 1 : 1 > .
i i i ) 500 fj 1 de l a s o l u c i ó n se a f o r a r o n a 10 mi con e l b u f f e r
c o r r e s p o n d i e n t e . Se t r a b a j ó con b u f f e r de f o s f a t o s <p = 0 . 0 4 ) de
pH 7 . 6 , 7 . 7 9 , 8 . 4 y 8 . 6 . La c o n c e n t r a c i ó n de l a s s o l u c i o n e s
f i n a l e s f u e de 4 . 6 x 10 Se m i d i ó l a a b s o r b a n c i a a 410, 425 y
435 nm.
2) T514
Se p r e p a r ó una s o l u c i ó n de T514 a l 0.05% ( a c e t o n a - a g u a 1 : 2 ) .
PROCEDIMIENTOS
i ) 250 f j l de l a s o l u c ión +• una go ta de HC1 conc . se a f o r a r o n a
10 mi con (acetona—agua 1 : 2 ) .
i i ) 250 ¿il de l a s o l u c i ó n + una g o t a de NaOH 0 . 1N se a f o r a r o n a
10 mi con (acetona—agua 1 : 2 ) .
i i i ) 250 f j l de l a s o l u c i ó n se a f o r a r o n a ÍO mi con e l b u f f e r
c o r r e s p o n d i e n t e . Se t r a b a j ó con b u f f e r de f o s f a t o s i f j = 0 . 0 4 ) de
pH 7 . 2 5 , 7 . 8 y 7 . 8 5 . La c o n c e n t r a c i ó n de l a s s o l u c i o n e s f i n a l e s
f u e de 2 . 4 x 10 sft. Las a b s o r b a n c i a s se m i d i e r o n a 410 , 421 y
430 nm .
3) T496
Se p r e p a r ó una s o l u c i ó n de T496 a l 0.25% en acetona .
PROCEDIMIENTO;
i ) 100 fj 1 de l a s o l u c i ó n + una g o t a de HC1 conc. se a f o r a r o n a
10 mi con una s o l u c i ó n de NaCl i f j = 0 . 0 5 ) .
i i ) 100 /J1 de l a s o l u c i ó n + una go ta de NaOH
10 mi con una s o l u c i ó n de NaCl {fj = 0 . 0 5 ) .
i i i ) 100 ¡ j l de l a s o l u c i ón se a f o r a r o n a 10
c o r r e s p o n d i e n t e . Se t rabad ó con b u f f e r de
s o d i o (f j = 0 . 0 5 ) de pH 1 0 . 5 7 , 10 .77 ,
c o n c e n t r a d ón de l a s s o l u c i o n e s f i n a l e s f u e
m i d i ó l a a b s o r b a n c i a a 380 , 400 y 425 nm.
C) METODO DE PARTICION-
DETERMINACION;
1) T544
De una s o l u c i ó n de 1 mg/ml en o c t a n o l se c o l o c a r o n 50 ¡j1 en
tubos Eppendor f y se l l e v a r o n a 500 fj 1 con o c t a n o l , se a g i t ó con
500 p l de buf f e r y se c e n t r i f u g ó po r 10 min . ; se tomó 0 . 3 mi de
l a f a s e o r g á n i c a , se l l e v ó a 2 . 6 mi con o c t a n o l y se l e y ó l a
a b s o r b a n c i a a 415 nm. Se t r a b a j ó a una c o n c e n t r a c i ó n i n i c i a l de
1 . 8 x 10~4M.
0 .1N se a f o r a r o n a
ml con e l b u f f e r
t e t r a b o r a t o de
10 .91 y 1 0 . 9 8 . La
de 5 x 10"SM. Se
2) T 5 Í 4
De una s o l u c i ó n de 0 . 5 mg/ml en o c t a n o l se c o l o c a r o n 100 ¿¿1 en
tubos E p p e n d o r f y se l l e v a r o n a 500 con o c t a n o l , se a g i t ó con
500 ¿jl de b u f f e r y se c e n t r i f u g ó p o r 10 m i n . ; se tomó 0 . 3 mi de
l a f a s e orgánica, se l l e v ó a 2 . 6 mi con o c t a n o l y se l e y ó l a
a b s o r b a n c i a a 402 nm. Se t r a b a j ó a una c o n c e n t r a c i ó n i n i c i a l de
1 . 9 x 10~4M.
P a r a ambas d e t e r m i n a c i o n e s se u t i l i z a r o n b u f f e r de f o s f a t o s de
pH 6 . 1 , 6 . 8 , 7 . 6 , 8 y 8 . 3 = 0 . 0 4 ) .
En ambos casos l a s c u r v a s de c a l i b r a c i ó n c o r r e s p o n d i e n t e s se
r e a l i z a r o n con l a s t o x i n a s p u r a s d i s u e l t a s en o c t a n o l .
Notas E l o c t a n o l y l o s b u f f e r s se s a t u r a r o n uno con e l o t r o
a n t e s de r e a l i z a r l a p a r t i c i ó n .
4 ) DEGRADACION DE LAS TOXINAS EN SOLUCIONES ACUOSAS
A p a r t i r de una s o l u c i ó n de 0.025% (en acetona ) de l a t o x i n a , se
c o l o c a r o n 100 ¡jI ( 0 . 0 2 5 mg) en t u b o s de v i d r i o 13 x lOO mm, se
a g r e g ó 1 mi d e l b u f f e r c o r r e s p o n d i e n t e , se a g i t ó y se tapó .
E l e s t u d i o se l l e v ó a cabo a 2 5 ° , 3 7 ° y 70°C y en c o n d i c i o n e s de
l u z y o s c u r i d a d ; se u t i l i z a r o n b u f f e r de f o s f a t o s ifj - 0 . 2 ) de
pH 2 . 5 , 6 , 9 y 12.
A d i s t i n t o s i n t e r v a l o s de t iempo se r e t i r a r o n l o s tubos de l o s
bafíos de t e m p e r a t u r a c o n t r o l a d a , se ag regó 1 mi de CHCl g , se
a g i t ó po r 30 seg . y se s e p a r ó l a f a s e o r g á n i c a , l a c u a l se
e v a p o r ó con se l l e v ó a un volumen c o n o c i d o en benceno. La
t o x i n a remanente se c u a n t i f i c ó en CCF p o r r e f l e c t a n c i a . Todos
l o s e s t u d i o s c i n é t i c o s se r e a l i z a r o n h a s t a t iempos mayores de
dos veces e l t i / 2 p a r a cada una de l a s c o n d i c i o n e s .
Se m i d i ó e l pH de l a s s o l u c i o n e s d u r a n t e todo e l t iempo que d u r ó
e l ensayo .
RESULTADOS
Todos l o s r e s u l t a d o s p r e s e n t a d a s en l a s s i g u i e n t e s t a b l a s son
p romedio de p o r l o menos t r e s d e t e r m i n a c i o n e s , con excepc ión de
l a d e t e r m i n a c i ó n de s o l u b i 1 i d a d , p a r a l a c u a l se r e a l i zó una
med ic ión ú n i c a .
I ) SOLUBILIDAD (18 ) •
Los r e s u l t a d o s de l a p rueba de s o l u b i l i d a d se muest ran en l a
t a b l a I .
I I > COEFICIENTE DE FARTICIQN APARENTE (Kpa) LIPIDQ/AGUA ( 1 9 ) .
Los r e s u l t a d o s de l o s c o e f i c i e n t e s de p a r t i c i ó n a p a r e n t e s se
muestran en l a t a b l a I I a, b y c .
I I I ) CONSTANTE DE ACIDEZ ( K J .
Se u t i 1 i z a r o n dos métodos d i s t i n t o s p a r a hacer l a s
d e t e r m i n a c i o n e s . En ambos casos e r a n e c e s a r i o conocer
p r e v i a m e n t e e l rango d e n t r o d e l c u a l e s t a b a e l pK de cada una
de l a s t o x i n a s . Pa ra e l l o se m i d i ó e l pH de s o l u c i o n e s de
c o n c e n t r a c i ó n c o n o c i d a de cada una de e l l a s en acetona—agua y ,
po r medio de l a ecuac ión de Henderson H a s s e l b a l c h , se c a l c u l a r o n
l o s v a l o r e s que f i g u r a n en l a T a b l a I I I . Con e l l o se pudo
conocer e l rango de pH a l c u a l se i b a a t r a b a j a r p a r a hacer l a s
de te rminac i ones .
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I ) METODO ESPECTROFOTGHETFTICO•
E l método e s p e c t r o f o t o m é t r i c o p a r a l a d e t e r m i n a c i ó n d e l pK^ ha
s i d o ampl iamente u t i l i z a d a p a r a conocer e l pK de o t r o s fá rmacos .
H u r w i t z (18) l o u t i l i z ó p a r a d e t e r m i n a r e l P ^ a de e s t r é n e n o s .
La e c u a c i ó n empleada p a r a c a l c u l a r e l pK p o r e s t e método se di
deduce a p a r t i r de l a e c u a c i ó n de H e n d e r s o n - H a s s e l b a l c h .
pK = pH - l o g (ft) ~ (fta) (1) ¿I
(Ab) - (A)
Donde:
A = a b s o r b a n c i a de una s o l u c i ó n a l pH
c o n s i d e r a d o y a una dada X.
Aa — a b s o r b a n c i a de l a misma s o l u c i ó n a l a
misma X. y a un pH á c i d o .
Ab = a b s o r b a n c i a de l a misma s o l u c i ó n a l a
misma X y a un pH b á s i c o .
Aa y Ab se deben m e d i r a l e j a d a s un mínimo de dos u n i d a d e s de pK
p a r a que toda l a s u s t a n c i a e s t é en fo rma i o n i z a d a y no i o n i z a d a
r e s p e c t i v a m e n t e . Además, o t r o r e q u i s i t o p a r a que se cumpla l a
e c u a c i ó n 1, es que e x i s t a v a r i a c i ó n en e l e s p e c t r o U V - V i s i b l e
p a r a l a fo rma i o n i z a d a y no i o n i z a d a s de e s t a s m o l é c u l a s . Po r
e l l o f u e n e c e s a r i o r e a l i z a r p r e v i a m e n t e e l e s p e c t r o U V — V i s i b l e
de cada uno de l o s c o m p u e s t o s . ( F i g . 7 . a , b y c ) .
425nm
4(0nm
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380 nm
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Para s a c a r un p romed io d e l v a l o r d e l pK^ se d e t e r m i n a r o n l a s
a b s o r b a n c i a s de l a s s o l u c i o n e s a 3 X d i f e r e n t e s , l a X de
a b s o r b a n c i a máxima p a r a l a forma b á s i c a , p a r a l a á c i d a y o t r a X
i n t e r m e d i a . ( T a b l a IV a , b y c ) .
2> METODO DE PARTICION.
Ezumi (19) u t i l i z ó e s t e método p a r a d e t e r m i n a r e l pK^ de a l g u n o s
fármacos , aunque e l e q u i l i b r i o c o r r e s p o n d i e n t e h a b l a s i d o
d e s c r i t o en 1953 ( 2 0 ) .
S i cons ideramos e l s i g u i e n t e e q u i l i b r i o s
Fase o r g á n i c a
AHorg A o r g . / 4
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Fase acuosa
K = CH •"*" ao3 CA ao3 (2) ¿I a 1
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Y c o n s i d e r a n d o que a un pH cercano a l pK (A ) o r g = O, l o s
c o e f i c i e n t e s de r e p a r t o que se c a l c u l a r o n ( T a b l a I I ) f u e r o n
a p a r e n t e s y d e p e n d i e r o n d e l pH de l a f a s e acuosa .
Kpa = (AHoro)
(AHaq) + (A~aq>
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EX c o e f i c i e n t e de d i s t r i b u c i ó n v e r d a d e r o (KD) es e l que
i n t e r e s a en l o s e s t u d i o s f i s i c o q u í m i c o s y e s t á d i rectamente
r e l a c i o n a d a can l a K . a
KD = (AHoro) (4)
(AHaq)
R e l a c i o n a n d o l a s e c u a c i o n e s 2 , 3 y 4 l l egamos a l a ecuac ión 5
donde:
Kpa = KD - K a Kpa <5)
CH-3
Por l o t a n t o g r a f i c a n d o Kpa p a r a d i s t i n t o s pH c o n t r a Kpa/CH + 3 se
debe o b t e n e r una l i n e a r e c t a de cuya p e n d i e n t e se c a l c u l a K y el
KD de l a o rdenada a l o r i g e n .
Las g r á f i c a s que o b t u v i m o s en n u e s t r o caso se muestran en l a
F i g . 8 . Los v a l o r e s de KD y pK p a r a l a T544 f u e r o n de 11 .4 d
- 0 . 1 5 y 8 . 4 2 - 0 . 3 r e s p e c t i v a m e n t e y p a r a l a T514 de
8 . 2 - 0 . 1 2 y 7 . 2 6 - O . 2 5
IV ) DEGRADACION DE LAS TOXINAS EN SOLUCIONES ACUOSAS.
Para poder c a l c u l a r l a v i d a media de l a s t o x i n a s , neces i tábamos
conocer l a c o n s t a n t e de v e l o c i d a d de l a r e a c c i ó n , l a c u a l
ob tuv imos a l d e t e r m i n a r e l o r d e n de r e a c c i ó n .
FIGURA 8 GRAFICA DE Kpa vs K p a / [ H ~ H PARA CALCULAR KD Y Ka / L_ _l CONCENTRACION INICIAL DE T544 r 1.8 X IO-4 M. (4l5nm) CONCENTRACION INICIAL DE T514 - 1.9 X IO-4 M. (402 nm ) SOLVENTES: OCTANOL Y BUFFERS DE FOSFATOS pH 6.1, 6.8, 76. 8 Y 8 . 3 ( / < r 0.04 )
Empleamos e l método g r á f i c o (21) p a r a a v e r i g u a r l a c i n é t i c a de
degradac i ón que s i guen 1as tox i n a s . Pa ra cada o rden de reacc i ¿n
ex i s t e una ecuac i ¿n de v e l o e i dad <Tabla V ) . La 1 i n e a r i d a d f ya
sea de C, LnC o 1 /C en f u n c i ó n d e l t iempo nos i n d i c a l a c i n é t i c a
de l a r e a c c i ó n . De l a p e n d i e n t e de l a r e c t a se c a l c u l a l a
c o n s t a n t e de v e l o c i d a d y é s t a se s u s t i t u y e en l a ecuac ión de
v i d a media c o r r e s p o n d i e n t e p a r a e l o rden de r e a c c i ó n e n c o n t r a d o
(Tab la V ) .
La c i n é t i c a de d e g r a d a c i ó n que s i g u i e r o n l a s t o x i n a s T544 y T514
f u e de p r i m e r o rden ( F i g s . 9a y b ) . Aquí se muestran a l g u n a s de
l a s g r á f i c a s o b t e n i d a s p a r a l a s d i f e r e n t e s c o n d i c i o n e s d e l
es t u d i o ; t od as f u e r o n seme j a n t e s .
No hubo v a r i a c i ó n s i g n i f i c a t i v a d e l pH de l a s s o l u c i o n e s a l cabo
d e l t i empo .
Empleamos l a ecuac idn t l / 2 = 0 . 6 9 3 / k p a r a c a l c u l a r l a v i d a media
de cada una de l a s t o x i n a s ( T a b l a V I ) .
Un e j e m p l o d e l e f e c t o d e l t iempo y l a t e m p e r a t u r a s o b r e l a T514
se puede o b s e r v a r en l a s f i g u r a s 10 y 11.
Pa ra l a T496 a 2 5 ° y 37°C y a pH á c i d o s se p r e s e n t ó también una
c i n é t i c a de p r i m e r o r d e n ( F i g . 12 ) y se c a l c u l ó su v i d a media
( T a b l a V I I ) , p e r o a pH b á s i c o s no f u e p o s i b l e c a l c u l a r su
c i n é t i c a ya que l a T496 se t r a n s f o r m a en o t r o compuesto en un
t iempo r e l a t i v a m e n t e c o r t o , a l r e d e d o r de 5 m i n u t o s ( F i g s . 13 y
1 4 ) . A P H á c i d o y a 70°C aparece también e l mismo compuesto. En
l a F i g . 1 5 se p r e s e n t a l a c i n é t i c a que s i g u i ó l a T496 en d i c h a s
c o n d i c i o n e s .
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3.73767 -
Ln O 4.55" 5.826 X 10'3T
R2- 0.9601
9 0 HORAS 120
pH 25 25° C
3.67795
3.33220 -
L n C = 4 . 4 0 3 1 - 7 3 1 7 X I 0 _ 3 t
f2= 0.9437
90 120 HORAS
T544 OSCURIDAD I pH 2.5 70* C
FIGURA 9A GRAFICAS DE Ln T544 VS TIEMPO CONCENTRACION INICIAL = 0.025 mg/ml. BUFFER DE FOSFATOS (/<=0.2)
FIGURA 9t> GRÁFICAS DEL Ln T5I4 VS TIEMPO CONCENTRACION INICIAL = 0.025 mg/mL BUFFER DE FOSFATOS ÍM = 0.2 )
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F i g u r a 10. E f e c t o d e l t iempo. A: 2 h r
B: 8 h r
Cromatograma de T514 a pH2 ( b u f f e r de f o s f a t o s ^ =
25°C ( R ) , 37°C ÍS> y 70°C <Q>; l u z ÍL) y o s c u r i d a d Í O ) .
C o n c e n t r a c i ó n i n i c i a l : 0 . 0 2 5 mg/ml .
A d s o r b e n t e : S í l i c a g e l S 60 Merck, espesor de capa 0 . 2
S is tema de s o l v e n t e : B /A 3 / 1 .
RL RO SL SO QL QO
F i g u r a 11. E f e c t o de l a t e m p e r a t u r a .
Cromatograma de T514 a pH 2 ( b u f f e r de f o s f a t o s fj = 0 . 2 ) ; t iempo
de i n c u b a c i ó n B h r , 25 °C ( R ) , 37 °C (S) y 70°C ( Q ) ; l u z (L) y
o s c u r i d a d ( O ) .
C o n c e n t r a c i ó n i n i c i a l : 0 . 0 2 5 mg /ml .
A d s o r b e n t e : S i l i c a g e l 6 óO Merck, espesor de capa 0 . 2 mm.
S is tema de s o l v e n t e : B /A 3 / 1
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F i g u r a 13. Cromatograma de T496 a d i s t i n t o s pH.
C o n d i c i o n e s : 24 h r , 37 °C , l u z .
C o n c e n t r a c i á n i n i c i a l : 0 . 0 2 5 mg/ml .
Adsorbentes S i l i c a Qel B ¿SO Merck, espesor de capa 0 . 2 M .
S is tema de s o l v e n t e : B /A 5 / 1 .
a : E s t á n d a r de T496
b; pH 2
c: pH 6
d s pH 9
es pH 1 1 . 5
B u f f e r de f o s f a t o s (¡j = 0 . 2 ) .
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F i g u r a 14. Cromatograma de T496 a d i f e r e n t e s t iempos ; l u z ,
pH9 ( b u f f e r de f o s f a t o s /J = 0 . 2 ) .
C o n c e n t r a c i ú n i n i c i a l : 0 . 0 2 5 mg/ml
A d s o r b e n t e : S í 1 i c a g e l 6 60 Merck « espesor de capa 0 . 2 mm.
S is tema de s o l v e n t e : B /A 5 / 1 .
a: 0 minutos
b : 3 minutos
c : 5 m inu tos
N 3 .J CM
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DISCUSION
No e x i s t e n i n g ú n d a t o c u a n t i t a t i v o en l a l i t e r a t u r a con r e s p e c t o
a l a s o l u b i l i d a d de l a s t o x i n a s , aunque ya se t e n í a una i d e a de
su 1 i p o s o l u b i 1 i dad Í 8 ) .
E s t e t i p o de compuestos posee s u s t i t u y e n t e s h i d r ó f i l o s en s u
e s t r u c t u r a a n t r a c e n á i i c a <F íg . 4 ) , l o que l e c o n f i e r e una
1 i p o s o l u b i 1 i d a d i n t e r m e d i a ; como consecuenc ia de e l l o no son muy
s o l u b l e s n i en s o l v e n t e s p o l a r e s n i en s o l v e n t e s no p o l a r e s .
Las t o x i n a s en medios a l c a l i n o s t i e n d e n a i o n i z a r s e d e b i d o a que
son á c i d o s d é b i l e s , p o r eso p r e s e n t a n una mayor s o l u b i l i d a d en
medios acuosos a l c a l i n o s que en medios acuosos á c i d o s (Tab la I ) .
E x i s t e una d i f e r e n c i a e s t r u c t u r a l i m p o r t a n t e en e l s i s tema
a n t r a c e n ó n i c o no común. La T514 posee un g rupo o x h i d r i l o
a l c o h ó l i c o , l o c u a l l a hace más p o l a r que l a T496 ( F i g . 4 ) .
La mayor p o l a r i d a d de l a T514 se ve c l a r a m e n t e en su s o l u b i l i d a d
en e l agua y en l o s s i s t e m a s acuosos a d i f e r e n t e s pH ( T a b l a I )
con r e s p e c t o a l a s o t r a s dos t o x i n a s .
Además, comparando l a s o l u b i 1 idad de l a T514 a pH 2 . 5 y 6
( T a b l a 1) con l o s d a t o s c o r r e s p o n d i e n t e s de T496 y T544 se
o b s e r v a un aumento de s o l u b i l i d a d so lamente p a r a l a p r i m e r a a l
aumentar e l pH. Se p o d r í a pensar que e s t a t e n d e n c i a se
c o r r e s p o n d e con l o s pK e n c o n t r a d o s ( v e r más a d e l a n t e ) . s
La T544 p r e s e n t a escasos g r u p o s p o l a r e s en l a e s t r u c t u r a no
comúi ( F i g . 4) p o r l o que posee una mayor s o l u b i 1 idad en l o s
s o l v e n t e s no p o l a r e s y de p o l a r i d a d i n t e r m e d i a .
En g en e r a 1 se c on f i rman 1os r e s u 1 1 ados ob t en i dos en l a
d e t e r m i n a c i ó n de s o l u b i l i d a d con l o s v a l o r e s e n c o n t r a d o s p a r a e l
c o e f i c i e n t e de p a r t i c i ó n a p a r e n t e (Kpa) l i p i d o / a g u a pa ra l a s
t r e s t o x i n a s ( 1 7 ) :
- E l c o e f i c i e n t e de p a r t i c i ó n a p a r e n t e es mayor en c l o r o f o r m o
que en n - h e x a n o y bu tano1 , l o c u a l r e a f i r m a l a mediana
1 i p o s o 1 u b i 1 idad de e s t o s compuestos.
- En medios acuosos á c i d o s se p r e s e n t a un mayor c o e f i c i e n t e de
p a r t i c i ó n a p a r e n t e que en medios acuosos a l c a l i n o s , ya que en
e s t o s ú l t i m o s e x i s t e i o n i z a c i ó n y , como señalamos a n t e r i o r m e n t e ,
mayor s o l u b i 1 idad en l a f a s e acuosa .
- La t o x i n a menos s o l u b l e en med i os acuosas ác i dos (T496)
p r e s e n t a e l mayor c o e f i c i e n t e de p a r t i c i ó n a p a r e n t e en
c l o r o f o r m o m i e n t r a s que l a más s o l u b l e (T514) p r e s e n t a e l menor
c o e f i c i e n t e de p a r t i c i ó n a p a r e n t e .
La t i t u l a c i ó n p o t e n c i o m é t r i c a , comúnmente ú t i l i z a d a p a r a l a
d e t e r m i n a c i ó n d e l pK , no f u e p o s i b l e a p l i c a r l a en n u e s t r o caso
d e b i d o a l a escasa s o l u b i l i d a d que p r e s e n t a n l a s t o x i n a s en agua
y po r l a c a n t i d a d de s u s t a n c i a r e q u e r i d a p a r a e l e s t u d i o
(aproximadamente 50 mg) s i se r e a l i z a r a en s o l v e n t e s no acuosos
( 2 2 ) -
Para l a d e t e r m i n a c i ó n d e l empleamos dos métodos i n d i r e c t o s
( e s p e c t r o f o t o m é t r i c o y de p a r t i c i ó n ) . E s t o s métodos se basan en
l o s cambios q u í m i c o s que p r e s e n t a n e s t o s t i p o s de compuestos a l
v a r i a r e l pH, l o c u a l o r i g i n a e s p e c i e s i o n i z a d a s y no i o n i z a d a s .
Cada una de e l l a s muest ra p r o p i e d a d e s f í s i c a s d i f e r e n t e s , l o
c u a l l a s hace p r o p i c i a s pa ra su d e t e r m i n a c i ó n .
La base de l a med ic ión p o r e l método e s p e c t r o f o t o m é t r i c o , r a d i c a
en l a s a b s o r b a n c i a s d i f e r e n c i a l e s que p r e s e n t a n l a s d i s t i n t a s
e s p e c i e s ( i o n i z a d a s y no i o n i z a d a s ) a d i s t i n t a s
Se c a l c u l a e l pK^ p o r medio de l a ecuac ión 1 ( R e s u l t a d o s ) . En
e s t e caso pa ra que d i c h a ecuac ión se cumpla debemos de t r a b a j a r
a l o s pH adecuados.
E l método de p a r t i c i ó n p a r a l a med ic ión d e l pK se fundamenta en el
l a d i f e r e n c i a de s o l u b i 1 idad que e x i s t e e n t r e l a s fo rmas
i o n i z a d a s y no i o n i z a d a s a l o s d i s t i n t a s pH empleados ; tomando
en c u e n t a l o s d i f e r e n t e s e q u i l i b r i o s que e x i s t e n en s o l u c i ó n , se
1 lega a l a ecuac ión 5 ( R e s u l t a d o s ) , a t r a v é s de l a c u a l se
o b t i e n e l a K . a
Para e s t a d e t e r m i n a c i ó n se u t i 1 i z a de p r e f e r e n c i a n—heptaño
d e b i d a a que l a d i s o c i a c i ó n i ó n i c a es menor en e s t e s o l v e n t e . En
n u e s t r o t r a b a j o no f u e p o s i b l e e m p l e a r l o dada l a escasa
s o l u b i l i d a d que p r e s e n t a n l a s t o x i n a s en e l mismo ( T a b l a I ) . En
su l u g a r usamos n—octano l , e l c u a l también ha s i d o r e p o r t a d o
como s o l v e n t e ú t i l p a r a d e t e r m i n a r l a K^ de a l g u n o s compuestos
( 1 9 ) . En e s t e caso se hace n e c e s a r i o s a t u r a r l a s f a s e s e n t r e s i
a n t e s de r e a l i z a r l a p a r t i c i ó n , p a r a o b t e n e r una me jo r
s e p a r a c i ó n de l a s mismas.
La cuant i f i cac i ón en e s t e caso no se 11evó a cabo p o r
c r o m a t o g r a f i a en capa f i n a , a p e s a r de s e r más s e n s i b l e que l a
e s p e c t r o s c o p í a UV—Vis ib le , d e b i d o a l a d e g r a d a c i ó n que
p r e s e n t a b a n l a s t o x i n a s a l e v a p o r a r con N2 e l o c t a n o l .
La T514 p r e s e n t ó l a mayor a c i d e z , l e s i g u i ó l a T544 y p o r ú l t i m o
1 a T49¿>. E s t e o r d e n c o r r e l a c i o n a b i e n con l o s d a t o s de
s o l u b i l i d a d ( T a b l a I ) . Observamos que l a T514 con un pK oL
a l r e d e d o r de 7 . 2 ( T a b l a IVb) aumenta su s o l u b i l i d a d a l pasar de
pH 2 a ¿>, en e l c u a l ya e s t á p a r c i a l m e n t e i o n i z a d a . E s t o no
sucede con l a s o t r a s dos t o x i n a s . Pa ra l a T544 con un pK
a l r e d e d o r de 8 . 4 ( T a b l a IVa ) sucede l o mismo p e r o a l cambiar de
pH 6 a 9 ( T a b l a I ) .
Las v e n t a j a s que p r e s e n t a n e s t o s métodos p a r a l a med ic ión de l a
K es su s e n c i l l e z , s e n s i b i l i d a d y c o n f i a b i 1 i d a d ; p o r l o c u a l el
recomendamos su uso . La p o s i b l e d i f e r e n c i a en l a e f i c i e n c i a de
ambos métodos se d e t e r m i n ó med iante l a p rueba t de S t u d e n t dando
una p no s i g n i f i c a t i v a .
Con a n t e r i o r i d a d a e s t e t r a b a j o , suponíamos que l a s t o x i n a s
f u e r a n i n e s t a b l e s , p e r o no conocíamos sus c a r a c t e r l s t i c a s . E l
e v a l u a r 1a deg radac i ón de e s t o s compuestos a d i f e r e n t e s
c o n d i c i o n e s de pH f t e m p e r a t u r a e i l u m i n a c i ó n , nos p e r m i t e una
m e j o r m a n i p u l a c i ó n en e l a i s l a m i e n t o , p u r i f i c a c i ón,
a lmacenamiento y medios de r e a c c i ó n (23 , 24 , 25 y 2 6 ) .
La m a y o r í a de l o s p r o c e s o s o b s e r v a d o s en l a n a t u r a l e z a s i g u e n
una c i n é t i c a de p r i m e r o r d e n ( 2 7 ) . La T544 y T514 s i g u i e r o n e s t e
t i p o de c i n é t i c a p a r a su d e g r a d a c i ó n en l a s d i f e r e n t e s
c o n d i c i o n e s empleadas.
Tanto l a T544 como l a T514 f u e r o n más i n e s t a b l e s en medios
a l c a l i n o s , en l a l u z y a l aumentar l a t e m p e r a t u r a ( F i g . 1 1 ) . En
g e n e r a l l a T514 p r e s e n t ó menor e s t a b i l i d a d que l a T544.
Cabe a c l a r a r que l a d e g r a d a c i ó n de l a T514 a pH 12 ( T a b l a V I )
no se l l e v ó a cabo d e b i d a a que l a e x t r a c c i ó n con c l o r o f o r m o no
f u e p o s i b l e . E s t o se e x p l i c a po rque l a t o x i n a e s t á t o t a l m e n t e
i o n i z a d a a ese pH (pK = 7 . 2 7 -- 0 . 0 9 , Kpa CHC1 / p H 12 = 0 . 0 6 4 ) . d d
La i n f 1 u e n c i a d e l pH en l a degradac i ón que p r e s e n t a r o n l a s
t o x i n a s se debe a su e s t r u c t u r a f e n ó l i c a . En medios a l c a l i n o s ,
e s t e t i p o de compuestos se t r a n s f o r m a en su base c o n j u g a d a ; é s t a
es muy i n e s t a b l e y r e a c t i v a , dando l u g a r a d i v e r s o s p r o d u c t o s de
o x i d a c i ó n ( 2 8 ) .
La o x i d a c i ón de f e n o l e s se puede 1 l e v a r a cabo p o r
a u t o — o x i d a c i ó n a t r a v é s de r a d i c a l e s l i b r e s ( 2 9 ) . En n u e s t r o
caso , l a s tox i n a s p r e s e n t a n e s t e t i p o de e s t r u c t u r a ; l a
d e g r a d a c i ó n que observamos con l a l u z , se p o d r í a e x p l i c a r p o r
e s t e mecanismo. Además, se conoce que e l aumento de t e m p e r a t u r a
a c e l e r a l o s p r o c e s o s de o x i d a c i ó n .
Los r e s u 1 t a d o s ob ten i d o s con 1a T496 l o s cons ideramos a p a r t e p o r
p r e s e n t a r un compor tamiento d i s t i n t o de l a s o t r a s t o x i n a s .
Es te compuesto f u e (en g e n e r a l ) más i n e s t a b l e que l o s o t r o s en
t o d a s l a s c o n d i c i o n e s empleadas .
Como ya se mencionó a n t e r i o r m e n t e ( R e s u 1 t a d o s ) , l a T496 se
t r a n s f o r m a a o t r o compuesto a pH a l c a l i n o ( F i g . 13) y a todas
l a s t e m p e r a t u r a s e s t u d i a d a s (a pH á c i d o s so lamente a 7 0 ° C ) , en
un t iempo c o r t o . Deb ido a é s t o no se pudo d e t e r m i n a r su
s o l u b i 1 i d a d , c o e f i c i e n t e de p a r t i c i ó n a p a r e n t e l i p i d o / a g u a y su
d e g r a d a c i ó n a pH 9 y 12.
Por e l mismo m o t i v o , l a d e t e r m i n a c i ó n d e l se l l e v ó a cabo
s ó l o p o r e l método e s p e c t r o f o t o m é t r i c o . A p e s a r de que ambos
métodos ( e s p e c t r o f o t o r o é t r i c o y de p a r t i c i ó n ) se r e a l i z a r o n a pH
a l c a l i n o , s ó l o se u s ó e l p r i m e r o d e b i d o a que su t iempo de
a n á l i s i s f u e de 3 m i n u t o s . E l a n á l i s i s p a r a e l segundo no f u e
p o s i b l e r e a l i z a r l o en menos de 5 m i n u t o s , t iempo en e l c u a l se
comprobó que empieza l a t r a n s f o r m a c i ó n de l a T496 <F ig . 1 4 ) .
En l o s casos en que se pudo m e d i r , l a c i n é t i c a de T496 f u e de
p r i m e r o r d e n .
CONCLUSIONES
1) La T514 r e s u l t ó s e r l a menos l i p o s o l u b l e y l a más á c i d a de
l a s t o x i n a s .
2) La T496 f u e l a más i n e s t a b l e en todas l a s c o n d i c i o n e s .
3 ) Se p o d r í a p e n s a r en una mayor a b s o r c i ó n de l a T496 en e l
o rgan ismo d e b i d o a su mayor c o e f i c i e n t e de d i s t r i b u c i ó n a p a r e n t e
l l p i d o / a g u a . S i n embargo a l pH g á s t r i c o l a s t r e s t o x i n a s e s t a r á n
no i o n i z a d a s y se podrán a b s o r b e r s i n d i f i c u l t a d .
4 ) Las t r e s t o x i n a s se p o d r í a n d e p o s i t a r en g r a s a dada s u
1 i p o s o l u b i 1 i d a d .
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