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REVISTA BIOLOGÍA Vol. 14, No. 1, 2000

TOXINAS ANIMALES: ACCIONES FACILITADORAS DE LA TRANSMISIÓN COLINÉRGICA Olga Castañeda Pasarón(*) INTRODUCCIÓN GENERAL A lo largo de la evolución diferentes grupos animales desarrollaron variadas estrategias tanto para asegurar su alimentación como para defenderse de sus enemigos. Como parte de ellas surgieron los venenos: poderosas mezclas de sustancias químicas de diversa naturaleza capaces de “programar”, en la presa o el predador, una cadena de eventos que trae como consecuencia la afectación de procesos vitales tales como la trasmisión neuromuscular, la circulación sanguínea, la permeabilidad de las membranas, entre otros efectos, como forma de garantizar el dominio de la víctima. Las herramientas moleculares capaces de lograr dichas acciones y en el orden correcto, son las toxinas. La mayoría son proteínas y sustancias de bajo peso molecular, peptídicas o no, que tienen como sitio blanco de acción general las enzimas, los receptores, los canales iónicos y las membranas. Los animales productores de veneno representan una amplia diversidad de grupos, entre ellos: peces, anfibios, reptiles, artrópodos, anélidos y moluscos. Aún los animales más primitivos como los equinodermos, los celenterados, las gorgonias, los dinoflagelados e incluso los microorganismos, han desarrollado la capacidad de producir venenos. Algunos animales están dotados de glándulas especializadas y utilizan estructuras y mecanismos en ocasiones sofisticados para la descarga del veneno, por ejemplo, las serpientes, los escorpiones y algunos insectos. Otros, producen el veneno en células urticantes especializadas como es el caso de los celenterados. Quizás por el hecho de que en mayor o menor medida el sistema nervioso está involucradoo en el control de todos los procesos fisiológicos, es que la mayoría de los venenos contienen neurotoxinas que actúan sobre los diferentes mecanismos de la actividad nerviosa. A pesar del considerable número de toxinas caracterizadas, la naturaleza y en particular el mar tienen mucho que ofrecer. Los avances en la Toxinología están estrechamente relacionados con el desarrollo de las Neurociencias, donde la búsqueda de marcadores y reactivos específicos que permitan la caracterización de estructuras y funciones, constituye una estrategia de primera línea. Otros aspectos tales como el origen de las sustancias, su función en el organismo que las produce y el papel que desempeñan en el ecosistema, aunque menos representativo del estado actual de las investigaciones, pueden constituir un tema muy importante si se tiene en cuenta su repercusión en el medio y su influencia en los recursos naturales. Las intoxicaciones con el alimento de orgen marino y el ganado afectado por toxinas de plantas y algas son algunos de los efectos devastadores de las toxinas en la naturaleza.

(*) Departamento de Biología Animal y Humana, Facultad de Biología. Universidad de La Habana.

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ACCIONES FACILITADORAS DE LAS TOXINAS SOBRE EL SIST EMA DE TRANSMISIÓN COLINÉRGICO Las toxinas que actúan sobre el sistema de transmisión colinérgico pueden ser antagonistas o sinergistas de la acetilcolina. Se consideran antagonistas, por ejemplo, aquellas que bloquean los receptores postsinápticos nicotínicos (curaremiméticas), como las alfa-neurotoxinas de las serpientes, así como las toxinas que inhiben la liberación de acetilcolina, por ejemplo, la toxina botulínica y las toxinas con actividad de fosfolipasa A2 de las serpientes. (Strong, 1987; Harris, 1991) Las toxinas sinergistas tienen, por el contrario, acciones facilitadoras mediadas por diferentes mecanismos que tienden a incrementar la concentración de la acetilcolina en la sinapsis. Las acciones facilitadoras pueden lograrse por tres mecanismos básicos: a) acciones sobre canales iónicos, que prolongan la duración del potencial de acción y conducen a un incremento en la liberación de acetilcolina b) acciones que estimulan el mecanismo de exocitosis del neurotransmisor c) inhibición de la hidrólisis de la acetilcolina. A continuación analizaremos el primero y el último de estos mecanismos. a) Acciones sobre los Canales Iónicos El proceso de señalización de la célula nerviosa implica la acción coordinada de canales iónicos selectivos en la membrana celular. Estos canales son proteínas de membrana que funcionan como poros para iones particulares. En respuesta a un estímulo adecuado, por lo general un cambio en la diferencia de voltaje a través de la membrana, estas proteínas sufren un cambio conformacional que conduce a la apertura o cierre del poro. Existe, por tanto, una alteración transitoria de la permeabilidad de la membrana a iones particulares. Los iones fluyen a través de estos canales a su gradiente electroquímico y la corriente resultante “dispara” una variedad de respuestas fisiológicas. En el proceso de señalización exitatoria en las neuronas, los iones implicados son Na+, K+ y Ca+2. Canales específicos para estos iones generalmente se abren o se cierran, en respuesta a las variaciones del potencial de membrana, y por tanto se refieren como canales dependientes del voltaje. Estos canales no están uniformemente distribuidos en las neuronas. Acciones sobre los canales de Na+ Los canales de Na+ son responsables de la fase ascendente del potencial de acción. Estos canales se encuentran usualmente cerrados (no conducen) a valores de potencial de membrana en reposo y requieren un estímulo despolarizante para pasar al estado abierto (conducen). Una vez que han sido abiertos (activados) presentan el fenómeno conocido como inactivación, lo cual significa que pasan a un estado no conductor aunque esté presente el estímulo activador. Resulta interesante destacar que el primer hallazgo de neurotoxinas de acción específica sobre canales iónicos fue demostrar que la tetrodotoxina (TTX), un alcaloide obtenido a partir de un pez japonés de la Familia Tetraodontidae (Tahara, 1909), era capaz de bloquear la permeabilidad al Na+ en axones gigantes de langosta. (Narahashi, 1974) De modo general, existen tres acciones básicas de las toxinas sobre los canales de Na+: (a) toxinas que bloquean el canal, (b) toxinas que afectan la activación del canal y (c) toxinas que afectan la activación del canal. Nos limitaremos a analizar solamente las acciones facilitadoras de las toxinas sobre estos canales. En presencia de algunas toxinas, los canales de Na+ se abren más rápidamente; en términos electrofisiológicos esto significa que la curva de dependencia del voltaje sobre la activación, se desplaza

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hacia valores de potencial de membrana más negativos. Entre estas toxinas se destaca un grupo de alcaloides tanto de origen vegetal: veratridina, aconitina, germina (Detwiler, 1972; Caterall, 1980; Benn y Jacyno, 1983) como procedentes de la piel de los anfibios, la batracotoxina. (Daly et al ., 1978) Todas provocan importantes efectos estimulantes tanto en el músculo esquelético como en el cardíaco. Otras toxinas de actividad similar proceden de dinoflagelados y se obtienen a través de la cadena alimentaria, por ejemplo, la brevetoxina (Baden, 1983) y la ciguatoxina (Yasumoto, 1977). Estan han mostrado numerosas acciones excitatorias: despolarizaciones irreversibles, disparos repetitivos de potenciales de acción, incremento en la liberación cuantal de acetilcolina, entre otros (Bidart et al ., 1984; Benoit et al ., 1986; Molgó, 1990; Meunier et al ., 1995). También pertenecen a este grupo las denominadas β-toxinas de escorpiones, que proceden de venenos de diferentes especies de América. Son polipéptidos o pequeñas proteínas que tienen efecto excitatorio sobre nervios y músculos, como consecuencia de las corrientes de Na+ provocadas por la apertura de canales a valores de potencial de membrana en que predomina el estado cerrado de éstos. (Katz y Edwards, 1972; Watt y Simard, 1984; Jover et al ., 1980; Arantes et al ., 1992) Finalmente, existe un grupo muy importante de toxinas de naturaleza proteica cuyo efecto fundamental es retardar el proceso de inactivación de los canales de Na+, por lo cual el canal permanece abierto durante más tiempo. Esto provoca un incremento notable en la excitabilidad de nervios y músculos, como consecuencia del aumento en la liberación de acetilcolina desde las terminaciones nerviosas. En este grupo se incluyen las α-toxinas de escorpiones presentes en los venenos de especies procedentes de Africa y América del Norte, tales como: Androctonus australis Héctor y Tityus serulatus, entre otras, (Jover et al ., 1980; Wang y Strichartz, 1983; Kirsch et al .,, 1989), así como las toxinas de anémonas que referiremos a continuación. Los trabajos pioneros de Béress et al ., en 1975 permitieron aislar una serie de polipéptidos análogos a partir de la anémona Anemonia sulcata (ATXI, II, III y IV) de los cuales, el más abundante y activo en membranas de vertebrados es ATXII. Toxinas con propiedades similares han sido aisladas a partir de otras especies: Anthopleura xantogrammica, Radianthus paumotensis, Condylactis gigantea, Heteractis macrodactylus, Phyllactis flosculífera, Stichodactyla giganteum y Stichodactyla helianthus. Todas provocan actividad espontánea y repetitiva en axones y en músculo esquelético o cardíaco. Las propiedades químicas y las relaciones estructura-actividad de las toxinas de anémonas que actúan a nivel de los canales de sodio han sido revisadas ampliamente por Norton en 1991. Recientemente se ha purificado y secuenciado una nueva toxina de 54 residuos de aminoácidos a partir de Actinia equina y se le ha denominado Ae I(Lin et al ., 1996), esta toxina presenta gran homología estructural con otras bloqueadoras de canales de Na+ previamente descritas. Principales tipos de canales de K+ Antes de tratar los efectos de las toxinas sobre los canales de K+, se hace necesario destacar los principales tipos de estos canales así como sus características más generales. En contraste con la escasa diversidad de canales de Na+, existen muchos tipos de canales de K+. A pesar de que los canales de K+, Na+ y Ca2+ están presentes tanto en células excitables como no excitables, los canales de K+ son los más ubícuos y al parecer están presentes en todas las células eucariotas. Esta amplia distribución de los canales de K+ está en correspondencia con la amplia gama de procesos fisiológicos sujetos a su actividad. Resulta difícil, por tanto, hacer generalizaciones sobre los diferentes tipos, lo que explica que existan diferentes clasificaciones. (Rudy, 1988; Adams, 1990; Halliwell, 1990; Latorre y Labarca, 1996) De forma general los canales de K+ pueden clasificarse de acuerdo a como se regula el paso de la configuración abierta a la cerrada en: (a) canales dependientes del voltaje, (b) canales activados por Ca2+ (c) canales regulados por ATP y (d) canales regulados por agonistas y segundos mensajeros. Aún así, existe cierta superposición, por ejemplo los canales activados por Ca2+ requieren un cambio en el potencial de membrana para su funcionamiento.

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Los canales dependientes del voltaje y los activados por Ca2+ han sido los más estudiados en neuronas. Los canales dependientes de voltaje pueden subdividirse en: (a) de rectificación tardía, (b) transientes y (c) rectificadores de entrada. Los canales de rectificación tardía son los que clásicamente describieron Hodkin y Huxley (1952) en axón gigante de calamar, como responsables de la fase de despolarización del potencial de acción. La corriente de activación tardía tiende a activarse lentamente con la despolarización y a permanecer activada hasta el cese del estímulo despolarizante. Los canales transientes se abren rápidamente con la despolarización pero se cierran espontáneamente aún si la despolarización es mantenida. Este tipo de corriente, a menudo conocida como corriente tipo-A (IA), fue descubierta en neuronas de invertebrados (Connor y Stevens, 1971) pero desde entonces ha sido registrada en muchas neuronas de mamíferos. Su importancia radica en que regula la frecuencia de descarga repetitiva en respuesta a despolarizaciones tónicas. Los canales rectificadores de entrada se activan por hiperpolarización más que por despolarización, y desarrollan corrientes de entrada más que de salida. Debido a este comportamiento, el cual se opone a las clásicas corrientes rectificadoras, estos canales se conocen a menudo como “de rectificación anómala”. Son responsables del mantenimiento de la meseta en algunos potenciales de acción, del mantenimiento de la actividad marcapaso y de la regulación de la frecuencia de disparo en neuronas. Los canales de K+ dependientes de Ca2+, se abren en respuesta a concentraciones en el rango µmol/L o menores de Ca2+ intracelular. Tienen una amplia distribución y son particularmente importantes en células secretoras y excitables. Existen diferentes tipos de estos canales, por ejemplo, los de “pequeña conductancia”(5-15 pS) y los de “gran-conductancia”(100-250 pS) y los de “maxi-conductancia”(>200 pS). Algunos canales de K+ son activados por diversos agentes intracelulares como el ATP, los segundos mensajeros y las proteínas G, así como por neurotransmisores: serotonina, ácido gamma-aminobutírico (GABA), acetilcolina, entre otros. Hasta el presente, estos canales no parecen ser afectados directamente por toxinas. Se han aislado varios tipos de DNA, que codifican proteínas que conforman canales de K+ dependientes de voltaje, mediante la explotación de mutantes de Drosophila; éstos se dividen en 4 superfamilias: Shaker, Shab, Shaw y Shal. La utilización de pruebas de baja restringencia ha permitido el aislamiento de numerosos cDNA relacionados con estas superfamilias a partir de tejido cerebral de vertebrados: rata, ratón y humano (Strong, 1990). Estos tipos de canales de K+ funcionales, pueden ser expresados en oocitos de Xenopus o en células de mamíferos en cultivo. La diversidad de nombres asignados a estos canales resulta, en ocasiones, confusa. En este sentido, resulta últil la nomenclatura simplificada propuesta por Chandy en 1991 según la cual, se identifica a las 4 familias antes mencionadas como: Kv1, Kv2, Kv3 y Kv4 respectivamente. Dentro de ellas se establecen subdivisiones que permiten homologar los diferentes subtipos con las denominaciones en Xenopus, ratón, rata y humano. Después de la aplicación de la biología molecular al campo de la electrofisiología, los canales de K+ se han agrupado de acuerdo a su estructura primaria en tres grandes superfamilias, según el número de segmentos de cadena polipeptídica que atraviesan la matriz lipídica de la membrana. (Latorre y Labarca, 1996) Acciones de las toxinas sobre los canales de K + En las neuronas, las corrientes de K+ son básicamente inhibitorias, ya que equivalen a corrientes de salida que contrarrestan las señales despolarizantes provocadas por las corrientes de Na+ y Ca2+. De manera general, la apertura de canales de K+ conduce a que el potencial de membrana tienda al potencial de Nernst para el K+ y con ello la célula se hiperpolariza. En contraposición, el bloqueo de los canales de K+ dependientes de voltaje produce incremento en la duración del potencial de acción y/o en la frecuencia de descarga. Como consecuencia, aumenta la duración de la despolarización en la terminación nerviosa, los canales de Ca2+ permanecen abiertos por más tiempo, penetra Ca2+ y como consecuencia, aumenta la liberación de acetilcolina. La farmacología de los canales de K+ , en relación a la de los canales de Na+ y Ca2+, constituye un área prácticamente inexplorada sobre todo si se tiene en cuenta su amplia diversidad. En este sentido, no resulta

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posible establecer hasta el presente una clasificación de las acciones específicas de las toxinas que actúan a nivel de estos canales. El tetraetilamonio (TEA) fue la primera droga empleada como bloqueador de canales de K+. A pesar de que no es muy potente ni muy específica, ha sido utilizada como criterio de diferenciación entre canales sensibles o no a ésta (Cook y Quast, 1990). El descubrimiento de algunas toxinas naturales como potentes agentes farmacológicos con acciones específicas sobre canales de K+, a pesar de ser llimitado, ha contribuido notablemente al conocimiento de las propiedades biofísicas y farmacológicas de estos canales, así como a la vinculación de éstos a una gran diversidad de procesos fisiológicos. (Moczydlowsky, 1988; Cook y Quast, 1990; Brewster y Strong, 1990; Harvey, 1993) La primera toxina caracterizada con acción específica sobre canales de K+ dependientes de voltaje, fue la noxiustoxina (NTX), obtenida a partir del veneno del escorpión de México Centruroides noxius, la cual es un polipéptido de 36 residuos de aminoácidos y tres disulfuros (Possani et al ., 1982). Bloquea la corriente de rectificación tardía en axones gigantes de calamar (Carbone et al ., 1982; 1987) y, en concentraciones superiores, bloquea algunos canales de K+ dependientes de Ca2+. Se ha demostrado que facilita la liberación de acetilcolina en terminaciones nerviosas motoras de mamíferos (Harvey et al ., 1992). Ha sido utilizada en la preparación de columnas de afinidad con el objetivo de aislar canales de K+ en membranas axónicas de calamar, lo cual ha permitido el estudio de parámetros biofísicos del canal de K+ (Prestipino et al., 1990). También se han aislado y caracterizado dos toxinas polipeptídicas a partir del veneno de otra especie de este género, el escorpión Centruroides limpidus. Ambas toxinas desplazaron a la noxiustoxina radioyodada (125INTX) de membranas sinaptosomales de rata con alta afinidad e inhibieron las corrientes transientes de K+ (IA) en células cerebrales de rata en cultivo (Martin et al ., 1994). Por otra parte, las dendrotoxinas (DTXs), un grupo de pequeñas proteínas aisladas a partir del veneno de varias serpientes mambas, constituyen poderosos bloqueadores de los canales de K+ dependientes del voltaje. Las especies incluyen la mambra verde oriental Dendroaspis angusticeps, la mamba verde occidental Dendroaspis viridis (Harvey y Karlsson, 1980; 1982). Las DTXs poseen carácter básico y están formadas por una cadena única de 59-61 aminoácidos estabilizada por tres uniones disulfuro. Muestran gran homología estructural con inhibidores tipo Kunitz, tales como el inhibidor pancreático bovino de la tripsina (Dufton, 1985). Sin embargo, este último no presenta actividad bloqueadora de canales de K+ a pesar de que las DTXs inhiben algunas proteasas. (Marshall y Harvey, 1988) El primer efecto caracterizado como consecuencia del bloqueo de los canales de K+ dependientes de voltaje por las DTXs, fue incrementar la liberación de neurotransmisor en uniones neuromusculares de vertebrados (Harvey y Karlsson, 1980; 1982; Harvey y Anderson, 1985). En los nodos de Ranvier del nervio ciático de rana, la DTX bloquea específicamente un componente de la corriente rápida transiente (Benoit y Dubois, 1986). En neuronas sensoriales de ganglios dorsales de cobayo la DTX I reconoce un subtipo de canal de K+ que no se inactiva. (Penner et al ., 1986) Con posterioridad, otros autores demostraron que estas toxinas lograban este efecto tanto en neuronas periféricas como centrales de diferentes regiones (Docherty et al .,1983; Dlly et al ., 1984; Weller et al ., 1985; {ennerr et. al ., 1986; Awan y Dolly, 1991). Por ejemplo, cuando se inyectó por vía intracerebro-ventricular en rata, tanto la DTX como su homóloga DTX I, produjeron convulsiones y muerte (Mehraban et al ., 1985; Silveira et al ., 1988). En estas condiciones se produce un incremento generalizado de la actividad neuronal que afecta la liberación de neurotransmisores, tanto excitatorios como inhibitorios (Halliwell et al ., 1986). Experimentos in vitro han demostrado que la dendrotoxina causa una ligera despolarización de los sinaptosomas de mamíferos que conduce a la liberación, dependiente de calcio, de GABA y de glutamato (Weller et al ., 1985; Nicholls et al ., 1985; Tibbs et al ., 1989; Barbeito et al ., 1990). Todos estos resultados son consistentes con el hecho de que la dendrotoxina bloquea ciertas corrientes de K+ en terminaciones nerviosas centrales y periféricas. Las dendrotoxinas constituyen importantes herramientas bioquímicas en el estudio de la neurofarmacología de los canales de K+ dependientes de voltaje. Así, la dendrotoxina radioyodada (125I-DTX) ha permitido conocer la distribución de los sitios de unión de esta toxina al cerebro, los cuales se

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corresponden con áreas muy ricas en sinapsis (Bidard et al ., 1989; Pelchen-Mathews y Dolly, 1989). Esto ha contribuido a la determinación del sitio de unión de la toxina al canal de K+, lo cual ha sido complementado con estudios en canales clonados y expresados en oocitos de Xenopus. (Scott et al ., 1990; Hurst et al ., 1991) Otra toxina que resultó ser un bloqueador de canales de K+ dependientes de voltaje, se obtuvo a partir del veneno de Apis mellífera: Breithaipt y Habermann en 1968 aislaron un péptido capaz de inducir la liberación de histamina en mastocitos, que se denominó “péptido desgranulador de mastocitos” (MCDP). Posteriormente se demostró que posee fuerte efecto convulsivo cuando se administra directamente en el SNC (Habermann, 1977). Finalmente, se comprobó que es capaz de competir con la DTX por sitios de unión membranas neuronales (Stanfield et al ., 1987; Bidard et al ., 1987), además de bloquear corrientes de K+ de activación rápida sensibles a la DTX (Neuman et al ., 1991). No está totalmente esclarecido si puede facilitar la liberación de neurotransmisor en terminaciones nerviosas. Existe también un grupo de neurotoxinas con actividad de fosfolipasa-A2 aisladas a partir de venenos de serpientes que incluyen la beta-bungarotoxina, la crotoxina, la notexina y la taipoxina, las cuales se conocen por su capacidad de bloquear la liberación de acetilcolina en terminaciones motoras (Chang, 1985; Harris, 1991). En adición se comprobó que, previo a este efecto, estas toxinas facilitan la liberación de acetilcolina en terminaciones nerviosas motoras, lo cual está relacionado con su capacidad de bloquear corrientes de K+ dependientes de voltaje a este nivel. (Anderson et al ., 1987; Rowan y Harvey et al ., 1988) Además, se han caracterizado algunas toxinas con acciones específicas sobre canales de K+ dependientes de Ca2+. La primera de estas toxinas fue la apamina, pequeño polipéptido de sólo 18 residuos aislado del veneno de Apis mellífera (Habermann, 1965). Esta toxina bloquea selectivamente, a concentraciones en el rango nmol/L, el subtipo de canal dependiente de Ca2+ de baja conductancia. Tiene además la característica, poco usual en un polipéptido, de ganar acceso al SNC; esto provoca hiperactividad, convulsiones y muerte. (Mourre et al ., 1988; Messier et al ., 1991) La charybdotoxina (CbTX) aislada a partir del veneno del escorpión de Israel Leiurus quinquestriatus (Miller et al ., 1985) es un polipéptido de 37 residuos de aminoácidos y tres puentes disulfuro. A diferencia de la apamina, la CbTX bloquea el subtipo de alta conductancia en neuronas y en otros tipos celulares. (Moczydlowsky et al ., 1988; Dreyer, 1990; Strong, 1990) Con posterioridad, a partir del veneno del escorpión Orthochirus scrobiculosus, se purificaron tres toxinas polipeptídicas (Os-K-1, OsK-2 y OsK-3). Osk-1 posee 38 aminoácidos, 3 disulfuros y presenta gran homología con la CbTX. Además, OsK-1 y OsK-2, bloquean específicamente el subtipo de baja conductancia en neuronas de la serie NG108-15; a diferencia de OsK-3 que bloquea selectivamente los de alta conductancia en células de la hipófisis anterior. (Nosyreva et al ., 1995) Hasta hace algunos años se pensaba que las anémonas eran fuente casi exclusiva de toxinas con acción sobre canales de Na+ (Norton, 1991), sin embargo recientemente las anémonas han atraído la atención como la primera fuente de toxinas de origen marino con acciones sobre los canales de K+. Estas toxinas han sido aisladas y caracterizadas a partir de varias especies de anémonas: Bunodosoma granulífera (toxina denominada BgK, Aneiros et al ., 1993; Cotton et al ., 1997), Stichodactyla helianthus (toxina denominada ShK, Castañeda et al ., 1995), Anemonia sulcata (toxinas denominadas AsKC1, AsKC2, AsKC3 y AsKS Schweitz et al ., 1995), Heteractis magnifica (denominada HmK, Gendeh et al ., 1997) y Actinia equina (toxina denominada AeK, Minagawa et al ., 1998). Investigaciones preliminares sugieren que también se encuentran presentes en los extractos totales de Actinia bermudensis, Bunodosoma cangicum y Stichodactyla martensii (Harvey et al .,1995; Araque et al ., 1995). Todas las moléculas descritas hasta el presente con actividad de este tipo, en estas especies, son polipéptidos de carácter altamente básico que presentan seis residuos de Cys con los cuales forman tres puentes disulfuro (Pohl et al ., 1995). Las más pequeñas: BgK, ShK, AsKS, HmK están formados por 35-37 residuos de aminoácidos, mientras que las mayores: AsKCs, están formados por 58-59 residuos. Estas toxinas representan una nueva clase estructural de péptidos bloqueadores de canales de K+ que presentan muy poca homología estructural entre compuestos de actividad similar descritos a partir de otras especies e incluso entre las diferentes especies

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de anémonas entre sí. Por estas razones, la diversidad de estructuras que se suponen nos permite aseverar que el estudio de las toxinas de las anémonas contribuirá de forma muy efectiva a una mejor comprensión de la farmacología de los canales de K+. b) Inhibición de la Hidrólisis de la Acetilcolina Otro mecanismo a través del cual se logran acciones facilitadoras en el sistema colinérgico, consiste en inhibir la enzima que hidroliza la acetilcolina. Debido a esta acción, los agentes anticolinesterásicos producen una acumulación anormal de acetilcolina en la sinapsis que equivale a una estimulación colinérgica. Como resultado de las investigaciones sobre la base bioquímica de algunos venenos animales, se han referido algunas toxinas con actividad anticolinesterásica en especies poco relacionadas. La primera referencia de una toxina con actividad anticolinesterásica resultó ser la melitina, un polipéptido pequeño de 26 aminoácidos, aislado a partir del veneno de Apis mellífera, inicialmente conocido por su actividad hemolítica (Habermann et al ., 1965). Sin embargo, con posterioridad se demostró que era capaz de inhibir la acetilcolinesterasa del tejido cerebral de larvas de Drosophila. (Herschel et al ., 1971) Por otra parte, al estudiar los efectos tóxicos del veneno en la mamba verde Dendroaspis angusticeps, se observó que la administración intraperitoneal de éste provocó en ratones una serie de signos tales como: fasciculación generalizada, secreción de diversas glándulas y otros que son característicos del envenenamiento agudo con agentes anticolinesterásicos (Rodríguez-Ithurralde et al ., 1981). Ya se había purificado y aislado la DTX a partir de esta misma especie (Harvey y Karlsson, 1980), pero la magnitud del efecto colinomimético era tal, que podía ser explicada en base a la presencia de otros agentes presentes en el mismo veneno, que de alguna forma potenciaban las acciones colinérgicas. Posteriormente se demostró la presencia en dicho veneno de 2 polipéptidos con potente actividad anticolinesterásica: las fasciculinas I y II (Rodríguez-Ithurralde et al ., 1983). La mayor parte de los estudios bioquímicos y neurobiológicos se han realizado con la fasciculina II (FAS). Esta posee 61 residuos y 4 uniones disulfuro. La secuencia aminoacídica de esta toxina había sido determinada por Viljoen y Botes en 1973, quienes la identificaron como F VII antes de que los aspectos básicos de su actividad biológica fuesen esclarecidos. Las FAS inhibe tanto la “pseudo” como la “verdadera” acetilcolinesterasa de diversas fuentes. Es un inhibidor de tipo no competitivo (Karlsson et al ., 1985; Cerveñansky et al ., 1991). Además, ha constituido una poderosa “herramienta” en estudios neurobiológicos, puesto que ha permitido demostrar el papel clave de la acetilcolinesterasa estriatal en los mecanismos colinérgicos involucrados en el control de la conducta motora. (Dajas et al ., 1991) Otras toxinas anticolinesterásicas de naturaleza peptídica han sido aisladas a partir de otras especies de serpientes, por ejemplo la atramina, a partir del veneno de Naja naja atria, la cual inhibe la acetilcolinesterasa presente en el veneno de Bungarus multicinctus. (Takechi y Tanaka, 1980) También se han aislado agentes anticolinesterásicos a partir de organismos marinos. Por ejemplo, a partir de una cepa de la cianobacteria Anabaena flosaquae NRC-525-17 se aisló una neurotoxina, anatoxina-a (s), (Mahmood y Camichael, 1886). Las ratas tratadas con dosis letales de esta toxina mostraron reducción o total inhibición de la acetilcolinesterasa sanguínea. Además, desarrolló una actividad de tipo no competitivo frente a la acetilcolinesterasa de anguila eléctrica. El análisis de su estructura indicó que se trataba de un alcaloide de peso molecular menor de 400 Da. A partir de las secreciones del molusco marino Onchidella binneyi se identificó el onchidal como el principal componente de la misma. El compuesto posee estructura análoga a la acetilcolina e inhibe irreversiblemente la acetilcolinesterasa, puesto que forma un enlace covalente con esta enzima (Abramson et al ., 1989). De modo análogo se analizaron los extractos y/o secreciones de 5 especies de gasterópodos marinos abundantes en costas cubanas: Aplysia dactylomela, aplysia juliana, Bursatela leachi, petalifera ramosa y Onchidella floridiana; todas inhibieron de forma significativa la acetilcolinesterasa de suero equino. Las evidencias anteriores sugieren la importancia defensiva de los agentes anticolinesterásicos en los moluscos. (García et al ., 1993)

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En adición, los extractos de tentáculos de Physalia physalis y del cuerpo total de Bunodosoma granulífera (Castañeda et al ., 1985) así como de la columna corporal de Condylactis gigantea (Rivera et al ., 1987) inhibieron la colinesterasa sanguínea de ratones. Estos resultados indicaron que la toxicidad de estos extractos se debe, al menos en parte, a la presencia de agentes anticolinesterásicos en estos celenterados. Esos resultados motivaron a explorar la presencia de compuestos con actividad similar en el extracto del cuerpo total de la “anémona del sol”: Stichodactyla helianthus, característica del mar Caribe. Como resultado de estos estudios el extracto de esta especie, cuando se administró a ratas previo al tratamiento con metilfenidato, produjo una reducción significativa del clásico efecto excitatorio en áreas extrapiramidales (Rivera y Castañeda, 1985). Este efecto puede ser suprimido, en gran medida, por el tratamiento previo con drogas que inhiben a la acetilcolinesterasa (Ross, 1978; Moss et al ., 1985). Con posterioridad se demostró que en las ratas así tratadas se produjo una reducción significativa de la acetilcolinesterasa cerebral. El aislamiento y purificación de un principio anticolinesterásico a partir del extracto acuoso del cuerpo total de esta especie, constituyó la afirmación de nuestras suposiciones sobre la presencia de agentes antilcolinesterásicos en los celenterados. Se trata de un compuesto no proteico, de muy bajo peso molecular, que ejerce una inhibición de tipo mixto frente a la acetilcolinesterasa eritrocítica humana (Karlsson et al ., 1991; Castañeda, 1996). De modo análogo fue purificado un anticolinesterásico a partir de la anémona Bunodosoma granulífera, también de naturaleza similar y cuyo peso es inferior a 2 000 Da (Aneiros et al ., 1992). La presencia de agentes antilcolinesterásicos en extractos o secreciones procedentes de animales venenosos constituye, hasta el presente, un hecho poco generallizado. Sin embargo, en las especies que los presentan, pueden considerarse que forman parte de la maquinaria defensiva de estos grupos. EL SINERGISMO: MODO DE ACCIÓN DE LAS TOXINAS PRESEN TES EN LOS VENENOS Es un hecho común que los animales que liberan secreciones neurotóxicas producen varios tipos de toxinas que actúan en sinergismo. Por ejemplo, el molusco marino Conus geographus produce tres “conotoxinas: (ω, α y µ) que antagonizan las acciones de la acetilcolina por mecanismos diferentes (Olivera et al ., 1984). La serpiente Dendroaspis angusticeps (mamba verde), produce dendrotoxinas, fasciculinas y toxinas con acciones sobre receptores muscarínicos y el efecto combinado de éstas es incrementar el nivel de acetolcolina en la sinapsis. (Karlsson et al ., 1985) La aparición de toxinas excitatorias (exitotoxinas) a lo largo de la evolución, pudo estar influenciada por la mayor o menor eficiencia del animal en inmovilizar la presa. Por ejemplo, algunas serpientes marinas que disponen de otros medios para someter a las presas, generalmente liberan toxinas de acción postsináptica que, por un mecanismo relativamente lento, logran una parálisis flácida. Las anémonas, por su parte, carentes de otros mecanismos de inmovilización, contactan inicialmente a sus presas con un solo tentáculo. Consecuentemente, han desarrollado la capacidad de producir toxinas que, por diversos mecanismos conducen a incrementar el nivel de acetilcolina en la sinapsis: las que retardan la inactivación de los canales de sodio, las que bloquean los de canales de K+ dependientes de voltaje, así como las anticolinesterásicas. De esta forma provocan una rápida respuesta excitatoria en sus presas que puede conducir a una parálisis rígida inmediata. Además, la existencia de toxinas anticolinérgicas descritas en algunas especies de celenterados (Menéndez et al ., 1990; Garateix et al ., 1992), pudieran sugerir la coexistencia de dos tipos de estrategias ofensivas en los representantes de este phylum: una parálisis flácida, más lenta, típica del bloqueo neuromuscular postsináptico y una parálisis rápida, rígida, típica del bloqueo neuromuscular presináptico. Recientemente se han referido estrategias similares para el molusco marino Conus purpurascens. (Terlau et al ., 1996) La contribución creciente de numerosos grupos de investigadores en el estudio de asilamiento, purificación y caracterización bioquímico-farmacológica de las más diversas toxinas a partir de secreciones venenosas y cuerpo íntegros de especies tóxicas, permitirá: definir en gran medida su significación funcional en la ecofisiología de las respectivas especies, esclarecer en gran parte los procesos fisiológicos sujetos a la acción de receptores y canales sobre todo en los vertebrados y analizar su utilización potencial en el diagnóstico y tratamiento de enfermedades en beneficio de la humanidad.

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