seguridad alimentaria brucelosis
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Presentacion del genero Brucella y sus implicancias en la salud publicaTRANSCRIPT
Especialización en Seguridad Alimentaria Martinez, 15 de junio de 2012
Brucelosis un problema presente para la Salud Publica
Prof. MV Bact. Cecilia Di Lorenzo . Catedra de Inmunología I parte. Carrera de Microbiología Clínica e Industrial .
Genero Taxonomía Genoma Características metabólicas Relación MO-huésped Relación MO-ambiente
Un solo mundo de medicina veterinaria, OIE
Un mundo una salud (OIE,OMS,FAO)
Conceptos para recordar:
Enfoque interdisciplinario no multidisciplinario
Notas para recordar… La brucelosis, también llamada fiebre malta o fiebre ondulante, es una
enfermedad bacteriana (infecciosa) que afecta a varias especies de mamíferos dentro de los cuales se encuentra el hombre, causando la brucelosis humana.
El capitán David Bruce fue enviado a Malta y condujo una investigación a partir de 1884. El aisló un agente llamado Micrococcus melitensis de bazos humanos de pacientes hospitalizados que habían consumido leche de cabra cruda.
El profesor L.F. Benhard Bang, patólogo veterinario y bacteriólogo Danés, describió un organismo causante de abortos en ganado en 1895 llamado Bacillus abortus.
En 1914 en Estados Unidos, fue aislada la especie Brucella de un feto de cerdo abortado la cual fue llamada B. suis
-1887, David Bruce aisla una bacteriaa partir del bazo de un soldado inglésmuerto en Malta tras sufrir una enfermedad caracterizada por un cuadro febril ondulante. Bruce denomina a esta bacteria Micrococcus melitensis
1897 Bernhard Bang descubre una bacteriacausante de abortos en vacas a la que denominaBacillus abortus
Laboratorio de Inmunologia. Prof. Cecilia Di Lorenzo
1914 Temistocles Zammit demuestra quela brucelosis se transmite por el consumode leche de cabra
1917 Alice Evans demuestra que la leche de vaca también transmite la brucelosis.Asocia la enfermedad al Bacillus abortus de Bang al que renombra como Brucella abortus
1931 Forrest Huddleson reconoce el microorganismocausante de la brucelosis en cerdos como una especienueva: Brucella suis
1966 Leland Carmichael descubre una nuevaespecie a la que denomina Brucella canis poraislarse de casos de abortos en perros.Esta especie se demuestra capaz de infectar a laspersonas
Laboratorio de Inmunologia. Prof Cecilia Di Lorenzo
Laboratorio de Inmunologia
AISLAMIENTO DE LAS ESPECIES DE Brucella
1886 - Bruce - Br. melitensis del hombre
1897 - Bang - Br. abortus de bovinos
1914 - Traum - Br. suis de porcinos
1953 - Buddle y Boyes - Br. ovis de ovinos
1957 - Stoenner y Lackman - Br. neotomae de ratas
1966 - Carmichael - Br. canis de caninos
1994 – Ross et al – Br. cetaceae de delfines
1994 – Ross et al – Br. pinnipediae de focas
2000.- Skol Br. microti
BRUCELOSIS
Laboratorio de Inmunologia. Dra Cecilia Di Lorenzo
Clasificaciones filogenéticas
La información genética de los seres vivos se encuentra codificada en la secuencia de bases del ADN.
La clasificación filogenética se fundamenta en las relaciones genéticas generales que tienen las bacterias sobre la base de antepasados comunes
El estudio del genoma demuestra que la
composición de bases es constante y característica para cada microorganismo.
Para su realización se emplean técnicas de biología molecular con el fin de conocer el ADN (cromosómico o extracromosómico) y el ARN.
Actualmente se utilizan varios parámetros combinados para determinar las relaciones ADN, como son:
tamaño del genoma, contenido de guanina más citosina, estabilidad térmica de las secuencias afines de ADN relaciones del ADN mediante hibridación.
Por otro lado, el ARN ribosómico (ARNr), por su carácter ancestral en la biosíntesis de proteínas, presenta más homología entre microorganismos diferentes que el ADN, y parece ser un buen candidato para la medida de la distancia evolutiva.
A medida que los organismos sufren procesos de mutación, recombinación, o transducción sus genomas cambian de tamaño, composición y secuencia de bases, cumpliéndose la teoría de Darwin de la selección de las especies que mejor se adaptan al medio, es decir, la evolución.
División BXII. Proteobacteria
Clase I Alphaproteobacteria
Orden I Rhodospirillales
Familia II AcetobacteraceaeGénero I Acetobacter Género IX Gluconobacter
Orden II Rickettsiales
FamiliaI Rickettsiaceae Género I Rickettsia
Orden VI Rhizobiales
Familia I RhizobiaceaeGénero I RhizobiumGénero II Agrobacterium
Family III BrucellaceaeGénero I Brucella
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Pertenecen al grupo de las alfa-proteobacterias y mas específicamente a la clase Rhizobiales.
Br.maris
B suis
Cepa B. ovis
B.suis
B.suisB.canis
B.suis
Br.maris
B.suis
B.suis
B.canisB.suis
B. Brucella melitensis variedad suis (porcinos, liebres,ciervos, bisontes,etc ) Brucella melitensis variedad abortus (bovinos)
Brucella melitensis variedad neotomae (roedores: meriones )
Brucella melitensis variedad ovis (ovejas)
Brucella melitensis variedad canis (caninos) Brucella melitensis variedad maris (delfines, marsopas, ballenas,
focas),
Brucella melitensis variedad microti (zorros rojos, roedores de campo), Brucella melitensis variedad inopinata, recientemente descrita (2009), aislada de una infección en implante mamario de una paciente de 71 años.
Hoy se plantea el genero como mono especie: Brucella melitensis El resto se las considera biovariedades y se las denomina
Brucella melitensis variedad melitensis
Genero Brucelosis
Gram negativos
Características Microscópicas
InmóvilesNo Poseen cápsula No poseen plasmidos
Son bacilos pequeños de 0.6-1.5 micras de longitud y 0.5-0.7 de diámetro
Laboratorio de Inmunologia
Coloración de Gram
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Vida endocelular
Principales características del Generococobacilo, aeróbico
Gram negativo
No poseen capsulas
Son inmóviles
No son esporulados
Parásitos intracelulares facultativos
Particular perfil metabólico
Producen una infección de por vida en los animales
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Colonias regulares, brillantes, traslucidas, pequeñas, convexas. “ gotas de rocío” Crecimiento lento
Características Macroscópicas
Repique de 72hs. B abortus
Relación con el Huésped Genero fuertemente adaptado al huésped Crece y se reproduce dentro de una gran variedad
de células.
Los cultivos lisos de Brucella (S) presentan tendencia a sufrir variaciones durante el crecimiento, especialmente con subcultivos, y aparecen formas rugosas (R).
Las colonias son entonces mucho menos transparentes, presentan una superficie mate más granular y el color varía de blanco mate a marrón con luz reflejada o trasmitida.
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La comprobación de esta transición se realiza fácilmente por tinción con cristal violeta: las colonias rugosas aparecen rojas y las lisas de color amarillo pálido.
Por lo general, los cambios de morfología colonial se asocian con cambios en la virulencia, en las propiedades serológicas y/o en la sensibilidad a los fagos.
La aglutinación positiva con un antisuero anti-Brucella es una identificación preliminar de que el aislado corresponde a Brucella.
La identificación posterior completa se realiza mejor en un laboratorio de referencia.
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Si las colonias son lisas deben probarse con antisuero contra B. abortus lisa, o preferiblemente con antisueros monoespecíficos contra los antígenos de superficie A y M.
En el caso de colonias rugosas, las colonias deben probarse con antisuero contra el antígeno R de Brucella.
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La mayoría de las especies son Catalasa positivas y Oxidasa positivo , solo son negativos a la oxidasa: B. ovis
B. neotomae
Son aerobios estrictos a excepción B. ovis y B. abortus, son microaerobias (5-10% de CO2)
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Requerimientos de Cultivo Necesita medios enriquecidos complejos, por requerir de
ciertos animoácidos , tiamina, biotina, nicotinamida, pantotenato de calcio y trazas de magnesio.
Se usan medios con suero
Medio enriquecido Albimi
Medio Selectivo Farrel ( ac nalidixico)
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Cultivos de 72 hs
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Brucella canis
Lab de Inmunologia. FCV. UNLP
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Laboratorio de Inmunologia
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Genero BrucellaLaboratorio de Inmunologia. Dra Cecilia Di Lorenzo
Laboratorio de Inmunologia
Tbilisi
BRUCELÓFAGOS
6 grupos de fagos :
Tipo 1:: Tbilisi B.abortus en fase S SI o I Tipo 2: cepa Firenze75/13 . B.abortus S SI I y B.suis(4)Tipo 3:: cepa Weybridge B.abortus S SI I y B.suis
Tipo 4: Berkeley BK0 BK1 Y BK2 Formas S abortus,neotomae,suisTipo 5: R/O ,R/C Formas R de Brucella Tipo 6: Tzatnagar Iz Cultivos S,SI,I de abortus,melitensis,neotomae y suis.
El patrón de sensibilidad a los fagos muestra una gran
vinculación con la actividad de oxidación metabólica, definen : especie
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B abortus inhibida por Thionina B suis inhibida por Fucsina Laboratorio de Inmunologia. Dra Cecilia Di Lorenzo
Aglutinación con sueros monoespecíficos.-
Procedimiento : Una ansada del cultivo en 0,5 ml de suero en poratojetos
Se emplean el suero monovalente A y en monovalente M.
El R se utiliza solo cuando se sospecha de B. canis o de otra especie rugosa natural.
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Genoma de Brucella: 2 replicones
Laboratorio de Inmunologia
Chr I Chr II2,1 mega bases 1,1, megabases Típico bacteriano Típico plasmido
Funcionalmente absolutamente complemetarios 98% de correspondencia entre especies
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Genero Brucella Especie : Brucella melitensis Biovares:
melitensisabortus
suiscanisovis
neotomaemaris
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RESERVORIOS COMUNES DE LA ESPECIE DE BRUCELLA
ESPECIE BIOVAR. HOSPEDERO PATOGENICIDADEN HUMANOS
Br. melitensis Todas Caprinos/ovinos +
Br. abortus Todas Bovinos +
Br. suis 1, 3 Porcinos +
2 Porcinos, liebres -
4 Caribus, renos +
Br. canis Caninos +
Br. ovis Ovinos -
Br. neotomae Ratas de campo -
Br. maris Ballenas, delfines, bufeos +
Focas, leones marinos
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Laboratorio de Inmunologia
Constitución del Lipopolisacarido
Brucella : aminoglycose y acidos grasos
Glucose,mannose and quinovosamina
Homopolymer 100 residues of 4 -dideoxymannose
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B.abortus B.melitensis B.suis
Brucella lisas Laboratorio de Inmunologia. Dra Cecilia Di Lorenzo
Brucella ovis y Brucella canis
Laboratorio de Inmunologia
Son cepas naturalmente RUGOSAS
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LPS : Brucella
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Cepas Lisas o S Cepas RugosasLaboratorio de Inmunologia. Dra Cecilia Di Lorenzo
LPS Rugoso
Laboratorio de Inmunologia
Cadena O de tipo R
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Método para identificación de fase
Laboratorio de Inmunologia
•Método de Henry : iluminación a 45 °
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Método para identificación de fase
Método de Wilson (Coloración con Cristal Violeta)
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CV
Cultivo de 48 hs + Sol de Cristal Violeta por 30 “
Se vuelca el colorante y se observa en Lupa
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Cambios en la morfología de las colonias son generalmente asociados con cambios en la virulencia.
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Diagnostico Directo
Aislamiento: sangre - hemocultivo fetos placenta semen
Poner en evidencia el agente: Técnicas de biología molecular
Coloraciones especificas: Coloración de Stamp
PCR
Coloraciones especificas : Coloración de Stamp
Coloración de Stamp
15¨mVolcar Y Lavar con agua corriente
1/10
0,5%
20-30”Volcar Y Lavar con agua corriente
Volcar Y Lavar con agua corriente10”
Coloración de Stamp
Puntillado o cadenas cortas rojas sobre fondo azul
HEMOCULTIVOPunción venosa (2-5 ml ) Colocar en medio para hemocultivo y homogeneizar
Mantener a Temp ambiente
hasta llevar al Laboratorio
Marcha Bacteriológica
Stamp +
Siembra ATS con 10% de suero estéril
24 – 48 - 72 hs 37ºC
Gram - Colonias pequeñas como gotas de rocío
Aisalmiento en Leche y derivados Leche: centrifugar a 10000 rpm
15 minutos Sembrar en medios selectivos
por separado grasa y sedimento Por 15 días
Queso: porciones de 1 grs en medio liquido selectivo, durante 15 días .
Repicar a medios solidos selectivos.
PCR en leche y queso
Con y sin 10 % CO2
•T1: Hidrogeno Sulfurado•T2: Movilidad (agar semisolido)•T3: Ureasa ( Medio Bauer)• Oxidasa• Catalasa
T1
Negativo
T2 T3
Enviamos a Laboratorio de Referencia para confirmación por fagolisotipiaOxidación metabólica , biología molecular y determinación de especie
Negativo Positivo
Bacterias compatibles con el genero Brucella
Coloración de Stamp Positiva
Oxidasa Positiva, Positva débil
Catalasa Positiva
Urea Positiva, indicar tiempo
Hidrógeno Sulfurado Negativo durante 4 dias
Movilidad Inmóvil
Ureasa
Laboratorio de Inmunologia
• Área Urea de Christensen(Rojo de Fenol)
• Buenos Aires ModificadoIndicador de Andrade y Azul de Timol
Pos Neg
Cronometrar tiempo de reacción
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Urea Rápida
Laboratorio de Inmunologia
Prueba de Catalasa positiva
Prueba de Oxidasa positiva / positiva débil(Parafenilendiamina)
(Ansada en H2O2 )
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Movilidad
Laboratorio de Inmunologia
Agar semisólido
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Hidrogeno sulfurado
Laboratorio de Inmunologia
ATS en pico de flauta Con papel con acetato de
plomo por 4 días ( cambio diario)
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•T1: Hidrogeno Sulfurado•T2: Movilidad (agar semisolido)•T3: Ureasa• Oxidasa• Catalasa
T1
Negativo
T2 T3
Enviamos a Laboratorio de Referencia para confirmación por fagolisotipiaOxidación metabólica , biología molecular y determinación de especie
Negativo Positivo
Bacterias compatibles con el genero Brucella
Coloración de Stamp
Positiva
Oxidasa Positiva, Positva débil
Catalasa Positiva
Urea Positiva, indicar tiempo
Hidrógeno Sulfurado
Negativo durante 4 dias
Movilidad Inmóvil
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Laboratorio de Inmunologia
Diagnostico Indirecto
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MUESTRAS
Laboratorio de Inmunologia
• VIA DE EXTRACCIÓN - VOLUMEN (4 -5 ml.) - INSTRUMENTAL A UTILIZAR
• CALIDAD : - HEMOLISIS - CONTAMINACIÓN • TIPO : - SANGRE ENTERA : refrigerada - SUERO: frizado
• EMBALAJE
• IDENTIFICACIÓN
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Tbilisi
BRUCELÓFAGOS
6 grupos de fagos :
Tipo 1:: Tbilisi B.abortus en fase S SI o I Tipo 2: cepa Firenze75/13 . B.abortus S SI I y B.suis(4)Tipo 3:: cepa Weybridge B.abortus S SI I y B.suis
Tipo 4: Berkeley BK0 BK1 Y BK2 Formas S B.abortus,B.neotomae,B.suisTipo 5: R/O ,R/C Formas R de Brucella Tipo 6: Tzatnagar Iz Cultivos S,SI,I de B.abortus,B.melitensis,B.neotomae y B.suis.
El patrón de sensibilidad a los fagos muestra una gran vinculación con la actividad de oxidación metabólica, definen :
ESPECIE
Genero Brucella
B.abortus B.melitensis B.suis
• Brucella ovis•Brucella canis•Brucellla maris
RUGOSAS
Brucella lisas
Genoma de Brucella: 2 replicones
Chr I Chr II2,1 mega bases 1,1, megabases Típico bacteriano Típico plasmido
Funcionalmente absolutamente complemetarios 98% de correspondencia entre especies
Estudio de genoma de Brucella
No posee plasmidos como factor de virulencia Vías metabólicas oxidativasIdentificado vías metabólicas básicas faltantes
Relación huésped Imposibilidad de ciclo libre 98% de correspondencia entre especies
Pruebas Moleculares: PCR
B. can
is
B. ab
ortu
s S19
B. A
bo
rtus cam
po
B. ab
ortu
s RB
51
B. su
is
M -
152
272
450
1682
794 587
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