TEMAS SELECCIONADOS DE TOXINASCON IMPLICACIONES BIOMDICAS Y MTODOS PARA SU ESTUDIO

TEMAS SELECCIONADOS DE TOXINASCON IMPLICACIONES BIOMDICAS Y MTODOS PARA SU ESTUDIO

4ndice

Identificacin de Toxinas con Actividad Antineoplsica en el

Veneno del Escorpin Tityus discrepans

Metaloproteinasas dependientesde Zinc: Protagonistas centrales en la Fisiopatologa deEnvenenamientos por Serpientes de la familia Viperidae

Desarrollo Biotecnolgico en elInstituto Clodomiro Picado

Utilidad de los Pptidos Sintticosen Estudios de Estructura-Funcine Identificacin de Epitopos en Toxinas

Monocapas y Bicapas Lipdicas en el Estudio de la Accin de

Biocompuestos Activos Contra Biomembranas. Modulacion

Supramolecular de la Actividad Lipoltica en Superficies Lipdicas.

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5Interactions of Sticholysin I with DPPC/SM bilayers.A Molecular Dynamics study

CalTx a New Toxin (13 Amino Acid Residues) Blocker of Calcium

Channels Obtained from Conus Californicus

Laboratorio de Venmicay Proteinmica Estructural

La Thalassiolina-B, un Flavonoide de Origen Marino con Efecto Antinociceptivo, Bloquea la Corriente Asic en las Neuronas de los Ganglios de la Raz Dorsal de la Rata

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6Prlogo

os captulos que incluye el libro electrnico Temas selecci0 nados de toxinas con implicaciones biomdicas y mtodos para su estudioresultan de una primera aproximacin para mostrar de manera panormica el trabajo de investigacin que desarrollan los miembros de la Red Iberoamericana Temtica CYTED 212RT0467 (Biotox) en el campo de las toxinas con impli-caciones para la Biomedicina. El texto no pretende ser exhaustivo, ms bien se trata de un material introductorio, de carcter general, cuyo propsito comunicativo es servir como presentacin delas lneas de in-vestigacin de los principales grupos de Argentina, Brasil, Chile, Costa Rica, Cuba, Espaa, Mxico y Venezuela pertenecientes a la Red Biotox que se ocupan de toxinas o cuentan con un arse-nal metodolgico para su caracterizacin fsico-qumica, biolgica o su accin farmacolgica. Los autores son reconocidos especialistas en sus respectivas reas de trabajo a los cuales agradezco el esfuerzo en la elabo-racin de este material que puede ser til a profesionales y estudiantes interesados en conocer aspectos del estado del arte en investigaciones sobre toxinas o mtodos para su estudio, en el mbito iberoamericano. En principio, estos textos fueron concebidos para apoyar las exposiciones que se realizaron en el I Taller-Cientfico Tcnico de Biotox celebrado en el Instituto Clodomiro Picado, Costa Rica (6-10 agosto, 2012), que dio inicio a las actividades de la Red. Invito a los interesados a acompaar la lectura de los artculos con las correspondientes presenta-ciones de sus autores. Las presentaciones pueden encontrarse en la Multimedia: Memorias de las actividades de la Red CYTED 212RT0467, Biotox: Toxinas de Inters para la Biomedicina, 2012 (Costa Rica) y posteriormente sern depositadas en la pgina Web de la Red que se encuentra en desarrollo

L

7(www.iq.usp.br/biotox).Esperemos el material sea de utilidad a estudiantes, profesio-nales y otros actores sociales interesados en el tema de toxinas, en especial la comunidad toxinolgica iberoamericana.

Carlos M. lvarez ValcrcelCoordinador Iberoamericano Red CYTED 212RT0467 BiotoxToxinas de Inters para la BiomedicinaEnero, 2013

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Identificacin de Toxinas con Actividad Antineoplsica en el Veneno del Escorpin Tityus discrepans

Gina DSuze*a, Arnaldo Rosalesa , Vctor SalazarB , Carlos Sevcik a

aLaboratorio de Neurofarmacologa Celular, BServicio de Histologa, Centro de Biofsica y Bioqumica, Instituto Venezolano de Investigaciones Cientificas (IVIC) Caracas, Venezuela.e-mail: gdsuze@ivic.gob.ve

resumenEn el veneno del escorpin venenzolano Tityus discrepans se encontraron 4 toxinas con actividad antineoplsica. Estas son integrantes de la fraccin I (FI) del veneno separado me-diante exclusin molecular, la cual contiene los componen-tes de mayor peso molecular y es no toxica para los mamfe-ros. Las 4 toxinas aisladas de la FI mediante cromatografa lquida de alta resolucin son pptidos que inducen apopto-sis preferencialmente en la lnea celular de cncer de mama humano SKBR3 y tienen poco o ningn efecto sobre las clu-las normales de rin de mono MA104. Apoptosis es el me-canismo de accin en el cual se basa la eficiencia de drogas antineoplsicas comnmente utilizadas en quimioterapia. La apoptosis inducida en SKBR3 es equivalente e incluso mayor a los efectos de paclitaxel y vinblastina estudiados en condiciones similares. Mediante inmunohistoqumica se de-termin que las toxinas se unen a la membrana plasmtica y que la muerte ocurre por induccin de apoptosis mediante la sobreexpresin de FasL (DSuze et al., 2010). Este es el pun-to de inicio de una serie de eventos bioqumicos nucleares codificados genticamente relacionados con la activacin de las caspasas citoplasmticas.palabras claves: Veneno de Escorpin, SKBR3, Compuestos Anticancergenos, Apoptosis, FasL.

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abstractFour toxins with antineoplastic activity were isolated from the Venezuelan Tityus discrepans scorpion venom. These toxins are part of fraction I (FI) from the molecular exclusion isolation, which contains the higher molecular weight com-ponents and is also non-toxic to mammals. The active toxins, isolated from FI by HPLC, are peptides able to induce apop-tosis preferentially in human breast cancer cell line SKBR3. The same toxins, have little or no effect on normal monkey kidney cell line MA104. Apoptosis is the action mechanism underlying the efficiency of commonly used antineoplas-tic drugs in chemotherapy. Induced apoptosis in SKBR3 is completely equivalent or even greater than the effects of paclitaxel and vinblastine studied under similar conditions. It was determined by immunohistochemistry that these toxins bind to the plasma membrane inducing cell death by apoptosis as consequence of FasL overexpression (DSuze et al., 2010). This is the starting point of a series of nuclear bio-chemical events genetically encoded, related with cytoplas-mic activation of caspases.key words: Scorpion venom, SKBR3, FasL, Antineoplastic natural compounds, Apoptosis.

introduccin Los escorpiones o alacranes son arcnidos de hbitos prefe-rentemente nocturnos. Han vivido en la tierra desde hace mas de 400 millones de aos; se encuentran entre los pri-meros artrpodos que tuvieron xito en el paso del medio acutico al terrestre. Su larga historia evolutiva y la natu-raleza proteica de su veneno les han permitido diversificar sus venenos bajo la presin selectiva del medio donde vi-ven. Se encuentran ampliamente distribuidos en el mundo, en donde se estima que existen cerca de 1500 especies, pertenecientes a 12 familias, de las cuales la familia Buthidae es la nica que contiene las especies con veneno peligroso para los humanos. En el Continente Americano esta familia tiene dos gneros que son importantes desde el punto de vista de la salud humana, Tityus distribuido en Amrica del

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Sur, Amrica Central e islas del Caribe y Centruroides en Amri-ca del Norte, Amrica Central, islas del Caribe y algunas regio-nes del norte de Amrica del Sur (Gonzlez-Sponga, 2011). Los escorpiones del gnero Tityus inducen en el humano una sintomatologa compleja denominada sndrome de emponzoamiento escorpinico (DSuze y col., 2011) el cual incluye trastornos neurolgicos, pancreatitis aguda (Porras, 1994, Ghersy de Nieto y col., 2004), manifestaciones cardio-vasculares, edema agudo del pulmn (Mazzei de Dvila y col., 2002), sindrome de dificultad respiratoria por escor-pionismo (DSuze y col., 1999), trastornos de la coagulacin (De Sousa y col., 1995; DSuze y col., 2003; Brazn y col. 2008) y activacin de los procesos inflamatorios (Guinand y col., 2004; DSuze y col., 2004a; 2007). El escorpionismo en Vene-zuela se caracteriza por inducir una respuesta sistmica con variedad de complicaciones, las cuales dependen de la es-pecie de escorpin, de la cantidad de veneno inoculado y de la sensibilidad del afectado. Estos venenos contienen tanto las toxinas responsables del sndrome de envenenamiento escorpinico como otras inocuas al ser humano. Las toxi-nas venenosas al ser humano han sido las mas estudiadas, son las mas abundantes en cuanto a su concentracin en el veneno, sin embargo las inocuas al ser humano, casi no han sido estudiadas a pesar de que representan la mayor varie-dad en el veneno. El veneno de los escorpiones est constituido por ppti-dos, enzimas, nucletidos, lpidos, aminas y otros compues-tos no identificados. El estudio protemico del veneno de T. discrepans revel 205 componentes los cuales se aislaron en columnas de fase reversa dadas sus diferencias en hidrofo-bicidad y pesos moleculares (Batista y col., 2006). Este tra-bajo revel que las toxinas que eluyen entre los primeros 10 minutos tienen masas entre 200 y 2000 Da, en este grupo se han descrito toxinas con actividad inhibitoria de la activi-dad amidoltica del factor Xa y de la plasmina (Brazn, 2006). Las toxinas que eluyen entre 10 y 20 minutos tienen masas entre 2 y 4 kDa, las eludas entre 20 a 30 minutos pesan en-tre 3 kDa y 5 kDa, en estos dos grupos se han

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descrito toxinas con actividad en canales de K+ (DSuze y col., 1999; 2004b). El grupo de toxinas que eluyen entre 30 y 40 minutos presentan masas que van entre 5 kDa y 8 kDa estas en su mayora presentan actividad sobre isocanales de Na+ tanto de mamferos como de invertebrados (DSuze y col., 1995; 1996; 1997; 2004c). En este tiempo eluyen tambin las toxinas de cadena larga activas en canales de K+ (Diego-Gar-ca y col., 2007; DSuze y col., 2009). Los pptidos que eluyen despus de los 40 minutos son protenas mas hidrofbicas y de mayor peso molecular >8 kDa en donde se pueden encon-trar aquellas con actividad curarizante (DSuze y col., 1995), con actividad enzimtica como metaloproteasas, hialuroni-dasas entre otras (Brazn 2006), activadoras de plaquetas (Brazn y col., 2011) y con actividad antineoplsica (DSuze y col., 2010). El inters por el valor farmacetico de los venenos de es-corpin como potenciales agentes teraputicos contra tu-mores cancergenos comenz con el descubrimiento de la clorotoxina (ChTx). ChTx fue aislada del veneno de Leiurus quinquestriatus demostrando tener una potente y selec-tiva actividad sobre gliomas humanos (DeBin y col., 1993; Soroceanu et al.,1998; Deshane y col., 2003). La ChTx bloquea canales de Cl-, pero su efecto anticancergeno ocurre por induccin de apoptosis. Hasta la fecha unas pocas toxinas con actividad anticancergena han sido caracterizadas. Algu-nas ejercen su accin mediante el bloqueo de ciertos canales inicos (Jger et al, 2004), otras inhibiendo la invasin y ex-travasacin de las clulas cancergenas (Deshane et al., 2003) o activando las vas metablicas que inducen apoptosis (Gupta et al., 2010). La apoptosis es un tipo de muerte celu-lar iniciada por eventos bioqumicos nucleares codificados genticamente, relacionados con la activacin de las caspa-sas citoplasmticas (Green y Reed, 1998). En este trabajo nues-tra atencin va dirigida hacia los componentes del veneno de T. discrepans con actividad anticancergena. Se estudi la accin del veneno completo y sus componentes purificados mediante HPLC sobre la lnea celular SKBR3 de cncer de mama humano y sobre la lnea de clulas no malignas MA104 de rin de mono.

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materiales y mtodosEl veneno fue fraccionado por cromatografa de exclusin molecular convencional empleando una columna de sepha-dex G-50 (200 x 1 cm, 19 mL/h/cm2) (Pharmacia Biotech AB, St. Louis, MO, U.S.A) equilibrada y eluda a ~25C con acetato de amonio 20 mM, pH 4,7. La deteccin de las fracciones se realiz por absorbancia a 280 nm. Se carg en la columna 100 mg de veneno diluido en 1 mL del tampn de equilibrio (D Suze y col, 1995). Las fracciones eludas se liofilizaron y se usaron para ensayos de toxicidad. La fraccin mas potente se purific mediante cromatografa lquida de alta resolu-cin (CLAR) a 25C, por una columna semipreparativa de fase reversa C4 (250 x 10 mm) (Vydac, Hesperia, CA, U.S.A). Los componentes se separaron usando un gradiente lineal de solvente A [agua con 0,12 % de cido trifluoroactico (TFA)] a 80% de Solvente B (acetonitrilo con 0,1 % de TFA), en 80 minutos (1 mL/min, 230 nm). Las fracciones con actividad se recromatografiaron hasta obtener el compuesto puro en una C4 analtica (250 x 4.6 mm). Se recolectaron manu-almente y liofilizaron para el anlisis de espectrometra de masa por MALDI-TOF, la degradacin automtica de Edman y para los experimentos sobre las lneas celulares de cncer de mama humano SKBR3 (ATCCRNumber: HTB-30TM) y c-lulas normales de rin de mono MA104 (ATCCRNumber: CRL-2378.1TM). Las lneas celulares se cultivaron a confluen-cia en placas de 96 pozos en medio DMEM con suero fetal bovino (FBS). Antes de exponerlas al veneno o toxinas puras el medio de cultivo se cambi a DMEN libre de FBS. Ambas lneas celulares fueron incubadas con las fracciones elu-das de Sephadex G-50 fracciones (0,15 g/L), se determin viabilidad celular despus de 48 h utilizando bromuro de tiazolil tetrazolio (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) (Mos-mann,1983). La muerte celular se determin mediante la lectura de absorbancia a 570 nm. Para la cuantificacin de apoptosis y necrosis las lneas celulares se cultivaron a con-fluencia en cubreobjetos 22x22 mm2 en presencia de medio DMEM con suero fetal bovino (FBS) y se expusieron a las toxinas purificadas (1 g/L) durante 5 h. La deteccin y

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cuantificacin de las clulas en apoptosis y necrosis se rea-liz por microscopia de epifluorescencia utilizando bromuro de etidio (100 g/mL) y naranja de acridina (100 g/mL) (EB/AO) en PBS (McGahon et al., 1995; Jolly et al., 1997). Para mayores detalles vea DSuze et al., 2010.

resultados y discusinEl veneno completo indujo la prdida de la forma y adhesin de las clulas al substrato, contraccin y aparicin de espi-gas alargadas en la superficie de algunas de ellas, lisis even-tual y muerte celular (Fig.1).

A: SKBR3 control B: SKBR3 FI C: MA104 FI

Figura 1:4 x 104 clulas por pozo cultivadas hasta confluencia en DMEM/10% FBS, penicilina (100 U/mL), gentamicina (48 mg/mL) y anfotericina B (3 mg/mL) en 5% de CO2 y 37 C. Antes de exponerlas al veneno se cambiaron a medio libre de FBS. Las fracciones del veneno se resuspendieron en medio DMEN libre de FBS [0,15 g/L], las clulas se mantuvieron a 5% de CO2 y 37 C durante 48 h.

Estos eventos no se producen en las clulas normales de rin de mono (MA104) al exponerlas al veneno bajo las mismas condiciones, estas se mantienen formando una monocapa y no cambian su morfologa. El efecto inducido por FI sobre las clulas cancergenas SKBR3 es dependiente del tiempo de exposicion y de la concentracin de veneno (para detalles ver DSuze et al., 2010). La fraccin del veneno de T. discrepans que indujo mayor muerte en la lnea celular SKBR3 fue la fraccin I proveniente de Sephadex G-50, la cual no es toxica a mamferos y contiene las toxinas de mayor peso molecular. FI (0.15 g/L) indujo 70% de muerte en las

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clulas cancergenas SKBR3 a las 48 h de exposicin. Me-diante epifluorescencia se determin la forma como esta fraccin estaba induciendo la muerte celular. Sobre la base de la absorcin diferencial de bromuro de etidio y naranja de acridina (EB/AO) se determin simultneamente el porcen-taje de muerte por necrosis y por apoptosis al exponer las clulas a la FI (0.15 g/L) durante 5h. Las clulas vivas se ob-servaron con su ncleo de color verde. Las clulas apoptti-cas tempranas se observaron con un ncleo de color verde brillante, con cromatina condensada o fragmentada. Las clulas apoptticas tardas tenan la cromatina condensada y fragmentada de color naranja y las clulas que murieron a causa de necrosis directa presentaban el ncleo de color naranja estructuralmente normal (Fig. 2).

A: SKBR3 control B: SKBR3 con veneno (1 g/L) 5 h

Figura 2: 4 x 104 clulas se cultivaron a confluencia en cubreobjetos con DMEM-10%FBS. La apoptosis y necrosis se determin por microsco-pia de epifluorescencia utilizando bromuro de etidio (100 ug/mL) y naranja de acridina (100 ug ul/mL) (EB/AO) en PBS. Las clulas se expu-sieron a la FI [0,15 g/L] por 5 h.

Se fraccion FI mediante cromatografa lquida de alta reso-lucin hasta lograr la pureza de sus componentes (Fig. 3).

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Figura 3: Perfil cromatogrfico de FI eluido en una columna semi-preparativa de fase reversa C4 a 1 mL/min usando un gradiente linear de solucin A [agua con 0.12% cido trifluoroacetico (TFA)] hasta 80% solucin B (acetonitrilo con 0.10% TFA) en 80 min. Insertos: Purifi-cacin de los componentes activos presentes en la FI eluidos en una C4 analtica. Los picos identificados como 1, 2, 3 y 4 son toxinas con activi-dad antineoplsica; de los cuales 3 y 4 son neopladina 1 y neopladina 2 (DSuze et al., 2010).

Se estudi el efecto de todos los componentes de la FI cada uno por separado sobre las lneas celulares SKBR3 y MA104. Para ello se calcularon los porcentajes de necrosis y apop-tosis de las lneas celulares cultivadas a confluencia en cu-breobjetos 22x22 mm2 en presencia de medio DMEM-FBS. Cada uno de los componentes de la FI se disolvi por sepa-rado a una concentracin de 1 g/L en medio DMEN libre de FBS y se expusieron las clulas a ellos durante 5 h. Luego se trataron las clulas con bromuro de etidio y naranja de acridina en PBS y se observaron con epifluorescencia. Al grupo de las clulas controles se les agreg medio DMEN libre de FBS. Se usaron como controles positivos paclitaxel 6 nM (Clitaxel Nolver CA, Venezuela) y vinblastina 6 nM (VinblastinaTN, Elmor SA, Venezuela). Los porcentajes de apoptosis y necrosis se de-terminaron en base de al menos 1500 clulas contadas desde campos seleccionados al azar. Los datos representan al menos tres experimentos independientes realizados por duplicado (Fig.

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4). Figura4: Porcentaje de muerte celular por apoptosis o necrosis in-ducido por las toxinas purificadas de la F1. 4 x 104 clulas se cultivaron a confluencia en cubreobjetos 22x22 mm2 con medio DMEM-FBS. Las clulas se expusieron a las toxinas puras (NTx) [1 g/L] durante 5 h. Barras moradas: % apoptosis. Barras anaranjadas: % necrosis.

La FI contiene 4 pptidos que inducen apoptosis con selec-tividad para las clulas de cncer de mama humano SKBR3, su efecto en clulas no malignas renales de mono MA104 no fu estadsticamente diferente a los controles. En los con-troles positivos con paclitaxel se observ en las clulas SKBR3 (n = 1714): 3,2 0,43% de apoptosis y 0,47 0,17% de necrosis, pero en la lnea celular MA104 (n = 952) paclitaxel solo in-dujo 0,42 0,21% de apoptosis y no necrosis. La vinblastina induce 4,69 0,50% de apoptosis y 1,87 0,32% de necrosis en la lnea celular SKBR3 (n = 1814), el mismo frmaco indujo 3.2 0,56% apoptosis y 0,2 0,14% de necrosis en las clu-las MA104 (n = 999) (DSuze et al., 2010). Los porcentajes de apoptosis inducidos por las toxinas de la FI sobre las clulas SKBR3 fueron mayores que los inducidos por los controles positivos. Estas toxinas a tiempos cortos y/o en concentra-ciones bajas, inducen un efecto apopttico significativo sin necrosis. En la Figura 5 se muestran micrografas de contraste de fase y de fluorescencia en las que las exposiciones (5h) a las toxinas purificadas NTx de la FI (1 g/L) inducen frag-mentacin nuclear, condensacin del citoplasma, las clulas formaron picos en la membrana plasmtica, vesculas in-tracelulares y prdida de confluencia celular en las clulas de cancer de mama SKBR3 pero no en las clulas renales de mono MA104. Los efectos apoptticos observados se ase-

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mejan a los causados por el veneno de B. martensii (Karsch) en glioma humano y al efecto inducido por el veneno de H. bengalensis en clulas leucmicas (Wang y Ji, 2005; Gupta et al, 2010).

A:SKBR3 5h con NTx. Contraste de fase

C:MA104 5h con NTx. Contraste de fase

B:SKBR3 5h con NTx. EB/AO barra: 25

D:MA104 5h con NTx. EB/AO barra: 25

Figura 5: Efecto de las toxinas purificadas de la FI (1 g/l, 5h) sobre SKBR3 y MA104.

Los venenos de escorpion contienen cientos de componen-tes con diferentes actividades farmacolgicas, en especial los escorpiones de la familia Buthidae cuyos venenos pueden inducir la muerte en humanos. Sin embargo no to-dos los componentes son txicos a humanos, especialmente

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aquellos de alto peso molecular, como son las toxinas que conforman la FI del veneno de T. discrepans. Estas inducen apoptosis a concentraciones similares o inferiores a las en-contradas en otras toxinas de escorpiones (Wang and Ji, 2005; Gupta et al., 2010). Mediante inmunohistoqumica se determin que las toxinas se unen a la membrana plasmti-ca y que la muerte ocurre por apoptosis al inducir una so-breexpresin de FasL (DSuze et al., 2010). La muerte celular ocurre por apoptosis debido a una serie de eventos bio-qumicos nucleares codificados genticamente relacionados con la activacin de las caspasas citoplasmticas. Apoptosis es el mecanismo de accin en el cual se basa la eficiencia de drogas antineoplsicas. Las toxinas aisladas de la FI son pp-tidos apoptticos en clulas SKBR3 y tienen poco o ningn efecto sobre las clulas normales MA104. La apoptosis indu-cida en SKBR3 puede parecer pequea debido al corto pero-do de observacin, pero es completamente equivalente a los efectos de paclitaxel y vinblastina estudiadas en condiciones similares, mas an, su efecto apoptognico fue mayor que el de paclitaxel y vinblastina. Otra droga como por ejemplo la cisplatino, comnmente utilizada en quimioterapia induce apoptosis en clulas cancergenas mediante una va similar (Mller et al., 1997).

agradecimientosLos autores agradecen el apoyo tcnico de: Lic. Yoliver Higuerey, Lic. Moises Sandoval y MSc. Patricia Daz (CBB-IV-IC). Este trabajo fu parcialmente financiado por el FONACYT de Venezuela y se agradece el apopyo de de la RedCYTED-212RT046 (Toxinas para la Biomedicina) por su ayuda para la difusin de esta informacin.

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Metaloproteinasas dependientes de Zinc: Protagonistas centrales en la Fisiopatologa de Envenenamientos por Serpientes de la familia Viperidae

Jos Mara Gutirrez*, Teresa Escalante, Alexandra Rucavado

Instituto Clodomiro Picado, Facultad de Microbiologa, Universidad de Costa Rica, San Jos, Costa Ricae-mail: jose.gutierrez@ucr.ac.cr

resumenSe presenta y discute el papel que juegan las metalopro-teinasas de los venenos de serpientes (SVMPs) de la familia Viperidae en la fisiopatologa de los envenenamientos in-ducidos por mordeduras de estos reptiles. Se hace especial nfasis en los mecanismos mediante los cuales estas enzi-mas inducen hemorragia. As mismo, se discuten otros efec-tos que resultan de la accin de estas enzimas, tales como la necrosis muscular, la formacin de ampollas y flictenas, y la coagulopata. Finalmente, se analiza el rol que juegan las SVMPs en la deficiente regeneracin de tejido muscular que caracteriza estos envenenamientos.palabras clave: serpientes; venenos; metaloproteinasas; hemorragia, dao tisular.

abstractThe role played by snake venom metalloproteinases (SVMPs) in the pathophysiology of envenomings induced by snakes of the family Viperidae is discussed. The mechanisms involved in the ability of these enzymes to generate hemorrhage are presented, together with an analysis of other pathological effects induced by SVMPs, such as myonerosis, blistering and coagulopathy. Finally, the role played by these enzymes in the poor skeletal muscle regeneration characteristic of viperid snakebite envenomings is analyzed.

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key words: Snakes; venoms; metalloproteinases; hemor-rhage; tissuedamage.

introduccinLos venenos de serpientes constituyen secreciones de enorme complejidad bioqumica, con una alta concentracin de protenas, muchas de las cuales presentan efectos txicos que les permiten a las serpientes inmovilizar a sus presas y, en algunos casos, efec-tuar una predigestin de las mismas. Los estudios protemicos de venenos de serpientes han revelado la existencia de una gran can-tidad de protenas, las cuales sin embargo se pueden clasificar en un nmero limitado de familias (Calvete, 2011). Los venenos de ser-pientes de la familia Viperidae presentan, en general, una alta con-centracin de metaloproteinasas dependientes de zinc (en ingls snakevenommetalloproteinases, SVMPs). Estas SVMPs pertenecen a la familia M12 de las metaloproteinasas, junto con las ADAMs (a disintegrin and metalloproteinase), con las cuales forman la subfamilia de las reprolisinas (Fox y Serrano, 2005), las cuales a su vez forman parte de las metzincinas, junto con las astacinas, ser-ralisinas y metaloproteinasas de matriz. Las metzincinas se carac-terizan por presentar una secuencia consenso en el sitio cataltico (HExxHxxGxxH) y luego una regin conteniendo un residuo de metionina (Metturn). Las SVMPs juegan un papel central en las dos funciones princi-pales de los venenos, esto es, en la inmovilizacin y muerte de las presas y en la predigestin (Gutirrez et al., 2010). Adems de su actividad digestiva, las SVMPs ejercen una serie de efectos txicos relevantes, entre los que destacan su actividad he-morrgica, su capacidad para generar necrosis como consecuen-cia de la isquemia, su actividad procoagulante, la inhibicin de la agregacin plaquetaria y la degradacin de la matriz extracelular, entre otros efectos (Gutirrez et al., 2010). Dada la relevancia de estas enzimas en los venenos de vipridos, diversos grupos han avanzado en la caracterizacin mole-cular de estas proteinasas y en la comprensin de los mecanismos mediante los cuales provocan alteraciones fisiopatolgicas y pa-tolgicas. El presente trabajo resume algunos de estos hallazgos.

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estructura y clasificacin de las SVMPsLas SVMPs difieren notoriamente en sus masas moleculares, las cuales van desde 22 kDa hasta ms de 70 kDa (Fox y Serrano, 2005). Esta heterogeneidad se debe a las variacio-nes en la composicin de dominios de estas enzimas. Todas las SVMPs presentan, en su protena madura, un dominio metaloproteinasa, el cual contiene la secuencia de unin a zinc y el bucle donde se encuentra la metionina. Las SVMPs que presentan nicamente este dominio se clasifican en la clase PI. Algunas SVMPs presentan, adems del dominio metaloproteinasa, un dominio disintegrina, constituyendo la clase PII. En muchos casos este dominio disintegrina es liberado como consecuencia de la accin proteoltica, aunque unas pocas SVMPs presentan los dos dominios en la protena madura (Fox y Serrano, 2005). Las SVMPs clasifica-das en la clase PIII contienen, adems del dominio metalo-proteinasa, un dominio tipo-disintegrina y un dominio rico en cistena. Dentro de esta clase PIII hay algunas enzimas que presenten una subunidad adicional, una protena tipo lectina tipo C, unida a la cadena con tres dominios mediante puentes disulfuro. Dentro de las clases PII y PIII existen varias subclases dependiendo de si se trata de protenas dimrica-so con base en otras caractersticas (Fox y Serrano, 2005). Se conoce la estructura 3D de una serie de SVMP de la clase PI y de algunas SVMPs de la clase PIII, las cuales se disponen en forma de C, con el dominio rico en cistena ubicado cerca del dominio cataltico (Escalante et al., 2011b). Se ha propuesto que la evolucin molecular de las SVMPs se basa en el reclu-tamiento ancestral de un gen que codifica para una ADAM, seguido de un proceso evolutivo molecular basado en pr-dida de dominios, evolucin acelerada y neofuncionalizacin de los dominios remanentes (Casewell et al., 2011). SVMPs de la clase PIII han sido aisladas de venenos de serpientes de las familias Viperidae, Elapidae, Atractaspididae y Colubridae (sensu lato), en tanto SVMPs de las clases PII y PI solamente se han descrito en venenos de la familia Viperidae (Gutirrez et al., 2010).

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actividades txicas de las SVMPsLa actividad txica ms estudiada de las SVMPs es su ca-pacidad para inducir hemorragia, tanto a nivel local como sistmico. Este efecto acarrea consecuencias fisiopatolgicas variadas y complejas, ya que contribuye a la patologa local del envenenamiento, asociada con la destruccin de tejido, que lleva frecuentemente a secuelas permanentes, y con alteraciones hemodinmicas severas que pueden culminar en un choque cardiovascular (Gutirrez et al., 2005). Pero adems, las SVMPs son capaces de inducir necrosis muscu-lar, probablemente como consecuencia de la isquemia resul-tante de la destruccin microvascular (Gutirrez et al., 1995). Adems, inducen formacin de flictenas (Jimnez et al., 2008) y contribuyen con las coagulopatas caractersticas de envenenamientos por vipridos, ya que hay SVMPs que acti-van el factor X de la coagulacin y la protrombina, generan-do la formacin de microtrombos, con la consecuente des-fibrinogenacin y alteracin de las pruebas de coagulacin (Gutirrez et al., 2010). Algunas SVMPs de la clase PIII son capaces de inhibir la agregacin plaquetaria inducida por el colgeno y otros agonistas (Kamiguti, 2005). Por otra parte, las SVMPs contribuyen con la inflamacin caracterstica de la accin de estos venenos (Teixeira et al., 2005).

mecanismo de accin de SVMPs hemorrgicasLos estudios ultraestructuraleshan demostrado que las SVMPs hemorrgicas provocan lesiones drsticas en los va-sos capilares muy rpidamente despus de la inyeccin en animales de laboratorio (Gutirrez et al., 2005). Los capila-res afectados presentan evidentes alteraciones tanto en las clulas endoteliales como en la membrana basal (MB). En el caso de las clulas endoteliales, estas disminuyen el nmero de vesculas pinocitticas, se distienden y adelgazan y, even-tualmente, se rompen (Gutirrez et al., 2005, 2006). La es-tructura de la MB se altera, con prdida de su integridad y de su continuidad. Cuando se analiza este efecto mediante inmunohistoqumica, con anticuerpos contra los componen-tes de la MB, se observa una clara prdida de tincin para

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laminina, nidogen y colgeno tipo IV (Escalante et al., 2006). No obstante el conspicuo efecto patolgico observado en las clulas endoteliales de los vasos capilaresin vivo, cuando lneas de endotelio son expuestas in vitro a SVMPs hemo-rrgicas, no ocurre efecto citotxicoagudo equivalente a lo que se observa in vivo. Lo que se observa es un despegue de las clulas de su sustrato, seguido, varias horas despus, por muerte celular apopttica (Daz et al., 2005). La discrepancia descrita entre las observaciones in vivo e in vitro se pueden explicar mediante una hiptesis que plantea que la hemorragia inducida por las SVMPs ocurre en dos pasos: inicialmente las enzimas actan sobre sustratos ubicados en la MB, resultando en un debilitamiento de la estabilidad mecnica que dicha MB provee a la estructura de los vasos capilares. Como consecuencia de dicho debili-tamiento, in vivo, se desencadena el segundo paso del pro-ceso: las fuerzas biofsicas que normalmente operan en la vasculatura (presin hidrosttica y fuerzas de cizalla o shear stress) provocan una distensin en el capilar debilitado, lo cual lleva eventualmente a la ruptura de la clula endotelial y la consecuente extravasacin (Gutirrez et al., 2005, 2006, 2010). Al no operar estas fuerzas biofsicas in vitro, esto ex-plica la ausencia de patologa directa sobre el endotelio en cultivo celular. En el contexto de esta hiptesis, es interesante pregun-tarse por qu algunas SVMPs son hemorrgicas y otras no, tomando en cuenta que todas son generalmente capaces de hidrolizar protenas de la MB. Una posible respuesta a esta incgnita fue presentada por Escalante et al. (2011a y 2011b). Cuando se estudiaron los patrones de degradacin in vitro e in vivo sobre protenas de la MB como consecuencia de la accin de una SVMP hemorrgica y una no hemorrgica se observ que, aunque ambas hidrolizaban de manera similar la laminina y el nidogen, la SVMP hemorrgica fue mucho ms efectiva en la hidrlisis del colgeno tipo IV y del proteo-glicano perlecan (Escalante et al., 2011a). Estas observaciones se relacionan con el hecho de que precisamente el colgeno tipo IV y el perlecan juegan un papel central en la estabili-

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dad mecnica de los vasos capilares. Por ende, una hidrli-sis de estos componentes redunda en un debilitamiento mecnico de la MB en particular y de la pared vascular en general, lo cual encaja muy bien con la hiptesis de los dos pasos para explicar el mecanismo de accin de las SVMPs hemorrgicas. La base estructural de la diferente capacidad de SVMPs de la clase PI para inducir hemorragia no se conoce a cabalidad. No obstante, Wallnoefer et al. (2010), al comparar mediante simulaciones dinmicas SVMPs hemorrgicas y no hemo-rrgicas, observaron que existen diferencias en la dinmica molecular de un bucle localizado en la vecindad del sitio activo de estas enzimas. Las SVMPs hemorrgicas presentan ms flexibilidad en una parte de ese bucle, en tanto las no hemorrgicas la presentan en otra regin.

por qu las SVMPs de la clase PIII son ms hemorrgicas que las de la clase PI?Consistentemente se ha observado que las SVMPs hemo-rrgicas de la clase PIII son mucho ms activas en su capa-cidad de inducir hemorragia que las de la clase PI. Dado que las primeras tienen una estructura multidominio, se ha planteado que los dominios adicionales (tipo disintegrina y rico en cistena) son responsables de dicho fenmeno. Estos dominios poseen exositios que les permiten a las SVMPs PIII ligarse a blancos celulares y de la matrix extracelular que las ubican en sitios estratgicos para lesionar la microvascula-tura, en la vecindad de la MB o de las clulas endoteliales. Al carecer de esos exositios, por tener nicamente un dominio metaloproteinasa, las SVMP de la clase PI tienen una accin ms promiscua y menos dirigida a blancos estratgicos para generar lesin microvascular (Gutirrez et al., 2005). Por otra parte las SVMPs PIII son resistentes a la accin inhibitoria de la 2-macroglobulina, una protena plasmtica de alta masa molecular que inhibe diversos tipos de proteinasas; por el contrario, las SVMPs de la clase PI son inhibidas por la 2-macroglobulina (Baramova et al., 1990; Gutirrez et al., 2005). La razn por la cual las SVMPs PIII resisten la in-

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hibicin por esta protena plasmtica no se conoce a cabalidad; se ha planteado que la misma se basa en un impedimento estructural generado por los dominios adi-cionales tipo disintegrina y rico en cistena. La ausencia de inhibicin por la 2-macroglobulina explicara por qu las SVMPs PIII son capaces de inducir hemorragia sistmica, en tanto las PI generan fundamentalmente hemorragia local, ya que al ingresar a la circulacin son inhibidas por esta protena plasmtica. Finalmente, podra ser que la mayor actividad hemorrgica de las SVMPs PIII se relacione con su capacidad para inhibir la agregacin plaquetaria, contribu-yendo as al sangrado generado por la hidrlisis de las prote-nas de la MB (Gutirrez et al., 2005; Kamiguti, 2005).

la accin de las SVMPs en la pielUno de los efectos patolgicos que se observa con frecuen-cia en pacientes envenenados por serpientes de la familia Vi-peridae es la formacin de ampollas o flictenas en la regin donde es inyectado el veneno. Los estudios experimentales han mostrado que este efecto es reproducido en ratones mediante inyeccin con SVMPs purificadas (Jimnez et al., 2008). Se ha postulado que esta lesin es consecuencia de la degradacin proteoltica de componentes de la MB que forma la interfase entre la epidermis y la dermis, lo cual ha sido evidenciado me-diante inmunohistoqumica (Jimnez et al., 2008; Escalante et al., 2009). El anlisis del exudado colectado a nivel subcutneo en ratones inyectados con una SVMP mostr la presencia de diversas protenas de la matriz extracelular, as como de quera-tinas (Escalante et al., 2009, 2011a).

las SVMPs y el problema de la deficiente regeneracin del tejido muscularLos envenenamientos por mordeduras de serpientes de la fa-milia Viperidae se caracterizan por una severa necrosis muscu-lar local. En muchos pacientes, esta necrosis no es seguida por un proceso adecuado de regeneracin muscular, por lo que se generan secuelas permanentes asociadas a prdida de masa y funcin muscular, con un alto impacto en la calidad de vida de

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estas personas. Las razones por las cuales est afectado el pro-ceso de regeneracin muscular se ha investigado a nivel experi-mental. Se ha observado que, cuando se inyectan toxinas que inducen mionecrosis, pero que no afectan la microvasculatura, la regeneracin se desarrolla de manera exitosa (Hernndez et al., 2011). Sin embargo, cuando los ratones son inyectados con una mezcla de miotoxinas y SVMPs hemorrgicas, o cuando se inyecta veneno total, la regeneracin es deficiente (Hernndez et al., 2011). Dado que el proceso de regeneracin muscular de-pende de una adecuada perfusin sangunea al tejido en re-generacin, se ha postulado que la destruccin de la microvas-culatura por las SVMPs hemorrgicas afecta drsticamente la regeneracin (Hernndez et al., 2011). Adems, es probable que las SVMPs tambin afecten las fibras nerviosas de los nervios perifricos que llegan al msculo, contribuyendo de esta mane-ra en la inadecuada regeneracin (Hernndez et al., 2011).

conclusionesLas SVMPs juegan unpapel clave en la fisiopatologa de los en-venenamientos por serpientes de la familia Viperidae, al con-tribuir de manera directa con la patologa local y sistmica de dichos envenenamientos. Pese a que se ha avanzado de manera significativa en la comprensin de la estructura y mecanismo de accin de las SVMPs, an permanecen muchas incgnitas relacionadas con los determinantes estructurales de la toxici-dad y con los mecanismos mediante los cuales estas enzimas generan lesin tisular e inflamacin. As mismo, desde la perspectiva teraputica, es muy importante descubrir y desa-rrollar inhibidores de estas enzimas, los cuales puedan ser uti-lizados como complemento a los antivenenos en el tratamiento de los envenenamientos por mordeduras de serpientes.

agradecimientosAlgunos de los estudios discutidos en este trabajo han sido financiados por la Vicerrectora de Investigacin de la Universi-dad de Costa Rica, por la red NeTropica y por el Wellcome Trust.

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Desarrollo Biotecnolgico en elInstituto Clodomiro Picado

Guillermo Len*, lvaro Segura, Mara Herrera, Maringela Vargas, Mauren Villalta, Aarn Gmez, Ricardo Estrada

Instituto Clodomiro Picado, Facultad de Microbiologa, Universidad de Costa Rica, San Jos, Costa Rica.*Corresponding author: Guillermo Len, Instituto Clodomiro Picado, Facultad de Microbiologa, Universidad de Costa Rica, San Jos, Costa Rica. Phone: 506-22293135. Fax: 506-22920485. e- mail: guillermo.leon@ucr.ac.cr

resumenEl Instituto Clodomiro Picado (ICP) es un instituto de inves-tigacin adscrito a la Facultad de Microbiologa de la Uni-versidad de Costa Rica, el cual se dedica al estudio de los venenos de serpiente; y al desarrollo y produccin de los antivenenos que se consumen en Centroamrica y en otras regiones afectadas por el problema del ofidismo. En el ICP se emplean caballos como fuente de inmunoglobulinas y los antivenenos son formulados con molculas de inmunoglo-bulinas completas, que son purificadas por precipitacin con cido caprlico y son formuladas como solucin inyec-table o como polvo liofilizado. El presente resumen sintetiza los conceptos bsicos que sustentan el diseo del proceso de produccin del ICP. palabras clave: Veneno de serpiente; antiveneno; cido caprlico; IgG.

abstractInstituto Clodomiro Picado (ICP) is a research institute attached to the Microbiology Faculty of the Universidad de Costa Rica, dedicated to the study of snake venoms; and to the development and production of the antivenoms con-

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sumed in Central America and other regions affected by ophidism. In the ICP, horses are used as immunoglobulin source and antivenoms are formulated using whole immu-noglobulin molecules, purified by caprylic acid precipitation and formulated as solutions for injection or as lyophilized powder. This overview summarizes the basic concepts un-derlying the design of the production process of the ICP.key words: Snake venom; antivenom; caprylic acid; IgG.

introduccinEl envenenamiento por mordedura de serpiente es un pro-blema de salud importante en muchos lugares del mundo (Kasturiratne et al., 2008), particularmente en los pases tropicales, donde las condiciones climticas (temperatura y humedad relativa cercana a los 30C y 70%, respectiva-mente) favorecen la proliferacin de serpientes; y las condi-ciones econmicas limitan la accesibilidad a antivenenos de calidad y el establecimiento de cadenas de fro para el alma-cenaje y distribucin de este tipo de medicamentos (Gutirrez et al., 2009). Por otra parte, la poca rentabilidad econmica de la co-mercializacin de antivenenos, hace que pocos laboratorios productores asuman el suministro de las zonas ms vulne-rables en Amrica Latina, Asia y frica. El desabastecimiento producido por la falta de oferta de antivenenos, ha favore-cido el surgimiento de un mercado inescrupuloso de pro-ductos con calidad deficiente, o que del todo no son eficaces para el tratamiento de los envenenamientos que ocurren en una regin particular. Los antivenenos ofdicos son soluciones de inmunoglobu-linas que tienen la capacidad de neutralizar los efectos txi-cos inducidos por los diferentes componentes de los vene-nos de serpiente. El procedimiento general empleado para la produccin industrial de antivenenos no ha cambiado sustancialmente desde las primeras formulaciones comer-ciales producidas a principios del siglo XX. Sin embargo, la incorporacin constante de nuevo conocimiento cientfico ha permitido la mejora de la eficiencia de los procesos de

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produccin, y de la eficacia, efectividad y seguridad de las formulaciones actuales. El presente resumen sintetiza los conceptos bsicos que sustentan el diseo del proceso de produccin de antive-nenos del Instituto Clodomiro Picado (ICP), incluyendo la manutencin de la coleccin de serpientes dedicada a la produccin de veneno, la inmunizacin de animales para la produccin de anticuerpos anti-veneno (Len et al., 2011) y la purificacin de esos anticuerpos para su posterior formu-lacin como solucin inyectable (Gutirrez et al., 2011).

manutencin de serpientes y produccin de veneno.La manutencin en cautiverio de una coleccin de ser-pientes venenosas, es la forma ms comn para establecer una fuente permanente del veneno que se consume en los esquemas de inmunizacin y en los ensayos de control de calidad requeridos para la elaboracin de antivenenos. El nmero de ejemplares que deben conformar la coleccin se determina considerando la productividad de veneno por individuo y el consumo proyectado. Por ejemplo, para la pro-duccin del antiveneno anti-coral que se consume en Cen-troamrica, es necesario emplear cerca de 300 mg de vene-no de la serpiente Micrurus nigrocinctus. Considerando que cada serpiente de esta especie produce cerca de 15 mg de veneno al ao, puede calcularse que la coleccin de corales debe estar conformada por al menos 20 ejemplares. En el caso del ICP, la coleccin de corales est conformada por 80 serpientes. Para la manutencin de estos ejemplares se emplea una dieta basada en sus presas naturales (ser-pientes de los gneros Geophis y Ninia), complementada con una dieta alternativa a base de pescado (Chacn et al., 2012). Los animales alimentados de esta manera han logrado ser mantenidos en cautiverio durante un tiempo que en prome-dio supera los dos aos.

produccin de plasma hiperinmune.En el mundo, la mayor parte de los laboratorios productores de antivenenos emplean caballos como fuente de inmuno-

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globulinas. Sin embargo, tambin existen formulaciones comerciales preparadas con anticuerpos ovinos. Tambin, antivenenos experimentales han sido preparados con an-ticuerpos de otras especies como cabras, camellos, llamas, burros y gallinas (Gutirrez et al., 2011; Len et al., 2011). La mayor parte de la capacidad neutralizante de los anti-venenos preparados en caballos es debida a anticuerpos de las clases IgG3 e IgG5, anteriormente conocida como IgG(T) (Fernandes et al., 1991). Debido a que estas inmunoglobuli-nas son altamente glicosiladas, ha sido sugerido que su in-munogenicidad debe ser mayor que la de inmunoglobulinas de otras especies, como por ejemplo las de oveja (Sjostrom et al., 1994). Sin embargo, un estudio reciente mostr dife-rencias mnimas en la incidencia de reacciones adversas in-ducidas por antivenenos de origen equino y de origen ovino (Abubakar et al., 2010). Por otra parte, las inmunoglobulinas de camlidos tam-bin han sido empleadas para la formulacin de antive-nenos ofdicos (Fernndez et al., 2010). Estos antivenenos presentan dos tipos de anticuerpos: 1- Anticuerpos hetero-tetramricos (~160kDa) conformados por dos cadenas pesa-das idnticas y dos cadenas livianas idnticas, y 2- Anti-cuerpos homodimricos (~100 kDa), conocidos tambin como anticuerpos de cadena pesada, los cuales correspon-den a las subclases IgG2 e IgG3 y estn compuestos nica-mente por dos cadenas pesadas idnticas. Anticuerpos antiveneno de la clase IgY (~180kDa) pueden ser purificados a partir de la yema de los huevos de gallina. Algunos investigadores han sugerido que la pro-duccin de antivenenos formulados con IgY podra resultar ms econmica que la produccin de antivenenos de origen equino (de Almeida et al., 2008). Esta hiptesis est siendo evaluada en el ICP mediante el estudio de la composicin del veneno de la serpiente Taipn (Oxyuranus scutellatus) de Papa Nueva Guinea (Herrera et al., 2012) y la comparacin de su inmunogenicidad en caballos (Vargas et al., 2011) y en gallinas.

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Una vez seleccionada la especie empleada como fuente de inmunoglobulinas, debe disearse un esquema de inmuni-zacin. Es decir, una serie de inyecciones de veneno (o venenos) cuya dosis, va de administracin y frecuencia de aplicacin son definidas con el fin de estimular la produccin de anticuerpos. El uso de adyuvantes inmunolgicos contribuye a mejorar el efecto inmunoestimulador del veneno y a incrementar la capa-cidad neutralizante de los anticuerpos producidos (Len et al., 2011). Hasta ahora, las emulsiones simples agua/aceite (como el adyuvante de Freund) han sido las ms eficaces en incrementar las respuestas por anticuerpos contra veneno de serpiente. Sin embargo, la severidad de las lesiones que producen en el sitio donde se inyectan, limita su uso a las primeras etapas de los esquemas de inmunizacin. Por eso, los refuerzos subsecuentes son administrados empleando otros adyuvantes como las sales minerales (Len et al., 2011). La inmunizacin de animales puede ser realizada empleando como antgeno uno o varios venenos, para producir antive-nenos monoespecficos o poliespecficos, respectivamente. A su vez, los antivenenos poliespecficos pueden ser producidos mediante dos estrategias: a) inmunizando con una mezcla de venenos, o b) mezclando antivenenos monoespecficos. La seleccin de la estrategia empleada en la produccin de anti-venenos poliespecficos debe considerar que algunos venenos poseen actividad inmunosupresora, y por eso deben realizarse experimentos para determinar los efectos cruzados en las respuestas por anticuerpos contra los venenos empleados como coinmungenos (dos Santos et al., 2011). La constitucin gentica de los individuos inmunizados es otro factor que determina la capacidad neutralizante de los plasmas obtenidos. Estas diferencias individuales se hicieron evidentes en un estudio en el que, de un grupo de animales in-munizados de la misma manera con los venenos de las serpien-tes Protobothrops mucrosquamatus y Viridovipera stejnegeri, solo algunos alcanzaron capacidades neutralizantes superiores a las especificaciones establecidas para la produccin de anti-venenos (Villalta et al., 2012)

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seleccin de la molcula empleada como principio activo.Durante dcadas ha sido considerado que los antivenenos formulados empleando fragmentos F(ab)2 como sustancia activa son ms seguros y eficaces que los que emplean in-munoglobulinas completas (IgG). Por eso en la actualidad, la mayora de los laboratorios productores de antivenenos formulan sus productos empleando fragmentos F(ab)2. La presuncin de la mayor seguridad de los antivenenos formulados con fragmentos F(ab)2 se fundamenta en la consideracin de que la mayora de las reacciones tempra-nas inducidas por antivenenos, son producidas por anafilo-toxinas liberadas como consecuencia de la activacin de la va clsica del complemento. Entonces se ha considerado que por no poseer el fragmento Fc, los fragmentos F(ab)2 son incapaces de activar la va clsica del complemento y por lo tanto se ha asumido que estos antivenenos deben inducir reacciones adversas tempranas con una incidencia menor que los que usan IgG. Sin embargo, un estudio clnico reciente demuestra que antivenenos formulados con IgG con F(ab)2 no difieren en la incidencia de las reacciones ad-versas que inducen (Otero et al., 2012). Por otra parte, en comparacin con las IgGs, los frag-mentos F(ab)2 poseen mayor volumen y velocidad de distri-bucin. Esto es debido a las diferencias entre las masas de ambas molculas. Con base en esas diferencias farmacoci-ticas, se ha asumido que los antivenenos formulados con fragmentos F(ab)2 deben ser ms eficaces que los formula-dos con IgG. Sin embargo, la evidencia clnica seala que los antivenenos formulados con IgG o con F(ab)2 no difieren en su eficacia (Otero et al., 2012). Es posible que este resultado se deba a que las alteraciones de permeabilidad en la mi-crovasculatura de la localidad donde el veneno es inyectado, hacen que la pared capilar no presente selectividad en la extravasacin de molculas de IgG o de fragmentos F(ab)2 (Gutirrez et al., 2003). Por otro lado, tanto antivenenos formulados con IgG o con F(ab )2 han mostrado ser muy eficaces para neutralizar la letalidad y los principales efectos sistmicos producidos por

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los venenos de serpiente, pero poco eficaces en el control de los efectos locales (Gutirrez et al., 2011). La pobre neutra-lizacin de los efectos locales puede atribuirse a la rapidez con la que estos efectos se desarrollan y a la falta de corre-lacin entre las propiedades toxicocinticas de los venenos y la farmacocintica de los antivenenos (Gutirrez et al., 2003).

purificacin de inmunoglobulinas y formulacin de antivenenos.Desde las primeras formulaciones que consistan en pre-paraciones crudas de inmunoglobulinas, los procedimien-tos de elaboracin de antivenenos han adaptado diferentes tcnicas fsico-qumicas para separar las inmunoglobulinas de los contaminantes proteicos propios del plasma. En ge-neral, esas tcnicas se basan en la diferencia de solubilidad de las protenas y se ven influenciadas por factores como la concentracin de protena, el pH y la fuerza inica (Gutirrez et al., 2011). La precipitacin con sales como el sulfato de amonio es una tcnica de purificacin de inmunoglobulinas amplia-mente difundida entre los productores de antivenenos en el mundo. Otra tcnica de purificacin de inmunoglobulinas es la precipitacin con cido caprlico, la cual fue empleada para la produccin industrial de los antivenenos que se consumen en Centroamrica (Rojas et al., 1994) y adaptada por el ICP para la produccin de antivenenos para Nigeria (Gutirrez et al., 2005), Papa Nueva Guinea (Vargas et al., 2011) y Taiwn (Villalta et al., 2012). Actualmente, el ICP traba-ja en la produccin de antivenenos, empleando una tcnica descrita para la purificacin de inmunoglobulinas humanas en un sistema de dos fases acuosas polmero sal (Vargas et al., 2012). Considerando que la sustancia activa de los antivenenos es nicamente las inmunoglobulinas que logran la neutra-lizacin de los componentes txicos del veneno, podemos sealar a las inmunoglobulinas no neutralizantes como los principales contaminantes en las formulaciones actuales. Por eso, los esfuerzos para mejorar la pureza de los antivene-

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nos deben dirigirse no solo a la separacin fsico-qumica de las inmunoglobulinas, sino que adems a la implemen-tacin de estrategias de inmunizacin que permitan ob-tener plasmas con mayores ttulos de anticuerpos neutrali-zantes (Segura et al., 2012). Debido a que existen virus como el Hendra y el virus del oeste del Nilo, que pueden ser transmitidos desde los ca-ballos empleados como fuente de inmunoglobulinas hasta los pacientes envenenados, es importante que la estrategia de purificacin de inmunoglobulinas en la produccin de antivenenos, incluya pasos especficos diseados con el obje-tivo de remover o inactivar virus (Burnouf et al., 2004). En el ICP se est estudiando la seguridad viral conferida por pro-cedimientos como la precipitacin con cido caprlico (Burnouf et al., 2007), el tratamiento con solventes-deter-gentes (Segura et al., 2009a) y la formulacin a pH cido (Solano et al., 2012). Una vez purificadas las inmunoglobulinas y formulado el antiveneno, la eficacia del producto debe garantizarse du-rante toda su vida til. Por eso, es importante considerar que cuando el antiveneno va a ser empleado en lugares en los que no se puede garantizar la cadena de fro, la formulacin debe incluir el uso de una estrategia de estabilizacin ade-cuada como la liofilizacin o la adicin de co-solutos como el sorbitol (Segura et al., 2009b).

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Utilidad de los Pptidos Sintticos en Estudios de Estructura-Funcine Identificacin de Epitopos en Toxinas

Bruno Lomonte

Instituto Clodomiro Picado, Facultad de Microbiologa, Universidad de Costa Rica, San Jos 11501, Costa Rica e-mail: bruno.lomonte@ucr.ac.cr

resumenLos pptidos sintticos han ganado un lugar relevante den-tro de la caja de herramientas de la investigacin bio-mdica actual. Las tcnicas de sntesis automatizada y el costo decreciente de los procesos, unidas a mejoras en su eficiencia y velocidad, hacen cada vez ms accesibles a es-tas herramientas. Su aplicabilidad es muy amplia, desde la generacin de molculas farmacolgicamente activas, hasta el desarrollo de vacunas, por ejemplo. En este resumen se presentan algunos ejemplos de las aplicaciones de pptidos sintticos en el estudio de las fosfolipasas A2 miotxicas, un grupo de protenas responsables de la necrosis del tejido muscular que ocurre frecuentemente en los envenenamien-tos causados por serpientes de la familia Viperidae

introduccinVincent Duvigneaud y colaboradores lograron sintetizar, en 1953, una pequea hormona peptdica: el nonapptido oxitocina. Tras un arduo trabajo de muchos meses con un equipo de expertos en sntesis orgnica, este avance fue reconocido en 1955 con el Premio Nobel de Qumica. En com-paracin, gracias a los avances que siguieron en las estrate-gias de sntesis de pptidos, esta meta ya se poda lograr en apenas unas horas de trabajo para la dcada de 1990. Como bien escriba el visionario novelista Jules Verne (1828-1905),

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...aquello que hoy puede catalogarse de fantstico, ser lo co-tidiano del maana... es solo una cuestin de tiempo. Bruce Merrifield, otro galardonado con el Nobel de Qumica (1986), sent las bases para la sntesis de pptidos moderna, al desarrollar mtodos para efectuar las reacciones de acople secuencial de aminocidos unidos a una fase slida, junto con la introduccin de diversas estrategias de proteccin de las ca-denas laterales. La longitud de los pptidos sintetizados ha ido superando lmites cada vez mayores, logrndose - por ejemplo - producir la fosfolipasa A2 humana (grupo IIA), de 124 amino-cidos, mediante la unin de dos segmentos sintticos de 51 y 53 residuos (Hackeng et al., 1997). El presente resumen presenta algunos ejemplos de las aplicaciones de pptidos sintticos en el estudio de las fos-folipasas A2 miotxicas, un grupo de protenas responsables de la necrosis del tejido muscular que ocurre frecuen-temente en los envenenamientos causados por serpientes de la familia Viperidae (Gutirrez y Lomonte, 1995; Monte-cucco et al., 2008; Lomonte y Gutirrez, 2011).

utilidad de los pptidos sintticosLos pptidos sintticos constituyen en la actualidad una herramienta muy til en la investigacin biomdica, con aplicabilidad en (a) la construccin de molculas farma-colgicamente activas, (b) el estudio de las relaciones estruc-tura-funcin de protenas, (c) la generacin de anticuerpos contra sitios predeterminados de un antgeno proteico, (d) la identificacin de epitopos lineales para linfocitos B y T en protenas, (e) el desarrollo de vacunas, o (f) el refinamiento de pruebas de utilidad diagnstica, entre muchos otros fines. En ciertos casos, la bioactividad de una protena logra ser reproducida mediante un pequeo segmento, el cual puede ser sintetizado con relativa facilidad y eficiencia, a un costo cada vez ms accesible.

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pptidos sintticos en el estudio de la relacin estructura-funcin de miotoxinasEn un ejemplo de nuestra propia experiencia, las actividades biolgicas de una familia de miotoxinas presente en los venenos de muchas especies de serpientes de la familia Vi-peridae, denominadas fosfolipasas A2 tipo Lys49, pueden ser reproducidos por un segmento de apenas 13 aminocidos, ubicados cerca de su extremo carboxilo-ter-minal (secuencia 115-129, en la nomenclatura convencional de Renetseder et al. [1985]). Estos pptidos C-terminales de las miotoxinas Lys49 son capaces de inducir citotoxicidad y actividad bactericida in vitro, as como mionecrosis y ede-ma en animales de experimentacin (Lomonte et al., 1994, 2003a, 2003b; Caldern y Lomonte, 1998; Pramo et al., 1998; Nez et al., 2001; Angulo y Lomonte, 2005; Lomonte y Ran-gel, 2012). Lo anterior ha servido de base para proponer que el mecanismo de toxicidad de estas protenas, que poseen estructura de fosfolipasa A2, pero que carecen de actividad cataltica, se basa en la existencia de un sitio bioactivo que comprende los aminocidos 115-129 (Figura 1), el cual es capaz de interactuar con membranas y desestabilizarlas (Lomonte et al., 1994; Lomonte y Rangel, 2012).

Figura 1: Las diversas actividades biolgicas de muchas miotoxinas tipo Lys49 (variantes catalticamente inactivas de fosfolipasa A2) pueden ser reproducidas empleando un segmento (115-129) de su regin C-terminal (sealado en rojo), en la forma de pptido sinttico.

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A travs del uso de pptidos sintticos, tambin se ha po-dido ubicar el sitio de las miotoxinas tipo-Lys49 que media su fuerte interaccin con el receptor 2 para el factor de cre-cimiento de endotelio vascular (VEGF-R2), con una constante de disociacin (Kd) en el orden de los 5x10-9 M (Yamazaki et al., 2005; Fujisawa et al., 2008). Al igual que las bioactivi-dades anteriormente mencionadas, la unin a este receptor celular depende del segmento C-terminal 115-129 (Figura 2), cuyo pptido sinttico interacta con una afinidad nanomo-lar en ensayos de unin realizados mediante anlisis de reso-nancia de plasmones de superficie (SPR) en BIAcore.

Figura 2: Evaluacin de la interaccin de diversos pptidos sintticos que cubren la secuencia completa de aminocidos de la miotoxina II de Bothrops asper de Costa Rica (paneles A-H) con el receptor VEGF-R2 inmovilizado sobre un chip de BIAcore. El pptido 115-129 (panel F) reproduce la interaccin que se observa al utilizar la toxina completa (recuadro inserto a la derecha). Adaptado de Fujisawa et al. (2008).

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pptidos sintticos para generar anticuerpos hacia sitios predeterminados de miotoxinasMediante la inmunizacin de animales de experimentacin con pptidos sintticos que corresponden a segmentos particulares de un antgeno proteico (y acoplados cova-lentemente a una protena inmunognica que acte como transportador), es posible obtener anticuerpos hacia sitios predeterminados del antgeno. Pese a su naturaleza poli-clonal, estos anticuerpos van a poseer una especificidad restringida, predefinida por el pptido empleado durante la inmunizacin. En ocasiones, tales anticuerpos son capaces de reconocer al epitopo correspondiente de la protena com-pleta en su estado nativo, lo cual los convierte en una he-rramienta muy til para su caracterizacin inmunoqumica y funcional. En el caso de la miotoxina II (Lys49) de Bothrops asper, se ha demostrado que los anticuerpos dirigidos contra su seg-mento C-terminal 115-129 son capaces de reconocerla y neu-tralizar su accin ltica sobre clulas en cultivo, as como su accin miotxica en animales (Caldern y Lomonte, 1998), en concordancia con el modelo que propone que este sitio es crucial para la toxicidad de las miotoxinas tipo Lys49. Adems, se ha explorado el potencial del pptido sinttico 115-129 como inmungeno para la generacin de anticuerpos que protejan de la mionecrosis causada por la miotoxina II, en un modelo de ratn. Dicho pptido sinttico, acoplado al toxoide diftrico en una proporcin molar de 3:1, indujo en los ratones inmunizados una proteccin cercana al 50% en trminos de necrosis de fibras musculares, en comparacin con el grupo de animales no inmunizados, luego de someter ambos grupos a la inyeccin intramuscular de una dosis de reto de la miotoxina (Caldern y Lomonte, 1999). Aunque la proteccin inducida mediante la inmunizacin con mio-toxina completa fue superior a la observada al inmunizar con el pptido sinttico de la regin C-terminal, el estudio demostr en principio que es posible reducir el dao tisular ocasionado por miotoxinas, empleando como inmungeno apenas un corto segmento sinttico de su estructura.

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Las actuales facilidades para la sntesis de pptidos y su costo decreciente hacen atractiva la opcin de considerar a los pptidos sintticos como potenciales inmungenos, con aplicabilidad en la induccin de anticuerpos neutralizantes contra diversos tipos de toxinas de importancia mdica.

pptidos sintticos para la identificacin de epitoposlineales en miotoxinas

Los epitopos, o sitios de un antgeno que son reconocidos por el sistema inmune adaptativo (B y T) de un individuo que es expuesto a l, pueden clasificarse en dos grupos genera-les. Unos, denominados secuenciales, lineales, o continuos, estn formados por aminocidos contiguos en la secuencia, en el caso de las protenas. Los otros, llamados discontinuos o conformacionales, se forman por la yuxtaposicin de ami-nocidos que no son contiguos en la estructura primaria, pero que se aproximan entre s gracias a los plegamientos que conforman la estructura secundaria y terciaria (o cua-ternaria) de las protenas. Aunque estos ltimos epitopos son difciles de reproducir empleando pptidos sintticos, los epitopos lineales son fcilmente representables me diante esta estrategia. Con la finalidad de ubicar cules son las regiones lineales de una protena que el sistema inmune adaptativo humoral de un individuo reconoce, es posible preparar una coleccin de pptidos traslapados, que cubran la secuencia completa del antgeno, y enfrentarlos, mediante algn tipo de prueba inmunolgica, contra el suero del individuo (o individuos) inmunizado. Esta estrategia de anlisis provee informacin relevante para comprender las caractersticas moleculares de la respuesta de anticuerpos contra una determinada pro-tena inmunognica, lo cual posee gran relevancia en el caso de toxinas, dado que la generacin y administracin de an-ticuerpos neutralizantes es la piedra angular para la terapia de muchos tipos de envenenamientos.

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La miotoxina II de Bothrops asper ha sido recientemente estudiada mediante esta estrategia, con el fin de identificar cules son sus principales epitopos lineales reconocidos por anticuerpos en una respuesta inmune. Para ello se evalu el reconocimiento por parte de animales inmunizados con la toxina purificada, empleando conejos, as como el recono-cimiento por parte de los equinos que son sometidos a in-munizacin con venenos completos (incluyendo a la especie cuyo veneno contiene dicha toxina). Una serie de 56 pptidos dodecamricos que cubre la secuencia completa de la mio-toxina II, con un desplazamiento o traslape de 2 residuos, se enfrent a los distintos tipos de sueros (tres lotes de anti-venenos equinos de uso teraputico, o un lote de suero de conejo anti-miotoxina II) empleando un ensayo inmunoen-zimtico basado en la captura de los pptidos biotinilados mediante estreptavidina acoplada a una fase slida (Lo-monte, 2012). Algunos de los epitopos lineales identificados fueron compartidos en las dos especies evaluadas, mien-tras que otros fueron nicos, como se muestra en la Figura 3. Adems, se observ ciertas diferencias entre los lotes de antiveneno equino, en cuanto a su reconocimiento a nivel de epitopos. El conocimiento sobre la manera en que los anti-venenos de uso teraputico reconocen a las toxinas ofdicas, por ejemplo, es muy limitado. Sin embargo, su comprensin podra tener implicaciones importantes para mejorar en este tipo de medicamentos, mediante estrategias de inmu-nizacin con toxinas recombinantes, epitopos sintticos, o segmentos gnicos codificantes por toxinas, por ejemplo.

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Figura 3: Identificacin de epitopos lineales de la miotoxina II de Bo-throps asper de Costa Rica, reconocidos por anticuerpos de conejo anti-miotoxina II (paneles A y C) o por anticuerpos presentes en el an-tiveneno teraputico de origen equino (paneles B y D) utilizado en los envenenamientos ofdicos en Centroamrica. Los asteriscos sealan a los epitopos ms intensamente reconocidos en el ensayo inmunoen-zimtico. Adaptado de Lomonte (2012).

agradecimientosEl autor agradece la colaboracin de numerosos colegas y estudiantes en las investigaciones citadas en el presente resumen, as como el apoyo econmico de la Vicerrectora de Investigacin de la Universidad de Costa Rica, del Inter-national Center of Genetic Engineering and Biotechnology, del Programa CYTED, y de la red NeTropica de colaboracin Suecia-Centroamrica.

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bibliografa AnguloY,LomonteB,2005.DifferentialsusceptibilityofC2C12 myoblasts and myotubes to group II phospholipase A2 myotoxins from crotalid snake venoms. Cell Biochem. Funct. 23, 307-313. CaldernL,LomonteB,1998.Immunochemicalcharacte-rization and role in toxic activities of region 115-129 of myotoxin II, a Lys49 phospholipase A2 from Bothrops asper snake venom. Archs. Biochem. Biophys. 358, 343-350. CaldernL,LomonteB,1999.Inhibitionofthemyotoxicaction of Bothrops asper myotoxin II in mice by immunization with its synthetic peptide 115-129. Toxicon 37, 683-687. FujisawaD,YamazakiY,LomonteB,MoritaT,2008.Cata-lytically inactive phospholipase A2 homologue binds to vas-cular endothelial growth factor receptor-2 via C-terminal loop region. Biochem. J. 411, 515-522. GutirrezJM,LomonteB,1995.PhospholipaseA2myotoxins from Bothrops snake venoms. Toxicon 33, 1405-1424.Hackeng TM, Nounier CM, Bon C, Dawson PE, Griffin JH, Kent SBH, 1997. Total chemical synthesis of enzymatically active hu-man type II secretory phospholipase A2. Proc. Natl. Acd. Sci. USA 94, 7845-7850. LomonteB,MorenoE,TarkowskiA,HansonL,MaccaranaM, 1994. Neutralizing interaction between heparins and myo-toxin II, a Lys-49 phospholipase A2 from Bothrops asper snake venom. Identification of a heparin-binding and cytolytic toxin region by the use of synthetic peptides and molecular modeling. J. Biol. Chem. 269, 29867-29873. LomonteB,AnguloY,CaldernL,2003a.AnoverviewofLysine-49 phospholipase A2 myotoxins from crotalid snake venoms and their structural determinants of myotoxic action. Toxicon 42, 885-901. LomonteB,AnguloY,SantamaraC,2003b.Comparativestudy of synthetic peptides corresponding to region 115-129 in Lys49 myotoxic phospholipases A2 from snake venoms. Toxicon 42, 307-312. LomonteB,GutirrezJM,2011.PhospholipasesA2fromViperidae snake venoms: how do they induce skeletal muscle

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Bruno Maggio

Centro de Investigaciones en Qumica Biolgica de Crdoba (CIQUIBIC)- Depto. De Qumica Biolgica, Fac. Cs. Qumicas. CONICET-Universidad Nacional de Crdoba. Haya de la Torre y Medina Allende. Ciudad Universitaria, X5000HUA Crdoba, Argentina.

abstract Biomembranes contain a wide variety of lipids and pro-teins within an essentially two-dimensional structure. The coexistence of such a large number of molecular species causes local tensions that frequently relax into a phase or compositional immiscibility along the lateral and transverse planes of the interface. As a consequence, a substantial mi-croheterogeneity of the surface topography develops and that depends not only on the lipidprotein composition, but also on the lateral and transverse tensions generated as a consequence of molecular interactions. The presence of pro-teins, membrane active enzymes that modify membrane lipid composition and immiscibility among lipids, constitute major perturbing factors for the membrane sculpturing both in terms of its surface topography and dynamics. In this work, we will summarize some recent evidences for the involvement of membrane-associated, both extrinsic and amphitropic, proteins as well as membrane-active phos-phohydrolytic enzymes and sphingolipids in driving lateral segregation of phase domains thus determining long-range surface topography.Supported by MINCyT (CONICET, FONCyT), MINCyT-Crdoba (ACC), SECyT-UNC.

Monocapas y Bicapas Lipdicas en el Estudio de la Accin de Biocompuestos Activos Contra Biomembranas. Modulacion Supramolecular de la Actividad Lipoltica en Superficies Lipdicas.

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key words: Surface topography, sphingolipids, lipid mono-layers, bilayer vesicles, phospholipases.

resumenLas biomembranas contienen una gran variedad de lpidos y protenas organizados en una estructura esencialmente bi-dimensional. La coexistencia de tal heterogeneidad com-posicional causa tensiones locales cuya relajacin frecuen-temente lleva inmiscibilidad ntre los componentes y/o a se-gregacin del estado de fase a lo largo y a travs del plano de la bio-interfase. Como consecuencia, se desarrolla una con-siderable microheterogeneidad topogrfica que depende no solamente de la composicin lpido-protena sino tambin de las tensiones laterales y transversales generadas por la adaptacin termodinmioca de las interacciones intermo-leculares locales. La presencia de portenas, enzymas activas contra componentes de la membrana que causan cambios de la composicn de la misma o inmiscibilidades entre los componentes consituyen factores de gran importancia para la dinmica estructural. En esta presentacin se tratar de resumir evidencias del efecto de lpidos, protenas y enzimas fosfohidrolticas en el establecimiento de segregacin de dominios con diferente estado de fase y como ello determina la topografa general de la superficie.Financiado por MINCyT (CONICET, FONCyT), MINCyT-Crdoba (ACC), SECyT-UNC.palabras claves: Topografa de superficie, esfingolpidos, monocapas lipdicas, vesculas bicapa, fosfolipasas.

introductionMembrane structures have revealed an extraor