CINETICA DE LA FERMENTACION ALCOHOLICA Y EFECTO DE LA TEMPERATURA EN EL PROCESO DE ELABORACION DE ALCOHOL

Laboratorio de alimentos fermentados

Profesora: Elvia Hernández Hernández

Equipo 2Contreras Rizo Gustavo

Duran Espinosa Sandra ErandiLino León Cipactli

Martínez Cruz María Guadalupe Morales Carrillo Violeta

RESUMEN:

En esta práctica evaluamos el efecto de la temperatura en la fermentación alcohólica para esto utilizamos como inoculo la levadura Saccharomyces cerevisiae. Y un medio de cultivo a base de glucosa con pH 4.5 esto se coloco en un fermentador que se esterilizo a 121 ºC durante 15 minutos al igual que los medios y se les realizo una prueba de esterilidad para evitar cualquier contaminación y que esto alterara nuestros resultados dando negativa esta prueba se procedido a colocar el medio con el inoculo en condiciones estériles en el fermentador.

Se coloco el fermentador en un un baño maría con una temperatura de 30° que fue a la que le toco trabajar a nuestro equipo pero a otros equipos les asignaron otra temperatura que son las dos que comúnmente se ocupan en la producción de etanol a nivel industrial para producir bebidas alcohólicas

La fermentación se llevo a cabo por 72 horas a partir del tiempo cero se empezaron a tomar muestras cada 24h, a las cuales se les realizo pruebas con el fin de conocer la concentración de levaduras, de etanol y azucares reductores.

INTRODUCCION:

La levadura de cerveza (Saccharomyces cerevisiae) es un hongo unicelular, un tipo de levadura utilizado industrialmente en la fabricación de pan, cerveza y vino. El ciclo de vida de las levaduras alterna dos formas, una haploide y otra diploide. Ambas formas se reproducen de forma asexual por gemación. En condiciones muy determinadas la forma diploide es capaz de reproducirse sexualmente. En estos casos se produce la meiosis en la célula formándose un asca que contiene cuatro ascosporas haploides. S. cerevisiae es uno de los modelos más adecuados para el estudio de problemas biológicos. Es un sistema eucariota, con una complejidad sólo ligeramente superior a la de la bacteria pero que comparte con ella muchas de sus ventajas técnicas. Además de su rápido crecimiento, la dispersión de las células y la facilidad con que se replican cultivos y aíslan mutantes, destaca por un sencillo y versátil sistema de transformación de ADN. Por otro lado, la ausencia de patogenicidad permite su manipulación con las mínimas precauciones. S. cerevisiae es un sistema genético que, a diferencia de la mayoría de los otros microorganismos, presenta dos fases biológicas estables: haploide y diploide. La fase haploide permite generar, aislar y caracterizar mutantes con mucha facilidad, mientras que en la diploide se pueden realizar estudios de complementación. Las utilidades industriales más importantes de esta levadura son la producción de cerveza, pan y vino, gracias a su capacidad de generar dióxido de carbono y etanol durante el proceso de fermentación. Básicamente este proceso se lleva a cabo cuando esta levadura se encuentra en un medio muy rico en azúcares (como la D-glucosa). En condiciones de escasez de nutrientes, la levadura utiliza otras rutas metabólicas que le permiten obtener un mayor rendimiento energético, y por tanto no realiza la fermentación. Desde el punto de vista científico, este microorganismo se ha empleado como modelo simple de la célula eucariota. Esto se debe a una serie de ventajas como su facilidad de cultivo y su velocidad de división celular (aproximadamente dos horas). Las fuentes de carbono utilizadas por las levaduras varían desde los carbohidratos hasta los aminoácidos. Entre los azúcares que puede utilizar están monosacáridos como la glucosa, fructosa, manosa y galactosa, entre otros. También son capaces de utilizar disacáridos como la maltosa y la sacarosa y

trisacáridos como la rafinosa. Uno de los azúcares que no puede metabolizar es la lactosa. (es.wikipedia.org/wiki/Saccharomyces_cerevisiae)

La fermentación alcohólica (denominada también como fermentación del etanol o incluso fermentación etílica) es un proceso biológico de fermentación en plena ausencia de aire (oxígeno - O2), originado por la actividad de algunos microorganismos que procesan los hidratos de carbono (por regla general azúcares: como pueden ser por ejemplo la glucosa, la fructosa, la sacarosa, el almidón, etc.) para obtener como productos finales: un alcohol en forma de etanol (cuya fórmula química es: CH3-CH2-OH), dióxido de carbono (CO2) en forma de gas y unas moléculas de ATP que consumen los propios microorganismos en su metabolismo celular energético anaeróbico. El etanol resultante se emplea en la elaboración de algunas bebidas alcohólicas, tales como el vino, la cerveza, la sidra, etc. Aunque en la actualidad se empieza a sintetizar también etanol mediante la fermentación a nivel industrial a gran escala para ser empleado como biocombustible. La fermentación alcohólica tiene como finalidad biológica proporcionar energía anaeróbica a los microorganismos unicelulares (levaduras) en ausencia de oxígeno para ello disocian las moléculas de glucosa y obtienen la energía necesaria para sobrevivir, produciendo el alcohol y CO2 como desechos consecuencia de la fermentación. Una de las principales características de estos microorganismos es que viven en ambientes completamente carentes de oxígeno (O2), máxime durante la reacción química, por esta razón se dice que la fermentación alcohólica es un proceso anaeróbico.

SABOURAUD- AGAR.

Medio utilizado para el aislamiento, identificación y conservación de hongos patógenos y saprófitos. También es útil para el cultivo de levaduras.

Fundamento:Medio de cultivo recomendado para el aislamiento y desarrollo de hongos, particularmente los asociados con infecciones cutáneas (piel, pelo, etc.). En el medio de cultivo, la pluripeptona y la glucosa, son los nutrientes para el desarrollo de microorganismos. El alto contenido de glucosa, la presencia de cloranfenicol y el pH ácido, favorecen el crecimiento de hongos por sobre el de bacterias.Además, al medio de cultivo, pueden agregarse otros agentes selectivos de crecimiento.

DETERMINACION POR GRADO ALCOHOLICO

El dicromato de potasio oxida al etanol a ácido acético, este procedimiento es de gran utilidad. El producto de la oxidación del etanol con dicromato de potasio, en presencia de ácido sulfúrico, es el acido acético:

2Cr2O7 + 3C2H5OH + 16H 4Cr + 3 CH3COOH + 11 H2O

Para oxidar completamente el etanol a ácido acético se requiere una adecuada concentración de iones hidrógeno. Si ésta no es suficiente, el alcohol se oxida a acetaldehído o una mezcla de acetaldehído y ácido acético. El dicromato en exceso se determina reduciendo con una disolución valorada de sulfato ferroso amoniacal:

Cr2O7 + 6 Fe + 14 H 2CR + 6 Fe + 7 H2O

El punto final de la valoración no es muy definido visualmente por lo que se utiliza la 1,10ofenantrolina, como indicador redox.

DETERMINACION DE AZUCARES REDUCTORES

Fundamento: El acido 3,5 dinitrosalicilico en presencia de calor reduce el ácido 3-amino-5 nitrosalicilico por los azucares reductores presentes, desarrollándose un color amarillo café el cual es estable hasta por 24 horas. La lectura se realiza a 575 nm. Este método permite medir las unidades reductoras presentes en los azucares.(Miller) Los azúcares reductores pueden reducir al ácido 3,5dinitrosalicílico (DNS) bajo determinadas condiciones. Preparar el reactivo DNS: 100ml de solución DNS 2mM en NaOH 0,2N y 250ml de solución de tartrato de sodio y potasio 4hidrato 2,12M. Mezclar ambas soluciones y se llevar a 500ml.Si la muestra contiene proteínas éstas pueden producir falsos negativos, para evitarlos desproteinizar 5ml de leche añadiendo 1 ml de ácido acético 1N; centrifugar a 4.000 x g durante 10 minutos. Si en la muestra es posible la presencia de di, tri o polisacáridos con más de un componente reductor, neutralizar con NaOH 1N para evitar una posterior hidrólisis ácida (se sobre estimaría la cantidad del sacárido).Añadir 4,475ml de agua destilada y 25ml de muestra 500μl de reactivo DNS. Mantener la mezcla en baño de agua hirviendo durante 5 minutos y medir a continuación absorbancia a 540nm, interpolando el valor obtenido con los valores calculados para soluciones de sacárido de concentración conocida.

AZUL DE METILENO AL 0.5 % (Conteo diferencial de levaduras).

Las coloraciones de acuerdo a la complejidad se subdividen en 2 tipos que son la TINCIÓN SIMPLE y la TINCIÓN DIFERENCIAL.

TINCION SIMPLE se emplea un solo colorante, que puede ser azul de metileno, cristal violeta o carbol fucsina. Y en ella la célula se tiñe uniformemente (aunque en algunos casos puede distinguirse gránulos en el interior de la célula teñidos con mayor intensidad, lo que indica la presencia de entidades químicas activas).Con este tipo de tinción se crea un contraste con el medio donde se está haciendo el frotis o tinción y se puede observar la morfología y la disposición bacteriana. La importancia está en que es muy fácil de aplicar.

Un ejemplo de uso de tinción simple es cuando se utiliza azul de metileno de esta forma se pueden ver levaduras y diferenciar las vivas de las muertas. Las levaduras muertas se tiñen en su interior y se ven del mismo color del tinte que se aplico, debido a los enlaces que forma

el azul de metileno (base) con las cargas que están dentro de la célula como proteínas. Las levaduras vivas no se tiñen por dentro debido a los enlaces que forma el colorante con la membrana celular y de esta manera no entra el colorante al interior de la célula.

OBJETIVOS:

Analizar el efecto de la temperatura en la fermentación de un mosto con Saccharomyces Serevisiae Estudiar los factores que intervienen en una fermentación alcohólica Observar cómo influye el O2 en la producción de Biomasa

RESULTADOS:Cuadro 1. Condiciones de cultivo

Tiempo horas

Contenido alcohólico (mL de sulfato ferroso

Alícuota grado alcohólico

Azucares reductores (absorbancia)

Diluciones Levaduras viables (#)

Levaduras no viables(#)

Levaduras totales (#)

Dilución

O 59.2 5 mL 0.244 (2/100)(2/12) 3.48x1010 4.8x109 3.96x1010 (1/5)(1/2)24 18.2 3 mL 0.1955 (2/100)(2/10) 9x1010 5x109 9.5x1010 (1/10)(1/2)48 8 3 mL 0.1805 (2/100)(2/6) 1.5x1011 1.5x1010 1.5x1011 (1/15)(1/2)

72 0 3 mL 0.075 1/100 1.6x1011 1.74x1011 1.74x1011 (1/20)(1/2)

Ecuación de la recta: Y=6.583x 10−4 X−0.0494r2=0.99

Despejando la ecuación de la recta para calcular las concentraciones de azúcares en el mosto de acuerdo a la absorbancia.

X= Y+0.04946.583 x 10−4

Para obtener los valores de Azucares reductores (% p/v), sustituimos los valores de Y en la ecuación anterior, el resultado se multiplica por el factor de dilución, se pasa a gramos y se obtiene el promedio.

X=0.244+0.04946.583 x10−4 =

445.69µ g/mL (300)1000000

=0.13370 x100=13.37%

X=0.1955+0.04946.583 x10−4 =

372.01µ g/mL (250)1000000

=0.93002 x100=9.30%

X=0.1805+0.04946.583 x10−4 =

349.23µ g /mL(150)1000000

=0.52384 x 100=5.23%

X=0.075+0.04946.583 x10−4 =

188.97 µg /mL(100)1000000

=0.01889 x100=1.88%

Para obtener el Contenido alcohólico (% v/v) utilizamos la siguiente formula

Contenido alcohólico=¿¿

Contenido alcohólico=¿¿

Contenido alcohólico=¿¿

0 200 400 600 800 1000 1200 14000

0.2

0.4

0.6

0.8

1

Curva estandar de azucares reductores

Concentración de glucosa (µg/mL)

Abso

rban

cia 5

40nm

Concentración de Glucosa (g/mL)

Absorbancia 540 nm

0 0300 0.091600 0.334900 0.541200 0.763

GRÁFICAS:

0 10 20 30 40 50 60 70 800

5

10

15

20

25

30

Equipo 2 30° C

Contenido alcohóico

Azucares reductores

levaduras to-tales

Tiempo (horas)

Varia

bles

Grafica 1. Por cultivo a 30°C

0 10 20 30 40 50 60 70 800

5

10

15

20

25

30

Equipo 3 24°C

Contenido alcohóico

Azucares reductores

levaduras to-tales

Tiempo (horas)

varia

bles

Grafica 1a. Por cultivo 24°C

0 10 20 30 40 50 60 70 8021.5

2222.5

2323.5

2424.5

2525.5

2626.5

Crecimiento microbiano

30° C24° C

Tiempo (horas)

ln Le

vadu

ras t

otal

es

0 10 20 30 40 50 60 70 8002468

101214161820

Contenido alcohólico

30° C24° C

Tiempo (hora)

Cont

enid

o al

cohó

lico

0 10 20 30 40 50 60 70 8002468

10121416

Consumo de azúcares

30° C24° C

Tiempo (horas)

Azúc

ares

redu

ctor

es

DISCUSIÓN:

De acuerdo al cuadro 1 observamos que hubo crecimiento de Saccharomyces cerevisiae debido a que la cuenta de levadura tiende a aumentar conforme pasa el tiempo, de tal forma que las 24 horas de incubación ya se encuentra en la fase exponencial y para las 72 horas empieza la fase estacionaria, esto se debe a que la temperatura óptima es de 30°C para el crecimiento de ésta levadura.

Si observamos la figura 1 se aprecia en la curva de crecimiento un aumento de la concentración de biomasa, también encontramos la fase exponencial que es de gran importancia, debido a que en esta se forma etanol que es un metabolito primario; la curva de contenido de azúcares decrece debido a que la levadura la utiliza para la producción de etanol, por tal motivo el contenido de etanol va en aumento.

En la figura 2 tenemos el crecimiento microbiano a dos temperaturas de acuerdo a la bibliografía la temperatura óptima de crecimiento para Saccharomyces cerevisiae es de 30°C por ésta razon a la temperatura de 24°C el crecimiento es lento y se observa con mayor amplitud la fase de latencia, mientras que a la temperatura de 30°C su crecimiento es más rápido y llega antes a la fase exponencial.

En la figura 4 observamos que la concentración de azúcares conforme pasa el tiempo disminuye debido a que la población de levaduras va en aumento y el consumo del sustrato (azúcares) es mayor, principalmente a la temperatura de 30°C. Para la temperatura de 24°C hay una disminución de la concentración de azúcares sin embargo no se nota tan pronunciada porque esos resultados están mal calculados; corrigiéndolos se obtiene la figura 4a en donde también se aprecia la disminución de la concentración de azúcares y observamos que no hay gran diferencia en la producción de azúcares reductores a diferentes temperaturas.

Gráfica 3 tenemos el contenido alcohólico para la temperatura de 30°C que va en aumento conforme pasa el tiempo debido a que tenemos una fase exponencial en el crecimiento y es ahí en donde se forman los metabolitos primarios, en este caso el etanol para la temperatura de 24°C los resultados varían demasiado, obteniendo una curva que disminuye con respecto al tiempo, esto podría significar una titulación inadecuada ó una mala manipulación de la muestra, o simplemente un descuido para hacer los cálculos por parte del equipo 3, con quiénes comparamos resultados.

CONCLUSIÓN:

Se analizo que en efecto, la temperatura influye en el rendimiento y en la velocidad con la que se produce etanol. Se trabajo con 24°C y 30°C, la temperatura optima de crecimiento de Saccharomyces cerevisiae es de 30°C y 40°C para su máxima producción de etanol.

Se estudio que la producción de etanol en una fermentación depende del inoculo, de la composición del medio de cultivo, de las condiciones ambientales, del crecimiento microbiano, etc.

En esta práctica se analizó lo importante que es controlar los factores como temperatura, pH, agitación, cantidad de oxigeno, concentración de sustrato y la adición de micronutrientes al medio; ya que al variar alguno de estos factores el resultado podría no ser el deseado.

Según los resultados obtenidos durante la práctica, la fermentación alcohólica puede realizarse en las siguientes condiciones: Temperatura: 30ºC, pH: 4.5 en ausencia de oxígeno, dado que bajo estas condiciones se obtuvo un mayor rendimiento, lo cual es coherente ya que la literatura reporta que una fermentación alcohólica debe realizarse a un pH entre 3.5-5.5 y una temperatura de 30ºC ya que es la temperatura optima de Saccharomyces cerevisiae.

Una fermentación alcohólica debe llevarse a cabo en condiciones asépticas para evitar el crecimiento de microorganismos indeseables y que se desarrolle el proceso en excelentes condiciones. Además de tener mucho cuidado durante la fermentación, también se debe tener cuidado al determinar azucares, alcohol, levaduras viables y no viables ya que estas determinaciones son la prueba de que la fermentación se llevo a cabo correctamente.La fermentación alcohólica es de suma importancia a nivel industrial tanto en bebidas alcohólicas como en la producción de biocombustibles.

REFERENCIAS:

(es.wikipedia.org/wiki/Saccharomyces_cerevisiae)http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/sabouraudgluagar.htm

ANEXOS:

Imágenes (Izq y Der.)

Fermentador al tiempo cero; el

medio de cultivo muestra poca

turbidez y ausencia de espuma.

Imágenes: Fermentador después de

24h (Der) y 48h (Izq); el medio de cultivo

muestra más turbidez y

abundancia de espuma

(producción de CO2) conforme

transcurre el tiempo.

Observación al microscopio de la levadura Saccharomyces cerevisiae.

Determinación de azúcares reductores: Dilución de acuerdo al cuadro de la preparación de las muestras de fermentación alcohólica.

Determinación de azúcares reductores: Duplicado de la dilución de acuerdo al cuadro de la preparación de las muestras de fermentación. .alcohólica.

Determinación del grado alcohólico por oxidación de dicromato.

Color verde botella, luego añadir la solución de sulfato ferroso amoniacal.

Determinación del grado alcohólico por oxidación de dicromato. Esta toma fué hecha con más exposición a la luz.