capítulo viii enzimas

Federico Rivadeneira

CAPÍTULO VIII ENZIMAS1

LAS ENZIMAS SON CATALIZADORES BIOLÓGICOS

Las enzimas son catalizadores biológicos que no forman parte de los productos finales ni se degradan en el proceso por lo que actúan mediante la disminución de la EA de una reacción química permitiendo que esta ocurra a niveles de pH y temperatura moderados (fisiológicos). Además las enzimas, frente a los catalizadores inorgánicos presentan una mayor selectividad pudiendo distinguir hasta entre isómeros ópticos (por ejemplo la glucoquinasa que distingue entre la D y la L-glucosa).

Luego, las enzimas las podemos clasificar según la IUBMB según su función y subclases, con determinados números; el primer número se refiere al tipo de reacción que catalizan y estos son:

1. Oxidorreductasas: Estas catalizan reacciones de óxido-reducción necesitando de la presencia de coenzimas. 1.1 Si el sustrato es donante de hidrógeno al nombre del sustrato se le antepone la

palabra deshidrogenasa1.2 Cuando la reacción ocurre en el sentido inverso le decimos reductasa1.3 En el caso de que el aceptor de hidrógeno sea oxígeno las llamamos oxidasas1.4 En el caso de que se incorpore O2 al sustrato las llamamos oxigenasas1.5 Y por último peroxidasas cuando se utiliza H2O2 como aceptor de hidrógeno. Ejemplo: La reacción catalizada por la enzima L-lactato:NAD oxidorreductasa o sino 1.1.1.27

2. Transferasas: Catalizan la transferencia de un grupo funcional de una molécula a otra. Ejemplo: L-aspartato: 2-oxoglutarato aminotransferasa o aspartato aminotransferasa (2.6.1.1)

3. Hidrolasas: Catalizan la ruptura de enlaces C–N; C–O; C–S y C–P por adición de H2O y se nombran como el sustrato con el sufijo –asa; por ejemplo la acetilcolinesterasa, ribonucleasa o la arginasa (ejemplo).

4. Liasas: Estas catalizan la ruptura de enlaces C–N, C–S y C–C mediante un mecanismo distinto al de la hidrólisis, ya sea mediante la eliminación de un grupo para formar un doble enlace o ciclo (descarboxilasas, aldolasas, deshidratasas); o mediante la adición de un grupo a un doble enlace (sintasas). Ejemplo: Fructosa-1,6-difosfato: D-gliceraldehído-3-fosfato liasa ó fructosa difosfato aldolasa (4.1.2.13).

5. Isomerasas: Catalizan la interconversión de cualquier tipo de isómeros (epimerasa, racemasa, etc).

6. Ligasas: Estas catalizan la unión de dos moléculas utilizando la energía de un nucleósido trifosfato y a estas enzimas es a las que se las puede denominar sintetasas y no sintasas. Ejemplo: Glutamato: Amoníaco ligasa o glutamina sintetasa 6.3.1.2.

COENZIMAS

Muchas enzimas realizan su función catalítica en presencia de otras moléculas generalmente más pequeñas, no proteicas y denominadas coenzimas (algunos las denominan grupos prostéticos si la asociación de estas con la enzima es de carácter covalente). El complejo resultante se denomina holoenzima donde la parte proteica se llama apoenzima (termolábil, no dializable) y la parte no proteica y relativamente pequeña se denomina coenzima (termoestable, no proteica). Tanto oxidorreductasas, isomerasas y ligasas requieren de coenzimas.

Las coenzimas participan activamente en la reacción, por ejemplo en las oxidorreductasas aceptan o ceden hidrógenos o electrones y en las transferasas aceptan o ceden los grupos. Además se asocian a vitaminas (como las del grupo B) lo que demuestra la importancia fisiológica de las mismas y su ingesta. Luego, tenemos que una coenzima no es específica para un tipo de reacción sino que la porción de la enzima que da la especificidad es la apoenzima. Por ejemplo, la lactato deshidrogenasa, malato deshidrogenasa y glutamato deshidrogenasa utilizan NAD como coenzima (aceptora de H) así como también otras oxidorreductasas.

1 BLANCO, Antonio. Química biológica. 8va ed. El Ateneo. 2007. pp. 125 y ss. ISBN 950-0-20422-3

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METALOENZIMAS

Los iones metálicos contribuyen a la capacidad catalítica de la holonzima por su capacidad para donar y aceptar electrones y estabilizar las estructuras terciarias y cuaternarias proteicas de las mismas. Algunos ejemplos son:

Fe: Catalasa, peroxidasas y citocromos. Cu: Tirosinasa, ácido ascórbico oxidasa y citocromo oxidasa. Zn: Alcohol deshidrogenasa y anhidrasa carbónica. Mo: Es parte de la xantino oxidasa (catalizan la oxidación de

hipoxantina a xantina y luego de xantina a ácido úrico), otras oxidasas y deshidrogenasas.

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Mg: El mismo se requiere en enzimas que utilizan ATP como cofactor donde la forma activa del ATP se encuentra unida en un complejo ATP-Mg2+ donde el mismo se coordina con las cargas negativas de los grupos fosfato.

Mn: El mismo es indispensable en la acción de la acetil-CoA carboxilasa, desoxirribonucleasa y otras. Se: Se une a glutatión peroxidasa Ca: El Ca2+ es indispensable para muchas enzimas.

Además es indispensable para otras enzimas o para muchas de esta la presencia de cationes como Na+, K+ o aniones como Cl-.

CATÁLISIS ENZIMÁTICA

Como sabemos las enzimas actúan disminuyendo la energía de activación necesaria para que se produzca la reacción sin modificar la constante de velocidad de las mismas ni producir ningún cambio en la energía libre de la

misma. Para la reacción se postula que se produce un complejo intermedio enzima-sustrato que luego se disocia sin afectar la estructura de la enzima por lo que la misma puede utilizarse nuevamente.

SITIO ACTIVO

El sitio activo está compuesto por un sitio de unión y por un sitio catalítico. Aminoácidos usuales en este sitio de unión son cisteína, glutamato, glicina, aspartato, arginina, histidina, serina o treonina. Cuando la E se une con el S lo hacen mediante uniones no covalentes como enlaces iónicos e interacciones débiles de Van der Waals, etc. Solo durante el transcurso de la reacción se pueden formar algunos enlaces covalentes transitorios. Luego en el estado de transición donde se forma el complejo o intermediario de reacción tenemos que la molécula de sustrato sufre una debilitación en los enlaces que reaccionarán por parte de la enzima que permitirán disminuir la energía de activación de la misma y por lo tanto un incremento en la velocidad de reacción.

La hipótesis más aceptada es la del ajuste inducido de Koshland que en 1958 postula que las enzimas se modifican con la unión del sustrato exponiendo ciertos residuos aminoacídicos. Se ha demostrado que los sitios activos cambian permanentemente hasta que el sustrato se une definitivamente

ZIMÓGENOS

Los zimógenos o proenzimas son enzimas sintetizadas y secretadas en un estado inactivo o no catalítico; las mismas se activan generalmente cuando se hidroliza alguna porción de la misma. El péptido liberado de la proenzima es denominado péptido de activación.

ENZIMAS ANORMALES POR ALTERACIONES GÉNICAS

Los denominados errores congénitos del metabolismo o simplemente trastornos metabólicos se deben usualmente a una falla en la vía metabólica de cierto compuesto. Esto puede ocurrir por la falta o cambio de un aminoácido solamente en el sitio activo de la enzima modificando así su actividad.

SISTEMAS MULTIENZIMÁTICOS

Los sistemas multienzimáticos están compuestos por un grupo de enzimas las cuales se ubican espacialmente de determinada manera de forma tal que el producto de una reacción es utilizado como sustrato de la siguiente. También existen enzimas multifuncionales como la ácido graso sintasa que es sintetizada a partir de la fusión de diferentes enzimas resultando en una enzima multifuncional con diferentes dominios catalíticos.

DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

La actividad de una enzima puede medirse como la cantidad de sustrato consumido o de producto formado en un tiempo dado. Si medimos velocidad inicial es conveniente medirla hasta que se haya consumido al menos el 20% del sustrato (o mejor el 5%). Y para definir esta actividad utilizamos las unidades internacionales (UI) donde se define como la cantidad de micromoles de sustrato consumido por minuto.

Luego, la actividad específica de una enzima es la cantidad de micromoles de sustrato consumido por minuto por miligramo de enzima presente. Esto denota una relación entre la actividad enzimática y la cantidad de enzima presente en una mezcla variable de proteínas.

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Luego, si tenemos una solución pura de determinada enzima podemos calcular su número de recambio, actividad molar o constante catalítica como la cantidad de micromoles de sustrato consumido por minuto y por la cantidad de moles presentes en la solución trabajando con saturación de sustrato.

Unidades internacionales (UIE)

UI=μmol ( S )

minActividad específica

actividad específica= UImg de proteína

Número de recambio

Nº derecambio= UImoles deenzima

FACTORES QUE MODIFICAN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Concentración de enzima

La velocidad de reacción es directamente proporcional a la concentración de enzima presente. Estas gráficas se construyen midiendo la velocidad inicial antes de que se consuma el 5% de sustrato inicial en condiciones de sustrato saturante a diferentes concentraciones de enzima.

Concentración de sustratoAl realizar esta curva de actividad enzimática en función de la concentración de

sustrato tenemos que obtenemos curvas de tipo hiperbólico donde al principio la misma crece casi linealmente y luego asintóticamente punto donde se determina la velocidad máxima (Vmáx). Se dan diferentes casos:

1. La enzima se une al sustrato rápidamente y los productos se separan lentamente. En caso de que se sature la enzima, esto es, incrementando la concentración de sustrato se llega a un punto en el cual la velocidad no aumenta y la reacción se comporta como de orden cero.

En condiciones definidas de reacción podemos determinar la constante de Michaelis-Menten que corresponde a la concentración a la cual la velocidad es igual a la mitad de la velocidad máxima.

Si la ecuación de velocidad inicial es:

v=V máx [S ]K m+[S ]

Si [S]<Km tenemos entonces que la reacción depende del sustrato y por lo tanto es de primer orden respecto a este.

Luego la ecuación de Michaelis-Menten puede ser linealizada para poder determinar así experimentalmente los valores necesarios de una forma más fácil. Esta ecuación es tomando el recíproco en ambos miembros y se denomina la ecuación de Lineweaver-Burk.

1v=

Km

V máx

.1

[ S ]+ 1

V máx

La misma representa la ecuación de una recta

TemperaturaComo es de suponer, las velocidades de reacciones enzimáticas aumentan con un

incremento de la temperatura dentro de ciertos rangos de esta última. Para eso definimos un valor denominado Q10 o coeficiente de temperatura que es el valor por el cual cambia la velocidad de reacción al aumentar en 10 °C la temperatura. En el gráfico podemos ver que la velocidad o actividad enzimática llega a un máximo que es denominado como la temperatura óptima de la

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enzima (37 °C para la mayoría de los homeotermos). Al aumentar la temperatura por encima de 60 °C aproximadamente las enzimas son completamente inactivas y esto se debe a la desnaturalización de las proteínas.

pHLas enzimas muestran un rango de pH óptimo de actividad que es generalmente entre 6 y 8. Sin embargo enzimas

como la pepsina presentan un pH óptimo de 1,5; la fosfatasa ácida uno de 5 y la fosfatasa alcalina de 9,5. Esto se debe a que las cargas tanto de enzima como de sustrato varían en función del pH (estado de ionización de las moléculas) provocando una mejor o peor interacción entre los mismos. Además, a valores de pH más extremos podemos también desnaturalizar las enzimas

INHIBIDORES ENZIMÁTICOS

Inhibidores irreversiblesDeterioran definitivamente la capacidad catalítica de una enzima como en el caso de los organofosforados que

inhiben la acción de la acetilcolinesterasa. Por ejemplo los denominados inhibidores suicidas (alopurinol que inhibe la xantina oxidasa) se unen específicamente mediante enlaces covalentes a las enzimas ocupando el sitio activo.

Inhibidores reversibles1. Inhibidores competitivos: Estos aumentan el valor de Km de la enzima sin variar la

velocidad máxima de la misma. Lo hacen por diferentes mecanismos:a. En estos casos el inhibidor se une al sitio activo de la enzima por una similitud

estructural que presenta con el sustrato. Por ejemplo la succinato deshidrogenasa con el malonato. La misma presenta grupos cargados positivamente en su sitio activo que interaccionan con los carboxilos cargados negativamente del succinato y también del malonato que ocupa su lugar.

b. Algunos inhibidores no presentan esta similitud estructural con el sustrato pero igualmente se unen al sitio activo como es el caso del salicilato en la alcohol deshidrogenasa y la 3-fosfoglicerato quinasa.

c. En otros casos el inhibidor se une a un sitio diferente al sitio activo inhibiendo la unión del sustrato a la enzima mediante un cambio conformacional de la misma.

Estos tipos de inhibición competitiva se pueden compensar aumentando la concentración de sustrato (competidor).

El mecanismo de acción de un inhibidor puede estudiarse midiendo la cinética enzimática a concentraciones variables de inhibidor y en ausencia del mismo.

2. Inhibidores no competitivos: Estos aumentan Vmáx y dejan constante Km y no se previenen con un aumento de S. Los mismos se unen a un lugar diferente al sitio activo y no inhiben la unión del sustrato a la enzima lo que explica que se disminuya la actividad enzimática sin modificar Km. A este grupo pertenecen aquellos que se unen reversiblemente a los grupos –SH de restos de cisteína como los metales Cu2+, Hg2+ y Ag2+. Otro ejemplo es el del CN– que posee mayor afinidad por el Fe2+ de citocromos, catalasas y peroxidasas o la EDTA que se une a cationes divalentes de enzimas impidiendo su funcionamiento. En el caso de que el inhibidor modifique Km y Vmáx se habla de una inhibición mixta.

3. Inhibidores anticompetitivos: Este tipo de inhibidores provoca una disminución de Km y de Vmáx. Este aumento aparente (dado por la cinética) de la afinidad de la enzima por el sustrato se debe a que el inhibidor consume al complejo ES por lo que se favorece la reacción reversible E+S⇋ ES hacia la derecha, pero se disminuye Vmáx debido a que el complejo ESI no es activo. Además, estos no se ven afectados por el aumento de S.

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REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

La regulación de la actividad depende de varios factores, entre ellos las condiciones fisiológicas y principalmente la disponibilidad de sustrato. Por esto mismo los niveles de sustrato son usualmente menores o cercanos a la concentración correspondiente a Km, por lo que un aumento o disminución de la disponibilidad de sustrato regula la actividad enzimática. A su vez, una vía metabólica está compuesta por una serie de enzimas y sustratos que llevan a un compuesto determinado del final de la vía; usualmente la primer enzima funciona como reguladora de la vía y las enzimas reguladoras se clasifican en dos grandes grupos que son: enzimas alostéricas y reguladas por modificación covalente.

Enzimas alostéricasLas enzimas alostéricas son aquellas que se ubican al inicio de la vía y son

reguladas por el producto de la última enzima. Por ejemplo la aspartato transcarbamilasa cataliza la primer reacción de la vía sintética de las pirimidinas (condensación del aspartato con el carbamil fosfato para dar carbamil aspartato) y se inhibe su función mediante la unión de la citidina trifosfato (CTP), último producto de la vía. Esta inhibición se denomina inhibición por retroalimentación o feedback. Como también existen moléculas que al unirse estimulan la actividad.

Estos compuestos son denominados efectores alostéricos o moduladores enzimáticos y los mismos se unen a un sitio distinto al sitio catalítico denominado sitio alostérico; el mismo puede ser un modulador o efector positivo o negativo y también se puede decir que son homotrópicos (en caso de que sean iguales al sustrato) o heterotrópicos en caso de que sean diferentes. Siendo las enzimas capaces de ejecutar interacciones hetero u homotrópicas.

La curva de la actividad enzimática de una enzima alostérica es sigmoidea a diferencia de la curva cinética clásica de tipo parabólico. Curva semejante a la que presenta la Hb respecto a la saturación con O2.

Modificación covalente (reversible)La actividad de una enzima puede ser también regulada por la adicción o sustracción de

grupos químicos como el fosfato (a residuos de Ser, Thr o Tyr) en el caso de la glucógeno fosforilasa que presenta una forma defosforilada (glucógeno fosforilasa b) con menor actividad enzimática y una forma fosforilada (“glucógeno fosforilasa a” con grupos fosfato unidos a los –OH de los residuos de serina de la enzima).

Mientras que la remoción de grupos fosfato es realizada por las fosfatasas. Enzimas constitutivas e induciblesLas enzimas pueden ser constitutivas si su tasa de eliminación y producción de la misma

es similar por lo que mantienen niveles más o menos constantes de enzima a nivel celular. En cambio, ciertas enzimas como las implicadas en el metabolismo de carbohidratos son inducibles y se sintetizan de novo haciendo a este proceso mucho más lento que todos los demás.

Procesos enzimáticos en cascada (regulación por proteólisis)Estos procesos consisten en la activación de zimógenos y el cual se da en una escala logarítmica como ocurre en

la cascada de coagulación o en muchos otras vías enzimáticas. Como son el caso de la quimiotripsina, tripsina y pepsina que son sintetizados y liberados como proenzimas.

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ISOZIMAS

Las isoenzimas son enzimas con la misma actividad catalítica específica pero con diferente secuencia aminoacídica. La presencia de estas se revela mediante una electroforesis en gel seguida de tinción específica y se las numera de acuerdo a su migración al ánodo siendo la que más migra la 1 y la que menos migra la de número más alto.

Por ejemplo la lactato deshidrogenasa es una enzima que presenta cinco isoenzimas y se encuentra distribuida ampliamente en diversos tejidos donde una isoenzima predomina sobre otra (en los testículos aparece una sexta clase predominante). En el caso de la LDH tenemos que las mismas son tetrámeros de dos cadenas polipeptídicas diferentes (A o M) y (B o H).

Esta enzima, cataliza la reacción de lactato a piruvato y viceversa utilizando NADH como cofactor (la LDH es NADH dependiente o en algunos casos también Cit–C dependiente que es la D-Lactato deshidrogenasa).

Además ciertas isozimas presentan una distribución subcelular determinada por lo que sirven también como marcadores celulares o subcelulares.

LA RELACIÓN ENTRE LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO Y LA VELOCIDAD DE REACCIÓN PUEDE SER EXPRESADA CUANTITATIVAMENTE

La derivación moderna de la ecuación de Michaelis-Menten incluye la conjetura de Briggs y Haldane del estado estacionario.

La derivación comienza con los dos pasos iniciales de formación y ruptura del complejo ES.

Siendo la segunda ecuación, la de la ruptura del complejo la que usualmente es más lenta y por lo tanto es el paso limitante de la reacción.

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Al comenzar la reacción podemos suponer que la cantidad de P es insignificante, entonces despreciamos k –2 y la reacción queda como:

Luego, V0 se puede determinar midiendo la velocidad de descomposición de ES por lo que: Pero es muy difícil medir [ES] experimentalmente por lo que introducimos una nueva

expresión que es [Et] que es la concentración total de enzima (ES+E) y por lo tanto E = E t – ES; además como [S] está en exceso la cantidad de [ES] no modifica considerablemente a [S]. Entonces:

1. La velocidad de formación y ruptura de ES son:

2. La hipótesis del estado estacionario nos dice que la velocidad de ruptura y formación de ES son las mismas por lo que:

3. Luego de procedimientos algebraicos llegamos a:

4. Siendo la expresión k2+k−1

k1

=K m por lo que la expresión anterior queda como:

[ ES ]= [ Et ] [ S ]Km+[S]

5. Luego, podemos expresar V0 en términos de [ES]

V 0=k 2 [ Et ] [S ]Km+[S ]

=V máx [S]K m+[S ]

LOS PARÁMETROS CINÉTICOS SON USADOS PARA COMPARAR ACTIVIDADES ENZIMÁTICAS

Muchas reacciones enzimáticas (excepto las reguladas) siguen patrones cinéticos de Michaelis-Menten pero esto no significa que las mismas reacciones sean en dos pasos necesariamente.

Para las reacciones en dos pasos se cumple que k2+k−1

k1

=K m.

Cuando k2 es el paso limitante tenemos que k 2≪k−1 por lo que podemos

decir que Km=k−1

k1

=Kd donde Kd está definida como la constante de disociación

de ES y es una medida de la afinidad de la enzima por el sustrato; sin embargo esto no ocurre siempre.Además el cálculo de Vmáx difiere también de una enzima a otra, si consideramos la siguiente reacción:

Y tenemos en cuenta que el último paso es el limitante entonces la velocidad máxima estará dada por la última

constante de velocidad, o sea, V máx=k3 [ Et ] por lo que para no confundirnos definimos una nueva cantidad

denominada k cat como la constante de velocidad de reacción correspondiente al paso limitante de la misma, en el último

ejemplo, k cat=k3; además este k cat es equivalente al concepto antes definido como número de recambio.

COMPARACIÓN ENTRE MECANISMOS CATALÍTICOS Y EFICIENCIA CATALÍTICA

Los parámetros k cat y Km poco nos dicen acerca de la eficiencia y el mecanismo de una reacción enzimática. Por

ejemplo, dos enzimas diferentes pueden tener iguales k cat pero sin embargo no pueden ser igual de eficientes porque las

reacciones que catalizan no poseen el mismo ∆ G‡. Entonces, la mejor forma de comparar las eficiencias catalíticas de diferentes enzimas o el número de recambio de

una enzima frente a diferentes sustratos surge de la comparación entre los cocientes kcat

Km

para ambas reacciones,

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parámetro usualmente llamado constante de especificidad. Y corresponde a la constante de velocidad de transformación de E+S a E+P cuando [ S ]≪ Km por lo que la ecuación queda como:

V 0=k cat

K m[ E t ] [ S ]

Como podemos ver la velocidad depende tanto de ambas concentraciones por lo que la reacción es de segundo orden (por lo que las unidades son M–1 s–1) además es bueno notar que existe un límite superior de velocidad dado por las velocidades de difusión máximas que pueden alcanzar en solución acuosa E y S (valores que se acercan a 10 8 y 109 M–1 s–

1).

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