437662599.clase 6 - atlas sobre diagnóstico de las micosis superficiales

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EL LABORATORIO en las MICOSIS CUTÁNEAS

PROCEDIMIENTO BÁSICOS

TOMA DE MUESTRAReviste una importancia primordial. El diagnóstico va a depender en buena medida de la cali-dad de la muestra que va a procesarse. No debemos olvidar, pues, algunos condicionantesbásicos a la hora de la recogida de muestras en las dermatomicosis.

a) Asegurarse de que no haya habido tratamiento antifúngico previo, sobre todo sistémico.En tal caso, demorar la toma de muestras hasta pasadas al menos dos semanas.

b) Recoger una cantidad suficiente de material patológico.

c) Utilizar el instrumental adecuado al tipo de muestra de que se trate.

El instrumental para la toma de muestras comprende pequeños utensilios adecuados parapracticar el raspado de las lesiones y obtener las escamas y fragmentos de pelo que van aestudiarse. A tal fin, pueden emplearse hojas de bisturí, curettes, plumillas metálicas o inclu-so los bordes de los portaobjetos. Nosotros adoptamos hace tiempo el uso de los vacinosti-los, que ofrecen múltiples ventajas: son estériles, desechables, fáciles de obtener, de costemuy bajo, y su forma permite emplearlos tanto para raspar en superficie mediante su extre-mo plano, como para obtener material del lecho ungueal en las onicomicosis por medio desu extremo punzante. En las micosis ungueales, sin embargo, preferimos tomar la muestracon la pequeña cucharilla del “cuchillo de Le Cron”, un instrumento de uso habitual en odon-tología y fácil de encontrar en las tiendas o proveedores de instrumental médico (Fig. 1).

TABLA 3: PROCEDIMIENTOS BÁSICOS EN MICOLOGÍA

Toma de muestras

Examen directo (ED)

Cultivo

Identificación

Comenzamos por limpiar bien la zona sospechosa con alcohol o lavado jabonoso, eliminan-do restos de pomadas, suciedad y restos epidérmicos. Nos aseguramos de que no ha exis-tido tratamiento antifúngico en los últimos días, en caso afirmativo lo suspendemos y retra-samos la toma una o dos semanas.

Diferenciamos una serie de detalles para la toma micológica según la realicemos, en una piti-riasis versicolor, una tiña, una candidosis o en micosis ungueales (Tabla 4).

PITIRIASIS VERSICOLOR

Lo más sencillo, es el raspado de las escamas furfuráceas y finas de las lesiones con elborde de un portaobjeto, depositando el producto del raspado en otro portaobjeto que colo-camos en posición horizontal bajo la lesión.

Existen otros procedimientos entre los que destacamos la utilización de la cinta adhesiva(“cello”, cinta adhesiva), con la que presionamos fuertemente sobre la lesión y a continuaciónpegamos en un portaobjeto. La maniobra también puede llevarse a cabo con un portaobjeto enel que hemos depositado previamente unas gotas de cola de contacto de cianocrilato.Esperando unos segundos, la aplicamos sobre una plaquita de la enfermedad, al endurecersela cola y retirar el portaobjeto arrancamos la superficie escamosa, lista para teñir (Figs. 2, 3).

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TABLA 4: TOMA DE MUESTRAS

1. PITIRIASIS VERSICOLOR

2. TIÑAS

Tiñas del peloTiñas de la piel lampiña

3. CANDIDOSIS

Candidosis cutáneasCandidosis mucosas

4. MICOSIS UNGUEALES

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Atlas de MICOLOGÍA CUTÁNEA

Fig. 2. Pitiriasis toma con fixo

Fig. 3. Pitiriasis toma con portaobjeto

TIÑAS

Sin olvidar las premisas indicadas al principio, describiremos la toma según sea la tiña de piellampiña o glabra (sin cabellos), de zonas pilosas o bien de uñas.

Toma de muestra de piel lampiña

(Tinea corporis, tinea faciei, tinea cruris, tinea manuum y tinea pedis).

Raspamos en la periferia de la lesión, ya que la zona central de la misma, redondeada casisiempre, está escasamente parasitada. Lo realizamos con un bisturí, vacinoestilo, escalpeloo con el borde de un portaobjeto. Recogemos en otro portaobjeto las escamas, las guarda-mos entre dos portaobjetos e identificamos con sumo cuidado la toma. Si la lesión presentavesículas (tinea pedis, tiñas inflamatorias) rompemos las mismas (Figs. 4-6).

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Fig. 4. Tiña toma con portaobjeto

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Fig. 5. Tiña toma con portaobjeto

Fig. 6. Tiña toma vacionestilo

Toma de muestra de zonas pilosas

(Tinea capitis, tinea barbae).

Lo más sencillo es raspar enérgicamente el borde de la lesión con lo que obtenemos no sóloescamas sino también pelos parasitados. Es útil el uso de pinzas de depilación para obtenerpelos parasitados, que no ofrecen resistencia a la tracción, y que nos permiten el examendirecto del parasitismo piloso en el cultivo. En las tiñas inflamatorias de estas localizacioneso bien, obtenemos los pelos como hemos indicado, o simplemente tomamos el material puru-lento con un hisopo bacteriológico estéril. En ocasiones, se lleva a cabo con cepillos de plásticoestériles o bien, con un fragmento cuadrado de moqueta estéril, con los que frotamos la zonasospechosa, y a continuación se inoculan directamente las placas de Petri con el medio. Nohay que olvidar que los cabellos o pelos de la barba sanos (ofrecen resistencia a la tracción)obtenidos con pinzas no están parasitados y por tanto, no son útiles para el estudio. La luzde Wood puede ser útil en algunas tiñas causadas por Microsporum, al permitir encontrarmás fácilmente los pelos parasitados por su fluorescencia verdosa (Figs. 7.1,7.2, 8).

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Fig. 7.1. Tiña toma zona pilosa

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Fig. 7.2. Tiña toma zona pilosa

Fig. 8. Tiña barba, toma pelo

El material así obtenido en las diversas formas se puede depositar directamente en el por-taobjetos para el examen directo, en una placa de Petri estéril o en un sobre estéril.Llamamos de nuevo la atención en el cuidado de la identificación correcta de la muestra.

Para terminar, recordar que en las lesiones inflamatorias, las costras, secreciones y pelos,especialmente los centrales, no suelen contener hongos, por ello es necesario eliminarlospreviamente. Y siempre es positivo realizar la toma en los bordes de la lesión.

CANDIDOSIS

Diferenciamos según la localización mucosa, cutánea o ungueal. En las mucosas (boca,genitales, ano) la recogida se puede realizar con hisopo bacteriológico de algodón estéril, ocon esponjas de poliester humedecidas previamente en medios de cultivo líquido. En orofa-ringe, asimismo, podemos realizar enjuagues con suero fisiológico, que se siembra sobreuna placa de Petri con medio sólido y permite hacer recuento del número de colonias.

En las lesiones de piel la recogida la realizamos con el método descrito en las tiñas, peroseñalando que es más aconsejable el fondo del pliegue para la toma. Si la lesión es húme-da utilizamos un hisopo estéril (Figs. 9,10).

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Fig. 9. Candidosis, toma bucal

En la toma de las candidosis es preciso, no olvidar las condiciones previas pero, especial-mente, tener en cuenta las condiciones de traslado al laboratorio, para evitar la desecacióndel material, ya que las candidas no sobreviven más de 24 horas en una toma seca. Por ello,es aconsejable utilizar hisopos con dispositivo de humedad, y siempre intentar que la mues-tra llegue inmediatamente al laboratorio.

MICOSIS UNGUEALES

Los resultados del estudio micológico van a depender en gran medida de la técnica utilizadapara la obtención de muestras. En las uñas hay que extremar el cuidado, dado el alto por-centaje de falsos negativos.

La técnica consiste en recortar con tijeras (alicates de podólogo para uñas de pies), procu-rando llegar hasta la frontera entre la invasión fúngica y la zona de uña sana, lugar donde loshongos son viables y por tanto cultivables. A continuación raspar con el extremo romo(cucharilla) del cuchillo de Le Cron. También se puede realizar con escarpelos, curetas o conel mismo ángulo del portaobjeto. Asimismo, puede utilizarse una fresa rotatoria (pequeñotaladro) o incluso una biopsia “punch” ungueal.

El material así obtenido se deposita entre dos portaobjetos, en una placa de Petri estéril o enun sobre estéril. Repartimos el material obtenido, para examen directo y para los diversoscultivos. Es aconsejable realizar, antes de la toma, un lavado enérgico y asegurarnos que noha existido tratamiento antifúngico previo. Con estos cuidados hemos mejorado muy positi-vamente los porcentajes de falsos negativos (Figs. 11,12).

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Fig. 10. Candidosis, toma en pliegues

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Fig. 11. Toma ungueal. Primero recortar

Fig. 12. Toma ungueal. Segundo raspar

EXAMEN DIRECTO (KOH)Se denomina Examen Directo (ED) a la técnica diagnóstica cuya finalidad estriba en detec-tar u observar el agente infeccioso directamente en la muestra patológica, con ayuda de unosreactivos o colorantes simples. A diferencia de la histopatología, la muestra destinada al exa-men directo no necesita fijación ni preparación previa, y la observación puede llevarse a cabode forma inmediata.

No participamos en la afirmación de facilidad o sencillez con que se refieren la mayoría delos autores al ED, porque necesita un aprendizaje detallado; pero si compartimos la idea deque es una técnica muy práctica para identificar con rapidez la presencia de dermatofitos,levaduras y mohos.

La técnica es bien simple. Sobre el material que habíamos destinado a ello en un portaobje-tos se deposita una gota del reactivo elegido, habitualmente una solución de potasa, y secubre con un cubreobjetos. Es indispensable calentar ligeramente la preparación a la llamade un mechero, y presionar suave y repetidamente con el mango del asa sobre el cubre,hasta que la muestra aparezca completamente disociada, es decir, hasta que el material que-ratinoso se haya disuelto bajo la acción de la potasa.

Acto seguido, se procede a la observación al microscopio, utilizando primero los aumentosbajos (10X) y acto seguido, los altos (20X y 40X). El objetivo de inmersión no suele sernecesario.

El Examen Directo es una técnica sumamente rentable. La dificultad radica fundamentalmenteen la aparición de una serie de artefactos, que luego citaremos, que se asemejan en granmedida las verdaderas hifas del micelio. La solución a esta dificultad radica en hacer unaadecuada preparación, la utilización del disgregante-colorante más idóneo y la práctica dia-ria de la observación microscópica, o sea de la experiencia personal. Describimos la técnicadetalladamente (Figs. 13.1-13.4,14).

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1. Preparación: Depositamos una porción del material obtenido (escamas, pelos, uñas) enun portaobjetos, añadimos unas gotas del disgregante-colorante, se mezcla, se fragmentamecánicamente (con la ayuda de un punzón), se coloca un cubreobjetos y se flamea suave-mente evitando la ebullición. Si la muestra se obtuvo mediante torunda o escobillón puedepracticarse el examen directo frotando un poco del mismo en un portaobjeto. A continuaciónaplicamos:

Disgregante-colorante: Sustancias que facilitan la observación de filamentos, produciendouna separación de las escamas y fragmentos de uñas. La más usada es el hidróxido de pota-sio (KOH) en agua destilada al 20-40%. La capacidad disgregante de la potasa, para cabe-llos y uñas, aumenta si le añadimos dimetilsulfósido. Si le agregamos glicerina, aumenta laduración de la preparación hasta 48 horas, ya que evita la formación de cristales de potasa.

La observación se facilita añadiendo un colorante a la potasa. El más usado era la tinta azulnegra Parker Superchrome. En la actualidad, se está utilizando la solución de Swartz-Lamkins, que da resultados similares a la antigua fórmula. Existen numerosos colorantescomo el clorazol, lactofenol, técnicas de fluorescencia, pero no se utilizan de rutina en ellaboratorio.

2. Observación: Se realiza mediante microscopio óptico, mejor con condensador de con-traste de fase, ya que los elementos fúngicos son refringentes. Comenzamos con un peque-ño aumento (x 10), para tener una visión panorámica de las escamas y buscar mejor la posi-ble presencia de filamentos. Para confirmarlo, pasamos a un mayor aumento (x 40).

3. Interpretación: Comentaremos los dermatofitos, las levaduras, los mohos y terminaremosdescribiendo algunos artefactos.

Los dermatofitos aparecen de forma diferente según estudiemos las escamas o el pelo. Enel ED de las escamas se presentan como filamentos hialinos, de bordes nítidos y regulares,de paredes paralelas, septados (este hecho es muy importante) y con la presencia de rami-ficaciones, que toman color azul. No tienen relación con los bordes celulares, a los que atra-viesan sin orden determinado. A menudo, estas hifas se muestran fragmentadas en artroco-nidias cuboidales. Este patrón diagnostíca genéricamente a los dermatofitos, pero no pode-mos precisar la especie (Figs. 15.1,15.2,16.1,16.2).

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Fig. 15.1. ED KOH x 100

Fig. 15.2. ED KOH x 400

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Fig. 16.1. ED KOH

Fig. 16.2. Examen directo. KOH – tinta Parker. X1000

Si estudiamos el pelo tenemos que precisar que la "utilización" de la queratina de los pelospor los dermatofitos curiosamente varía según sea "in vivo" o "in vitro".

"In vivo" presenta dos patrones fundamentales, bien sea el parasitismo interior al pelo(endotrix) o exterior al mismo (ectotrix). Este proceder sí nos permite identificar la especie.

El patrón endotrix tiene a su vez dos tipos: Uno, artrosporado, que es el genuino endotrix,que presenta todo el interior del pelo repleto de cadenas de conidios, artrosporados, de 3-4 nmde diámetro (T. tonsurans, T. violaceum). Otro tipo de endotrix es el fávico, dentro del peloencontramos filamentos dispuestos a lo largo del mismo, ondulados unos, ramificados otros.Son típicas las burbujas de aire (T. schoenleinii) (Fig. 17).

El patrón ectotrix presenta así mismo tres modelos: Uno, tipo en mosaico, en el que lasesporas son pequeñas (2-3 nm diámetro), redondas, formando una densa y compacta vainaalrededor del pelo, que no se dispersa con la potasa. En el interior del pelo hay filamentos(M. canis, M. audouinii). Otro, tipo microide, presenta también pequeñas esporas (2-4 nmde diámetro), pero dispuestas de forma irregular en el exterior del pelo, ya que son fácil-mente dispersables con la KOH, filamentos en el interior (T. mentagrophytes, T. rubrum,M. gypseum). Y un tercero, tipo megasporado, con esporas de mayor tamaño (4-6 nm), enel exterior del pelo, dispuestas en grumos o racimos y otras sueltas. Filamentos intrapilares(T. verrucosum) (Fig. 18).

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Fig. 17. Examen directo de Tinea capitos. Parasitismo endotrix. KOH-tinta. X400

"In vitro" algunos dermatofitos atacan el pelo de una determinada forma, lo que constituyeuna prueba de diagnóstico diferencial, como es la producción de órganos perforantes, quese utiliza para diferenciar el T. mentagrophytes del T. rubrum, el primero produce órganosperforantes y el segundo no (Fig. 19).

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Fig. 18. Examen directo de Tinea capitis. Parasitismo ectotrix en mosaico. KOH-tinta.X400

TABLA 5: EL PARASITISMO PILOSO DE LOS DERMATOFITOS

ENDOTRIXArtrosporado

T. violaceumT. tonsurans

Fávica T. schoenleinii

ECTOTRIX

En mosaicoM. canisM. audouinii

MicroideT. mentagrophytesM. gypseum

Megasporado T. verrucosum

Las levaduras suelen presentarse bajo el aspecto de blastoconidias en gemación y pseudo-micelio. Su observación puede plantear mayores dificultades que la de los dermatofitos. Enel caso de la pitiriasis versicolor, la imagen es patognomónica, estando constituida por unamezcla de blastosporos singulares provistos de un nítido collarete de gemación y pseudomi-celio corto y grueso. Todos estos elementos se tiñen con gran rapidez mediante la tintaParker azul permanente o el colorante de Swartz-Lamkins (Fig. 20).

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Fig. 20. Examen directo de queilitis candidiasica. Blastoconidias y pseudomicelio. KOH-tinta X1000

Las gotas de grasa pueden tomarse por células de levadura, aunque su esfericidad, su dis-tinta tonalidad y su variado tamaño ayudan a distinguirlas.

La imagen conocida como “hongo en mosaico” (“mosaic fungi”) puede resultar muy engaño-sa, ya que estas estructuras, constituidas por cristales de colesterol y de otras substancias,se parecen mucho a las artroconidias de los dermatofitos, de las que pueden diferenciarsepor su disposición a lo largo del borde de las células epidérmicas y por su forma irregular.

Finalmente, de modo ocasional, pueden observarse en los exámenes directos macroconi-dias, que en ningún caso corresponden a dermatofitos, siendo la mayoría de las veces, tes-timonio de la presencia de un moho contaminante u oportunista.

Para terminar, haremos unos breves comentarios: el examen directo es interesante, rápido,aproximativo, pero repetimos, no permite distinguir las diversas especies de dermatofitos. Esfácil cuando es positivo, es difícil cuando es negativo. El examen directo no excluye el cultivo,que es imprescindible para el diagnóstico de las diferentes especies de dermatofitos.

SIEMBRA/CULTIVO

El Examen Directo puede permitirnos detectar la presencia del agente causal en la muestrapatológica, pero nada o casi nada nos dice de la identidad de ese agente, salvo muy limita-das excepciones (Malassezia globosa en la pitiriasis versicolor y Scopulariopsis brevicaulisen ciertas onicomicosis). El diagnóstico definitivo de una micosis requiere un segundo paso:el aislamiento e identificación del hongo responsable de la misma, mediante cultivo.

El cultivo se lleva a cabo depositando una cantidad de la muestra patológica en la superficiede uno o varios medios de cultivo, dispuestos en recipientes que pueden ser de dos tipos:tubos y placas. Nosotros preferimos las placas de Petri, de 9-10 cm de diámetro, porque per-miten una mejor disposición del inóculo y facilitan la observación y el estudio de las colonias.Tienen la desventaja de ofrecer más riesgo a la contaminación, pero este problema puedelimitarse con la adición de ciertos antibióticos y practicando las siembras cuidadosamente(trabajando siempre junto a la llama del mechero) (Figs. 22.1-22.3, 23.1, 23.2, 24.1, 24.2).

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Las placas o tubos, una vez inoculados, se incuban a temperatura ambiente o, mejor, en estu-fa a 25ºC. Esta es la temperatura ideal para el desarrollo de la mayoría de los agentes cau-santes de dermatomicosis, aunque algunos de ellos, como T. verrucosum o las levaduras delgénero Candida crecen con mayor rapidez a 37ºC. El cultivo de las levaduras lipofílicas delgénero Malassezia, que requieren temperaturas de 30ºC a 32ºC, no se lleva a cabo de formarutinaria, por no ser indispensables para el diagnóstico de la pitiriasis versicolor, pero consti-tuye un prometedor campo de investigación en otras dermatosis y es posible que se genera-lice en el futuro.

Cuando la incubación se realiza en estufa, a temperaturas por encima de los 30ºC, o cuan-do se prolonga más allá de las dos semanas, es aconsejable disponer las placas en bolsasde plástico cerradas, para evitar la desecación del medio.

IDENTIFICACIÓN

Los cultivos deben examinarse periódicamente a lo largo del tiempo de incubación, y nodeben desecharse como negativos hasta transcurridas tres semanas a partir de su siembra.Debe vigilarse la aparición de cualquier tipo de colonia, levaduriforme o filamentosa, tenien-do en cuenta que los hongos contaminantes que pudieran estar presentes en el materialpatológico, o introducirse en el medio al practicar las siembras o durante la incubación, cre-cen con más rapidez que los patógenos, pudiendo fácilmente cubrirlos o ahogarlos en pocosdías, impidiéndonos su aislamiento (Fig. 25).

Las colonias sospechosas, una vez detectadas, deben replicarse en medios frescos si seobserva contaminación. Una vez se estima alcanzada la madurez de la colonia, se procedea anotar sus características macromorfológicas, esto es su color, textura (granulosa, pul-verulenta, anteada, vellosa, algodonosa o glabra), superficie (plana, elevada, plegada, crateri-forme) y color del reverso. Con la práctica, el aspecto macroscópico de las colonias a menudobasta para orientar la identificación de la especie, al menos en los hongos filamentosos, demodo similar a lo que ocurre con las plantas.

Esta observación debe completarse siempre con el estudio de los caracteres micromorfoló-gicos, lo que llevaremos a cabo tomando una muestra de la superficie de la colonia por mediode un papel adhesivo transparente. Éste, se coloca acto seguido sobre un portaobjeto en elque previamente habremos depositado una gota de la solución colorante, habitualmente azulde lactofenol. La observación se realiza al microscopio, generalmente, con aumentos bajos(de x 100 a x 400) y debe centrarse en la morfología de las estructuras reproductoras, enespecial, los distintos tipos de conidias.

En aquellos casos en que la micromorfología no permita alcanzar una identificación definitivade la especie aislada, se recurre a ciertas técnicas auxiliares (tests fisiológicos o bioquími-cos) que se detallan en los capítulos correspondientes. Esto reza sobre todo para las leva-duras, cuya morfología es mucho más pobre que la de los hongos filamentosos.

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Examen macroscópico

En primer lugar observaremos si la colonia tiene aspecto levaduriforme (como gota dequeso fundido) (Fig. 25 A) o filamentoso (vulgarmente moho). En el segundo supuesto ano-tar si el crecimiento es muy rápido (mohos) (Fig. 25 C) o lento (dermatofitos) (Fig. 25 B). Engeneral, para los dermatofitos, es solo orientativo, pero con experiencia podremos sospe-char las especies mas frecuentes en nuestro medio: E. floccosum, M. canis, M. gypseum,T. mentagrophytes, T. rubrum, T. violaceum, T. verrucosum...

Realizamos la observación con el siguiente orden:

1. Color: Tanto del anverso (micelio aéreo): blanco, crema, amarillo, anaranjado, rojo, vio-leta...; como del reverso (micelio vegetativo): amarillento casi siempre, puede ser rojo,marrón, violeta o sin color.

2. Superficie: Pulverulenta, vellosa, aterciopelada, algodonosa...

3. Relieve: Plano, crateriforme, elevado cupuliforme, radiado...

4. Borde: Neto, con vellosidades...

5. Velocidad de crecimiento: Similar para casi todos (+/- 10 mm/semana), lento (1 mm/semana):T. verrucosum, T. violaceum.

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Debemos tener en cuenta que los caracteres morfológicos de los dermatofitos varían segúnlas condiciones del cultivo, tipo de medios, temperatura y en especial para el color, la luz quereciba la colonia. Por esto, la experiencia personal para las cepas del propio laboratorio estan valiosa. Algunos medios naturales (harina de maíz, patata, etc.) estimulan la producciónde pigmentos y otros medios artificiales como el DTM, específico para los dermatofitos, colo-rean el medio.

Examen microscópico

Se lleva a cabo de una manera sencilla obteniendo un fragmento del cultivo, con espátula ocon un trozo de cinta adhesiva, de la zona central de la colonia y montándolo entre porta ycubre, con unas gotas de azul de lactofenol, permite observar al microscopio óptico (x 100,x 400) los caracteres microscópicos del micelio fúngico.

1. Micelio tabicado, hifas septadas, ramificadas, formando una maraña. Observamos la peri-feria de la misma para encontrar conidias (macro y microconidias) o bien algunas estructu-ras morfológicamante interesantes para el diagnóstico micológico.

2. Conidias: Microconidias, son unicelulares, pequeñas, redondas, ovales o piriformes.Presentan dos tipos de disposición: a lo largo de la hifa (tipo acladium) en forma de raci-mos (cruz de Lorena). Unas veces son sesiles, otras nacen sobre cortos esterigmas. Lasmacroconidias, son multicelulares, grandes, con tabiques transversales. Existen diversostipos: fusiformes, en raquetas y en lápiz o maza. A su vez pueden tener las paredes grue-sas o finas, ser lisas o rugosas, aisladas o en racimos.

3. Estructuras morfológicas especiales: Casi todas variantes de tamaño y forma de las hifasseptadas:

Espirales: hifa fina enrollada en espiral.

Hifa en raqueta: ensanchamiento oval de una porción media o terminal de una hifa.

Cuerpos nodulares: filamentos engrosados formando nudos sobre si mismo.

Candelabro fávico: división terminal de una hifa en dos o tres puntas engrosadas.

Hifa peptinada: pequeñas prolongaciones en un solo lado de la hifa, que adopta así formade peine.

Hifa retrógrada: hifa que nace en sentido contrario, en ángulo agudo, al resto de lasramificaciones.

ESTRATEGIA DE LABORATORIORecordemos que la estrategia consiste en dividir el desarrollo del aprendizaje en tres niveles.El primer nivel va destinado a todos los dermatólogos, aunque no tengan conocimientos delaboratorio ni de micología. El segundo nivel, está dirigido a aquellos dermatólogos queposeen algunos medios, conocimientos y el interés científico de investigar los hongos. Eltercer nivel, va destinado a aquellos investigadores que trabajan con los hongos comoprotagonistas.

ESTRATEGIA DE LABORATORIO DE LA PITIRIASIS VERSICOLOR

PRIMER NIVEL

Objetivo: Confirmar el diagnóstico clínico de pitiriasis versicolor.

Método: Aplicación de luz de Wood. Observamos una fluorescencia amarilla, verde amari-llenta. Aconsejamos oscuridad absoluta en la habitación de exploración, cerciorándose deque no existe tratamiento previo de la lesión con cremas o ungüentos porque imposibilitan lafluorescencia. Podemos observar lesiones no perceptibles a simple vista. Lo único que nece-sitamos es una lámpara de Wood, de fácil adquisición en la actualidad. Este proceder,aunque no sea propiamente de laboratorio, lo incluimos por su simplicidad y para comple-mentar el signo clínico de la uñada de Besnier. Es útil tanto para confirmar el diagnósticocomo para valorar la eficacia del tratamiento (Figs. 26.1, 26.2).

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TABLA 6: ESTRATEGIA EN PITIRIASIS VERSICOLOR

PRIMER NIVELExamen con luz de Wood

SEGUNDO NIVEL

Examen directo con cinta adhesiva

TERCER NIVEL

Identificación especies Malassezia

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Fig. 26.1. Pitiriasis 1º nivel luz de Wood

Fig. 26.2. Pitiriasis 1º nivel luz de Wood 2

SEGUNDO NIVEL

Objetivo: Demostrar la presencia de Malassezia en unas lesiones clínicas sospechosas depitiriasis versicolor.

Método: Examen directo de las escamas cutáneas obtenidas con cinta adhesiva.Presionamos con un fragmento de cinta adhesiva sobre una lesión típica, lo separamos dela piel y lo pegamos sobre un portaobjeto. Depositamos una gota de KOH al 20-30% (continta azul Parker o bien la solución de Swartz-Lamkins) en un cubreobjeto y observamos almicroscopio. Encontraremos racimos de células levaduriformes, redondeadas, de 4-8 micras,con gemaciones y junto a estos racimos, podemos hallar filamentos cortos, tabicados e inclu-so ramificados. Esta imagen es patognomónica. Sólo necesitamos cinta adhesiva, un por-taobjeto y cubreobjetos, una gota de potasa y un sencillo microscopio (Figs. 27,28).

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Fig. 27. Pitiriasis 2º nivel ED X400

Fig. 28. Pitiriasis 2º nivel ED X1000

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ESTRATEGIA DE LABORATORIO DE LAS TIÑAS O DERMATOFICIAS

PRIMER NIVEL

Objetivo: Demostrar si en una lesión dermatológica sospechosa, existen o no dermatofitos,con una finalidad epidemiológica y fundamentalmente, terapéutica.

Método: Siembra en medio DTM/DTA.

Ya se ha comentado la toma de muestras para las tiñas, repasemos ahora la siembra: elmaterial que hemos obtenido, (escamas, pelos, fragmentos de uñas) lo depositamos, con laayuda de un asa de platino estéril, en la superficie del medio (tanto en tubo, como en placasde Petri) en varios puntos.

La siembra en este primer nivel la realizamos en medio DTM o DTA y, a la semana, el medio(que es de color amarillo miel) cambia el color a rojizo, sólo y exclusivamente si el hongo quecrece es un dermatofito. Sin embargo, el medio no cambia de color si el hongo que crece noes un dermatofito. No necesitamos microscopio, sólo como indicamos en la siembra: unmechero de alcohol, un asa de platino y un tubo/placa con el medio DTM o DTA (Fig. 31).

TABLA 7: ESTRATEGIA EN LAS TIÑAS

PRIMER NIVEL

Cultivo en medio DTM/DTA

SEGUNDO NIVEL

Identificación genérica de dermatofitos

TERCER NIVEL

Identificación de las especies de dermatofitos frecuentes

SEGUNDO NIVEL

Objetivo: Identificación genérica y rápida de dermatofitos.

Método: La realizamos mediante el examen directo y el parasitismo piloso.

Incluimos en este nivel el Examen Directo, y no lo hicimos en el primer nivel porque necesitamicroscopio y, además, porque, después de muchos años realizándolo, seguimos pensandoque representa cierta dificultad y precisa cierto aprendizaje y "oficio" de laboratorio. Con el exa-men directo incluimos el estudio del parasitismo piloso. Ambos representan algo muy interesan-te y rápido en el diagnóstico de los dermatofitos como origen fúngico de una dermatosis.

Examen directo (ED)

Recordamos y resumimos que los dermatofitos aparecen de forma diferente según estudiemoslas escamas o el pelo. En el ED de las escamas se presentan como filamentos hialinos, de bor-des nítidos y regulares, de paredes paralelas, tabicados (este hecho es muy importante) y conla presencia de ramificaciones, que toman color azul. No tienen relación con los bordes celu-lares, a los que atraviesan sin orden determinado. Este patrón diagnostíca genéricamente alos dermatofitos, pero no podemos precisar la especie (Fig. 15.1, 15.2, 16.1).

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Fig. 31.Tiñas 1º nivel cultivo en DTM

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Fig. 32. E. floccosum colonia

Fig. 33. E. floccosum micro

Punta fina: M. canis (Figs. 34, 35).Presentan macroconidias grandes, de gruesas paredes, fusiformes, espinulosas, con susextremos puntiagudos, en ocasiones el distal en forma curva. Normalmente, son muynumerosas. Tienen escasas microconidias, a veces abundantes. Las colonias son decolor amarillo anaranjado, más acentuado en la periferia, de aspecto plumoso. Es unhongo zoofílico.

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Fig. 35. M. canis micro

Fig. 34. M. canis colonia

Punta redondeada: M. gypseum (Figs. 36, 37).Presenta conidias grandes, gruesas paredes, espinuladas, muy parecidas hasta aquí a lasdel M. canis, pero las puntas son redondeadas, menos agudas; asimismo, son menosnumerosas. Puede haber microconidias en racimos. La colonia es muy típica, granulosa, decolor canela, que la diferencia a simple vista de la de M. canis. M. gypseum es un derma-tofito geofílico.

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Fig. 37. M. gypseum micro

Fig. 36. M. gypseum colonia

La presencia de hifas espirales es casi exclusiva de esta especie. Si lo unimos a los caracte-res de la colonia: blanco ocre, pulverulento para la variedad mentagrophytes (zoofílico) y blan-co algodonoso para la variedad interdigitale (antropofílico), y a la presencia de numerosasmicroconidias, redondeadas dispuestas en racimos, no tendremos dudas en el diagnóstico.

En caso de duda sembramos en medio Agar-Urea, en el que T. mentagrophytes cambia elcolor del medio (vira a rosa intenso/rojizo), mientras que T. rubrum no. Otra prueba diferencialsería la formación de órganos perforantes, que es positivo para T. mentagrophytes y negativapara T. rubrum.

Si no existen hifas espirales: Siembra en medio “potato dextrosa agar” (PDA):- Positivo (Colonia roja): T. rubrum (Figs. 40, 41).

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Fig. 39. T. mentagrophytes micro

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Fig. 40. T. rubrum. Colonia: izquierda en MGS, derecha en PDA

Fig. 41. T. rubrum micro

Las colonias de T. rubrum presentan en este medio una coloración rojiza, vinosa, especial-mente en el reverso. Sus típicas microconidias en lágrimas, están dispersas o dispuestas aambos lados de las hifas (según el tipo "acladium"). Hay escasas macroconidias en forma delápiz, finas, lisas y multiseptadas, muy semejantes a las que produce T. mentagrophytes.

Repasamos los caracteres diferenciales de T. rubrum, que en cierto modo ya han aparecido:No hay formas espirales. Ureasa negativo. Formación de órganos perforantes negativa yespecialmente positiva en medio potato dextrosa agar (PDA), con colonias de intenso y noto-rio color rojo-vino, especialmente en el anverso. Es un dermatofito antropofílico, con prefe-rencia por la invasión de las uñas.

- Negativo (colonia blanca): T. tonsurans (Figs. 42, 43).

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Fig. 43. T. tonsurans. Microconidias. X400

Fig. 42. T. tonsurans colonia

Visto así, el diagnóstico deT. tonsurans es por exclusión y con dificultades. Nos ayuda en sudiagnóstico el hecho de conocer que la toma micológica procede de una tiña de la cabeza,de tipo “puntos negros”. No presenta hifas espirales. Las colonias son blancas en medio PDAy forman microconidias redondeadas, que nacen con una base aplanada, muchas veces enforma de clavo. También, es típica la presencia de clamidosporos terminales e intercalares.Es un hongo antropofílico y en la actualidad en España, apenas se aísla.

De todas formas, dadas estas dificultades, es necesario en ocasiones recurrir al crecimientoen medios agar-trichophyton, especialmente los números 1, 2, 3 y 4, donde crece abun-dantemente en los nº 3 y 4, pero no en los dos primeros (no tienen tiamina), mientras queT. mentagrophytes y T. rubrum crecen bien en los cuatro medios.

SI NO EXISTEN NI MACRO NI MICROCONIDIAS

Tres especies pertenecientes al género Trichophyton, todas de crecimiento lento, no produ-cen conidias normalmente, sólo observamos hifas y algunos elementos que describimos acontinuación.

Colonia violácea: T. violaceum (Figs. 44, 45).Presenta colonias de crecimiento muy lento, pequeñas, de consistencia cérea, con uncolor violeta oscuro (vino tinto), aterciopeladas, en el reverso se ve muy bien su colora-ción. El crecimiento mejora en medios con tiamina (Agar trichophyton nº 3 y 4). No pro-duce conidias. Sólo se observa una maraña de hifas de color violeta, con algunos engro-samientos intercalados, a veces en cadenas. Es un dermatofito antropofílico.

Hifas toruloides: T. verrucosum (Figs. 46, 47).Lo que primero llama la atención es el lento crecimiento de la colonia (30 días), crecimientoque mejora si se incuba a 37ºC y en medios con tiamina (Agar trichophyton 3 y 4). Tambiénciertos caracteres microscópico de la colonia: como ser crateriforme, de color ocre-amari-llento a grisáceo, superficie lisa y plegada, y suele penetrar en el agar.

Microscópicamente sólo aparecen hifas, no conidias. En las hifas se intercalan cadenasde clamidosporos, de diferentes tamaños, dando lugar a las típicas hifas toruloides. Esun hongo zoofílico.

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Fig. 44. T. violaceum colonia

Fig. 45. T. violaceum micro

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Fig. 46. T. verrucosum colonia

Fig. 47. T. verrucosum micro

ESTRATEGIA EN EL LABORATORIO DE LAS CANDIDOSIS

PRIMER NIVEL

Objetivo: Diagnóstico del género Candida. Demostrar si en una afectación cutánea,mucosa o ungueal, si existen o no levaduras pertenecientes al género Candida, con fina-lidad terapéutica.

Método: Siembra en medio glucosado de Sabouraud (MGS).

Recordamos las precauciones que deben tenerse en cuenta al realizar la toma micológica.Se efectúa con hisopo (torunda) bacteriológico estéril en lesiones mucosas y lesiones cutá-neas húmedas, y en piel y uñas, como indicamos en el capítulo de toma micológica. Hay queprestar atención a la escasa supervivencia de las candidas en la muestra por lo que es acon-sejable la siembra inmediata. La siembra la realizamos en medio glucosado de Sabouraud(MGS) con cloramfenicol, mediante el hisopo que utilizamos en la toma o con un asa deplatino. Incubamos a temperatura ambiente y a las 48 horas obtenemos unas colonias blan-cas o blanco-marfil, cremosas, brillantes, como gotas de queso fundido. Son colonias tantípicas, que son diagnósticas por si mismas. Lo único que necesitamos es un hisopo estéril,un mechero de alcohol y un tubo o placa con medio glucosado de Sabouraud. En 24-48 horaspodemos hacer el diagnóstico con una simple visualización del tubo o placa (Fig. 48).

SEGUNDO NIVEL

Objetivo: Identificación de la especie C. albicans, imputada como causa de la mayoría delas candidosis.

Método: Partimos de la colonia que nos ha crecido en el primer nivel, sobre medio deSabouraud y realizamos una resiembra en un medio específico.

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TABLA 10: ESTRATEGIA EN LAS CANDIDOSIS

PRIMER NIVELDiagnóstico del género Candida

SEGUNDO NIVEL

Diagnósitico de la especie C. albicans

TERCER NIVEL

Diagnóstico de todas las especies de género Candida

Para simplificar esta identificación se han propuesto numerosos medios, que tienen encomún una rápida identificación de C. albicans, basándose en el aspecto macroscópico ycolor que adquieren sus colonias. Usamos el medio ChromAgar Candida, en el que la coloniade C. albicans se tiñe de color verdoso, facilitando el diagnóstico rápido y fácil. Sólo necesi-tamos un asa de platino, un mechero de alcohol y una placa de medio CROMAgar candida(Fig. 49).

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Fig. 49 Candida, segundo nivel, colonia verde a la izquierda (C. albicans) en medio ChromAgar

Fig. 48 Candida, primer nivel, colonia blanca en MGS

PATRONES DE DIAGNÓSTICO DE LOS HONGOS MÁSFRECUENTES:

DERMATOFITOS (FIGS. 54-73)

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Fig. 54. E. floccosum. SGA. 2 semanas

Fig. 55. E. floccosum. Macroconidias. ALFX 1000

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Fig. 56. M. canis. SGA. Colonias de 2 semanas

Fig. 57. M. canis. Macroconidias (detalle). ALF X1000

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Fig. 58. M. gypseum. SGA. Colonias de 10 días

Fig. 59. M. gypseum. Macroconidias. ALF X1000

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Fig. 60. T. mentagrophytes var. mentagrophytes. SGA. Colonias de 3 semanas

Fig. 61. T. mentagrophytes var. interdigitale. SGA. Colonias de 3 semanas

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Fig. 62. T. mentagrophytes var. mentagrophytes. Macro y microconidias. ALF X400

Fig. 63 T. mentagrophytes var. mentagrophytes. Microconidias y espirales. ALF X400

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Fig. 64. T. rubrum. SGA. Colonias de 3 semanas

Fig. 65. T. rubrum. PDA. Colonias de 3 semanas

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Fig. 66. T. rubrum. Microconidias. ALF X400

Fig. 67. T. rubrum var raubistchekii. Macro y microconidias. ALF X1000

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Fig. 68. T. tonsurans var sulphureum. SGA. 3 semanas

Fig. 69.T. tonsurans. Microconidias. ALF X40

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Fig. 70 T. violaceum. SGA. 3 semanas

Fig. 71. T. violaceum. ALF X1000

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Fig. 72. T. verrucosum. SGA. 3 semanas

Fig. 73. T. verrucosum. Hifas toruloides. ALF X1000

LEVADURAS (FIGS. 74-79)

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Fig. 75. Candida albicans. Clamidosporos. CMA X200

Fig. 74. Candida albicans. SGA

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Fig. 76. Candida parapsilosis. SGA

Fig. 77. Candida parapsilosis. CMA X100

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Fig. 78. Malassezia globosa. mDixon

Fig. 79. Malassezia globosa en cultivo. ALF X1000

MOHOS (FIGS. 80-91)

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Fig. 81. S. brevicaulis. ALF X1000

Fig. 80. Scopulariopsis brevicaulis. SGA

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Fig. 82. Alternaria alternata. SGA

Fig. 83. Alternaria alternata. Dyctiosporos. ALF X1000

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Fig. 86. A. flavus. SGA

Fig. 87. A. flavus-oryzae. ALF X1000

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Fig. 88 A. terreus. SGA

Fig. 89. A. terreus. ALF X1000

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Fig. 90. Fusarium sp. SGA

Fig. 91. Fusarium sp. Macro y microconidias. ALF X1000

437662599.clase 6 - atlas sobre diagnóstico de las micosis superficiales

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