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UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL

FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES

CARRERA DE BIOLOGÍA

ESTUDIO COMPARATIVO DE TRES FERTILIZANTES

AGRÍCOLAS SOBRE EL CRECIMIENTO COMPOSICIÓN

BIOQUÍMICA DE Scenedesmus sp. UGB-RJ3009 EN CULTIVOS

DISCONTINUOS

AUTOR: MARIA ALEXANDRA QUISHPE JADÁN

TUTOR: PhD. EVER MORALES AVENDAÑO

GUAYAQUIL, SEPTIEMBRE 2018


FACULTAD CIENCIAS NATURALES

CARRERA BIOLOGÍA

UNIDAD DE TITULACIÓN

Guayaquil, 30 de Agosto de 2018

Sra. Blga. MONICA ARMAS DE SOTO, MSc. DIRECTORA DE LA CARRERA DE BIOLOGÍA FACULTAD CIENCIAS NATURALES UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL Ciudad.- De mis consideraciones: Envío a Ud. el Informe correspondiente a la REVISIÓN FINAL del Trabajo de Titulación ESTUDIO COMPARATIVO DE TRES FERTILIZANTES AGRÍCOLAS SOBRE EL CRECIMIENTO COMPOSICIÓN BIOQUÍMICA DE Scenedesmus sp. UGB-RJ3009 EN CULTIVOS DISCONTINUOS, de la estudiante MARIA ALEXANDRA QUISHPE JADÁN. Las gestiones realizadas me permiten indicar que el trabajo fue revisado considerando todos los parámetros establecidos en las normativas vigentes, en el cumplimento de los siguientes aspectos: Cumplimiento de requisitos de forma:

El título tiene un máximo de 18 palabras.

La memoria escrita se ajusta a la estructura establecida.

El documento se ajusta a las normas de escritura científica seleccionadas por la Facultad.

La investigación es pertinente con la línea y sublíneas de investigación de la carrera.

Los soportes teóricos, en su mayoría son de máximo 7 años.

La propuesta presentada es pertinente. Cumplimiento con el Reglamento de Régimen Académico:

El trabajo es el resultado de una investigación.

El estudiante demuestra conocimiento profesional integral.

El trabajo presenta una propuesta en el área de conocimiento.

El nivel de argumentación es coherente con el campo de conocimiento. Adicionalmente, se indica que fue revisado, el certificado de porcentaje de similitud, la valoración del tutor, así como de las páginas preliminares solicitadas, lo cual indica el que el trabajo de investigación cumple con los requisitos exigidos. Una vez concluida esta revisión, considero que el estudiante MARIA ALEXANDRA QUISHPE JADÁN, está apta para continuar el proceso de titulación. Particular que comunico a usted para los fines pertinentes.

Atentamente,

Anexo 7



CARRERA BIOLOGÍA


RÚBRICA DE EVALUACIÓN MEMORIA ESCRITA TRABAJO DE TITULACIÓN

Título del Trabajo: ESTUDIO COMPARATIVO DE TRES FERTILIZANTES AGRÍCOLAS SOBRE EL CRECIMIENTO COMPOSICIÓN BIOQUÍMICA DE Scenedesmus sp. UGB-RJ3009 EN CULTIVOS DISCONTINUOS Autora: MARIA ALEXANDRA QUISHPE JADÁN

ASPECTOS EVALUADOS PUNTAJE MÁXIMO

CALF. COMENTARIOS

ESTRUCTURA Y REDACCIÓN DE LA MEMORIA 3 Formato de presentación acorde a lo solicitado 0.6 0.6 Tabla de contenidos, índice de tablas y figuras 0.6 0.6 Redacción y ortografía 0.6 0.6 Correspondencia con la normativa del trabajo de titulación 0.6 0.6 Adecuada presentación de tablas y figuras 0.6 0.6

RIGOR CIENTÍFICO 6 El título identifica de forma correcta los objetivos de la investigación 0.5 0.5 La introducción expresa los antecedentes del tema, su importancia dentro del contexto general, del conocimiento y de la sociedad, así como del campo al que pertenece

0.6 0.6

El objetivo general está expresado en términos del trabajo a investigar 0.7 0.7 Los objetivos específicos contribuyen al cumplimiento del objetivo general

0.7 0.7

Los antecedentes teóricos y conceptuales complementan y aportan significativamente al desarrollo de la investigación

0.7 0.7

Los métodos y herramientas se corresponden con los objetivos de la investigación

0.7 0.7

El análisis de la información se relaciona con datos obtenidos 0.4 0.4 Factibilidad de la propuesta 0.4 0.4 Las conclusiones expresa el cumplimiento de los objetivos específicos 0.4 0.4 Las recomendaciones son pertinentes, factibles y válidas 0.4 0.4 Actualización y correspondencia con el tema, de las citas y referencia bibliográfica

0.5 0.5

PERTINENCIA E IMPACTO SOCIAL 1 Pertinencia de la investigación/ Innovación de la propuesta 0.4 0.4 La investigación propone una solución a un problema relacionado con el perfil de egreso profesional

0.3 0.3

Contribuye con las líneas / sublíneas de investigación de la Carrera/Escuela

0.3 0.3

CALIFICACIÓN TOTAL* 10 10

* El resultado será promediado con la calificación del Tutor y con la calificación de obtenida en la Sustentación oral.

Fecha: 30 de Agosto del 2018

Anexo 8



CARRERA BIOLOGÍA


REPOSITORIO NACIONAL EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA

FICHA DE REGISTRO DE TESIS/TRABAJO DE GRADUACIÓN TÍTULO Y SUBTÍTULO:

Estudio comparativo de tres fertilizantes agrícolas sobre el

crecimiento composición bioquímica de Scenedesmus sp. UGB-

RJ3009 en cultivos discontinuos AUTOR(apellidos/nombres): Quishpe Jadán Maria Alexandra

REVISOR (ES)/TUTOR(ES)

(apellidos/nombres): Revisora: Salvador Brito Miriam

Tutor: Morales Avendaño Ever Darío INSTITUCIÓN: Universidad de Guayaquil UNIDAD/FACULTAD: Facultad de Ciencias Naturales MAESTRÍA/ESPECIALIDAD: GRADO OBTENIDO: Bióloga FECHA DE PUBLICACIÓN: No. DE

PÁGINAS:

75

ÁREAS TEMÁTICAS: Desarrollo biotecnológico, conservación y aprovechamiento

sostenible de los recursos naturales PALABRAS CLAVES/

KEYWORDS: Densidad celular, fertilizantes agrícolas, metabolitos primarios,

Scenedesmus sp.

RESUMEN/ ABSTRACT (150-250 palabras):

En este estudio se evaluó medios de cultivo basados en fertilizantes agrícolas (F1, F2 y F3) en

diferentes concentraciones (C1, C2 y C3), y su efecto sobre el crecimiento, producción de biomasa

y metabolitos primarios en la microalga Scenedesmus sp., en comparación con un medio de cultivo

estándar, con el propósito de hallar alternativas más económicas para el cultivo de microalgas. Los

cultivos se mantuvieron durante siete días en aireación permanente, irradiancia de 234 μmol fotones

m-2s-1 y fotoperiodo de 12:12h. Los tratamientos evaluados tuvieron respuestas diferentes; sin

embargo, los valores obtenidos en F1 (C2 y C3) en cuanto al crecimiento y la composición

bioquímica de Scenedesmus sp. fueron competitivos en comparación al medio control; tomando en

consideración su bajo precio y alta disponibilidad en el mercado, demostrando así que resultan un

opción viable y económica para el reemplazo de los medios nutritivos de laboratorio, principalmente

en cultivos a gran escala.

ADJUNTO PDF: SI NO

CONTACTO CON AUTOR/ES: Teléfono: 0980401004 E-mail: [email protected]

CONTACTO CON LA

INSTITUCIÓN:

Nombre: Facultad de Ciencias naturales

Teléfono: 043080777 – 043080758

E-mail: [email protected]

Anexo 10



CARRERA BIOLOGÍA


Guayaquil, 30 de Agosto de 2018

CERTIFICACIÓN DEL TUTOR REVISOR

Habiendo sido nombrado MIRIAM JACQUELINE SALVADOR BRITO, DOCENTE TUTORA, del trabajo de titulación ESTUDIO COMPARATIVO DE TRES FERTILIZANTES AGRÍCOLAS SOBRE EL CRECIMIENTO COMPOSICIÓN BIOQUÍMICA DE Scenedesmus sp. UGB-RJ3009 EN CULTIVOS DISCONTINUOS, certifico que el presente trabajo de titulación, elaborado por MARIA ALEXANDRA QUISHPE JADÁN con C.I. No. 0931271837, en la Carrera de Biología, Facultad de Ciencias Naturales, ha sido REVISADO Y APROBADO en todas sus partes, encontrándose apta para su sustentación.

Anexo 11

© Derechos de Autor

Maria Alexandra Quishpe Jadán

2018





ESTUDIO COMPARATIVO DE TRES FERTILIZANTES AGRÍCOLAS SOBRE EL

CRECIMIENTO COMPOSICIÓN BIOQUÍMICA DE Scenedesmus sp. UGB-RJ3009

EN CULTIVOS DISCONTINUOS

Autor: María Alexandra Quishpe Jadán

Tutor: PhD. Ever Morales Avendaño

RESUMEN

En este estudio se evaluó medios de cultivo basados en fertilizantes agrícolas (F1, F2 y F3) en diferentes concentraciones (C1, C2 y C3), y su efecto sobre el crecimiento, producción de biomasa y metabolitos primarios en la microalga Scenedesmus sp., en comparación con un medio de cultivo estándar, con el propósito de hallar alternativas más económicas para el cultivo de microalgas. Los cultivos se mantuvieron durante siete días en aireación permanente, irradiancia de 234 μmol fotones m-2s-1 y fotoperiodo de 12:12h. Los tratamientos evaluados tuvieron respuestas diferentes; sin embargo, los valores obtenidos en F1 (C2 y C3) en cuanto al crecimiento y la composición bioquímica de Scenedesmus sp. fueron competitivos en comparación al medio control; tomando en consideración su bajo precio y alta disponibilidad en el mercado, demostrando así que resultan un opción viable y económica para el reemplazo de los medios nutritivos de laboratorio, principalmente en cultivos a gran escala.

Palabras claves: Scenedesmus sp., fertilizantes agrícolas, densidad celular, metabolitos primarios, plasticidad fenotípica.

Anexo 13





COMPARATIVE STUDY OF THREE AGRICULTURAL FERTILIZERS ON

GROWTH AND BIOCHEMICAL COMPOSITION OF Scenedesmus sp. UGB-

RJ3009 IN BATCH CULTURE

Author: Maria Alexandra Quishpe Jadán

Advisor: PhD. Ever Morales Avendaño

ABSTRACT

In this research, different culture media based on commercial agricultural fertilizers (F1, F2, F3) at 0,25; 0,5 and 1,0 g.L-1 (C1,C2,C3) were evaluated as well as each of their effects on the growth, production of biomass and primary metabolites in the microalga Scenedesmus sp. in batch cultures compared to a standard culture medium, in order to find more affordable alternatives for the cultivation of microalgae. The cultures were maintained for seven days, under photoperiod conditions 12: 12h, constant aeration and at an irradiance of 234 μmol photons m-2 s-1. All the treatments evaluated had a different response; however, the values obtained in F1 (C2 and C3) regarding the growth and biochemical composition of Scenedesmus sp. were competitive with the control medium taking into account their low price and high availability in the market, proving that they are a viable and economical option for the replacement of nutritive laboratory culture media, mainly if large volumes of culture are required.

Keywords: Scenedesmus sp., agricultural fertilizer, cell density, primary metabolites, phenotypic plasticity.

Anexo 14





RÚBRICA PARA LA EVALUACIÓN DE LA SUSTENTACIÓN DEL TRABAJO DE TITULACIÓN*

Título del trabajo: Estudio comparativo de tres fertilizantes agrícolas sobre el crecimiento composición

bioquímica de Scenedesmus sp. UGB-RJ3009 en cultivos discontinuos. Autora: MARIA ALEXANDRA QUISHPE JADÁN

Nombre del miembro del Tribunal de Sustentación: Fecha de Sustentación:

Blga. Mónica Armas de Soto MSc. Martes, 11 de septiembre del 2018

EVALUACIÓN DE LA EXPOSICION ORAL PUNTAJE MÁXIMO

CALF. COMENTARIOS

El alumno realiza una presentación con seguridad, dirigiéndose hacia el tribunal, manteniendo su atención y manejando las transparencias o cualquier otro medio con soltura.

2

Capacidad de análisis y síntesis, Capacidad de organización, planificación y habilidad en la gestión de la información, administrando el tiempo de la exposición de manera adecuada.

2

Las ideas se presentan de manera clara y comprensible, dominando el tema y utilizando recursos viables y ejemplos. La presentación es original y creativa, sin uso excesivo de animaciones. Los elementos visuales son adecuados.

2

Los contenidos que se exponen son adecuados, ajustados a la memoria escrita y en un lenguaje científico.

2

Responde adecuadamente a las preguntas del tribunal, su actitud es respetuosa hacia los miembros del tribunal.

2

CALIFICACIÓN TOTAL** 10

*Cada miembro del tribunal utilizará una rúbrica para la evaluación de la sustentación y registrará su firma en el documento individualmente. ** El resultado será promedio con la calificación será promediado con la calificación de la memoria escrita para la obtención de la Nota Final de Sustentación del Trabajo de Titulación.

FIRMA DEL MIEMBRO DEL TRIBUNAL

FIRMA Y SELLO SECRETARIA DE LA CARRERA

C.I. No. 0907686240

Anexo 15









Blga. Miriam Salvador de Castro Martes, 11 de septiembre del 2018


CALF. COMENTARIOS


2


2


2


2


2





C.I. No. 0907678288

Anexo 15









PhD. Xavier Álvarez Montero Martes, 11 de septiembre del 2018


CALF. COMENTARIOS


2


2


2


2


2





C.I. No. 0908695364

Anexo 15

ii

© Derechos de Autor

Maria Alexandra Quishpe Jadán

2018

iii

DEDICATORIA

A mis amados padres y hermanos, por su amor, paciencia y apoyo que han hecho

posible el poder alcanzar mis metas, por ser mi ejemplo y mi mayor fuerza para no

rendirme y hacerme sentir que todos los esfuerzos valen la pena.

iv

AGRADECIMIENTOS

Agradezco a Dios, por permitirme existir y conocer a aquellas maravillosas personas

que tengo junto a mí como mi familia y amigos, por poder amarlos y ser amada por

ellos, en ese sentimiento sé con seguridad que está tu presencia.

A mi amada madre María, por luchar y mantenerte fuerte ante las adversidades de la

vida, por seguirte manteniendo dulce y amorosa hacia mí y mis hermanos, y a la vez

fuerte para poder corregirnos y crear en nosotros valores y principios fundamentales

en la vida.

A mi padre Jorge y a mis hermanos Edwin y Fernando, su amor, preocupación y

abundante paciencia han sido indispensables para mi desarrollo profesional y mi

propio bienestar.

A mi tutor de tesis, PhD. Ever Morales Avendaño, por sus enseñanzas y correcciones

en el desarrollo de esta tesis. Gracias por su motivación y constante preocupación

hacia todos sus alumnos y darnos mayores oportunidades para crecer

profesionalmente, además de sembrar en nosotros la semilla de ayudar a los demás

con el mismo entusiasmo con el que usted lo hace todos los días.

A mis profesores, por impartir sus conocimientos de forma paciente y constante,

compartiendo parte de su experiencia, anécdotas y por su apoyo reconfortante cuando

lo necesitamos y a su vez empujarnos a seguir creciendo profesionalmente y nunca

detenernos. A todos mis amigos, por hacer que todos estos años de preparación sean

más divertidos e inolvidables, haciendo que aquellas etapas difíciles se sientan menos

con su apoyo y pasen más rápido.

Gracias al Laboratorio de Biotecnología, por acogerme y confiar en mí para desarrollar

este tema de tesis que forma parte de uno de sus proyectos de investigación. Gracias

a los integrantes del Área de microalgas, al Blgo. Leonardo García, Dianita Macías y

Yelsin Loor, por enseñar y guiarme con todo lo necesario para desarrollar esta

investigación, muchas gracias por su compañía y valiosa ayuda durante todo el

proceso. Así mismo agradezco a todo el personal que conforma el Laboratorio de

v

Biotecnología por sus aportaciones y su buena disposición para ayudar ante cualquier

inconveniente o duda.

Y por último gracias a la Facultad de Ciencias Naturales por haberme dado la

oportunidad de realizar una carrera profesional.

vi

ÍNDICE DE CONTENIDO

INTRODUCCIÓN ...................................................................................................1

CAPÍTULO I ..........................................................................................................4

1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ...........................................................4

1.2. OBJETIVOS ................................................................................................6

1.2.1. Objetivo general ....................................................................................6

1.2.2. Objetivos específicos .............................................................................6

1.3. JUSTIFICACIÓN .........................................................................................7

1.4. HIPÓTESIS ...............................................................................................10

CAPÍTULO II .......................................................................................................11

2.1. ANTECEDENTES .....................................................................................11

2.2. MARCO TEÓRICO ....................................................................................13

2.2.1. Aspectos generales de las microalgas .................................................13

2.2.2. Factores para el cultivo de microalgas .................................................14

2.2.3. Aplicaciones biotecnológicas ...............................................................14

2.2.4. Clasificación taxonómica .....................................................................16

2.2.4.1 Género Scenedesmus ....................................................................16

2.2.4.2 Plasticidad fenotípica de Scenedesmus .........................................17

2.2.5. Fertilizantes agrícolas ..........................................................................18

2.2.5.1 Fertilizantes agrícolas en el cultivo de microalgas ..........................18

CAPÍTULO III ......................................................................................................20

3.1. METODOLOGÍA ........................................................................................20

3.1.1. Material biológico .................................................................................20

3.1.1.1. Condiciones del inóculo ................................................................20

3.1.2. Diseño experimental ............................................................................21

3.1.2.1. Medio de control ...........................................................................21

3.1.2.2. Medios basados en fertilizantes agrícolas .....................................22

vii

3.1.3. Condiciones generales de los cultivos .................................................23

3.2. EVALUACIÓN DE LOS CULTIVOS ...........................................................24

3.2.1. Crecimiento .........................................................................................24

3.2.1.1. Método de recuento celular ..........................................................24

3.2.1.2. Método de turbidez ........................................................................25

3.2.1.3. Determinación de la biomasa seca ................................................25

3.2.2. Determinación de pigmentos fotosintéticos ..........................................26

3.2.3. Determinación de carbohidratos ..........................................................27

3.2.4. Determinación de lípidos .....................................................................28

3.2.5. Determinación de proteínas .................................................................29

3.2.6. Caracterización de la plasticidad fenotípica .........................................30

3.2.6.1. Expresión del morfotipo: Unicelulares y cenobiales .......................30

3.2.6.2. Dimensiones celulares ...................................................................30

3.3. ANÁLISIS ESTADÍSTICO ..........................................................................30

CAPÍTULO IV ......................................................................................................31

4.1. RESULTADOS ..........................................................................................31

4.1.1. Crecimiento de los cultivos ..................................................................31

4.1.1.1. Recuento celular ............................................................................31

4.1.1.2. Turbidez ........................................................................................32

4.1.1.3. Biomasa seca ................................................................................32

4.1.2. Pigmentos ...........................................................................................33

4.1.3. Correlación entre parámetros de crecimiento ......................................34

4.1.4. Carbohidratos ......................................................................................34

4.1.5. Lípidos .................................................................................................35

4.1.6. Proteínas .............................................................................................36

4.1.7. Caracterización de la plasticidad fenotípica .........................................38

4.1.7.1. Formas unicelulares y cenobiales ..................................................38

viii

4.1.7.2. Dimensiones celulares ....................................................................39

DISCUSIÓN .........................................................................................................41

CONCLUSIONES ................................................................................................44

RECOMENDACIONES........................................................................................46

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................................47

ANEXOS .............................................................................................................58

ix

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Estudios realizados referentes al efecto de los fertilizantes agrícolas en el

cultivo de distintas especies de microalgas. ............................................................ 19

Tabla 2. Diseño experimental con los factores y variables de respuesta evaluadas 21

Tabla 3. Composición del medio Basal de Bold (Bischoff & Bold, 1963) ................. 22

Tabla 4. Concentración de los componentes presentes en cada fertilizante agrícola

(mg.L-1) en las distintas concentraciones evaluadas .............................................. 23

Tabla 5. Correlación entre parámetros de crecimiento de Scenedesmus sp. ......... 34

Tabla 6. Valores obtenidos de los parámetros de crecimiento y macromoléculas

(pigmentos, carbohidratos, lípidos y proteínas) en los cultivos de Scenedesmus

sp.UGB-RJ-3009 al sexto día. ................................................................................ 37

x

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Células de Scenedesmus en cenobios de ocho células. .............................. 16

Figura 2. Células de Scenedesmus sp. UGB-RJ-3009 observadas en microscopio a

40X. ......................................................................................................................................... 20

Figura 3. Cultivos de Scenedesmus sp. UGB-RJ-3009 en un sistema autotrófico con

aireación. ................................................................................................................................ 24

Figura 4. Diagrama de flujo del protocolo para la extracción y cuantificación de

pigmentos liposolubles. ........................................................................................................ 26

Figura 5. Diagrama de flujo del protocolo seguido para la extracción y cuantificación

de carbohidratos. ................................................................................................................... 27


de lípidos. ............................................................................................................................... 28


de proteínas.. ......................................................................................................................... 29

Figura 8. Curvas de crecimiento (cel.mL-1) de los cultivos de Scenedesmus sp. RJ-

3009 en los tratamientos con fertilizantes agrícolas. ...................................................... 31

Figura 9. Turbidez medida por densidad óptica (750nm) de los cultivos de

Scenedesmus sp. UGB- RJ 3009....................................................................................... 32

Figura 10. Biomasa seca (mg.L-1) en los cultivos de Scenedesmus sp. UGB-RJ-3009

al sexto día. ............................................................................................................................ 33

Figura 11. Concentración de Clorofila a, Clorofila b y carotenoides, en los cultivos

de Scenedesmus sp. UGB-RJ-3009. ................................................................................. 34

Figura 12. Contenido de carbohidratos al sexto día de edad de los cultivos. ............ 35

Figura 13. Contenido de lípidos en los cultivos de Scenedesmus sp. UGB- RJ 3009

al sexto día. ............................................................................................................................ 36

xi

Figura 14. Contenido de proteínas en los cultivos de Scenedesmus sp. UGB-RJ-

3009 ......................................................................................................................................... 37

Figura 15. Observación de células de Scenedesmus sp. en los distintos medios de

cultivo evaluados.. ................................................................................................................. 38

Figura 16. Población de morfotipos (%) unicelulares y de cenobios de Scenedesmus

sp. RJ-3009 en los diferentes tratamientos. ..................................................................... 39

Figura 17. Dimensiones celulares (µm) de Scenedesmus sp. UGB-RJ-3009. ......... 40

xii

ÍNDICE DE ANEXOS

Anexo 1. Siembra de cultivos con Scenedesmus sp. UGB-RJ-3009 ...................... 58

Anexo 2. Botellas con los medios de cultivo inoculados con Scenedesmus sp. con

medios nutritivos en base a fertilizantes en tres concentraciones y un control ........ 58

Anexo 3. Lectura de estándares en el espectrofotómetro para la elaboración de la

curva de calibración de lípidos. ............................................................................... 59

Anexo 4. Variación de pH en los cultivos de Scenedesmus sp. ............................. 59

Anexo 5. Tabla con los porcentajes de morfotipos unicelulares y cenobiales en los

cultivos de Scenedesmus sp. .................................................................................. 60

xiii

LISTA DE SÍMBOLOS

μmol - micromol

mM - milimolar

mL - mililitro

°C - grados centígrados

cel.mL-1 - células por mililitro

mbar - milibar

rpm - revoluciones por minuto

nm - nanómetro

% - porcentaje

μL - microlitro

μm - micrómetro

mg.L-1 - miligramos por litro

xiv





ESTUDIO COMPARATIVO DE TRES FERTILIZANTES AGRÍCOLAS SOBRE

EL CRECIMIENTO COMPOSICIÓN BIOQUÍMICA DE Scenedesmus sp. UGB-

RJ3009 EN CULTIVOS DISCONTINUOS

Autor: María Alexandra Quishpe Jadán

Tutor: PhD. Ever Morales Avendaño

RESUMEN

En este estudio se evaluó medios de cultivo basados en fertilizantes agrícolas (F1, F2 y F3) en diferentes concentraciones (C1, C2 y C3), y su efecto sobre el crecimiento, producción de biomasa y metabolitos primarios en la microalga Scenedesmus sp., en comparación con un medio de cultivo estándar, con el propósito de hallar alternativas más económicas para el cultivo de microalgas. Los cultivos se mantuvieron durante siete días en aireación permanente, irradiancia de 234 μmol fotones m-2s-1 y fotoperiodo de 12:12h. Los tratamientos evaluados tuvieron respuestas diferentes; sin embargo, los valores obtenidos en F1 (C2 y C3) en cuanto al crecimiento y la composición bioquímica de Scenedesmus sp. fueron competitivos en comparación al medio control; tomando en consideración su bajo precio y alta disponibilidad en el mercado, demostrando así que resultan un opción viable y económica para el reemplazo de los medios nutritivos de laboratorio, principalmente en cultivos a gran escala.

Palabras claves: Scenedesmus sp., fertilizantes agrícolas, densidad celular, metabolitos primarios, plasticidad fenotípica.

xv





COMPARATIVE STUDY OF THREE AGRICULTURAL FERTILIZERS ON

GROWTH AND BIOCHEMICAL COMPOSITION OF Scenedesmus sp. UGB-

RJ3009 IN BATCH CULTURE

Author: Maria Alexandra Quishpe Jadán

Advisor: PhD. Ever Morales Avendaño

ABSTRACT

In this research, different culture media based on commercial agricultural fertilizers (F1, F2, F3) at 0,25; 0,5 and 1,0 g.L-1 (C1,C2,C3) were evaluated as well as each of their effects on the growth, production of biomass and primary metabolites in the microalga Scenedesmus sp. in batch cultures compared to a standard culture medium, in order to find more affordable alternatives for the cultivation of microalgae. The cultures were maintained for seven days, under photoperiod conditions 12: 12h, constant aeration and at an irradiance of 234 μmol photons m-2 s-1. All the treatments evaluated had a different response; however, the values obtained in F1 (C2 and C3) regarding the growth and biochemical composition of Scenedesmus sp. were competitive with the control medium taking into account their low price and high availability in the market, proving that they are a viable and economical option for the replacement of nutritive laboratory culture media, mainly if large volumes of culture are required.

Keywords: Scenedesmus sp., agricultural fertilizer, cell density, primary metabolites, phenotypic plasticity.

1

INTRODUCCIÓN

El aumento continuo de la población mundial ha desencadenado una importante

reducción de los recursos naturales que son explotados para satisfacer las

necesidades básicas humanas a través de prácticas insostenibles como la

producción agrícola desmedida e irresponsable para la obtención de alimento y de

biodiesel; el deterioro y destrucción de ecosistemas terrestres y acuáticos; la quema

de combustibles fósiles y la emisión de diferentes gases de efecto invernadero

(García-Gonzalez, 2014). Todos ellos han conducido a graves repercusiones

ambientales; tales como el calentamiento global, acidificación de los océanos,

aumento de lluvias ácidas, suelos infértiles, eutrofización de aguas, entre otras

(Bakuei, Ghazaleh, Najafpour, Jahanshahi, & Mohammadi, 2015), generando la

necesidad de hallar nuevas alternativas que permitan lograr los mismos objetivos de

forma eficaz y a la vez reducir el deterioro progresivo del ambiente (Velichkova,

Sirakov & Georgiev, 2013).

Las microalgas y cianobacterias son consideradas como uno de los biorecursos

con mayor potencial en el desarrollo biotecnológico, registrándose a lo largo de los

últimos años una extensa variedad de estudios referentes a su aplicación con distintas

finalidades, seleccionando aquellas especies que han demostrado características de

gran relevancia como una rápida tasa de crecimiento, alta tolerancia a cambios de los

parámetros ambientales, biomasa con un alto contenido nutricional, una mayor

capacidad de asimilación de CO2 y de nutrientes disueltos en el agua que a su vez

permitirán mejorar el rendimiento y disminuir costes en la producción de alimentos,

medicinas, suplementos nutricionales, biorremediación; además de considerarse

como una opción viable en la generación eficiente y sostenible de biocombustibles

(Kim et al., 2007; Soares et al., 2017; Toledo-Cervantes, Garduño-Solórzano,

Campos, Martínez-García & Morales, 2018).

Entre las microalgas, los géneros Scenedesmus y Desmodesmus

(Scenedesmaceae) abarcan un alto porcentaje de las investigaciones realizadas y

forman parte de los primeros grupos cultivados a nivel de laboratorio, debido al rápido

crecimiento y fácil mantenimiento de sus cultivos en comparación al de otras

microalgas; así mismo, su alta tolerancia a variaciones de las condiciones

2

ambientales han permitido que estas se distribuyan de forma abundante en los

cuerpos de agua dulce de casi todo el mundo (Kim et al., 2007; Lürling, 2003). Ambos

géneros, también se caracterizan por presentar una alta producción de biomasa cuya

composición bioquímica está enriquecida con múltiples metabolitos de interés y de

gran cotización en el mercado. De acuerdo a estos aspectos, dependiendo de la

especie y de las condiciones del cultivo, se han llegado a registrar máximos niveles

de proteína, carbohidratos y lípidos (65%, 50% y 40%; respectivamente), con un

extenso perfil de aminoácidos esenciales y ácidos grasos poliinsaturados; además de

contener vitaminas, minerales y pigmentos con propiedades antioxidante, anti-

infamatorio, antiagregante y vasoconstrictor, entre otros (Nayak, Thirunavoukkarasu

& Mohanty, 2016; Ramírez, Ragagnin, Queiroz & Jacob, 2015; Velichkova et al.,

2013).

En el área de la acuicultura, las microalgas de la familia Scenedesmaceae son

cultivadas a gran escala especialmente para la producción de alimento vivo, siendo

una de los grupos que ofrecen un mayor aporte nutricional en base a los

requerimientos propios de especies zooplanctónicas (cladóceros y rotíferos), larvas

de peces y camarones, beneficiándose de su alto contenido en ácidos grasos

(Omegas 3 y 6) y de proteínas (Shah et al., 2018; Toyub, Miah, Habib & Rahman,

2008). En el sector industrial es necesaria la generación de biomasa microalgal en

mayores proporciones para la obtención de moléculas de alto valor comercial. No

obstante, se requiere de fuentes de nutrientes efectivas y económicamente viables

que reemplacen a aquellos medios de cultivos formulados con reactivos químicos de

grado analítico y de elevados precios (Nayak et al., 2016).

El presente estudio forma parte del proyecto de investigación “Evaluación y

optimización del cultivo de la cepa de la microalga carotenogénica Scenedesmus sp

(UGB-RJ-3009) bajo la influencia de parámetros físicoquímicos” financiado por la

Dirección de Investigaciones y Proyectos Académicos (DIPA) y llevado a cabo por

el grupo de investigación del Área de microalgas y cianobacterias del Laboratorio de

Biotecnología de la Facultad de Ciencias Naturales.

Los objetivos de esta investigación buscan explorar nuevas opciones que suplan

los costosos medios de cultivo empleados a nivel de laboratorio, evaluando tres

fertilizantes agrícolas inorgánicos de bajo precio y amplia disponibilidad en el

3

mercado, considerando las variaciones en el crecimiento celular, producción de

biomasa y metabolitos como proteínas, carbohidratos, lípidos, pigmentos (clorofila a,

b, y carotenoides); además de registrar características fenotípicas como forma,

tamaño y número de células por cenobio, en comparación a un medio de cultivo

estandarizado sobre la especie de microalga dulcecuícola Scenedesmus sp.

disponible en el cepario de microalgas y cianobacterias del Laboratorio de

Biotecnología de la Facultad de Ciencias Naturales.

4

CAPÍTULO I

1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

La investigación sobre microalgas está enfocada en diversas aplicaciones

biotecnológicas orientadas a la obtención de una gran variedad de productos de

interés para el ser humano. Tradicionalmente, estos organismos han tenido una alta

aceptación en las industrias alimenticia y acuícola debido a su alto contenido

nutricional, abundante en carbohidratos, lípidos, ácidos grasos poliinsaturados,

proteínas, vitaminas, minerales y antioxidantes. Así mismo, la producción de

pigmentos lipídicos, como clorofila y carotenoides, resultan de gran importancia para

la elaboración de productos farmacéuticos, cosmetológicos y alimentarios, siendo los

de mayor relevancia las ficobiliproteínas en cianobacterias y los diferentes tipos de

carotenoides (Gómez, 2007).

Las microalgas requieren del aporte específico de nutrientes, en las

concentraciones adecuadas y en formas químicamente biodisponibles en su medio

para asegurar su óptimo crecimiento y desarrollo, existiendo ciertas variantes en

cuanto al tipo de elementos y sus proporciones de acuerdo a la especie que se desee

cultivar (Silva-Benavides, 2016). Los macronutrientes, micronutrientes (elementos

traza) y ciertas vitaminas proporcionados a través de los medios de cultivo, influyen

directamente en los parámetros de crecimiento, sobrevivencia y composición

bioquímica celular, de manera que, ante la carencia de uno o varios de aquellos

elementos, o en las cantidades inadecuadas pueden llegar a generar ciertas

limitaciones en tales parámetros (Ochoa, 2016).

Los medios de cultivo microalgales preparados a nivel de laboratorio requieren de

reactivos de grado analítico que pueden llegar a ser excesivamente costosos al

momento de trabajar con volúmenes de cultivo superiores, representando uno de los

factores de mayor interés en la producción masiva de estos organismos con fines

comerciales, en donde se toma como prioridad la implementación de alternativas más

económicas, que a su vez permitan la generación rápida de biomasa de excelente

calidad, sobre todo con altos porcentajes de moléculas como carbohidratos, lípidos,

proteínas y pigmentos, destinados a la elaboración de diferentes compuestos con

5

alto valor comercial (Brito, Milani, Pereira, González & Morán, 2006; Valenzuela et al.,

2005).

Existen diversos estudios basados en la evaluación de fertilizantes agrícolas

comerciales como sustitutos de los medios de cultivo estándares formulados para

microalgas, principalmente por su bajo costo, mayor asequibilidad y fácil aplicación

en los cultivos. Sin embargo, debido a la variabilidad de su composición química, es

necesario conocer la respuesta de las células ante el estímulo de cada fertilizante y

las fluctuaciones en las tasas de crecimiento y producción bioquímica de moléculas

de gran interés como carbohidratos, lípidos, proteínas y pigmentos (Brito et al., 2006).

Para el mejoramiento del cultivo de microalgas, se requiere de la formulación de

medios de cultivo, además de condiciones físico-químicas adecuadas, que permitan

una mayor producción de biomasa enriquecida con metabolitos de interés durante un

corto periodo de tiempo, además de reducir los costes de producción a gran escala,

generando así una producción con una más alta rentabilidad. En consecuencia, este

estudio se plantea comparar la acción de tres fertilizantes agrícolas en el cultivo de la

microalga Scenedesmus sp. UGB RJ-3009 y determinar las modificaciones dadas en

la tasa de crecimiento, densidad celular, polimorfismo y producción de proteínas,

lípidos, carbohidratos y pigmentos en comparación a los valores generados con el

medio de cultivo estándar Basal de Bold (Bischoff & Bold, 1963).

6

1.2. OBJETIVOS

1.2.1. Objetivo general

Evaluar el efecto de tres fertilizantes agrícolas en el crecimiento y producción de

proteínas, lípidos, carbohidratos y pigmentos en la microalga Scenedesmus sp.

UGB-RJ 3009 en cultivos discontinuos.

1.2.2. Objetivos específicos

Comparar el crecimiento de Scenedesmus sp. entre un medio de cultivo

convencional seleccionado y tres fertilizantes agrícolas comerciales.

Cuantificar la producción de biomasa, proteínas, carbohidratos, lípidos y

pigmentos (carotenoides y clorofila a y b) en los diferentes tratamientos.

Determinar cuantitativamente la expresión del morfotipo celular en los

tratamientos en relación a los medios de cultivos a ser analizados.

7

1.3. JUSTIFICACIÓN

Las microalgas son organismos fotosintéticos que han sido aprovechados en

beneficio del hombre de numerosas formas desde hace varios siglos; los primeros

registros existentes con respecto a su aplicación como complemento alimenticio se

remontan al siglo XVI, encontrando alimentos elaborados con la biomasa de cianofitas

del género Arthrospira (Spirulina) (García, 2014). Durante la Segunda Guerra

Mundial, investigadores alemanes empezaron a producir diatomeas en cantidades

masivas con el fin de obtener lípidos y proteínas de manera rápida, dando así un inicio

para este grupo de organismos en el campo de la biotecnología y el desarrollo

humano, que con el pasar de los años ha ido evolucionando significativamente,

encontrando a su vez una amplia variedad de aplicaciones en distintos sectores, y

consecuentemente expandiéndose a diversos países; hasta hace pocos años se

calculó que la biomasa microalgal producida a nivel mundial oscilaba entre 5 a 10 mil

toneladas por año, generando un aproximado de 1250 millones de dólares (Álvarez &

Gallardo, 1989; Cañavate, 2011; Pástor & Pozo, 2013).

El cultivo de microalgas ofrece una mayor rentabilidad a nivel industrial, en

comparación a la mayoría de organismos terrestres. Esto se debe a que presentan

altas tasas de crecimiento ocupando una menor unidad de superficie, requiriendo tan

sólo de luz, agua, CO2 y algunas sales como nutrientes inorgánicos para producir

altos rendimientos de biomasa con una extensa variedad de macromoléculas como

carbohidratos, lípidos, proteínas y pigmentos, e incluso metabolitos secundarios de

mucho interés sobre todo en el área agroalimenticia, biomédica, cosmetológica y

bioenergética (Bolaños & Martínez, 2016; Manso, 2015). Adicionalmente, constituyen

una alternativa económica y ecológicamente amigable basada en su eficacia en la

producción de O2, biorremediación de efluentes con metales pesados y otros

contaminantes, asimismo su capacidad de captación de CO2 del medio contribuye a

la formación de los grandes sumideros de dióxido de carbono en los océanos; los

cuales han sido verificados a través de numerosas investigaciones (Cabrera & Pulla,

2014; Olarte & Valencia, 2016).

La producción de microalgas a gran escala ha permitido la elaboración de una

amplia gama de productos en la industria alimenticia y farmacéutica, en donde se han

utilizado principalmente para mejorar la calidad nutricional de los alimentos, tanto de

8

animales como de seres humanos, inclusive en el sector de la acuicultura se utilizan

como base para la elaboración de piensos y como alimento vivo (Gutiérrez, Ocampo,

Montoya & Sánchez, 2016). Los múltiples pigmentos como clorofilas, carotenoides y

ficobiliproteínas son utilizados para la elaboración de colorantes naturales, fármacos

anti-inflamatorios, antioxidantes, profilácticos, mantenimiento de la estructura de los

tejidos, anti-agregantes y vasoconstrictores plaquetario.

Por otra parte, existen numerosos estudios que demuestran que las personas que

incluyen en su dieta alimentos ricos en clorofila a, tienden a reducir el riesgo de

presentar algún tipo de cáncer (Streit et al., 2015). Estos compuestos alcanzan un

gran valor en el mercado internacional y su demanda va en aumento, en conjunto con

el desarrollo de la tecnología industrial, la biotecnología y la demanda internacional

de nuevos medicamentos y compuestos de alimentación (Portillo et al., 2007).

Las microalgas del género Scenedesmus han sido evaluadas para la obtención de

una amplia gama de bioproductos como precursores de fármacos y como

complementos alimenticios. Además de, su notoria eficiencia en el tratamiento de

aguas residuales por su acción rápida y eficaz en la remoción de nutrientes y metales

pesados, además de poder capturar el CO2 del medio contribuyendo así a formar los

grandes sumideros de dióxido de carbono en los océanos (Olarte & Valencia, 2016).

Existen diversos estudios sobre este grupo de microorganismos en relación a los

medios de cultivo empleados para su crecimiento. Sin embargo, tan solo unas pocas

especies han demostrado un crecimiento óptimo en los medios de cultivo formulados

para algas dulceacuícolas, exhibiendo así un lento crecimiento en medios en donde

otras sí llegan a prosperar (Tapia & Manrique, 2015; Martínez et al., 2005).

Generalmente, en el cultivo de microalgas a gran escala se emplean diferentes

fertilizantes como reemplazo de los medios de cultivo preparados a nivel de

laboratorio; los cuales requieren de reactivos de grado analítico que resultan

excesivamente costosos y difíciles de adquirir para tales proporciones masivas;

siendo el uso de fertilizantes una opción más asequible y económica que ha permitido

generar altas densidades de crecimiento y, en muchos casos obtener un producto con

valores equitativos o mayores en su composición bioquímica en comparación a los

9

otorgados con los medios de cultivo estándares (González, Buitrago & Frontado,

1999; Panta, Macay, Moncayo &Vélez, 2016; Valenzuela et al., 2005).

La presente investigación pretende encontrar alternativas que permitan

complementar o cubrir las necesidades nutricionales de Scenedesmus sp., mediante

el mejoramiento del medio de cultivo estandarizado para este tipo de organismos,

generando así un incremento de la producción de biomasa y a la vez un mayor

aprovechamiento de las moléculas de interés comercial; tales como, proteínas,

lípidos, carbohidratos y pigmentos, a través de la implementación de fertilizantes

agrícolas comerciales, como una opción económica y rentable para la producción

masiva de esta microalga.

10

1.4. HIPÓTESIS

Hipótesis alternativa (Ha):

El uso de fertilizantes agrícolas como medio de cultivo para la microalga

Scenedesmus sp. inducirá diferencias significativas en su crecimiento y composición

bioquímica con respecto al medio de cultivo estándar (BBM).

Hipótesis nula (H0):

El uso de fertilizantes agrícolas como medio de cultivo para la microalga

Scenedesmus sp. no inducirá diferencias significativas en su crecimiento y

composición bioquímica con respecto al medio de cultivo estándar (BBM).

11

CAPÍTULO II

2.1. ANTECEDENTES

Estudios realizados con microalgas clorofitas sobre el uso de diferentes fertilizantes

en los cuales cultivaron tres especies de microalgas dulceacuícolas; Kirchneriella

obesa, Scenedesmus quadricauda y Chlorococcum infusorium, empleando dos

fertilizantes (Fert I y Fert II) y el medio F/2 de Guillard como control en volúmenes de

32 L de cultivo. Las máximas concentraciones para las tres especies se registraron

al décimo día en el control y en el Fert I, en el caso de S. quadricauda alcanzó una

densidad de 0.16 x106 cel.mL-1 (control) y 0.12 x106 cel.mL-1 (Fert I) y tasas de

duplicación de 1.44 y 1.14; respectivamente. Entre los resultados se logró demostrar

la eficacia del uso del fertilizante (Fert I) en comparación al medio de cultivo estándar

F/2 principalmente como una alternativa para disminuir costos en los cultivos de estas

microalgas (Ortega-Salas & Reyes-Bustamante, 2012).

Por otra parte, en una investigación realizada en base al efecto de los fertilizantes

agrícolas sobre el cultivo de Chlorella sorokiniana (Silva-Benavides, 2016) se

evaluaron dos fertilizantes agrícolas comerciales NPK 20-20-20 y NPK 22-10-7

(+MgO) complementados con sulfato de magnesio, bajo condiciones de intensidad

lumínica de 150 μmol fotones m-2 s-1, ajuste diario a pH 7 y con adición de CO2 en el

flujo de aire, mantenidos durante nueve días. Entre los resultados, se determinó que

con el fertilizante NPK 20-20-20 (1,0 g.L-1) + 0,27 g.L-1 MgSO4.7H2O, registrando la

máxima densidad al sexto día (3,25 g.L-1) con un alto contenido proteínico (50,10 ±

0.1%) y de carbohidratos (37,32 ± 0.27%). Se concluyó que estos fertilizantes

agrícolas, en conjunto con la adición de MgSO4, pueden utilizarse para el cultivo de

C. sorokiniana, generando un crecimiento y producción de biomasa similar a la

obtenida con un medio de cultivo estándar.

La evaluación de fertilizantes agrícolas como medios nutritivos para el cultivo de

Scenedesmus sp. fue estudiada por Nayak et al. 2016; quienes determinaron la

producción de biomasa y contenido lipídico en un cultivo discontinuo de

Scenedesmus sp.; con utilización de una combinación de urea con distintas

concentraciones de fertilizante inorgánico NPK, bajo condiciones de luz continua de

60 μmol fotones m-2.d-1. En estos estudios se demostraron óptimos resultados en

12

aquellos tratamientos con las más altas concentraciones del fertilizante (1.0 g.L-1),

con las cuales obtuvo una producción de biomasa de 1.19 g.L-1, y una productividad

de 66.1 mg.L-1.d-1, tasa de crecimiento específico de 0.265 μ.d-1 y un alto porcentaje

de lípidos (28.55%); mediante esta investigación se llegó a demostrar que el aporte

de nutrientes a partir de fertilizantes agrícolas puede ser empleado de forma óptima

para el correcto rendimiento de los cultivos de esta cepa microalgal.

Soares et al. (2017), realizaron cultivos discontinuos de Scenedesmus sp.

evaluando el crecimiento y composición bioquímica para lo cual emplearon como

medio nutritivo distintos fertilizantes agrícolas manteniendo el cultivo con adición de

5% de CO2 y utilizando como control el medio BG11. De acuerdo a una cinética de

16 días, se produjo una alta densidad celular y producción de biomasa (7.3 ± 0.9

×107 cel.mL-1 y 1.7 g.L-1, respectivamente). En cuanto a la composición de proteínas,

carbohidratos y lípidos se produjo 558.4 ± 23.1 mg.L-1, 287.1 ± 55.1 mg.L-1 y 271.5

± 17.6 mg.L-1; respectivamente. Concluyendo que el uso de fuentes de nutrientes de

grado comercial es una alternativa efectiva y de bajo costo para optimizar la

producción de los pigmentos, proteínas, carbohidratos y lípidos de esta microalga a

gran escala.

13

2.2. MARCO TEÓRICO

2.2.1. Aspectos generales de las microalgas

Las microalgas, son organismos unicelulares con capacidad fotosintética,

representados por una amplia diversidad de especies que pueden ser inmóviles o

tener movilidad mediante estructuras como flagelos, en su mayoría presentan

complejos ciclos de vida, protegidos por una pared celular que puede estar desnuda

o recubierta por estructuras de sílice o sustancias proteicas, hallándose de manera

individual o en pequeños grupos formando colonias con diversos tamaños y formas

(Adedoyin, 2017). Tienen una amplia distribución, llegando a habitar en casi todos

los ecosistemas acuáticos, ya sean estos marinos, dulceacuícolas, salobres, inclusive

en ecosistemas terrestres y ciertos hábitats con condiciones ambientales extremas

como las regiones árticas y zonas con hipersalinidad o alta alcalinidad (Osorio,

Belmar & Vásquez, 2016; Perénguez & Valdez, 2017).

Entre los principales grupos de microalgas están las clases Bacillariophyceae

(diatomeas), Chlorophyceae (algas verdes), Chrysophyceae (algas doradas pardas),

Prymnesiophyceae y Eustagmatophyceae, cuya categorización se basa

principalmente en el tipo de pigmentos fotosintéticos, considerando en menor medida

ciertos componentes bioquímicos, su estructura celular y ciclo de vida (Moreno, 2012).

La clasificación de estos microorganismos, sobre todo en taxones inferiores, ha sido

constantemente involucrada en controversias debido a que su morfología y fisiología

son altamente variables y dependientes de diferentes factores del medio; por lo cual,

el uso de marcadores moleculares para su identificación ha sido una de las

metodologías de mayor valor en la identificación de microalgas (Adedoyin, 2017;

Radha, Fathima, Sellamuthu & Mohandas, 2012).

Desempeñan un rol de gran importancia en los ecosistemas acuáticos, siendo parte

fundamental de las redes tróficas como base de la cadena alimenticia (organismos

productores). Además de, aportar grandes cantidades de oxígeno para el

metabolismo de organismos consumidores aeróbicos (González, 2010). Se calcula

que son los responsables de fijar más del 40% del dióxido de carbono de la atmósfera

durante el proceso de fotosíntesis para la producción de moléculas orgánicas, con

14

una eficiencia superior a la de plantas terrestres (Elías, 2018; Goswami & Kalita,

2011).

2.2.2. Factores para el cultivo de microalgas

Los principales factores externos que influyen en el crecimiento y en el contenido

bioquímico de estos microorganismos son la intensidad de luz, disponibilidad de

nutrientes y de dióxido de carbono, temperatura y pH; dependiendo del hábitat del

que provengan la salinidad puede jugar un rol importante; además de ellos, la

presencia de sustancias tóxicas y de metales pesados han demostrado a través de

diversos estudios su efecto sobre la densidad celular y composición química

(Arredondo, Voltolina, Zenteno, Arce & Gómez, 2017; Goswami & Kalita, 2011; Peña-

Castro, Martínez-Jerónimo, Esparza-García & Cañizares-Villanueva, 2004). Aunque

su principal fuente de energía sea la radiación solar y el dióxido de carbono, también

pueden aprovechar las fuentes de carbono orgánico por lo cual se los considera a la

vez como organismos mixotróficos (Elías, 2018).

2.2.3. Aplicaciones biotecnológicas

Las microalgas poseen diversas características que las convierten en un recurso

de gran interés para el desarrollo biotecnológico, tales como su alta tasa de

crecimiento y su capacidad de sintetizar productos de alto valor como aminoácidos,

lípidos, carbohidratos, pigmentos, vitaminas, enzimas y bioplásticos; generando

grandes expectativas para su aprovechamiento en las industrias alimenticia,

farmacéutica, cosmética, energética, acuicultura, así como un recurso viable para la

biorremediación de aguas contaminadas (Osanai, Park & Nakamura, 2017, Radha et

al., 2013).

Desde hace varias décadas el ser humano ha utilizado estos organismos como una

fuente de alimento de alto valor nutricional, encontrando en su composición un

elevado porcentaje de proteínas, semejante al que se puede hallar en otras fuentes

convencionales como el huevo y la soya (Adedoyin, 2017); además de contener

carbohidratos, ácidos grasos poliinsaturados (omegas 3 y 6), y una gran variedad de

pigmentos. Entre ellos la astaxantina, zeaxantina, luteína y betacaroteno que poseen

propiedades antioxidantes, todos ellos al mismo tiempo son necesarios para la

15

elaboración y desarrollo de diversos productos farmacéuticos y nutracéuticos (Duong

et al., 2015).

En el sector de la acuicultura se han obtenido múltiples beneficios debido a su alta

calidad nutricional y eficiente digestibilidad al emplear estos microorganismos, ya sea

como alimento vivo o en balanceados (en reemplazo del uso de harina y aceite de

pescado), destinados al cultivo de cladóceros, rotíferos, moluscos, camarones y

larvas de peces, influyendo en el mejoramiento de la calidad de los cultivos y el

incremento de la resistencia a distintas enfermedades (Shah et al., 2018).

Los estudios realizados en base a una gran variedad de especies microalgales han

demostrado su alto potencial como futuras materias primas para la generación de

biocombustibles debido a su capacidad de acumular grandes reservas de lípidos,

incluso hasta alcanzar la mitad de su peso seco, atrayendo y generando el interés de

los sectores público y privado que se mantienen en búsqueda de la reducción de

costos para su producción (Kilian, Benemann, Niyogi, & Vick, 2011). Diferentes tipos

de biocombustibles han sido obtenidos con su biomasa, entre ellos biodiesel,

bioaceites, bio-hidrógeno, ofreciendo una amplia variedad de alternativas

ecológicamente amigables para suplir aquellos combustibles de fuentes fósiles y de

limitado stock que a su vez han generado severas repercusiones ambientales

(Difusa, Takukdar, Kalita, Mohanty & Goud, 2015; Velichkova et al., 2013).

Existen abundantes investigaciones que han evidenciado la eficacia de numerosas

especies de microalgas como agentes de bioremediación, demostrando óptimos

resultados en la remoción de nutrientes en aguas residuales (principalmente carbono,

nitrógeno y fósforo), gracias a la presencia de exoenzimas capaces de degradar

compuestos orgánicos en moléculas más asimilables para su metabolismo

(Rodríguez, 2010). Así mismo, pueden capturar y acumular metales pesados tales

como cadmio, cobre y cromo, reduciendo la concentración de estos compuestos en

ecosistemas acuáticos que son liberados como producto de ciertas actividades

industriales que pueden llegar a ocasionar serios problemas ambientales (Ishaq,

2016; Peña-Castro et al., 2004).

16

2.2.4. Clasificación taxonómica

Imperio Eukaryota

Reino Plantae

Subreino Viridiplantae

Phylum Chlorophyta

Subphylum Chlorophytina

Clase Chlorophyceae

Orden Sphaeropleales

Familia Scenedesmaceae

Género Scenedesmus

Figura 1. Células de Scenedesmus en cenobios de ocho células. Fuente: Guiry & Guiry, 2018

(http://www.algaebase.org/search/species/detail/?species_id=fd80fe8490e537789)

2.2.4.1 Género Scenedesmus

El género Scenedesmus de la clase Chlorophyceae fue descrito por Meyen (1829),

en el cual se agrupó a aquellas microalgas verdes halladas frecuentemente en

cuerpos dulceacuícolas de casi todo el mundo (Peña-Castro et al., 2004),

17

caracterizadas principalmente por la formación de cenobios de dos, cuatro y ocho

células (Figura 1), con formas que varían entre ovaladas, elipsoidales ovadas,

fusiformes; láminas fuertes (sin ornamentaciones y tres capas de esporopolenina) y

ligeramente curveadas en las cuales las células suelen disponerse en una o dos

líneas; cloroplasto parietal y almidón, recubriendo al pirenoide; sin embargo, ante

determinadas condiciones ambientales pueden ser observadas predominantes en su

fenotipo unicelular (Fanés, 2008; Toledo-Cervantes et al., 2018). Se ha reconocido

taxonómicamente un aproximado de 74 especies para este género hasta la

actualidad, sin embargo, su morfología variante e inconstante ha generado

dificultades que impiden su correcta identificación (Ishaq, 2016).

Este grupo de microalgas es conocido como uno de los más prometedores debido

a su alta tasa de crecimiento, óptima resistencia a cambios en los parámetros físico-

químicos de su medio y especialmente por su alto contenido en diferentes metabolitos

de interés que alcanzan elevados precios en el mercado (Soares et al. 2017). En el

sector de la acuacultura su cultivo está destinado mayormente para la alimentación

del zooplancton herbívoro y de ciertos peces en estadío larval; sin embargo, su

capacidad de sintetizar una amplia variedad de aminoácidos esenciales, ácidos

grasos poliinsaturados y de múltiples pigmentos con propiedades antioxidantes, entre

otros diferentes compuestos, demuestran la potencialidad de las microalgas de este

género para ser aplicados en las industrias farmacéutica, alimenticia, cosmetológica,

energética y muchas otras (Sathasivam & Ki, 2018).

2.2.4.2 Plasticidad fenotípica de Scenedesmus

Estos organismos presentan una alta plasticidad fenotípica, que se refiere a la

capacidad de determinados genotipos de poder expresarse con distintos fenotipos

influenciados directamente por cambios en los factores externos o ambientales, entre

los más conocidos están la disponibilidad de nutrientes, estrés por contaminantes

como metales pesados, aceites, petróleo, temperatura y pastoreo de ciertos grupos

zooplanctónicos (Peña-Castro et al., 2004). Un alto porcentaje de las microalgas que

forman parte de la familia Scenedesmaceae han sido descritos en distintos estudios

como organismos con una gran plasticidad fenotípica, por lo cual se ha hallado en

constante controversia con respecto a su clasificación taxonómica, debiendo priorizar

18

su reubicación de acuerdo a criterios basados en análisis moleculares y no en su

morfología (Acevedo & Ramírez, 2003).

2.2.5. Fertilizantes agrícolas

Los fertilizantes agrícolas son compuestos químicamente disponibles para las

plantas y que producen un efecto positivo en su crecimiento y desarrollo; de acuerdo

a su origen pueden ser de tipo orgánico (como excreciones de animales), e inorgánico

cuando consisten en productos o sustancias obtenidas a través de procesos

químicos; en su composición se encuentran aquellos elementos esenciales para su

desarrollo, divididos en dos grupos; los macronutrientes abarcan aquellos que se

requieren en mayores proporciones, tales como el nitrógeno, fósforo, potasio, azufre,

calcio y magnesio. El segundo grupo es el de los micronutrientes, a pesar de que

estos se hallen en menores cantidades, su presencia es esencial para distintos

procesos fisiológicos, entre ellos están el hierro, manganeso, boro, cinc, cloro y cobre

(Pérez, 2014; Sánchez, 2014).

2.2.5.1 Fertilizantes agrícolas en el cultivo de microalgas

En la búsqueda de alternativas que permitan reducir los costos de producción en

el cultivo de microalgas, se ha evaluado el uso de otras posibles fuentes de nutrientes

para sustituir a aquellos medios formulados en base a reactivos químicos de grado

analítico debido a su elevado precio; entre aquellas opciones están los fertilizantes

agrícolas que contienen macro y micronutrientes que a su vez son compatibles y

asimilables para las microalgas (Soares et al., 2017). Varios investigadores han

demostrado resultados óptimos al emplear distintos fertilizantes agrícolas en el cultivo

de varias especies microalgales (Tabla 1) sobre los parámetros de crecimiento y

productividad de distintos metabolitos teniendo como comparación los valores

obtenidos con medios de cultivo estándares de laboratorio (Guzmán-Murillo et al.,

2007; Fabregas, Toribio, Abalde, Cabezas & Herrero, 1987; Granda, 2015; Muñoz-

Peñuela et al., 2012; Silva-Benavides, 2016).

19

Tabla 1. Estudios realizados referentes al efecto de los fertilizantes agrícolas en el cultivo de distintas

especies de microalgas.

Año Estudio Especies Parámetros evaluados Referencias

2016

Evaluación de fertilizantes agrícolas en la

productividad de la microalga Chlorella

sorokiniana

Chlorella sorokiniana

Crecimiento celular, productividad de biomasa, fluorescencia, contenido de

clorofila, proteínas y carbohidratos

(Silva-Benavides, 2016)

2005

Crecimiento, consumo de nutrientes y composición proximal de Rhodomonas

sp. cultivada con medio f/2 y fertilizantes agrícolas

Rhodomonas sp.

Densidad celular, tasa de crecimiento específica (µ), contenido de proteínas, carbohidratos, lípidos y

consumo de fosfato, nitrato y amonio

(Valenzuela-Espinoza, Lafarga-De la Cruz,

Millán-Núñez & Núñez-Cebrero, 2005)

1987

Approach to biomass production of the marine microalga Tetraselmis suecica (Kylin) using

common garden fertilizer and soil extract as cheap nutrient supply in batch

cultures

Tetraselmis suecica

Densidad celular, turbidez, concentración de clorofila a y

contenido de proteínas

(Fabregas, Toribio, Abalde,

Cabezas & Herrero, 1987)

2007

Cultivo de cuatro especies de microalgas

con diferentes fertilizantes utilizados en acuicultura

Chaetoceros muelleri,

Thalassiosira weissflogii,

Isochrysis sp. T. suecica

Densidad celular, contenido nutricional: proteínas,

carbohidratos y lípidos,

(Piña, Medina, Nieves, Leal, López-Elías &

Guerrero, 2007)

2002

Protein, carbohydrate, lipid and chlorophyll a content in Isochrysis aff. galbana

(clone T-Iso) cultured with a low cost alternative to

the f/2 medium

Isochrysis aff. galbana

Crecimiento, composición bioquímica referente a

clorofila a, proteínas, lípidos y carbohidratos

(Valenzuela-Espinoza, Millán-Núñez &

Núñez-Cebrero, 2002)

2003 The effect of agricultural fertilizer on growth rate of

benthic diatoms

Nitzschia laevis, N. thermalis var. minor y Navicula

incerta

Densidad celular y tasa de crecimiento

(Simental & Sánchez-Saavedra, 2003)

2006

Evaluación del crecimiento, consumo de nutrientes y composición proximal de Porphyridium cruentum cultivada con medio f⁄2 y fertilizantes

agrícolas.

Porphyridium cruentum

Crecimiento, pigmentos, proteínas, carbohidratos y

lípidos (González, 2006)

2007

Effects of fertilizer-based culture media on the

production of exocellular polysaccharides and cellular superoxide

dismutase by Phaeodactylum

tricornutum (Bohlin)

Phaeodactylum tricornutum

Densidad celular y producción de exopolisacáridos,

proteínas solubles y enzima superoxido dismutasa

(Guzmán-Murillo, López-Bolaños,

Ledesma-Verdejo, Roldan-Libenson,

Cadena-Roa, Ascencio, Felipe,

2007)

20

CAPÍTULO III

3.1. METODOLOGÍA

3.1.1. Material biológico

En el presente estudio se empleó la cepa de Scenedesmus sp. (UGB-RJ-3009)

(Figura 2), provista por el cepario de microalgas y cianobacterias del Laboratorio de

Biotecnología de la Universidad de Guayaquil, aislada del Río Jauneche, Cantón

Palenque en la Provincia de Los Ríos, Ecuador.

La cepa fue conservada en placas de agar con medio Basal de Bold (Bold Basal

medium) o BBM (Bischoff & Bold, 1963) y mantenida bajo condiciones controladas de

laboratorio.

Figura 2. Células de Scenedesmus sp. UGB-RJ-3009 observadas en microscopio a 40X.

3.1.1.1. Condiciones del inóculo

A partir de la cepa Scenedesmus sp. UGB-RJ 3009 mantenida en placas de agar

se extrajeron colonias macroscópicas y luego se transfirieron a medio BBM líquido

para su escalamiento hasta un volumen de 250 mL, en ellos se determinó la densidad

celular óptima y la cinética de crecimiento de la microalga para identificar la fase

21

exponencial de los cultivos, a partir de los cuales se seleccionó el inóculo para dar

inicio a cada uno de los experimentos.

El inóculo se mantuvo en su etapa exponencial mediante recambios agregando

medio de cultivo y con temperatura de 25±2°C, irradiancia incidente de 234 μmol

fotones m-2 s-1, fotoperiodo 12:12 (luz:oscuridad) y aireación continua.

3.1.2. Diseño experimental

Se realizaron cultivos discontinuos con un diseño factorial de 4x3, los factores

evaluados fueron los siguientes:

Factor A: Medios de cultivo (control y medios formulados con fertilizantes

agrícolas)

Factor B: Concentraciones (g.L-1) de los fertilizantes en los cultivos.

La experimentación y los análisis se realizaron por triplicado con un total de 30

unidades experimentales (Tabla 2).

Tabla 2. Diseño experimental con los factores y variables de respuesta evaluadas

Factor A

Medios de

cultivo

Factor B

Concentración de

fertilizante (g.L-1)

Réplicas Variables de

respuesta

Control

BBM ------------ 3 Densidad celular

Turbidez

Biomasa seca

Pigmentos

Proteínas

Lípidos

Carbohidratos

Formación de

cenobios y

unicelulares

Tamaño celular

Menorel (F1)

F1C1 (0.25) 3

F1C2(0.5) 3

F1C3 (1.0) 3

Kristalón (F2)

F2C1 (0.25) 3

F2C2(0.5) 3

F2C3 (1.0) 3

Nutri-Leaf (F3)

F3C1 (0.25) 3

F3C2(0.5) 3

F3C3 (1.0) 3

3.1.2.1. Medio de control

Se utilizó como control el medio estándar Basal de Bold, preparado con agua

destilada y la mezcla de soluciones stock de macronutrientes, micronutrientes y hierro

con EDTA (Tabla 3), todos ellos previamente esterilizados en autoclave a 121°C a 1

atm de presión durante 15 minutos.

22

Tabla 3. Composición del medio Basal de Bold (Bischoff & Bold, 1963)

Componentes Concentración final

mg.L-1 mM

Macronutrientes

NaNO3 250 2.94

MgSO4.7H2O 75 0.304

NaCl 25 0.428

K2HPO4 75 0.431

KH2PO4 175 1.29

CaCl2 . 2H2O 25 0.17

Micronutrientes

ZnSO4.7H2O 8.82 0.0307

MnCl2.4H2O 1.44 0.0073

MoO3 0.71 0.0049

CuSO4.5H2O 1.57 0.00629

Co(NO3)2.6H2O 0.49 0.00168

Solución de Boro

H3BO3 11.42 0.185

Solución EDTA alcalina

EDTA 50 0.17

KOH 31 0.55

Solución ácida de hierro

FeSO4.7H2O 4.98 0.018

H2SO4 (conc) 0.0101

3.1.2.2. Medios basados en fertilizantes agrícolas

Se evaluaron los medios de cultivo preparados en base a tres fertilizantes

agrícolas comerciales de origen inorgánico; Menorel, Kristalón y Nutri-leaf,

denominados F1, F2 y F3; respectivamente. Cada uno de ellos se preparó en base

a tres concentraciones: 0.25, 0.5 y 1.0 g.L-1. La concentración de los componentes de

los fertilizantes en cada una de estas concentraciones se especifica en la tabla 4.

Se preparó soluciones stock con cada fertilizante (concentración de 100 g.L-1),

todos ellos se hallaban en estado sólido en forma de cristales; por lo cual se pesó la

cantidad respectiva de cada uno utilizando una balanza analítica marca Sartorius

modelo BL 210 S, con sensibilidad de 0.01mg. Estos se esterilizaron con luz

ultravioleta, luego disueltos en agua destilada estéril y finalmente transferidos a un

filtro de 0.2 micras para eliminar impurezas. Posteriormente, a partir de un litro de

23

cada una de estas soluciones stock, se utilizaron las siguientes dosis de 2.5 mL (C1),

5.0 mL (C2) y 10.0 mL (C3), en los tratamientos respectivos.

Tabla 4. Concentración de los componentes presentes en cada fertilizante agrícola (mg.L-1) en las

distintas concentraciones evaluadas C1 (0.25 g.L-1), C2 (0.5 g.L-1) y C3 (1.0 g.L-1).

Elementos Menorel (F1) Kristalón (F2) Nutrileaf (F3)

C1 C2 C3 C1 C2 C3 C1 C2 C3

Nitrógeno 75 150 300 32.5 65 130 50 100 200

Fósforo 25 50 100 100 200 400 50 100 200

Potasio 25 50 100 32.5 65 130 50 100 200

Magnesio 5 10 20 NP NP NP NP NP NP

Azufre 2.5 5 10 NP NP NP NP NP NP

Boro 0.063 0.125 0.25 0.063 0.125 0.25 0.05 0.1 0.2

Cobre 0.025 0.05 0.1 0.025 0.05 0.1 0.125 0.25 0.5

Molibdeno 0.01 0.02 0.04 0.01 0.02 0.04 0.001 0.003 0.005

Hierro 0.175 0.35 0.7 0.175 0.35 0.7 0.25 0.5 1

Manganeso 0.1 0.2 0.4 0.1 0.2 0.4 0.125 0.25 0.5

Cinc 0.063 0.125 0.25 0.063 0.125 0.25 0.125 0.25 0.5

NP= No presentes

3.1.3. Condiciones generales de los cultivos

Las unidades experimentales constaron de botellas de vidrio con capacidad de

500 mL, en las cuales se trabajó con un volumen de 250 mL de cultivo y un inóculo

inicial de 5.0 x 105 cel.mL-1 (Anexo 1 y 2). Todos los cultivos se mantuvieron durante

siete días con iluminación artificial mediante lámparas fluorescentes con irradiancia

de 234 μmol fotones m-2 s-1 y fotoperiodo 12:12 horas (ciclo luz-oscuridad) y aireación

constante (Figura 3).

24

Figura 3. Cultivos de Scenedesmus sp. (UGB-RJ-3009) en un sistema autotrófico con aireación.

3.2. EVALUACIÓN DE LOS CULTIVOS

3.2.1. Crecimiento

Se extrajeron a diario alícuotas de 1mL de cada unidad experimental para

determinar el crecimiento microalgal mediante conteo directo y turbidez. Las muestras

tomadas se depositaron en tubos Eppendorf limpios con capacidad de 1.5 mL,

procurando efectuar su lectura inmediatamente para no generar errores por la

continua replicación de las células.

Además de los métodos de recuento celular y turbidez, existen otros parámetros

que permiten medir el crecimiento de los cultivos, como biomasa y pigmentos como

clorofila a (Morales, 2012), por lo cual se aplicó un análisis de correlación entre estos

parámetros para identificar cuáles de estos expresaron de manera más acertada el

crecimiento en los cultivos de Scenedesmus sp.

3.2.1.1. Método de recuento celular

El recuento celular se realizó en una cámara de Neubauer, colocando 10 µL de la

muestra con una micropipeta cerca del borde externo del cubreobjetos, luego se

procedió a contar las células con un microscopio óptico y objetivo de 40X. En el caso

25

de cultivos demasiado concentrados se realizaron diluciones, anotando el volumen

correspondiente que se utilizó para luego aplicarlo en la fórmula dada por Morales

(2012), para determinar la densidad celular:

𝐃𝐂 (𝐜𝐞𝐥. 𝐦𝐋−𝟏) =Nº células contadas

Nº de cuadros contados x 104 x Factor de dilución

3.2.1.2. Método de turbidez

La turbidez de los cultivos se determinó mediante la densidad óptica de ellos

utilizando un espectrofotómetro (Multiskan GO 1.00.40, Termo Scientific). Para ello

se homogenizó con vórtex las muestras extraídas previamente en tubos eppendorf,

tomando seguidamente 200 µL de cada uno, se las colocó en los pocillos de la placa

Maxisorp F bottom 96-well y se procedió inmediatamente a su lectura a una longitud

de onda de 750 nm (DO750nm). Para medir la turbidez en los cultivos se tomaron las

precauciones necesarias para reducir la sedimentación de las células y de las

partículas presentes en los medios de cultivo (Morales, 2012).

3.2.1.3. Determinación de la biomasa seca

Para determinar el peso seco de la biomasa microalgal se tomaron alícuotas de 10

mL de cada cultivo en fase estacionaria y colocadas en tubos de ensayo de 15 mL,

secos, rotulados y previamente pesados. Estos fueron centrifugados a 4000 rpm

durante 15 minutos. Una vez finalizado tal procedimiento, se desechó el líquido

sobrenadante y cada tubo de ensayo colocado cuidadosamente en un liofilizador

(Telstar, Lyoquest) a una temperatura de -56°C y 0,180 mbar durante 24 horas.

Finalmente se anotó el peso de cada tubo con la biomasa seca y se aplicó la fórmula

descrita por Pastuzo (2016); expresando los resultados en mg.L-1 de cultivo.

Biomasa seca =PTb − PTv

Volm

En donde:

PTb = Peso del tubo con la biomasa seca

PTv = Peso del tubo vacío

Vm = Volumen de la muestra del cultivo (10mL)

26

3.2.2. Determinación de pigmentos fotosintéticos

Para la determinación de pigmentos fotosintéticos (clorofila a, b y carotenoides) se

tomaron alícuotas de 2 mL diariamente de cada cultivo. Se realizó la extracción con

dimetilsulfóxido (DMSO); el cual fue seleccionado por su mayor eficiencia en la

extracción de pigmentos en microalgas clorofitas con paredes celulares gruesas,

como es el caso de Scenedesmus sp., siguiendo las técnicas descritas por Morales

(2012), con ciertas modificaciones realizadas por la autora y generadas mediante

ensayos previos (Figura 4).

Posteriormente se determinó su concentración en un espectrofotómetro Thermo

Scientific Genesys 10vis en las siguientes longitudes de onda: 665 nm (Chl a), 649

nm (Chl b) y 480 nm (carotenoides) utilizando las fórmulas propuestas por Jeffrey y

Humphrey (1975) para las clorofilas y las descritas por Strickland y Parsons (1972)

para los carotenoides. Los resultados se expresaron en microgramos por mililitro

(μg.mL-1) de cultivo.

Figura 4. Diagrama de flujo del protocolo para la extracción y cuantificación de pigmentos

liposolubles. Fuente: Arredondo et al., (2017) y adaptado por Morales (2012).

27

3.2.3. Determinación de carbohidratos

Para el análisis de carbohidratos se tomaron muestras de 2 mL de cada cultivo

durante su fase estacionaria utilizando tubos de ensayo de 15 mL previamente

lavados con ácido clorhídrico (HCl) al 10%. Se efectuó la extracción y cuantificación

de los carbohidratos totales en un espectrofotómetro (Multiskan GO 1.00.40, Termo

Scientific) a través del método propuesto por Dubois et al. (1956), con ciertas

modificaciones propuestas por Morales (2012) y por la autora. La curva estándar se

preparó con glucosa anhidra (R2= 1) en un rango de 12-120 μg.mL-1 y se realizaron

las diluciones necesarias con NaOH 1M procurando que la concentración de

carbohidratos en la muestra quede dentro del rango de lectura de la curva elaborada

(Figura 5).

Figura 5. Diagrama de flujo del protocolo seguido para la extracción y cuantificación de carbohidratos. Fuente: Dubois et al. (1956), Arredondo et al. (2017) y Morales (2012).

28

3.2.4. Determinación de lípidos

Se determinó la concentración de lípidos durante la fase estacionaria, para lo cual

se tomó alícuotas de 2 mL y se las colocó en tubos de vidrio de 15 mL previamente

lavados con HCl al 10% para su posterior centrifugación (4000 rpm durante 15 min) y

liofilización (a -56°C y 0,180 mbar durante 24 horas). Se realizó la extracción y

cuantificación de lípidos de acuerdo al método de carbonización simple de Marsh y

Weinstein, (1966) y modificado por Morales (2012). Para la elaboración de la curva

estándar se utilizó tripalmitina (R2= 1) en un rango de 30-270 μg.mL-1 (Anexo 3). El

proceso se describe detalladamente en la Figura 6.

Figura 6. Diagrama de flujo del protocolo seguido para la extracción y cuantificación de lípidos.

Fuente: Marsh y Weinstein (1956) y Morales (2012).

29

3.2.5. Determinación de proteínas

El contenido proteico se determinó, extrayendo 2 mL de cada cultivo durante la

fase estacionaria y se los colocó en tubos de vidrio previamente lavados con HCl al

10%. La extracción de proteínas se realizó a partir de biomasa fresca utilizando NaOH

1M y se determinó su concentración siguiendo las técnicas descritas por Lowry et

al. (1951) y adaptado por Morales (2012). Para elaborar la curva estándar se utilizó

Serum de Albúmina Bovina (BSA), manteniendo un rango de 15-150 μg.mL-1 (R2=

0.995). En el caso de aquellas muestras con un alto contenido de proteínas se

realizaron las diluciones necesarias con agua destilada, procurando que la

concentración hallada en la muestra se encuentre dentro del rango de lectura de la

curva elaborada. El proceso se describe detalladamente en la figura 7.

Figura 7. Diagrama de flujo del protocolo seguido para la extracción y cuantificación de proteínas.

Fuente: Lowry et al. (1951) y Morales (2012).

30

3.2.6. Caracterización de la plasticidad fenotípica

3.2.6.1. Expresión del morfotipo: Unicelulares y cenobiales

Para analizar el patrón de cenobios en los tratamientos se extrajeron alícuotas de

0.2 mL al inicio de la fase exponencial y durante la fase estacionaria. Se colocaron

las muestras diluidas con agua destilada en la cámara de Neubauer y luego fueron

observadas en el microscopio óptico con objetivo de 40X. Se cuantificaron los

morfotipos: unicelulares o cenobial (2, 3, 4, 6 y 8 células) y se expresaron los

resultados con una valoración porcentual.

3.2.6.2. Dimensiones celulares

Para determinar el tamaño celular se realizó una captura de imagen obtenida con

microscopio óptico (Motic) y el programa OptikalSView, en el sexto día de los cultivos.

Las mediciones se realizaron mediante el programa Microscope Image Capture and

Measurement (MICAM) versión 1.6, registrando los datos de las medidas de longitud

y ancho de las células (μm) en base a 30 células seleccionadas aleatoriamente, y

tomando en consideración las recomendaciones descritas por Soares et al., (2017).

3.3. ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Los cultivos (control y tratamientos) se evaluaron por triplicado generando un total

de 30 unidades experimentales. Los resultados obtenidos con respecto a cada

variable fueron sometidos a un análisis de varianza (ANOVA) de múltiples muestras

estableciendo diferencias significativas con un nivel de significancia de p ≤ 0.05, con

excepción de aquellos obtenidos sobre la caracterización fenotípica en la expresión

del morfotipo unicelular y cenobial los cuales se expresaron de forma porcentual.

Se aplicó un análisis Post hoc de Contraste múltiple de rango, el cual permitió

identificar cuáles de las medias presentan diferencias significativas. Se realizó un

análisis de correlación entre los métodos para medir el crecimiento o densidad celular

(recuento celular, turbidez, clorofila total y biomasa seca). Para realizar todos los

análisis estadísticos se empleó el programa StatGraphics Plus versión 5.1 (2000).

Los resultados obtenidos se presentaron de acuerdo a los valores promedios junto

con las desviaciones estándares correspondientes.

31

CAPÍTULO IV

4.1. RESULTADOS

4.1.1. Crecimiento de los cultivos

4.1.1.1. Recuento celular

La máxima densidad celular se registró en los tratamientos del F1 (Menorel) al

séptimo día, siendo mayor en el F1C3 (31.83 ± 3.71x106 cel.mL-1), seguido por el

F1C2 (28.39 ± 4.12 x 106 cel.mL-1); mientras que el F3 (Nutri-leaf), alcanzó su máximo

crecimiento al quinto día con 17.45 ± 1.29 x 106 cel.mL-1. El control (BBM), alcanzó

su máximo crecimiento al sexto día con 8.31 ± 1.11 x106 cel.mL-1. En cambio, el menor

crecimiento se presentó en F2 (Kristalón) al quinto día, entre ellos el F2C2 con 2.26

± 0.33 x 106 cel.mL-1 (Figura 8).

Figura 8. Curvas de crecimiento (cel.mL-1) de los cultivos de Scenedesmus sp. RJ-3009 en los

tratamientos con fertilizantes agrícolas.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 1 2 3 4 5 6 7

Den

sid

ad c

elu

lar

( x1

06

cel.m

L-1)

Edad del cultivo (días)

Control F1C1 F1C2 F1C3 F2C1

F2C2 F2C3 F3C1 F3C2 F3C3

32

4.1.1.2. Turbidez

Los valores de densidad óptica mostraron una superioridad en el control (BBM),

con respecto a los demás tratamientos evaluados, registrando al séptimo día un valor

de 0.64 ± 0.07 a 750 nm, seguido de los tratamientos F1C3 (0.50 ± 0.04) y F1C2

(0.47 ± 0.03). Por su parte, el fertilizante Kristalón en todas sus concentraciones

obtuvo los valores más bajos, en el caso del tratamiento F2C2 solo alcanzó a 0,16

± 0.01 (Figura 9).

Figura 9. Turbidez medida por densidad óptica (750nm) de los cultivos de Scenedesmus sp.

UGB- RJ 3009.

4.1.1.3. Biomasa seca

En el control se produjo una mayor producción de biomasa (p<0.05) con 978.44 ±

89.22 mg.L-1; seguido del tratamiento F1C3, F3C3 y F1C2 con 755.56 ± 39.38, 600.00

± 36.32 y 586.11 ± 42.76 mg.L-1; respectivamente. Los tratamientos con el fertilizante

Kristalón (F2) en las tres concentraciones evaluadas demostraron ser los más bajos

(p<0.05), entre ellos F2C1 con 291.67 ± 44.10 mg.L-1 (Figura 10).

33

Figura 10. Biomasa seca (mg.L-1) en los cultivos de Scenedesmus sp. UGB-RJ-3009 al sexto día.

4.1.2. Pigmentos

La concentración de clorofila a fue alta en el control (2.02 ± 0.05 mg.L-1); así como

en los tratamientos con el fertilizante Menorel (F1). Entre ellos, F1C2 (2.16 ± 0.01

mg.L-1) y F1C1 (2.09 ± 0.05 mg.L-1), y a menores contenidos en F3C1 (1.38 ± 0.03

mg.L-1) y F2C1 (1.41± 0.16 mg.L-1).

La clorofila b y los carotenoides fueron significativamente mayores (p<0.05) en el

tratamiento F1C3 con 2.58 ± 0.18 mg.L-1 y 0.88 ± 0.03 mg.L-1; respectivamente.

El tratamiento F1C2 obtuvo valores similares con 2.28 ± 0.11 mg.L-1 y 0.88 ± 0.01

mg.L-1; ambos llegaron a superar al control (1.65 ± 0.12 mg.L-1 y 0.83 ± 0.00 mg.L-

1). En cambio, los tratamientos que obtuvieron valores relativamente bajos en el

contenido de clorofila a, b y carotenoides en comparación a los demás tratamientos

fueron F3C1 (1.38 ± 0.03 mg.L-1, 0.64 ± 0.02 mg.L-1 y 0.55 ± 0.02 mg.L-1;

respectivamente); mientras que en F2C1 se produjeron valores de 1.41 ± 0.16 mg.L-

1, 0.68 ± 0.15 mg.L-1 y 0.50 ± 0.06 mg.L-1 (Figura 11).

34

Figura 11. Concentración (mg.L-1) de Clorofila a, Clorofila b y carotenoides, en los cultivos de

Scenedesmus sp. UGB-RJ-3009.

4.1.3. Correlación entre parámetros de crecimiento

Los valores obtenidos entre los parámetros analizados permitieron identificar que

la correlación entre turbidez (DO 750 nm) y biomasa es la más alta con 0.96, seguido

de turbidez y clorofila total con 0.82. La correlación más baja se presentó entre

densidad celular por recuento y biomasa (Tabla 5).

Tabla 5. Correlación entre parámetros de crecimiento de Scenedesmus sp.

Parámetros de crecimiento

Densidad por recuento celular

Turbidez Clorofila

total Biomasa

Densidad celular por

conteo ------ 0.65 0.75 0.60

Clorofila total 0.75 0.82 ----- 0.79

Turbidez 0.65 ----- 0.82 0.96

Biomasa 0.60 0.96 0.79 -----

4.1.4. Carbohidratos

El contenido de carbohidratos fue más alto (p<0.05) en el control (159.389±15.26

mg.L-1), seguido de F1C3 con 124.934± 23.01 mg.L-1, y de F3C1 con 120.15±1.55

35

mg.L-1. Mientras que, entre los valores más bajos se hallaron en F2; de los cuales el

F2C2 y F2C3 mostraron los menores contenidos con 40.34± 1.08 y 40.43± 8.16

mg.L-1; respectivamente (Figura 12).

Figura 12. Contenido de carbohidratos (mg.L-1) al sexto día de edad de los cultivos.

4.1.5. Lípidos

La mayor concentración de lípidos (169.58 ± 23.59 mg.L-1), se registró en el control

(p<0.05), seguido por F1C3 (120 .21 ± 11.16 mg.L-1) y F1C2 (92.61± 5.37 mg.L-1); en

cambio el valor más bajo se obtuvo en F2C3 (60.85 ± 5.68 mg.L-1) (Figura 13).

36

Figura 13. Contenido de lípidos (mg.L-1) en los cultivos de Scenedesmus sp. UGB- RJ 3009 al sexto día.

4.1.6. Proteínas

La concentración de proteínas fue superior en F1C3 (556.74 ± 55.27 mg.L-1),

seguido por el tratamiento F1C2 con 463.89 ± 45.88 mg.L-1; los valores más bajos

(p<0.05), se hallaron en todos los tratamientos del F2 de los cuales el F2C2 y F2C3

mostraron las menores concentraciones (204.88 ± 14.26 mg.L-1 y 202.81 ± 52.42

mg.L-1) (Figura 14).

37

Figura 14. Contenido de proteínas (mg.L-1) en los cultivos de Scenedesmus sp. UGB-RJ-3009

Tabla 6. Valores obtenidos de los parámetros de crecimiento y macromoléculas (pigmentos,

carbohidratos, lípidos y proteínas) en los cultivos de Scenedesmus sp.UGB-RJ-3009 al sexto día.

Datos presentados con error estándar ± obtenido del promedio de las réplicas de los tratamientos.

Letras minúsculas indican diferencias entre los grupos con un nivel de significancia p<0.05

38

4.1.7. Caracterización de la plasticidad fenotípica

4.1.7.1. Formas unicelulares y cenobiales

El morfotipo unicelular predominó en los tratamientos con los fertilizantes F1 y F3

con un porcentaje superior al 90% en todas las concentraciones evaluadas (Anexo

5). En el control predominaron los morfotipos unicelulares (47%) y cenobiales de 4

células (48%). En los tratamientos con F2 existió una dominancia de colonias de 4

células (65%); mientras que las formas unicelulares tuvieron menor presencia (25%)

durante el cultivo (Figura 15 y 16).

b)

a)

c)

d)

Figura 15. Observación de Células de Scenedesmus sp. en los distintos medios de cultivo evaluados. a) Medio de control BBM, b) Medio con fertilizante Menorel o F1, c) Medio con fertilizante Kristalón o F2, d) Medio con fertilizante Nutri-leaf o F3.

39

Figura 16. Población de morfotipos (%) unicelulares y de cenobios (2, 3, 4 y 8 células) de

Scenedesmus sp. RJ-3009 en los diferentes tratamientos. a) Medio Control (BBM), b) F1 (Menorel), c) F2 (Kristalón) y d) F3 (Nutri-leaf).

4.1.7.2. Dimensiones celulares

En los tratamientos con el F1 las longitudes celulares fueron inferiores en

comparación con los valores obtenidos en los tratamientos del F2, F3 y el control

(Figura 17). La máxima longitud celular se registró en el control con 14.3 ± 2.7 µm y

en el F2C3 con 13.6 ± 1.2 µm y la mínima en el tratamiento F1C1 con 8.5 ± 1.6 µm.

40

Figura 17. Dimensiones celulares (µm) de Scenedesmus sp. UGB-RJ-3009.

41

DISCUSIÓN

A partir de los datos obtenidos en este estudio se demuestra que es viable la

sustitución de los medios de cultivo convencionales por alternativas de menor costo

como los fertilizantes agrícolas para el crecimiento de Scenedesmus sp. en cultivos

discontinuos; sin embargo, la producción de biomasa y su composición bioquímica

junto con la plasticidad fenotípica de las células varían dependiendo de la

composición química y las concentraciones de cada fertilizante evaluado.

En este estudio se registraron las máximas densidades celulares en el tratamiento

F1C3 al séptimo día (31.83 ± 3.71x106 cel.mL-1) superando los valores obtenidos por

Ortega y Reyes (2012), quienes registraron su máxima densidad celular al décimo día

(12 x104 cel.mL-1). Sin embargo, no se superó los valores obtenidos por Soares et al.

(2017), al décimo sexto día (7.3 ± 0.9x107 cel.mL-1); lo cual podría estar relacionado

a la utilización de CO2 y exposiciones más prolongadas de luz (16:8 luz-oscuridad).

Una de las principales características observadas en el recuento celular fue la

predominancia de formas unicelulares en los tratamientos con F1 (Menorel) y F3

(Nutri-leaf), lo que influye en los altos valores registrados, superando

significativamente al control; aunque, esto no representó una mayor producción de

biomasa en dichos tratamientos; puesto que la densidad celular por recuento presenta

una correlación baja con la biomasa seca (p=0.60). La baja correlación generada

entre la densidad por recuento celular y los demás parámetros de crecimiento fue

inducida por la variación en los porcentajes de formas cenobiales y unicelulares en

los distintos tratamientos.

Es importante la utilización de fertilizantes agrícolas que contengan

concentraciones adecuadas de nitrógeno y fósforo, y además es esencial la presencia

de elementos, como el azufre y magnesio; los cuales influyen en distintos procesos

metabólicos; siendo el magnesio un elemento fundamental por formar parte de la

estructura de la clorofila y por lo tanto estar involucrado en los procesos fotosintéticos

de captación de la luz (Silva-Benavides, 2016).

El crecimiento y la composición bioquímica de la biomasa de Scenedesmus sp.

demostraron mejores resultados en el fertilizante Menorel (F1), en comparación a los

42

demás tratamientos con los fertilizantes Kristalón (F2) y Nutri-leaf (F3), posiblemente

a que su composición química es más rica en nitrógeno y contiene azufre y magnesio;

los cuales se ausentan en los otros fertilizantes.

En los cultivos con fertilizante Kristalón (F2) 13-40-13, se observó un decaimiento

del pH en los cultivos; lo cual puede deberse a que algunos de estos compuestos

contienen un alto porcentaje de nitrógeno en su forma amoniacal, pese a que este

sea más asimilable para las microalgas en comparación a los nitritos y nitratos. No

obstante, las altas concentraciones de amonio generalmente llegan a provocar acidez

en los cultivos (Silva-Benavidez, 2016). De acuerdo a Bakuei et al. (2015) el efecto

de la acidez en los cultivos puede ocasionar diversas alteraciones en la célula de la

microalga. Además, de que ciertos procesos enzimáticos suceden a un pH específico,

generalmente para los procesos fotosintéticos son óptimos los niveles de pH entre 8

y 9. Sin embargo, ciertos valores de pH más alcalinos pueden dificultar la absorción

y asimilación de nutrientes. Esto explica de cierta forma el bajo rendimiento en los

medios de cultivo con F2, al presentar bajos valores (Anexo 4) en todos los

parámetros evaluados (crecimiento, producción de pigmentos, carbohidratos y

proteínas). A pesar de que el F3 tenía en su composición valores relativamente altos

de NPK, la ausencia de azufre y magnesio, pudieron limitar la producción de biomasa

y metabolitos primarios.

La variabilidad de morfotipos generados en los distintos medios de cultivo

demuestran que determinados elementos y componentes que son suministrados en

los medios nutritivos pueden jugar un papel clave en la plasticidad fenotípica de

Scenedesmus sp.; lo que concuerda con lo descrito por Egan y Trainor (1989),

quienes describieron una serie de factores en los que se genera una drástica

disminución en la formación de cenobios; tales como altas concentraciones de fósforo

y amonio (en pH alcalinos) , bajas densidades celulares del inóculo y determinados

niveles de irradiancia y temperatura. Por ejemplo, en Scenedesmus armatus

(Desmodesmus) se presenta un bajo número de células por cenobio cuando hay una

menor intensidad lumínica (Peña-Castro et al., 2004).

La abundancia de formas unicelulares en los cultivos con F1 (Menorel) y F3 (Nutri-

leaf), puede ser ocasionada debido a la presencia de altas concentraciones de amonio

en el contenido total de Nitrógeno. En cuanto a las dimensiones celulares, las

43

menores tallas se presentaron en el F1 que a su vez tenía una abundancia del

morfotipo unicelular; reportándose un caso similar en un estudio realizado por Soares

et al. (2017) en cuyos medios también se aplicaron fertilizantes con altas

concentraciones de amonio, lo cual ayuda a corroborar la hipótesis acerca del efecto

del amonio sobre la plasticidad fenotípica en los cultivos de Scenedesmus sp.

44

CONCLUSIONES

Se evaluó el efecto de tres fertilizantes agrícolas como medios nutritivos

alternativos para el cultivo de Secenedesmus sp. (UGB-RJ-3009), en comparación a

un medio convencional. Todos influyeron de diferente manera en el crecimiento y

composición de la biomasa producida.

Las repuestas en el crecimiento de Scenedesmus sp. en el F1C2 y F1C3

demuestran que su utilización es viable en la sustitución del medio estándar (BBM),

permitiendo disminuir el costo de producción de biomasa, llegando a reducir

aproximadamente entre 30 y 60 veces el gasto en el medio de cultivo lo cual

representa una ventaja para las producciones a gran escala.

Se cuantificó la producción de biomasa y el contenido de metabolitos primarios

(pigmentos, carbohidratos, lípidos y proteínas), encontrando en los tratamientos con

F1C2 y F1C3 los valores más cercanos a los obtenidos con el medio estándar, lo cual

al considerar el costo entre estos medios nutritivos resulta conveniente la utilización

del fertilizante F1.

Se determinó la respuesta de la expresión del morfotipo de la cepa estudiada con

cada medio de cultivo evaluado, observando que con el medio estándar se presentan

en proporciones similares las formas unicelulares y cenobios de 4 células; mientras

que con la utilización del F1 y F3 predominan las formas unicelulares. En cambio, en

el F2 hay una mayor formación de cenobios de 4 células. En cuanto a las dimensiones

celulares se encontró que existieron variaciones en la longitud y ancho de las células

dependiendo del tipo de fertilizante y la concentración aplicada, siendo más marcada

la disminución del tamaño en el F1.

De acuerdo a los resultados observados, F1C2 y F1C3, fueron los tratamientos que

presentaron los mayores valores (p<0.05) en los parámetros de crecimiento celular y

contenido de metabolitos primarios (Tabla 6), teniendo como comparación a los

demás medios de cultivo preparados en base a fertilizantes; siendo los más cercanos

a los resultados obtenidos con el medio control de laboratorio (BBM). Se concluye

que ambos tratamientos son recomendables para el cultivo de esta microalga como

una alternativa más económica para el crecimiento y la producción de biomasa

45

enriquecida con macromoléculas de alto valor en el cultivo de Scenedesmus sp.

UGB-RJ-3009.

46

RECOMENDACIONES

Se recomienda complementar el estudio evaluando otras variables como los

factores de intensidad lumínica, pH, temperatura, salinidad y adición de CO2

encontrando los rangos óptimos que potencien la producción de biomasa y los

componentes de interés.

Reproducir el estudio mediante la aplicación de escalamientos a mayores

volúmenes en condiciones ex situ y de laboratorio.

Determinar el sistema de cultivo que permita optimizar la producción de biomasa

de Scenedesmus sp.

Analizar la calidad de lípidos, proteínas y pigmentos caracterizando el perfil de

ácidos grasos, aminoácidos y la caracterización de carotenoides.

Realizar un estudio para identificar el o los factores que impiden la formación de

cenobios en Scenedesmus sp.

47

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strain.pdf

58

ANEXOS

Anexo 1. Siembra de cultivos con Scenedesmus sp. UGB-RJ-3009

Anexo 2. Botellas con los medios de cultivo inoculados con Scenedesmus sp. con medios

nutritivos en base a fertilizantes en tres concentraciones y un control

59

Anexo 3. Lectura de estándares en el espectrofotómetro para la elaboración de la curva de

calibración de lípidos.

Anexo 4. Variación de pH en los cultivos con medios basados en fertilizantes y el control

Medios

nutritivosDia 0 Dia 5 Dia 6

Control 7 8.5 8.5

F1C1 6.5 7 7.5

F1C2 6.5 7 7

F1C3 6.5 8 7.3

F2C1 6.5 6 6

F2C2 6.5 5.5 5.8

F2C3 6.5 5.5 5.6

F3C1 6.5 8 6.6

F3C2 6.5 7 7

F3C3 6.5 7 7

60

Anexo 5. Tabla con los porcentajes de morfotipos unicelulares y cenobiales durante los días 0, 3,

4, 5, 6 y 7 en los cultivos con medios basados en fertilizantes y el medio control.

Morfotipo 0 3 4 5 6 7 0 3 4 5 6 7 0 3 4 5 6 7 0 3 4 5 6 7

Unicelular 22 54 44 46 44 47 32 99 98 97 98 97 20 28 25 23 27 26 23 93 94 95 95 96

Cenobio: 2 cel 14 1 3 6 6 5 13 1 1 2 1 2 10 8 10 8 7 7 13 2 3 3 2 2

Cenobio: 3 cel 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 2 1 1 0 0 0 1

Cenobio: 4 cel 64 44 51 48 49 47 55 0 0 0 1 1 69 59 62 64 63 63 64 3 3 2 2 1

Cenobio: 8 cel 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5 3 3 2 3 0 1 0 0 0 0

Control (BBM) F1 (C1, C2 y C3) F2 (C1, C2 y C3) F3 (C1, C2 y C3)

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