Trayendo a la vida una enzima. Por la dcada de 1950, los cientficos se dieron cuenta que el ADN contena el cdigo que permita la sntesis de protenas. Sin embargo, como una cadena de aminocidos se pliega en una protena funcional completa, sigue siendo un misterio. Debe existir un mecanismo que asegure el correcto plegamiento de la protena. Pero de dnde provino esa informacin? En 1957, Christian Anfinsen publico la primera evidencia de que la informacin para el correcto plegamiento estaba dentro de la protena misma. Background. Las protenas estn hechas por combinaciones de 20 aminocidos que luego se doblan en estructuras ms complejas. La cadena desenrollada de aminocidos es llamada estructura primaria. Para tener una actividad biolgica, la protena debe plegarse en las adecuadas estructuras secundaria y terciaria. Estas estructuras se mantienen unidas mediante interacciones qumicas entre las cadenas laterales de los aminocidos, incluyendo puentes de hidrogeno, interacciones hidrofbicas, y, a veces, enlaces covalentes. Durante mucho tiempo ha sido un misterio como se forman estas complejas estructuras. La protena se pliega correctamente mientras se est sintetizando o requiere la accin de otras protenas para su adecuado enrollamiento? Puede enrollarse por si misma espontneamente? En la dcada de los 50, Anfinsen era un bioqumico interesado en el correcto plegamiento de las protenas. El estaba investigando especficamente la formacin de puentes disulfuro, que son enlaces covalentes entre las cadenas laterales de la cistena (entre 2 molculas de cistena) los cuales sirven como unos de los mayores anclajes que mantienen unida la estructura de protenas que son secretadas por la clula (secretory protein). El crea que la propia protena contena toda la informacin necesaria para su adecuado plegamiento. El propuso la hiptesis termodinmica, la cual postula que la estructura biolgicamente activa de una protena tambin era la ms estable termodinmicamente, bajo condiciones in vivo. En otras palabras, si las condiciones intracelulares pudieran ser reconstruidas en un tubo de ensayo, entonces una protena se plegaria naturalmente en su estructura activa. Comenz su estudio en una enzima secretora, (que son secretadas por las clulas ya sea de forma endocrina o exocrina) la ribonucleasa pancretica bovina, y estudio su capacidad para enrollarse fuera de la de clula. El experimento. Las protenas desempean una extensa variedad de funciones en la clula. Independientemente de su funcin, una protena debe plegarse correctamente para llevar a cabo su rol biolgico. Para el estudio del enrollamiento de las protenas, es mejor usar una enzima cuya actividad biolgica pueda ser fcilmente monitoreada mediante la realizacin in vitro. Anfinsen escogi una pequea, protena secretora, la enzima ribonucleasa, en la que poda monitorear su correcto enrollamiento mediante el anlisis de su capacidad para producir la ruptura del ARN. La ribonucleasa, una protena secretada, es activa bajo condiciones oxidativas in vitro. La estructura terciaria de la ribonucleasa activa se mantiene unida gracias a 4 puentes disulfuro. Aadiendo un agente reductor, se reducen los enlaces disulfuro entre 2 lados de la cadena

lateral de la cistena a dos grupos sulfhidrilo, se pueden interrumpir los enlaces covalentes. La desnaturalizacin completa de la ribonucleasa requiere un tratamiento con un agente reductor. Anfinsen monitore la reduccin de la ribonucleasa midiendo el nmero de grupos sulfhidrilos libres presentes en la protena. En el estado oxidado, no hay grupos sulfhidrilos en la ribonucleasa, porque cada residuo de cistena esta unido por un enlace disulfuro. Por otro lado, en su mximo estado reducido, la ribonucleasa contiene 8 grupos sulfhidrilos libres. Anfinsen aprovech esta diferencia para medir la magnitud de la reduccin, usando un ensayo espectrofotomtrico para cuantificar el nmero de grupos sulfhidrilos. Para estudiar el plegamiento de la protena fuera de la clula, primero hay que desnaturalizar la protena. Las protenas son fcilmente desnaturalizadas por el calor, una separacin mecnica como agitar, y tratamientos qumicos. Las protenas con puentes disulfuros requieren otro tipo de tratamiento que contiene un agente reductor para romper los enlaces covalentes. Para desnaturalizar la ribonucleasa, Anfinsen primero redujo los puentes disulfuro con acido tiogliclico. Luego desnaturaliz la protena usando una alta concentracin de urea e incubando la solucin a temperatura ambiente. Demostr que este tratamiento deja inactivada a la enzima, ya que la ribonucleasa ahora era incapaz de producir el rompimiento del ARN. Us el ensayo espectrofotomtrico para demostrar que la ribonucleasa inactiva contena 8 grupos sulfhidrilo libres, que correspondan a los 4 puentes disulfuros rotos. Con una protena completamente reducida y desnaturalizada en mano, Anfinsen se pregunt: Una enzima desnaturalizada puede volver a su correcta estructura plegada y volverse activa otra vez? Para hallar la respuesta, Anfinsen dej que una solucin reducida y desnaturalizada de ribonucleasa, se oxidara. Removi la urea de la enzima desnaturalizada mediante precipitacin. A continuacin, resuspendi la desnaturalizada ribonucleasa sin urea enuna solucin buffer incubndola en esta por 2 o 3 das. La exposicin al oxgeno molecular en la atmsfera, oxid los residuos de cistena. Posteriormente, compar la actividad de la ribonucleasa re naturalizada con la enzima original. En los experimentos iniciales, 12-19% de la protena anteriormente inactiva fue capaz de producir la ruptura del ARN nuevamente. Los agregados de protenas en altas concentraciones, hacen que su correcto plegamiento sea ms difcil de cumplir. Disminuyendo casi totalmente la concentracin de ribonucleasa en la concentracin, Anfinsen mostr que el 94% de la protena poda ser replegada. La enzima se volvi plegar a su forma activa fuera de la clula, demostrando que la informacin para este adecuado plegamiento est contenida en la propia protena. Discusin A travs de cuidadosos experimentos, Anfinsen demostr que la informacin para el debido plegamiento est contenida en su estructura primaria. Su cuidadoso anlisis de la qumica de este proceso respondi una interrogante fundamental en la biologa. l continu demostrando el re plegamiento libre de otras enzimas, incluyendo protenas sin puentes disulfuro. Mientras que es posible re plegar diferentes protenas fuera de la clula, fuera del proceso normal de estas dentro, este proceso es muy acelerado in vivo por otras enzimas. Anfinsen continu estudiando el problema del enrollamiento proteico. Aunque la hiptesis termodinmica no es aplicable para todas las protenas, la demostracin de Anfinsen del re

enrollamiento libre de la ribonucleasa dej una marca en el campo de la bioqumica. En 1972, Anfinsen recibi el premio nobel de qumica por su trabajo.