producciÓn y caracterizaciÓn de la enzima …
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PRODUCCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LA ENZIMA RECOMBINANTE FRUCTOSILTRANSFERASA DE
Aspergillus oryzae EN Pichia pastoris GS115.
LINA MARCELA BOTERO RUTE
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial para optar el título de
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
BOGOTA D.C.
2014
PRODUCCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LA ENZIMA RECOMBINANTE FRUCTOSILTRANSFERASA DE
Aspergillus oryzae EN Pichia pastoris GS115.
LINA MARCELA BOTERO RUTE
APROBADO
___________________
Concepción Puerta Bula, Bact, Ph.D
Decana académica Facultad de Ciencias
____________________
JANETH ARIAS M.Sc.
Directora carrera Microbiología Industria
PRODUCCIÓN Y CARACTERIZACION DE LA ENZIMA RECOMBINANTE FRUCTOSILTRANSFERASA DE
Aspergillus oryzae EN Pichia pastoris GS115
LINA MARCELA BOTERO RUTE
APROBADO
____________________________
CARLOS JAVIER ALMECIGA-DIAZ QF. PhD.
Director
_____________________________
EDWIN ALEXANDER RODRIGUEZ LOPEZ L.Q
Co-Director
______________________________
ADRIANA MATIZ VILLAMIL M.Sc.
Evaluador
NOTA DE ADVERTENCIA
ARTÍCULO 23 DE LA RESOLUCIÓN No.13 DE JULIO DE 1946
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus tesis.
Solo velará porque no se publique nada contrario al dogma y la moral católica y porque la tesis no
contenga ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo por
buscar verdad y justicia”
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo se construyó con el esfuerzo y dedicación de muchas personas A todos ellos. ¡Mil Gracias!
Agradezco infinitamente a mis Padres por permitirme haber culminado tan arduo trabajo. Agradezco a mis directores Javier y Alex, por compartir su conocimiento y amistad conmigo, por delegarme este gran proyecto y orientarme cuando las cosas parecían sin solución. Agradezco a Laura y Catalina por el apoyo incondicional durante cinco años, por noches de estudio y momentos felices. Agradezco con gran cariño a Natalia y Jhonny por la ayuda recibida, así como por la amistad formada por encima de todo; a Dennis por ser una mujer llena de conocimiento capaz de compartirlo con los demás al igual que sus opiniones. A Joko por enseñar que la constancia y paciencia dan frutos. Agradezco a mis amigos incondicionales Luisa y Felipe quienes me vieron lidiar con este trabajo, por no abandonarme, ayudarme y tratar de entender lo que esto representa para mí. A las toda la familia del IEIM las personas que me recibieron y a todos los que se han unido hasta este momento; vincularse a este Instituto fortalece la mente pero también forma como persona, mil gracias a todas las personas con las cuales compartí. Al Doctor Luis Alejandro Barrera, por mantener en pie esta gran Familia.
<<Experience is not what happens to you; it's what you
do with what happens to you.>>
Aldous Huxley
TABLA DE CONTENIDO
INTRODUCCIÓN .............................................................................................................................. 3
JUSTIFICACIÓN Y PLANTEAMIENTO ................................................................................................ 5
1. MARCO TEORICO ............................................................................................................... 6
1.1 PREBIOTICOS ............................................................................................................................. 6
1.1.1 FRUCTOOLIGOSACARIDOS ............................................................................................. 6
1.1.1.1 CARACTERISTICAS GENERALES ..................................................................................... 6
1.1.2 FRUCTOSILTRANSFERASA ................................................................................................... 7
1.2 Pichia pastoris ........................................................................................................................... 7
1.2.1 PRODUCCION DE FRUCTOSILTRANSFERASA RECOMBINANTE ............................................. 8
1.3 ANTECEDENTES ........................................................................................................................ 9
2. OBJETIVO GENERAL ........................................................................................................ 10
2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ......................................................................................................... 10
3. METODOLOGÍA .................................................................................................................. 11
3.1 OBTENCION DE CLONES DE P. pastoris GS115 TRANSFORMADOS CON EL VECTOR DE
EXPRESIÓN PORTANDO EL GEN DE LA ENZIMA FTasa JUSTIFICACIÓN ......................................... 11
3.1.1 GENERACIÓN PLÁSMIDO PPIC9-FTASAOPT TRANSFORMACION DE E.coli ........................ 11
3.1.2 TRANSFORMACION DE P. pastoris .............................................................................. 11
3.2 DETERMINACIÓN FENOTÍPICA DE LOS CLONES ................................................................... 12
3.3 TAMIZAJE DE LOS CLONES OBTENIDOS A ESCALA DE 10 Y 100 mL ........................................ 12
3.3.1 CULTIVO DE P.pastoris A ESCALA DE 10mL ................................................................... 12
3.3.2 CULTIVO DE P.pastoris A ESCALA DE 100mL ................................................................ 13
3.4 CARACTERIZACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE LA ENZIMA A ESCALA DE BIORREACTOR BAJO
DOS DIFERENTES CONDICIONES DE TEMPERATURA, EMPLEANDO EL CLON CON MAYORES
NIVELES DE PRODUCCIÓN OBSERVADA A ESCALA DE 100mL ....................................................... 13
3.4.1 CULTIVO DE P.pastoris A ESCALA DE BIORREACTOR .................................................... 13
3.5 CUANTIFICACIÓN DE BIOMASA, PROTEÍNA Y ACTIVIDAD ENZIMATICA ............................... 14
3.5.1 DETERMINACIÓN DE BIOMASA, MÉTODO CUANTITATIVO ........................................... 14
3.5.2 DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA ................................................................................... 14
3.5.3 DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA FTASA .................................................. 14
3.5.4 DETERMINACIÓN DE PROTEASAS ................................................................................ 15
3.5.5 EVALUACIÓN ACTIVIDAD FTASA EN EL PERIPLASMA .................................................... 15
3.6 DETERMINACIÓN DE AZUCARES ........................................................................................ 15
3.6.1 CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA (TLC) ........................................................................ 15
3.7 DETERMINACIÓN DE TASAS, RENDIMIENTOS Y PRODUCTIVIDADES ...................................... 15
3.7.1 DETERMINACIÓN DE TASA DE CRECIMIENTO Y TASA DE PRODUCCIÓN ........................ 15
3.7.2 DETERMINACIÓN DE LOS RENDIMIENTOS PRODUCTO/BIOMASA, ACTIVIDAD
ESPECÍFICA/BIOMASA, BIOMASA/SUSTRATO Y PRODUCTO/SUSTRATO ......................................... 16
3.7.3 DETERMINACIÓN DE LAS PRODUCTIVIDADES DE BIOMASA Y DE PROTEÍNA .................. 16
3.8 ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS (SDS-PAGE) .................................................................... 17
4. EFECTO DE DIFERENTES CONDICIONES DE PH, TEMPERATURA, TIEMPO DE INCUBACIÓN Y
CONCENTRACION DE SACAROSA SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA ENZIMA REMBINANTE FTASA ...... 17
5. RESULTADOS ................................................................................................................. 18
5.1 OBTENCION DE CLONES DE P.pastoris GS115 TRANSFORMADOS CON EL VECTOR DE
EXPRESION PORTANDO EL GEN DE LA ENZIMA FTASA ............................................................... 18
5.2 DETERMINACIÓN FENOTIPICA DE LOS CLONES ....................................................................... 21
5.3 TAMIZAJE DE LOS CLONES OBTENIDOS MEDIANTE CULTIVOS A ESCALA DE 10 Y 100mL ........ 21
5.3.1 CULTIVO DE P.pastoris A ESCALA DE 10mL .................................................................... 21
5.3.2 CULTIVO DE P.pastoris A ESCALA DE 100mL................................................................... 24
5.4 PRODUCCIÓN DE LA ENZIMA A ESCALA DE BIORREACTOR BAJO DOS DIFERENTES
CONDICIONES DE TEMPERATURA, EMPLEANDO EL CLON CON MAYORES NIVELES DE
PRODUCCIÓN OBSERVADA A ESCALA DE 100mL ...................................................................... 25
5.4.1 CULTIVO DE P.pastoris PARA LA PRODUCCIÓN DE FRUCTOSILTRANFERASA CON
TEMPERATURA DE 28°C ................................................................................................................ 26
5.4.2 CULTIVO DE P.pastoris PARA LA PRODUCCION DE FRUCTOSILTRANSFERASA CON
TEMPERATURA DE 20°C ................................................................................................................ 27
5.5 DETERMINACION DE PROTEASAS .......................................................................................... 29
5.6 CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA (TLC) ................................................................................. 29
5.7 ELECTROFORESIS SDS-PAGE .............................................................................................. 30
5.8 DETERMINACION DE TASAS, RENDIMIENTOS Y PRODUCTIVIDADES ..................................... 31
5.8.1 DETERMINACION DE TASA DE CRECIMIENTO Y DE TASA DE PRODUCCIÓN ................... 31
5.8.2 DETERMINACION DE LOS RENDIMIENTOS BIOMASA/PRODUCTO, ACTIVIDAD
ESPECIFICA/ BIOMASA, BIOMASA/SUSTRATO Y PRODUCTO/SUSTRATO .................................... 32
5.9 CARACTERIZACIÓN DE LA ENZIMA FTASA POR PH, TEMPERATURA DE REACCIÓN, TIEMPO DE
REACCIÓN Y CONCENTRACIÓN DE SACAROSA PARA DETERMINAR LA ACTIVIDAD ÓPTIMA ........ 33
6. DISCUSIÓN ......................................................................................................................... 34
CONCLUSIONES ..................................................................................................................... 40
RECOMENDACIONES .................................................................................................................... 40
REFERENCIAS ................................................................................................................................ 41
ANEXOS ........................................................................................................................................ 45
LISTA DE TABLAS Y FIGURAS
Figura 1. Electroforesis que muestra el plásmido linealizado con EcoRI. Carriles marcados como 1,
3, 4, 5, y 6. 18
Figura 2: Plásmido de transporte con el gen FTasa 18
Figura 3. Digestión enzimática con EcoRI y XhoI. Carril 1 pPIC9, Carril 2 12ABHHEC_FTasa_pMA, la
banda inferior corresponde al gen FTasaopt. 19
Figura 4. Electroforesis. Carriles 4 y 5 que muestra ADN plásmidico correspondiente pPic9-
FTasaopt. 19
Figura 5. Digestión del plásmido pPic9-FTasaopt con enzimas de restricción. Carril uno: Bgl II. Carril
dos: Stu I. 20
Figura 6: Plasmido pPIC9 (Invitrogen),Izquierda. Plásmido Ppic9+FTasa. Derecha 21
Figura 7. Determinación fenotípica de los clones P. pastoris pPic9-FTasaopt. A: Control Mut+, B: clon
P. pastoris pPic9-FTasaopt, C: Control Muts. Resultados similares se observaron para todos los
clones evaluados. 21
Figura 8: Evaluación de los clones pFTa1 a pFTa5 a escala de 10mL A) Biomasa, B) concentración
de proteína, C) Actividad FTasa específica, D) Actividad FTasa volumétrica. 22
Figura 9: Evaluación de los clones pFTa6 a pFTa10 a 10mL A) Biomasa, B) concentración de
Proteína, C) Actividad Específica, D) Actividad Volumétrica. 23
Figura 10:. Evaluación de los clones pFTa11 a pFTa15 a 10mL A) Biomasa, B) concentración de
Proteína, C) Actividad Específica, D) Actividad Volumétrica 24
Figura 11: Evaluación de los clones pFTa5, 8, 9, 11 y 13a 100mL A) Biomasa, B) concentración de
Proteína, C) Actividad Específica, D) Actividad Volumétrica. 25
Figura 12: Evaluación actividad FTasa en el periplasma. La actividad FTasa fue evaluada en el
periplasma de los clones de P. pastoris estudiados a escala de 100 mL. Rojo: actividad FTasa
secretada obtenida sin los esferoplastos, verde: actividad FTasa en el periplasma. Para todos los
clones se evaluó la hora cero de inducción y la de máxima actividad extracelular. 26
Figura 13: Grafica integrada cultivo del clon pFTa5 P.pastoris GS115 a escala de 1,7L y
temperatura de 28°C durante la fase de inducción. 27
Figura 14: Grafica integrada cultivo del clon pFTa5 P.pastoris GS115 a escala de 1,7L y temperatura
de 20°C durante la fase de inducción. 28
Figura 15: Grafica integrada de actividad específica y actividad volumétrica para los cultivos de
P.pastoris GS115 a 28 °C (A) y 20°C (B). 28
Figura 16: Grafica integrada de la actividad proteolítica del cultivo del clon pFTa5 P.pastoris GS115
a escala de 1,7L y a dos condiciones de temperatura 28 °C (A) y 20 °C (B). 29
Figura 17: Análisis de carbohidratos mediante Cromatografía de Capa delgada. A: muestras cultivo
clon FTa5 a 28°C. B: muestras cultivo clon FTa5 a 20°C. Glu: Glucosa, Sac: Sacarosa, Raf: Rafinosa,
Fruc: Fructosa 30
Figura 18: Cromatografía de Capa delgada. GF2: 1-Kestosa, GF3: Nistosa, GF4: Fructofuranosil
nistosa, Sac: Sacarosa, Fruc: Frucosa, Glu: Glucosa. 30
Figura 19: Electroforesis de proteínas SDS-PAGE. Imagen izquierda: Cultivo a 28°C, Imagen
derecha: Cultivo 20°C. PM: Peso molecular. 31
Figura 20: Grafica integrada de Tasa de Crecimiento y tasa de productividad para los cultivos de
dé P. pastoris GS115 a dos condiciones de temperatura 28 y 20°C. A: Tasa de Crecimiento (h-1). B:
Tasa de producción (mg proteína/g biomasa/h). 31
Figura 21: Graficas integradas de Rendimientos y productividades para los cultivos de P. pastoris
GS115 a dos condiciones de temperatura 28 (A) y 20°C (B). 32
Figura 22: Grafica integrada de productividades biomasa y proteína para los cultivos de P. pastoris
GS115 a dos condiciones de temperatura 28 y 20°C. 33
Figura 23: Caracterización de la enzima a diferentes condiciones de pH, temperatura,
concentración de sacarosa y tiempo de reacción. Por filas A,B y C: pH 4; D,E y F: pH 5,5; G, H e I:
pH 7. Líneas: Verde(1 h), roja (4 h), azul (12h), rosado (24h). 34
1
RESUMEN
Los fructooligosacaridos (FOS) son considerados como compuestos funcionales en la dieta, los
cuales se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza. Estos estimulan el crecimiento de
bifidobacterias en el tracto grastrointestinal, y se ha descrito su importancia en la prevención de
enfermedades crónicas como el cáncer, mejoramiento del sistema inmune y de la salud
gastrointestinal. Los FOS están conformados por una unidad de glucosa unida a varias unidades de
fructosa por enlaces β-2, 1; siendo los más importantes la 1-kestosa (GF2), nistosa (GF3) y
fructofuranosil nistosa (GF4). Los FOS son sintetizados por fructosiltranferasas (FTasas), las cuales
están presentes en una amplia variedad de organismos. El uso de enzimas recombinantes se
presenta como una alternativa para suplir la necesidad de obtener grandes catidades de enzima
para sintetizar estos compuestos. En este proyecto se realizó la producción de la enzima
recombinante FTasa de Aspergillus oryzae N74, previamente aislado de ensilaje de caña de azúcar
en la región de La Peña (Colombia), en forma recombinante mediante la levadura Pichia pastoris.
A diferencia de trabajos previos, en este proyecto se empleó una versión del gen ftasa optimizada
en cuanto a su uso de codones para expresión en P. pastoris. El gen optimizado fue insertado en el
vector de expresión pPIC9 y usado para transformar células competentes de P. pastoris GS115. Se
obtuvieron 15 clones los cuales fueron tamizados a escala de 10, 100 ml, lo que permitió la
selección del clon Fta5 para su evaluación a escala de 1,7L, bajo dos condiciones diferentes de
temperatura durante la etapa de inducción (28 y 20°C). Los resultados mostraron un aumento de
93,5 y 74 veces en la actividad enzimática en el cultivo de 28 y 20°C, respectivamente, con
respecto a los valores reportados previamente empleando el gen ftasa nativo. La evaluación
cualitativa de los FOS mediante cromatografía de capa delgada sugiere que la enzima FTasa
recombinante es capaz de sintetizar GF2, GF3 y GF4. Finalmente, se estudiaron diferentes
condiciones de reacción de la enzima FTasa recombinante, encontrando que los mayores valores
de actividad se presentan con sacarosa 1,7M, a 45°C, pH 4, y 4 horas de reacción, lo cual es similar
a lo reportado previamente para la enzima nativa. Estos resultados representan información
valiosa para el desarrollo de procesos de producción de FOS en nuestro país empleando enzimas
recombinantes.
2
ABSTRACT
Fructooligosaccharides (FOS) are considering as components of functional foods. These
compounds are widely distributed in nature, which promote the growth of bifidobacteria in the
gastrointestinal tract. Recently, it has been described the importance of these compounds as
promoters of mechanisms in chronic diseases prevention, as cancer, as well as enhancement of
immune and gastrointestinal health. FOS are build up by one unit of glucose and several units of
fructose, linked by β-2,1 bonds. The most important FOS are 1-kestose (GF2), nystose (GF3) and
fructofuranosyl nystose (GF4). FOS are synthetized by fructosyltransferases (FTases), which are
present in a wide range of organisms. The growing interest in the use of these compounds has
shown the need to identify FTase high production yields and to produce high amounts of these
enzymes. The production of recombinant proteins is an alternative to supply these large quantities
of enzymes for FOS synthesis.
In this work, it was performed the production of the recombinant FTase from Aspergillus oryzae
N74, previously isolated from ensilage sugar cane in La Peña (Colombia), by using the yeast Pichia
pastoris. In contrast to previously works, in this project it was used an optimized version of the
FTase gene, using the codon-usage of P. pastoris.
The optimized FTase gene was inserted in the expression vector pPIC9; which was used to
transform P. pastoris GS115. After yeast transformation, 15 clones were obtained, which were
screened at 10 and 100mL scales. pFTa5 clone showed the highest enzyme activity levels at these
scales and was selected to be scaled up at 1,7L scale. Two different temperatures (28 and 20°C)
during induction stage were evaluated at this bioreactor scale. The results showed an increase of
93.5- and 74-fold in the enzyme activity at 28°C and 20°C, respectively, in comparison to the values
reported with the native FTase gene. The qualitative assays of FOS by Thin Layer Chromatography
suggested the ability of the recombinant FTase enzyme to synthetize GF2, GF3 and GF4. Finally,
different reaction conditions of recombinant FTase enzyme were studied, showing that the highest
enzyme activity values were obtained with Sucrose 1.7M (60%), 45 °C, pH 4, and 4 h of
reaction. This data is similar to that reported for the native enzyme. In summary, these results
present valuable information towards the development of process for the production of FOS in our
country by using recombinant FTases
3
INTRODUCCION
Los fructooligosacaridos (FOS) son polímeros formados por unidades fructosilo (F) unidas
mediante enlaces β-2,1 con una unidad de D-glucosa (GF). Entre los principales FOS se
encuentran la 1-kestosa (GF2), nistosa (GF3) y 1-β-fructofuranosilnistosa (GF4), los cuales se
diferencian en el grado de polimerización. Sin embargo, otros FOS pueden constar hasta de 200
unidades de fructosa (Sangeethaa et al, 2005; Yun 1996). Naturalmente los FOS se encuentran en
diversos organismos como cianobacterias, algas verdes y una amplia variedad de plantas a modo
de reserva de carbohidratos. Entre los alimentos con mayor concentración de FOS se encuentran
frutas y vegetales como banano, cebada, ajo, cebolla, centeno, tomate, raíces de espárragos, entre
otras. Por otro lado, los FOS pueden ser producidos por variedad de hongos y levaduras como
Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Fusarium oxysporum, Saccharomyces cerevisiae,
Schizosaccharomyces pombe; y por bacterias, como Arthrobacter sp., Bacillus sp., Streptococcus sp
(Sangeethaa, 2003). Los FOS no pueden ser hidrolizados por las enzimas digestivas del tracto
gastrointestinal de la mayoría de mamíferos, pero son metabolizados por bacterias prebióticas
como Bifidobacterium y Lactobacillus. Debido a esta propiedad, su uso se ha incrementado
durante la última década, siendo de principal interés en la industria de alimentos y farmacéutica
como prebióticos y edulcorantes. Además de poseer propiedades de bajo aporte calórico,
favorecen la reducción de los niveles de colesterol, triglicéridos y fosfolípidos, también se han
denominado como componentes clave en suplementos nutricionales, bebidas funcionales y
cosméticos (Roberfroid and Delzenne, 1998; Roberfroid, 2007; Guio et al, 2009).
Los FOS son producidos por enzimas con actividad de transfructolisación las cuales son
denominadas fructosiltransferasas (FTasas) (E.C. 2.4.1.9), también conocidas como β-
fructofuranosidasas. Los microorganismos con capacidad de sintetizar fructanos utilizan como
principal sustrato la sacarosa para realizar la transferencia de fructosa. Sin embargo, el mecanismo
de reacción de la FTasa depende de la fuente de extracción. En general, las FTasa actúan sobre la
sacarosa en una reacción no proporcional donde una molécula de sacarosa sirve como donador y
otra como aceptora (Yun et al, 1996).
El creciente interés en la producción de FOS ha llevado a la búsqueda de FTasas con altas tasas de
producción, como es el caso de la FTasa de la cepa Aspergillus oryzae N74 aislada de un cultivo de
4
caña en Colombia (Sánchez et al, 2008). El gen que codifica para la enzima FTasa de A. oryzae N74
fue clonado y caracterizado, con el objetivo de realizar la producción recombinante de dicha
enzima (Rodriguez et al, 2011). A pesar de los niveles de producción obtenidos con esta cepa, el
cultivo del hongo presenta desafíos desde el punto de vista del bioproceso, lo que limita su uso
para la producción industrial de esta enzima. Como una alternativa a la producción de esta
enzima, en este proyecto se evaluó la producción de la enzima recombinante FTasa de A. oryzae
N74 empleando la levadura metilotrófica Pichia pastoris GS115. Esta levadura posee una gran
ventaja en comparación con otros sistemas de expresión de proteínas recombinantes, como la
capacidad de secretar la proteína al medio de cultivo, emplear medios de cultivo económicos,
realizar modificaciones postraduccionales similares a las observadas en otros eucariotas, y ser
fácilmente manipulable desde el punto de vista genético y del bioproceso (Kalidas, 1999).
Específicamente, este proyecto se realizó en cuatro etapas: 1) Construcción del vector del
expresión y transformación de las levaduras, 2) tamizaje de los clones a escalas de 10 y 100 mL, y
3) producción de la enzima a escala de biorreactor (1,65 L) y 4) caracterización de la enzima.
5
JUSTIFICACION Y PLANTEAMIENTO
El creciente interés en la producción de alimentos y compuestos funcionales ha llevado un
marcado aumento en la busca de alternativas para su producción. Los FOS se encuentran dentro
de estos compuestos funcionales y su producción en el mundo se ha ido expandiendo en los
últimos años. La producción de FOS se realiza a través de cepas de hongos productores de la
enzima FTasa. Sin embargo, el cultivo de dichos hongos presenta una serie de obstáculos desde el
punto de vista del bioproceso como la heterogeneidad en la transferencia de calor y de oxígeno, y
los cambios en la reología del cultivo, que limitan su aplicabilidad desde el punto de vista
industrial. Una alternativa para superar este inconveniente es la de realizar la producción de la
enzima de forma recombinante en un organismo con mayor facilidad de manipulación y que
permita un posterior escalado de una manera más sencilla. Por tanto, este proyecto busca realizar
la producción recombinante de la enzima FTasa empleando la levadura Pichia pastoris, la cual es
uno de los sistemas de producción de proteínas recombinantes más caracterizados, esto como un
paso preliminar hacía la producción industrial de FOS en nuestro país.
6
1. MARCO TEORICO
1.1 Prebióticos
Los prebióticos son ingredientes dietéticos que tienen como principal función mejorar la flora
intestinal confiriendo beneficios para la salud. A diferencia de los probióticos, estos pueden ser
añadidos a productos que necesiten calor para su elaboración (Blatchford et al, 2013). Los
prebióticos no pueden ser hidrolizados ni absorbidos por el tracto gastrointestinal, pero son
empleados como sustrato por bacterias benéficas especialmente Lactobacilos y Bifidobacterias,
estimulando su crecimiento en el colon (Muñoz, 2012). Actualmente son descritos como
carbohidratos de cadena corta no digeribles con grados de polimerización que abarcan entre dos y
sesenta unidades de glucosa (Cummings, 2002). Como prebióticos existentes en el mercado se
encuentran los fructooligosacaridos (FOS), galactooligosacaridos (GOS) y los tipos inulina (Muñoz,
2012. Blatchford et al, 2013). Sin embargo, también se pueden caracterizar según su origen: en el
primer caso mediante la extracción de recursos naturales como las plantas seguida por la acción
de enzimas hidrolíticas donde se encuentran oligosacáridos de soya, xilooligosacaridos,
maltooligosacaridos entre otros, o en el segundo caso por la acción de enzimas transferasas como
transgalactooligosacaridos y fructooligosacaridos (Van loo et al, 1999).
Entre los principales efectos del consumo de prebióticos se encuentra el fortalecimiento de
colonización sobre la flora intestinal, la resistencia a invasión por patógenos y a las enfermedades
causadas por diarrea. Por otra parte se han realizado un mayor número de estudios en modelos
animales con el fin de establecer otro tipo de efectos benéficos tales como, la producción de
ácidos grasos de cadena corta y lactato durante la fermentación en el intestino grueso, el
incremento en la formación de biofilms junto con comunidades planctónicas y el mejoramiento en
la absorción de calcio, magnesio y hierro en el intestino delgado (Cummings, 2002; Guio et al,
2009).
1.1.1 Fructooligosacaridos
1.1.1.1 Características generales
Los FOS son descritos como fructanos que estimulan el crecimiento de Bifidobacterias en el tracto
gastrointestinal humano. Los FOS se han descrito como compuestos de bajo contenido calórico,
7
con propiedades no carcinogénicas, útiles en la absorción intestinal de calcio y magnesio, así
como en la reducción de los niveles de fosfolípidos, triglicéridos y colesterol en el plasma, además
de ser útiles en la formulación de productos para diabéticos (Guio et al, 2009). Los FOS son
oligopolimeros que están formados por enlaces β-2,1 entre D-Fructosa (F) a una unidad de D-
glucosa (G). Los FOS más utilizados son principalmente 1-kestosa (GF2), nistosa (GF3) y 1-β-
fructofuranosilnistosa (GF4), los cuales varían en la cantidad de unidades de fructosa que están
presentes en el polímero (Sangeetha et al, 2005; Yun 1996; Muñoz 2012). Comúnmente los FOS se
pueden encontrar en alimentos como: avena, miel, cebolla, ajo, banano (Roberfroid, 2007),
espárragos, remolacha, cebada y centeno. (Sangeetha et al, 2005). Sin embargo, existen
microorganismos con actividad de transfructolisación que pueden ser empleados para la
producción de FOS; entre los que se encuentran especies de hongos como Aspergillus,
Aureobasidium, Penicillium y Fusarium, también existen algunas bacterias como Arthobacter,
Zymomonas y Bacillus. En microorganismos, la síntesis de los FOS requiere la acción de la enzima
Fructosiltransferasa (FTasa) (E.C. 2.4.1.9), la cual actúa sobre moléculas de sacarosa donde una
molécula de sacarosa sirve como donador y otra como aceptor de las unidades de fructosa (Guio
et al, 2009; Almeciga et al, 2011).
1.1.2 Fructosiltransferasa
La enzima fructosiltransferasa hace parte de las enzimas de microorganismos productores de FOS,
estas poseen una actividad óptima a pH 4.5-7.5, temperaturas óptimas entre 50 a 60 °C, con
rango de concentración de sacarosa de 5-770,4 mmol l-1. (Velázquez-Hernández et al, 2009). La
acción de las FTasas se da por la actividad de transfructolisación actuando en una molécula de
sacarosa rompiendo el enlace β-1,2 y transfiriendo un grupo de fructosil a una molécula aceptora
como sacarosa liberando glucosa. La actividad de la FTasa se ha definido como la cantidad de
enzima capaz de transferir 1µmol de fructosa por minuto o la cantidad de enzima capaz de liberar
1µmol de glucosa por minuto (Maiorano et al, 2008)
1.2 Pichia pastoris
Pichia pastoris es una levadura metilotrófica ampliamente utilizada como sistema de expresión
para proteínas heterologas, posee ventajas sobre otras especies de levaduras, como
Saccharomyces cerevisiae por su habilidad de realizar glicosilaciones similares a las modificaciones
en células humanas, también tiene capacidad de secretar proteínas de manera más eficiente y su
8
habilidad de crecer en medios definidos obteniendo mayor rendimiento mediante el promotor
alcohol oxidasa 1 AOX1, regulado por metanol; esta ventaja asegura una disminución en la
secreción de proteínas endógenas (Niu et al, 2013, Córdoba et al, 2003). Adicionalmente resulta
fácil manipular genéticamente a P. pastoris (orientación de genes, transformación de DNA, y
clonación por complementación funcional) (Cereghino et al, 2002), por lo que la hace apta para la
expresión de proteínas recombinantes. Dicha expresión está vinculada a rutas de secreción
intervenidas por péptidos señales lo cual simplifica la fase de purificación. Los niveles de expresión
superan el 80% del total de la proteína (Potvin et al, 2012). Más de 400 proteínas han sido
producidas por este sistema de expresión desde, endostatina recombinante humana hasta
proteína de seda de araña (Cereghino et al, 2002).
Existen tres fenotipos de P. pastoris dependientes del uso de metanol. El primero es el fenotipo
Mut+ donde el gen AOX1 es completamente funcional y crece de manera igual a la cepa silvestre
en metanol, sin embargo requiere de grandes cantidades del mismo durante el cultivo, a baja
concentración, esto genera una dificultad en el manejo de escalado además de una posible
competencia entre la expresión del gen AOX y el funcionamiento celular, reduciendo el
rendimiento. El segundo fenotipo es Muts donde el gen AOX1 es reemplazado por el constructo de
expresión y el crecimiento se ve limitado a la expresión del gen AOX2; las limitaciones por oxigeno
disminuyen gracias a la baja rapidez de crecimiento. El tercer fenotipo es Mut- donde las cepas no
expresan ninguno de los genes AOX y por lo tanto son incapaces de crecer en metanol (Potvin et
al, 2012)
1.2.1 Producción de Fructosiltransferasa recombinante
Poco se ha descrito acerca de la producción de la enzima Fructosiltransferasa recombinante en
sistemas de expresión como Pichia pastoris; sin embargo, se ha reportado el uso de Escherichia
coli y Saccharomyces cerevisiae como sistemas de expresión para FTasa. Heyer y Wendenburg en
el 2001 clonaron el gen correspondiente de la FTasa de Aspergillus sydowi IAM 2544 para
expresarlo en dichos sistemas; como resultado los niveles de expresión fueron menores a los
obtenidos de manera recombinante en plantas de papa (Heyer & Wendenburg, 2001).
Chuankhayan et al en el 2010, clonaron el gen de la FTasa obtenido de Asperigullus japonicus
CB05, para su producción de manera recombinante en E.coli; sus resultados mostraron la
producción de FOS de 3-6 grados de polimerización (1-kestosa, nistosa y 1-β-
9
fructofuranosilnistosa) (Chuankhayan et al, 2010). Para el caso de P. pastoris en el 2012 Díaz y
Beltrán realizaron la expresión del gen nativo de FTasa de A. oryzae N74 obteniendo valores
superiores de actividad en escala de 100mL. (Díaz & Beltrán, 2012)
Según lo reportado en literatura, la producción de oligosacáridos en general se han obtenido por
tres métodos distintos; el aislamiento y obtención a partir de plantas, por vía enzimática por el uso
de microorganismos y por degradación enzimática de polisacáridos (Crittenden & Playne, 1996).
Sin embargo, para la producción de FTasa recombinante se han realizan en mayor proporción en
plantas tales como: raigrás perenne (Gadegaard et al, 2008) transformadas con dos genes
pertenecientes a la cebolla (Allium cepa) y plantas de papa (Solanum tuberosum) transformadas
con el gen de Aspergillus sydowi IAM 2544 (Heyer et al, 2001).
1.3 Antecedentes
Entre los antecedentes se encuentran trabajos realizados previamente con la cepa A. oryzae N74.
En el 2006 Sánchez et al, aisló esta cepa a partir de ensilaje de caña de azúcar en La Peña
(Colombia) mostrando altos rendimientos en actividad de transfructosilación (Sánchez, 2006). En
el 2008 se realizó la producción de FOS en un biorreactor con agitación mecánica (Sánchez et al,
2008), y posteriormente se realizó la clonación y caracterización del gen de la enzima FTasa de
esta cepa (Rodríguez et al, 2011). Finalmente, en 2012 Díaz y Beltrán realizaron la expresión del
gen nativo de FTasa de A. oryzae N74 en la levadura metilotrófica Pichia pastoris evaluando
concentraciones de oxígeno disuelto y concentraciones de metanol con el fin de seleccionar las
condiciones adecuadas de producción para la enzima. Los resultados mostraron que a condiciones
de 1,3% metanol y 25% OD se obtenían los mayores valores de actividad FTasa (Díaz & Beltrán,
2012)
10
2. OBJETIVO GENERAL
Caracterizar los niveles de producción de la enzima recombinante fructosiltransferasa de
Aspergillus oryzae en Pichia pastoris GS115
2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Obtener clones de P. pastoris GS115 transformados con el vector de expresión portando el
gen optimizado de la enzima FTasa de Aspergillus oryzae N74, para obtener la enzima de
forma recombinante.
2. Seleccionar los clones obtenidos mediante cultivos a escala de 10 y 100mL para elegir el
clon a escalar en biorreactor.
3. Caracterizar la producción de la enzima a escala de biorreactor bajo dos condiciones de
temperatura en el bioproceso, empleando el clon con mayores niveles de producción
observada a escala de 100mL.
4. Evaluar el efecto de diferentes condiciones de pH, temperatura, tiempo de incubación y
concentración de sacarosa sobre la actividad de la enzima recombinante FTasa.
11
3. METODOLOGIA
3.1 Obtención de clones de P. pastoris GS115 transformados con el vector de expresión
portando el gen de la enzima FTasa
3.1.1 Generación plásmido pPIC9-FTasaopt Transformación de E.coli.
El gen de la enzima FTasa de Aspergillus oryzae N74 fue optimizado en su uso de codones para
expresión en P. pastoris empleando las herramientas de GeneArt (Life Technologies). El gen
FTasaopt fue sintetizado por la compañía GeneArt. El plásmido recombinante
(12ABHHEC_FTasa_pMA) fue insertado en células competentes Escherichia coli DH5α mediante
protocolo de choque térmico. A las colonias resultantes se les realizo extracción de ADN
plasmídico con el protocolo de miniprep (Anexo 1). El plásmido fue confirmado mediante
restricción con la enzima EcoRI y el producto se visualizó por electroforesis en gel de agarosa 1%.
Para la obtención del plásmido recombinante pPIC9-FTasaopt, el plásmido FTasa_pMA (que
contiene el gen FTasaopt sintetizado) y el plásmido pPIC9 (Life Technologies) fueron digeridos con
las enzimas de restricción EcoRI y XhoI. Los productos de digestión fueron separados en gel de
agarosa al 1%. Las bandas correspondientes al gen FTasaopt y al vector pPIC9 linealizado fueron
purificadas con el estuche Silica Bead DNA gel Extration (Fermentas). Los fragmentos de ADN
purificados fueron ligados empleando el estuche Rapid DNA Ligation (Fermentas), y el producto de
ligación se utilizó para transformar células competentes de E.coli DH5α. Las colonias obtenidas
fueron sometidas a protocolo de miniprep y la correcta inserción del gen FTasaopt fue verificada
mediante digestión con las enzimas EcoRI yXhoI. El plásmido recombinante portando el gen
FTasaopt fue empleado para transformar células E. coli DH5α competentes y el plásmido para
transformación se obtuvo mediante protocolo de maxiprep.
3.1.2 Transformación de P. pastoris
El plásmido pPIC9-FTasaopt fue linealizado con las enzimas de restricción StuI y BglII. El producto de
digestión fue separado en gel de agarosa, purificado y empleado para realizar la transformación
de células de Pichia pastoris GS115 competentes mediante protocolo de electroporación (Moreno,
2012). Las células transformadas se sembraron en cajas de agar MD (1,34% YNB, 4x10-5 % biotina,
2% dextrosa) y MDH (1,34% YNB, 4x10-5 % biotina, 2% dextrosa, 100xHistidina) durante tres días a
12
30°C. Con los clones obtenidos se preparó un banco de trabajo conservándolos a -80°C en glicerol
al 30% y medio YPD.
3.2 Determinación fenotípica de los clones
La evaluación del fenotipo de los clones se realizó siguiendo el protocolo del fabricante (Life
Technologies). Para esto, los clones de P. pastoris son sembrados en agar Medio Mínimo (2%
Dextrosa, 1,34% YNB, 4x10-5Biotina y 0,5% Metanol), junto con los controles de fenotipo para Mut+
y Muts (Life Technologies). Los cultivos se incubaron durante 48 horas a 28°C. El fenotipo fue
obtenido comparando el crecimiento de los clones P. pastoris-FTasaopt contra el observado para
los controles Mut+ y Muts.
3.3 Tamizaje de los clones obtenidos a escala de 10 y 100 mL.
3.3.1 Cultivo de P. pastoris a escala de 10 mL.
Los clones obtenidos se evaluaron inicialmente a escala de 10 ml. Para esto se tomó un vial de
cada clon y se inocularon en 10 ml de medio líquido YPD (Extracto de levadura 1%, peptona 2%,
glucosa 2%) en tubos de 50mL. El inóculo se incubó por 24 horas a 30°C y 210 rpm. Pasadas las 24
horas se tomó 1 ml del cultivo en YPD y se transfirió a 9 ml de medio líquido BMG (Buffer fosfato
de potasio pH 6.0, 1.34% YNB, 4X10-5% biotina, 1% glicerol) incubando por 24 horas a 30°C y 210
rpm. Posteriormente, se centrifugó el cultivo a 3500 rpm, 4°C , descartando el sobrenadante y
resuspendiendo la biomasa en 10 ml de medio líquido BMM (Buffer fosfato de potasio pH 6.0,
1.34% YNB, 4X10-5% biotina, 0.5% metanol) e incubando a 30°C y 210 rpm durante 120 h. Cada 24
se tomaron alícuotas de 200 µl y se adicionaron 50 µl de metanol filtrado para mantener una
concentración final de metanol de 0,5% v/v. La evaluación de los clones se hizo mediante
cuantificación de biomasa, concentración de proteína y actividad FTasa. Los cultivos se realizarán
por duplicado. Previamente Díaz & Beltrán (2012) reportaron que la cepa Pichia pastoris GS115 sin
transformar no presenta valores de actividad FTasa, por lo que en este trabajo no se realizó el
cultivo de esta cepa.
13
3.3.2 Cultivo de P. pastoris a escala de 100 mL.
Los clones que presentaron la mayor actividad específica a 10 mL se escalaron a 100 mL. Para este
procedimiento se tomaran dos viales de cada clon y se inocularon en 90 ml de medio liquido YPD
en erlenmeyer de 500mL incubando por 24 horas a 30°C y 210 rpm. Luego se transfirieron 10 ml
del cultivo a 90 ml de medio líquido BMG incubando por 24 horas a 30°C y 210 rpm.
Posteriormente, el cultivo se centrifugó a 3500 rpm y 4°C. La biomasa se resuspendió en 100 ml
de medio líquido BMM con una concentración de metanol de 0,5% v/v y se incubo a 30°C y 210
rpm durante 120 h. Cada 24 horas se tomaron alícuotas de 200 µl y se adicionaron 500 µl de
metanol para obtener una concentración final de 0,5% v/v. Esta metodología se realizó por
duplicado. El clon que mostro los mayores valores de actividad fue evaluado a escala de
biorreactor Bioengineering® a KFL2000 de 3,7 L.
3.4 Caracterización de la producción de la enzima a escala de biorreactor bajo dos
diferentes condiciones de Temperatura, empleando el clon con mayores niveles de
producción observada a escala de 100mL.
3.4.1 Cultivo de P. pastoris a escala de biorreactor.
Con los resultados obtenidos en la escalada de 100mL se seleccionó un clon con los valores de
actividad más elevados, el cual fue evaluado en escala de 1,7 L empleando el biorreactor
Bioengineering® a KFL2000 de 3,7 L. Para esto, se descongelaron dos viales del banco de trabajo y
se inocularon en 9 ml de medio YPD por separado, incubando a 28°C a 210 rpm por 48 horas. Estos
preinóculos fueron adicionados por separado a 90 ml de medio MGli (1.34% YNB, 4X10-5% biotina,
1% glicerol) se incubaron por 24 horas a 28°C y 210 rpm. Posteriormente, los 200 ml totales de
inóculos fueron agregados a 1450 ml de medio salino [KH2PO4 25,74 g/L, (NH4)2SO4 3 g/L, K2SO4
8,58 g/L, CaSO4.2H2O 0,60 g/L, MgSO4.7H2O 7,02 g/L, Glicerol 4% (p/v), biotina 4x10-5 %, PTM4
0,1% (CuSO4.5H2O 2 g/L, NaCI 0,08 g/L, MnSO4. H2O 3 g/L, Na2MoSO4. H2O 0,2 g/L, H3BO3 0,02 g/L,
CaSO4.2H2O 0,5 g/L, CoCl2.6H2O 0,92 g/L, ZnCl 7 g/L, FeSO4.7H2O 22 g/L, H2SO4 0,1%)], para
obtener un volumen de trabajo de 1650 mL. Por último, se adiciono la solución de trazas
minerales, antiespumante y biotina. Durante la fase de crecimiento el cultivo se mantuvo a 28 °C,
pH 5 y agitación entre 400 y 900 rpm. Una vez la concentración de biomasa alcanzo 60 g/L se inició
con la fase de inducción manteniendo el metanol a una concentración de 0,5 % durante 120 horas
14
de cultivo. Durante esta fase el pH se mantuvo regulado en 5 y se evaluaron dos condiciones de
temperatura: 28°C y 20°C.
3.5 Cuantificación de biomasa, proteína y actividad.
3.5.1 Determinación de Biomasa, método cuantitativo.
La cuantificación de biomasa para todos los cultivos realizados fue determinada por densidad
óptica a 610nm. La expresión de biomasa en g/L fue hallada por medio de la ecuación siguiente,
reportada por Cordoba et al (2003).
Biomasa(peso seco) g/L = 0,619 𝑥 𝐷𝑂
0,528 𝑥 𝑓𝑑 R2=0,99
3.5.2 Determinación de Proteína.
Para las escalas de 10 y 100 mL la determinación de proteínas totales se realizó empleando el
método de Ácido Bicinconinico BCA, en placa de ELISA, siguiendo las instrucciones del fabricante
(Thermo Scientific ). La lectura se realizó en lector de placas a 595nm. Por otro lado, para la escala
de biorreactor se empleó el método de Follin-Lowry (Anexo 2) a longitud de onda de 610nm. Para
ambos métodos se utilizó una curva de calibración con Albumina sérica bovina (Sigma-Aldrich)
para BCA entre 0,065 a 0,74 mg/mL, mientras que para Follin-Lowry 0,072 a 1,2 mg/mL.
3.5.3 Determinación de Actividad enzimática FTasa.
La actividad enzimática se evaluó mediante la cuantificación de glucosa liberada al medio dada la
hidrolisis de la sacarosa por medio de la enzima. Para esto se siguieron las recomendaciones de
Sánchez et al (2008), tomando 900 µL de sacarosa al 66.7%(p/v) en buffer fosfato 0,5M, pH 5,5 y
100µL de muestra. La mezcla se incubó a 60 °C por 4 horas, y la reacción se detuvo mediante
incubación en baño maría durante 10 minutos. La cuantificación de glucosa liberada se realizó
empleando el estuche Glucosa oxidasa/peroxidasa (Bio-Systems), siguiendo las instrucciones del
fabricante, y empleando una curva de calibración de glucosa entre 0,36 y 2,5 mg/mL. Una unidad
enzimática FTasa se definió como la cantidad de enzima necesaria para liberar 1 mg de glucosa por
hora. La actividad específica está dada como mg de glucosa/h mg de proteína y la actividad
volumétrica esta expresada como mg de glucosa/h 9mL de muestra.
15
3.5.4 Determinación de Proteasas.
Para los cultivos realizados a escala de biorreactor, se determinó la concentración de enzimas
proteolíticas. La determinación se realizó utilizando una solución de caseína y siguiendo el
protocolo descrito en el anexo 3. La siguiente ecuación describe las Unidades proteolíticas por litro
(UP/L):
𝑈𝑃
𝐿:𝐷𝑂280𝑛𝑚 ∗ 10
30 ∗ 0,5∗ 103
3.5.5 Evaluación actividad FTasa en el periplasma.
Con los clones utilizados en la escala de 100 mL se implementaron los protocolos de esferoplastos
reportado por Trujillo et al, 2001 y el manual de Pichia pastoris de Invitrogen para evaluar la
presencia de la enzima recombinante en el periplasma.
3.6 Determinación de azucares
3.6.1 Cromatografía de Capa Fina (TLC).
Como procedimiento complementario para evidenciar la presencia de compuestos diferentes a
glucosa, sacarosa y fructosa se empleó cromatografía de capa delgada en silica gel (Merck)
empleando como fase móvil Butanol:Ácido Acetico:Éter:Agua (9:6:3:1). Posterior a la corrida
cromatográfica, las placas fueron secadas y reveladas con Orcinol 0,2% y H2SO4 20%.
3.7 Determinación de tasas, rendimientos y productividades
3.7.1 Determinación de tasa de crecimiento y de tasa de producción
La tasa de crecimiento (h-1) fue calculada teniendo en cuenta el cambio que existe en la
concentración de biomasa en 120 horas de cultivo; por otro lado para el cálculo de la tasa de
producción (mg de proteína/g de biomasa/h) se tuvo en cuenta el cambio de la concentración de
proteína en el tiempo de cultivo. Para dichos cálculos se emplearon las ecuaciones (1 y 2).
(1)𝑑𝑋
𝑑𝑡:
(𝑋𝑘+1−𝑋𝐾−1)
𝑋𝑘∗ ∆𝑡
(2)𝑑𝑃
𝑑𝑡:
𝑃𝑘+1−𝑃𝑘−1
𝑋𝑘∗ ∆𝑡
16
En las ecuaciones X es biomasa (g/L), P es proteína (mg/L), k es el momento de toma de muestras,
k-1 es la muestra anterior, k+1 es la muestra siguiente y ∆𝑡 es el tiempo entre k-1 y k+1 en horas.
3.7.2 Determinación de los rendimientos producto/biomasa, actividad
específica/biomasa, biomasa/sustrato y producto/sustrato
La determinación del rendimiento producto/biomasa (Yp/x) descrito como mg de proteína /g de
biomasa, fue calculado con la ecuación (3); el rendimiento actividad específica/biomasa (YAE/X)
descrito como actividad específica/g de biomasa fue calculado con la ecuación (4), donde AE es la
actividad específica para los rendimientos biomasa/sustrato y producto/sustrato (Yx/s), (Yp/s). La
tasa de consumo fue calculada con la ecuación (5) en la cual ∆𝑆/∆𝑡 corresponde a la pendiente del
consumo generada por el programa de control para el metanol. Las velocidades de consumo
fueron utilizadas para el cálculo de los rendimientos, en las ecuaciones 6 y 7 se calcularon los
rendimientos mencionados.
(3) 𝑌𝑃/𝑋 =𝑃𝑘
𝑋𝑘
(4) 𝑌𝐴𝐸/𝑋 =𝐴𝐸𝐾
𝑋𝐾
(5) 𝑑𝑆
𝑑𝑡=
∆𝑆
𝑋𝑘∗∆𝑡
(6) 𝑌𝑥/𝑠 =𝑑𝑋
𝑑𝑆
(7)𝑌𝑃/𝑆 =𝑑𝑃
𝑑𝑆
3.7.3 Determinación de las productividades de biomasa y de proteína
Se realizaron los cálculos para las productividades tomando como relación los g de biomasa o mg
proteína obtenidos en el cultivo de 1,65 L desde el tiempo de inducción siendo la hora cero; la
productividad está dada en g de biomasa/h y mg de proteína/h.
17
3.8 Electroforesis de proteínas (SDS-PAGE)
EL análisis de los extractos crudos se realizó mediante SDS-PAGE en gel de poliacrilamida al 10% en
condiciones reductoras. Las muestras se diluyeron en buffer Laemmli con 2-mercaptoetanol.
Posterior al corrido electroforético, las bandas fueron evidenciadas mediante tinción de plata.
4. Efecto de diferentes condiciones de pH, temperatura, tiempo de incubación y
concentración de sacarosa sobre la actividad de la enzima recombinante FTasa
La caracterización enzimática se realizó con un diseño experimental utilizando el programa Desing
Expert 9.0.2, aplicando un modelo Factorial optimizado personalizado con cuatro niveles:
Temperatura, concentración de sacarosa, pH y tiempo de incubación. Las variables presentaron
diferente numeró de niveles en cada caso: Temperatura: 37, 45 y 60°C; Concentración de
sacarosa: 1,7M, 0,8M y 0,4M; pH: 4, 5,5 y 7; Tiempo de incubación: 1, 4, 12, y 24 horas
respectivamente.
18
5. RESULTADOS
5.1 Obtención de clones de P. pastoris GS115 transformados con el vector de expresión
portando el gen de la enzima FTasa
Para la obtención de clones de Pichia pastoris GS115 fue necesario transformar células de E.coli
DH5α competentes, a las cuales se les inserto el plásmido portador del gen de la FTasa
12ABHHEC_FTasa_pMA. La confirmación del plásmido en los clones obtenidos se realizó mediante
digestión con EcoRI, con lo que se esperaba obtener una banda de aproximadamente 4 kb. Cinco
de los clones seleccionados presentaron la banda esperada (Figura 1) correspondiente al peso
total del plásmido con el gen (Figura 2).
Figura 1. Electroforesis que muestra el plásmido linealizado con EcoRI. Carriles marcados como
1,3,4,5,y 6.
Figura 2: Plásmido de transporte con el gen FTasa
El plásmido 12ABHHEC_FTasa_pMA fue digerido con EcoRI y XhoI, obteniendo dos bandas: una
superior de 2,5 kb y una inferior de 1,5 kb (Figura 3), correspondiente al gen FTasaopt (1551pb).
19
Este fragmento se purificó y se inserto en el plasmido Ppic9 (Invitrogen), previamente digerido
con EcoRI y XhoI (Figura 3), por medio de ligacion. El producto de ligación fue transformado en en
celulas E.coli DH5α competentes, obteniéndose seis clones.
Figura 3. Digestión enzimática con EcoRI y XhoI. Carril 1 pPIC9, Carril 2 12ABHHEC_FTasa_pMA(la
banda inferior corresponde al gen FTasaopt)
Los seis clones obtenidos fueron sometidos a protocolo de extracción de ADN plasmídico. Los
resultados de electroforesis de estos plásmidos mostraron que los clones 4 y 5 podrían
corresponder al plasmido pPic9-FTasaopt dado el patrón de bandas observado (Figura 4).
Figura 4. Electroforesis. Carriles 4 y 5 ADN plasmídico correspondiente a pPic9-FTasaopt.
La confirmación del plásmido se realizó mediante digestión con EcoRI y XhoI, con lo que se
esperaba encontrar dos bandas de 8000 y 1200 kb, correspondientes al vector y al gen FTasaopt,
respectivamente. De esta forma, estos clones correspondientes al plásmido pPic9-FTasaopt y
fueron combinados y utilizados para transformar células de P. pastoris GS115 competentes.
20
El plásmido pPic9-FTasaopt obtenido por maxiprep (501,3 ng/µL, relación 260/280 =1,86 y 260/230
=1,93), se linealizó con las enzimas de restricción StuI y BglII (Figura 5), según recomendaciones
del fabricante. Con BglII se observa que la enzima realizo 3 cortes en el plásmido pPic9-FTasaopt ya
que el plásmido posee dos sitios de corte para esta enzima además de que el gen de la FTasa
también posee este sitio en medio de su secuencia.(Figura 6). Por el contrario, StuI realizó un
único corte (Figura 5), de acuerdo a lo esperado por el número de sitios de corte para esta enzima
presentes en el plásmido pPic9-FTasaopt (Figura 6). Por lo tanto, se decidió trabajar con la enzima
de restricción StuI, para linealizar el plásmido antes de realizar la transformación de las células de
P. pastoris GS115 competentes.
Figura 5. Digestión del plásmido pPic9-FTasaopt con enzimas de restricción. Carril uno: Bgl II. Carril
dos: Stu I.
Tras la transformación de células competentes de Pichia pastoris GS115 con el plásmido obtenido
pPic9-FTasaopt se obtuvieron quince clones, los cuales se denominaron pFTa1 a pFTa15.
21
Figura 6: Plasmidos pPIC9 y pPIC9-FTasaopt.
5.2 Determinación fenotípica de los clones
La determinación fenotípica de los clones se realizó cultivo en medio sólido MM. Los quince
clones evaluados, al ser comparados con los controles de Mut+ y Muts, presentaron características
morfológicas similares a las del control Muts tal como se muestra en la Figura 7.
Figura 7. Determinación fenotípica de los clones P. pastoris pPic9-FTasaopt. A: Control Mut+, B: clon
P. pastoris pPic9-FTasaopt, C: Control Muts. Resultados similares se observaron para todos los
clones evaluados.
5.3 Tamizaje de los clones obtenidos mediante cultivos a escala de 10 y 100 mL.
5.3.1 Cultivo de P. pastoris a escala de 10 mL.
Con los clones obtenidos se realizó la evaluación a escala de 10mL. La evaluación de los clones se
realizó mediante cuantificación de biomasa (g/L), concentración de proteína (mg/mL), actividad
volumétrica (mg de glucosa/h/mL) y actividad específica (mg de glucosa/hora/mg proteína),
durante la fase de inducción. Los clones fueron evaluados en tres bloques de cinco cada uno
22
(pFTa1-pFTa5, pFTa6-pFTa10, pFTa11-pFTa15). En la figura 8 se observa que para el primer bloque,
la biomasa aumento durante toda la fase de inducción alcanzando valores finales entre 10 y 15
g/L. La concentración de proteína para este grupo de clones al final del cultivo estuvo entre 0,28 y
0,37 mg/mL, con el clon pFTa3 presentando los mayores valores. Con respecto a la actividad
FTasa, la mayor actividad se observó para el clon pFTa5 con valores de 0,233 mg/h/mg de
actividad específica y 0,582 mg/h/mL de actividad volumétrica.
Figura 8:. Evaluación de los clones pFTa1 a pFTa5 a escala de 10mL A) Biomasa, B) concentración
de proteína, C) Actividad FTasa específica, D) Actividad FTasa volumétrica.
En el segundo bloque (figura 9), la biomasa aumento durante toda la fase de inducción
alcanzando valores finales entre 15 y 29,5 g/L. La concentración de proteína para este grupo de
clones al final del cultivo estuvo entre 0,33 y 0,41 mg/mL con el clonpFTa8 presentando los
mayores valores. Con respecto a la actividad FTasa, la mayor actividad se observó para el clon
23
pFTa7 con valores de 0,274mg/h/mg de actividad específica y 0,861mg/h/mL de actividad
volumétrica.
Figura 9: Evaluación de los clones pFTa6 a pFTa10 a 10mL A) Biomasa, B) concentración de
Proteína, C) Actividad Específica, D) Actividad Volumétrica.
Finalmente, para el tercer bloque (Figura 10), los clones presentaron un aumento de biomasa
durante toda la fase de inducción alcanzando valores finales entre 11 y 33 g/L. La concentración
de proteína para este bloque al final del cultivo estuvo entre 0,32 y 0,52 mg/mL, con el clon
pFTa14 presentando los mayores valores (0,52 mg/mL). Con respecto a la actividad FTasa, la
mayor actividad se observó entre los clones pFTa11 y pFTa13 con valores de 1,04 mg/h/mg de
actividad específica y el clon pFTa11 con 3,51 mg/h/mL de actividad específica. .
24
Figura 10:. Evaluación de los clones pFTa11 a pFTa15 a 10mL A) Biomasa, B) concentración de
Proteína, C) Actividad Específica, D) Actividad Volumétrica.
Tomando estos resultados, los clones seleccionados para su evaluación a escala de 100mL fueron
pFTa5, pFTa8, pFTa9, pFTa11, pFTa13. Estos clones fueron seleccionados teniendo en cuenta los
valores de actividad FTasa específica y volumétrica observada dentro de cada bloque de clones
evaluados.
5.3.2 Cultivo de P. pastoris a escala de 100mL
Los cinco clones seleccionados fueron evaluados a escala de 100 mL como se describió en la
sección de materiales y métodos.
Como se observa en la figura 11 a escala de 100 mL la biomasa tiene un aumento durante toda la
fase de inducción la cual alcanza valores de 5,67 y 19,6 g/L. la concentración de proteína a escala
de 100mL 0,2 y 0,34 mg/mL. Finalmente los mayores valores de actividad FTasa fueron observados
para el pFTa5, con el que se obtuvieron valores de actividad específica y volumétrica de 0,8
25
mg/h/mg y 2,3 mg/h/mL , respetivamente, siendo este el clon que se seleccionó para su
evaluación a escala de 1,7 L. A pesar que el clon pFTa13 mostró los mayores valores de actividad
específica y volumétrica, estos valores fueron alcanzados a las 0 y 14 horas de inducción y
posteriormente niveles similares o inferiores a los observados para los otros clones. Dado que la
expresión de la enzima solo se da tras la adición del metanol (agente inductor) es poco probable
que el valor de actividad observado a la hora cero de inducción corresponda a actividad FTasa. Por
esta razón, este clon no fue considerado para ser escalado al biorreactor.
Figura 11: Evaluación de los clones pFTa5, 8, 9, 11 y 13a 100mL A) Biomasa, B) concentración de
Proteína, C) Actividad Específica, D) Actividad Volumétrica.
5.3.3 Evaluación actividad FTasa en el periplasma.
Con el fin de estudiar que la enzima recombinante estuviera siendo secretada al medio de cultivo,
en los clones evaluados a escala de 100 mL se analizó la actividad FTasa en las proteínas del
periplasma. Para este fin, la biomasa de los clones fue sometida a protocolo de esferoplastos
como se describe en la sección de Materiales y Métodos. Debido a limitaciones de la
disponibilidad de reactivos (Zimoliasa) de cada clon se evaluó la hora cero y la hora con mayor
actividad (Figura 12). Los resultados mostraron que aunque parte de la proteína está presente en
26
el espacio periplásmico la mayor parte es secretada al medio de cultivo. A pesar que en el caso del
clon pFTa13 parte de la proteína se encuentra en el periplasma esta no representa un gran valor
de actividad. Por dicha razón se decidió no continuar con la aplicación de los esferoplastos como
tratamiento al clon pFTa5 en biorreactor.
Figura 12: Evaluación actividad FTasa en el periplasma. La actividad FTasa fue evaluada en el
periplasma de los clones de P. pastoris estudiados a escala de 100 mL. Rojo: actividad FTasa
secretada obtenida sin los esferoplastos, verde: actividad FTasa en el periplasma. Para todos los
clones se evaluó la hora cero de inducción y la de máxima actividad extracelular.
5.4 Producción de la enzima a escala de biorreactor bajo dos diferentes condiciones de
Temperatura, empleando el clon con mayores niveles de producción observada a
escala de 100 mL.
5.4.1 Cultivo de P. pastoris para la producción de fructosiltransferasa con temperatura de
28°C.
La temperatura de 28°C es la condición recomendada para la producción de proteínas
recombinantes en P. pastoris GS115 (Invitrogen). La figura 13 muestra los datos obtenidos para
biomasa (g/L), proteína total (mg/mL) y actividad FTasa específica y volumétrica, en la figura 15. La
fase de inducción se inició con una biomasa de 59,8 g/L y un oxígeno disuelto (OD) de 3,9%.
Durante las 120 h de inducción el comportamiento del OD se mantuvo en niveles inferiores al
valor observado en el momento de inducción, alcanzando 2,6 %OD al finalizar el cultivo. El
metanol por su parte se mantuvo en la concentración de 0,5% aproximadamente, mientras que la
27
biomasa presento un constante aumento durante las 120 h, alcanzando una biomasa de 309,5 g/L.
En cuanto a la concentración de proteína, esta presentó un comportamiento similar al de la
biomasa, llegando a una concentración máxima de 5,24 mg/mL a las 108 h de cultivo. Finalmente,
la actividad FTasa presentó una actividad específica de 0,2 mg/h/mg y una actividad volumétrica
de 3,7 mg/h/mL.
Figura 13: Grafica integrada cultivo del clon pFTa5 P.pastoris GS115 a escala de 1,7L y
temperatura de 28°C durante la fase de inducción.
5.4.2 Cultivo de P. pastoris para la producción de Fructosiltransferasa con temperatura de
20°C
Con el objetivo de analizar el efecto de la temperatura durante la fase de inducción sobre la
producción de la proteína, se realizó un segundo cultivo con el clon pFTa5 a escala de 1,7L, con
una temperatura de 20 °C durante la fase de inducción. La Figura 14 muestra los resultados de
biomasa (g/L), concentración de proteína (mg/mL), mientras que los datos de actividad FTasa
específica y volumétrica se encuentra en la Figura 15. La inducción del cultivo con una biomasa de
102,8 g/L y un OD de 2,6%. El OD se mantuvo alrededor del 5% durante la mayoría del cultivo
finalizando con un OD de 22.7%, aunque entre las 60 y 64 horas de inducción se presentó un
aumento debido a un problema en la alimentación del metanol. La concentración de metanol se
mantuvo estable durante todo el cultivo en la concentración de 0,5%, exceptuando el
inconveniente previamente mencionado. La biomasa presento un aumento considerable en
28
comparación con el cultivo a 28°C, logrando una producción máxima de 360,50 g/L en la hora 100
del cultivo. Por el contrario, la concentración de proteína presentó valores menores que los
observados en el cultivo a 28 °C, con valores un máximo a las 100 h de 2,42 mg/mL. La actividad
FTasa presentó la máxima actividad a las 48 h a 28°C, siendo levemente mayor (actividad
específica 0,34 mg/h/mg , 3 mg/h/mL) comparada con la máxima actividad en el cultivo a 20 °C a
la hora 68 , con valores de actividad específica 0,27 mg/h/mg y una actividad volumétrica de 2,9
mg/h/mL (Figura 15).
Figura 14: Grafica integrada cultivo del clon pFTa5 P.pastoris GS115 a escala de 1,7L y temperatura
de 20°C durante la fase de inducción.
29
Figura 15: Grafica integrada de actividad específica y actividad volumétrica para los cultivos de
P.pastoris GS115 a 28 °C (A) y 20°C (B)
5.5 Determinación de proteasas
En la Figura 16 se observa los resultados del ensayo de proteasas. Para el cultivo a 28°C se observó
un aumento de unidades proteolíticas (UP) por litro a partir de las 48 hasta alcanzar un valor de
600 UP/L. Por el contrario, las UP especificas tienen una tendencia inversa, con una disminución
desde la hora cero (523,46 UP/g) hasta la hora 72 (127,02 UP/g). En el cultivo a 20°C se observó un
aumento notable de proteasas con respecto a lo observado en el cultivo a 28 °C. En este caso, las
UP/L y UP/g presentaron la misma tendencia aumentando hasta la hora 96, posteriormente
disminuyendo al final del cultivo. Los valores máximos y corresponden a 68166,7 UP/L y 48485,3
UP/g.
Figura 16: Grafica integrada de la actividad proteolítica del cultivo del clon pFTa5 P.pastoris GS115 a escala
de 1,7L y a dos condiciones de temperatura 28 °C (A) y 20 °C (B).
5.6 Cromatografía de Capa Fina (TLC).
Con el fin de analizar la producción de FOS, los productos de reacción de sacarosa y FTasa
recombinante fueron evaluados mediante cromatografía de capa delgada (Figura 17). Inicialmente
se emplearon patrones de glucosa, sacarosa, fructosa y rafinosa. En ambos casos, la hora de
mayor actividad coincidió con la muestra que presentó la mayor intensidad en la banda de
glucosa, la cual se va desvaneciendo en las horas posteriores. En todas las horas se tienen bandas
a la altura de sacarosa así como de fructosa; y las bandas inferiores, que pueden corresponder a
polímeros dada la altura de la rafinosa, aumentan en intensidad de acuerdo al tiempo de cultivo.
30
Figura 17: Análisis de carbohidratos mediante Cromatografía de Capa delgada. A: muestras cultivo
clon FTa5 a 28°C. B: muestras cultivo clon FTa5 a 20°C. Glu: Glucosa, Sac: Sacarosa, Raf: Rafinosa,
Fruc: Fructosa.
Posteriormente se realizó una cromatografía con los tres estándares de los FOS: 1-kestosa (GF2),
nistosa (GF3) y fructofuranosil nistosa (GF4). En este caso se evaluaron las muestras que
presentaron la máxima actividad FTasa de los cultivos a 28 y 20 °C (Figura 18). Estos resultados
sugieren que algunas de las bandas observadas en la cromatografía pueden corresponder a FOS.
Es de destacar que la intensidad de dichas bandas varió dependiendo de las muestras analizada.
Figura 18: Cromatografía de Capa delgada. GF2: 1-Kestosa, GF3: Nistosa, GF4: Fructofuranosil
nistosa, C1; Cultivo 28°C hora 48, C2: Cultivo 20°C hora 68, Sac: Sacarosa, Fruc: Frucosa, Glu:
Glucosa.
5.7 Electroforesis SDS-PAGE
Las electroforesis de proteínas para los dos cultivos revelan bandas a la altura de 66,2 kDa tal
como se muestra en la figura 19. Para ambas electroforesis se ve un aumento en la intensidad de
31
las bandas desde las 24 hasta las 120 h. Esta banda no se observó en la hora inicial de inducción,
lo que podría sugerir que se trata de la enzima recombinante FTasa.
Figura 19: Electroforesis de proteínas SDS-PAGE. Imagen izquierda: Cultivo a 28°C,
Imagen derecha: Cultivo 20°C. PM: Peso molecular.
5.8 Determinación de tasas, rendimientos y productividades
5.8.1 Determinación de tasa de crecimiento y de tasa de producción
En la figura 20 se observan las tasas de crecimiento y de producción para ambos cultivos
realizados. La tasa de crecimiento está dada como (h-1) y la tasa de proteína como (mg proteína/g
biomasa/h). El cultivo a 28°C presenta una mayor tasa de crecimiento como se muestra en la
figura 20 A en la hora 40 en comparación con el cultivo a 20°C; por su parte el cultivo a 28°C
presento una mayor tasa de producción de proteína alcanzando valores máximos de 1,4 mg
proteína/ g biomasa/h en 72 y 96 horas (figura 20 B).
Figura 20: Grafica integrada de Tasa de Crecimiento y tasa de productividad para los cultivos
de dé P. pastoris GS115 a dos condiciones de temperatura 28 y 20°C. A: Tasa de
Crecimiento (h-1). B: Tasa de producción (mg proteína/g biomasa/h).
32
5.8.2. Determinación de los rendimientos biomasa/producto, actividad específica/biomasa,
biomasa/sustrato y producto/sustrato
La figura 21 se muestra los rendimientos obtenidos por ambos cultivos. El rendimiento producto/
biomasa (Yp/x) resulta ser mayor a 20°C en comparación a 28°C, en contraposición el rendimiento
proteína/sustrato (Yp/s) es mayor a 28°C. En adición los rendimientos biomasa/sustrato (Yx/s),
actividad específica/ biomasa (YAE/X) no presentan diferencias significativas entre ambos cultivos.
Se observa en la figura 22 similitudes con respecto a la productividad de biomasa en ambos
cultivos, sin embargo la diferencia se presenta en la productividad de proteína, siendo superior la
presentada a 28°C.
Figura 21. Graficas integradas de Rendimientos para los cultivos de P. pastoris GS115 a dos
condiciones de temperatura 28 (A) y 20°C (B).
33
Figura 22. Grafica integrada de productividades biomasa y proteína para los cultivos de P. pastoris
GS115 a dos condiciones de temperatura 28 y 20°C.
5.9 Caracterización de la enzima FTasa por pH, temperatura de reacción, tiempo de
reacción y concentración de sacarosa para determinar la actividad óptima.
Se realizó la caracterización de la enzima teniendo en cuenta cuatro variables reportadas en la
literatura, utilizando como herramienta el programa Desing-Expert 9.0.3 en este se diseñó un
experimento factorial optimo personalizado, el cual genero 45 experimentos. De acuerdo a los
resultados obtenidos se determinó que la condición óptima para la producción de FOS se
encuentra utilizando las condiciones de pH 4, temperatura 45°C, 4 horas de reacción y una
concentración de sacarosa 1,7 M (Figura 22 A). Todos los experimentos fueron comparados con un
control de degradación de sacarosa.
34
Figura 23: Caracterización de la enzima a diferentes condiciones de pH, temperatura,
concentración de sacarosa y tiempo de reacción. Por filas A, B y C: pH 4; D,E y F: pH 5,5; G, H e I:
pH 7. Líneas: Verde (1 h), roja (4 h), azul (12h), rosado (24h).
6. DISCUSIÓN
Dado el creciente interés en el uso de FOS para la producción de alimentos funcionales, se ha visto
la necesidad de desarrollar alternativas que permitan obtener grandes cantidades de estos
compuestos (Nobre et al, 2013). Una de estas alternativas es mediante el uso de enzimas con
capacidad de transfructosilación, las cuales pueden ser obtenidas de hongos o bacterias, o
producidas de forma recombinante (Guio et al, 2009). En el último caso, el uso de la tecnología de
ADN recombinante para la producción de proteínas, presenta ventajas como bajo costo de
producción, fácil escalado, secreción de proteínas al medio lo cual facilita la purificación y la
posibilidad de realizar modificaciones sobre la enzima (Minjie et al, 2013). En el presente proyecto
35
se caracterizó la producción de la enzima FTasa de A. oryzae N74 en P. pastoris GS115 empleando
un gen optimizado en cuanto a su uso de codones para P. pastoris. Previamente, se había
realizado la producción de esta enzima de forma recombinante, aunque en dicha ocasión se
empleó el gen nativo (uso de codones de A. oryzae), y adicionalmente con pérdida de una región
3’ del mismo (Díaz y Beltrán, 2012). El empleado de un gen FTasa optimizado en cuanto al uso de
codones para P. pastoris permitiría el aumento en la expresión de la proteína de interés, asi como
su funcionalidad al ser secretada (Angov, 2011; Gustafsson et al, 2004)
El vector de expresión pPIC9-FTasaopt se usó para transformar células de P. pastoris GS115
competentes, logrando la obtención de 15 clones. El análisis del fenotipo de los clones obtenidos
mostró un fenotipo Muts. Sin embargo, este fenotipo no era el esperado puesto que se
recomienda que para obtener fenotipo Muts la linealización debe realizarse con la enzima de
restricción Bgl II, la cual no se seleccionó debido a que presenta sitios de corte en el gen FTasa.
Por este motivo se seleccionó la enzima StuI para realizar la linealización con la que se esperaría
un fenotipo Mut+. Según Cos et al, (2005) el trabajo con cepas de fenotipo Muts aumenta la
expresión, el rendimiento de la proteína, y la sensibilidad al metanol residual en el medio es
menor, facilitando el proceso de escalado. Los resultados a escala de biorreactor sugieren que el
clon Fta5 presenta un fenotipo Mut+, lo cual concuerda con los resultados esperados de acuerdo
con la linealización realizada, pero contradicen los resultados de fenotipo. Es importante aclarar,
que la clasificación de fenotipo es realizada de forma subjetiva al comparar los resultados de los
clones con los de las cepas control, por lo que se puede incurrir en un error de clasificación de las
cepas, como se ha reportado previamente (Moreno 2012). Con el objetivo de definir futuras
estrategias de cultivo con el clon seleccionado, es importante confirmar el fenotipo empleando
otro tipo de técnicas, como por ejemplo PCR empleando cebadores para la región del gen AOX1
(Moreno 2012).
Dado que no se puede asegurar una producción similar entre los clones obtenidos, todos fueron
tamizados a escala de 10 mL, para seleccionar los clones que serían llevados a escala de 100 mL y
1,7 L. Por ejemplo, a escala de 10 mL varios de los clones presentaron niveles bajos de biomasa y
concentración de proteína lo que posteriormente se pudo traducir en bajos niveles de producción
de la enzima recombinante (bajos niveles de actividad volumétrica).
36
Durante el desarrollo de este trabajo, la producción de la enzima FTasa recombinante se siguió
mediante la cuantificación de la glucosa liberada tras la reacción de la enzima con sacarosa. Esta
es una forma de medir la producción de la enzima, al cuantificar la cantidad de glucosa liberada
tras la hidrolisis de sacarosa por la enzima durante la reacción de transfructolisación. Sin embargo,
esta manera de cuantificar la actividad posee limitaciones, dado que solo permite ver las unidades
de glucosa libres tras la reacción, y no permite la cuantificación de los FOS o la proporción de
sustrato convertido en FOS por efecto de la enzima. Por tanto, es necesario realizar la
confirmación de estos resultados mediante la cuantificación de glucosa, fructosa y FOS mediante
cromatografía líquida de alta eficiencia.
A escala de 10 mL los clones fueron evaluados en bloques de 5 clones. La selección de los clones
que se decidieron escalar a 100 mL se realizó comparando los resultados de actividad específica y
volumétrica por cada bloque de clones evaluados, debido a las variaciones observadas en la
medición de actividad enzimática entre los tres bloques de clones. De esta forma, en el primero se
encontró que el clon pFTa5 alcanzaba la mayor actividad tanto volumétrica como específica, a
pesar que al mirar la producción de proteína esta estuvo en el rango de los clones con menor
producción, mientras que el clon pFTa3 el cual presento el valor más alto de proteína para este
bloque (0,37 mg/mL) no presentó valores de actividad, siendo 2,2 veces menores que los
observados para el clon pFTa5 (Figura 9). En el segundo bloque se seleccionaron los clones pFTa8
y 9 puesto que las réplicas presentaron comportamientos similares y presentaron los mayores
valores de actividad al comparar con el tiempo inicial de inducción. Finalmente, en el tercer
bloque se seleccionaron los clones pFTa11 y pFTa13, dado que presentaron los mayores valores
de actividad FTasa (Figura 11).
A escala de 100 mL el clon pFTa5 fue seleccionado para ser llevado a escala de 1,7 L teniendo en
cuenta las actividades calculadas (Figura 12). Cabe destacar que a pesar que el clon pFTa13 mostró
las actividades más altas a esta escala, estas actividades fueron observadas a la hora cero y 24 de
inducción. Dado que la expresión del transgen es controlada por el promotor AOX1, la producción
de la enzima no debería observarse en ausencia de metanol. Por esta razón, es poco probable que
los valores tan altos de actividad observados en el clon pFTa13 sean debidos a la presencia de la
enzima FTasa. Por el contrario, es probable que otras enzimas capaces de degradar la sacarosa
37
fueran producidas por este clon y su disminución podría estar asociada a la presencia de proteasas
posterior a las 24 horas de cultivo las cuales no fueron evaluadas a esta escala.
Trujillo et al, (2001) reportaron que el 81% de la enzima levansucrasa recombinante, productora
de FOS, fue detectada en el periplasma de P. pastoris y tan solo el 18% de esta era secretada al
medio. Debido a esto se decidió realizar, en los clones a estudiados a escala de 100mL, la
medición de la enzima FTasa en el periplasma mediante el protocolo de esferoplastos. Los
resultados mostraron que más del 50% de la proteína es liberada al medio de cultivo y solo una
parte es retenida en el espacio periplásmico. Dada la facilidad de trabajar con la proteína
secretada al medio de cultivo, se decidió realizar, a escala de 1,7 L, sólo el seguimiento de la
enzima recombinante que había secretada. Sin embargo, futuras investigaciones podrían
enfocarse en evaluar la producción de la enzima FTasa recombinante en el periplasma a escala de
biorreactor y el posible uso del microorganismo completo para la producción de FOS, tal y como se
reportó para la levansucrasa producida en P. pastoris (Trujillo et al. 2001)
El primer cultivo realizado a escala de 1,7 L se realizó en su totalidad (fases de crecimiento e
inducción) a 28°C, con concentración de metanol al 0,5% (v/v). La concentración de proteína se
mantuvo constante durante las primeras 20 horas, debido a que la producción de la proteína de
interés es inducida por metanol, y el promotor AOX1 es reprimido en presencia de glicerol (Minjie
et al, 2013), el cual se encuentra presente durante las primeras horas de inducción, como se
observa en el comportamiento del OD. Posterior a este tiempo la concentración de proteína y la
biomasa aumenta considerablemente. Como se ve, la proteína disminuye luego de las 100 h de
inducción, lo cual se pude deber al aumento en la actividad proteolítica hacia el final de cultivo,
que también afectaría la actividad FTasa. Se ha descrito que el fenotipo Muts posee baja capacidad
de crecimiento en comparación con Mut+ (Cereghino et al, 2000; Potvin et al 2012). Los resultados
mostraron que bajo las condiciones de este cultivo el clon pFTa5 presentó un crecimiento
constante sin alcanzar una fase estacionaria, alcanzando una biomasa de 309,5 g/L.
El segundo cultivo se realizó a 20°C durante la fase de inducción, lo cual afectó de manera global
todas las determinaciones realizadas. La biomasa final fue 1,2 veces (360 g/L) más que la obtenida
con el cultivo realizado a 28°C. Por su parte, la concentración de proteína disminuyo al igual que la
actividad FTasa 0,27 mg/h/mg y 3 mg/h/mL (1,35 y 0,78 veces, con respecto al cultivo realizado a
38
28 °C), respetivamente (Figura 15), mientras que la actividad proteolítica aumentó 113,6 veces.
Siren et al (2006), reportaron una disminución de la actividad proteolítica a bajas temperaturas,
esta disminución se encontraba ligada no a la poca cantidad de proteasas sino a su baja actividad,
por otra parte Li et al, (2001) demostraron las ventajas de utilizar bajas temperaturas,
favoreciendo a una baja producción de proteasas así como el incremento de celular y el aumento
de la proteína de interés. Finalmente, Jahic et al, (2003) asociaron la reducción de proteasas a la
disminución de lisis celular. Sin embargo, este efecto es dependiente de la proteína a expresar,
puesto que no todas las proteínas recombinantes actúan de la misma manera (Potvin et al, 2012).
Según Celik et al, (2012) el porcentaje de OD en el medio de cultivo para cultivos de P. pastoris
debe estar entre 20 y 30% con el fin de favorecer la oxidación del metanol a formaldehido. Sin
embargo, Pimentel (2013) demostró que para clones de P. pastoris GS115 la producción de una
proteína recombinante se ve favorecida bajo condiciones limitadas de OD, razón por la cual en
este trabajo se mantuvieron bajos niveles de OD durante la fase de inducción.
A pesar que los cultivos realizados en el presente trabajo no pueden ser comparados directamente
en términos de condiciones con el trabajo realizado por Díaz y Beltrán (2012), quienes emplearon
1,3% (v/v) metanol y 25% OD para obtener la máxima producción de la enzima FTasa de A. oryzae
recombinante, en el presente trabajo se obtuvieron mayores valores de biomasa (2,6 veces), de
concentración de proteína (2,8 veces) y de actividad FTasa (93,5 veces para el cultivo a 28°C y 75
veces para el cultivo a 20°C). Es importante destacar que este aumento se logró con una menor
concentración de metanol, lo que indica que a concentraciones altas (1,3% (v/v)) como las
utilizadas por Díaz & Beltrán (2012) no favorecen la producción de proteína, además del uso de un
gen optimizado representa una ventaja; por otra parte limitación de oxígeno disuelto favorece el
crecimiento celular así como la producción de proteína.
Con el fin de verificar la producción de FOS de forma cualitativa se empleó la Cromatografía de
Capa Delgada (TLC) de esta manera se pudo observar (Figura 18, 19) que la enzima FTasa realiza la
hidrolisis y posteriormente la actividad de transfructosilación generando los tres FOS de interés, la
intensidad de las bandas pueden sugerir una gran concentración de los mismos, así como la
presencia de otro tipo de productos generados que se encuentran poco después del patrón de 1-
39
Kestosa. Este resultado confirmaría una de las limitaciones mencionadas anteriormente para
cuantificación de glucosa liberada como forma de producción de enzima.
No obstante las imágenes de las electroforesis (Figura 20), revela un aumento de intensidad de
bandas al final del cultivo, en la hora cero para ambos cultivo no se evidencia banda por lo cual
puede sugerir que la proteína cuantificada no corresponde a la proteína de interés sino a proteínas
nativas; las bandas presentan un tamaño de 66,2kDa. La FTasa correspondiente a Aspergillus
oryzae N74, según Rodríguez et al, (2011) reportan un peso de 57 kDa, pero a su vez se describen
6 glicosilaciones que afectarían el peso, por lo cual las bandas de 66,2kDa corresponden a FTasa
con estas modificaciones.
Se observa que para el caso a temperatura de 28°C (figura 20 A), se obtiene una mayor tasa de
crecimiento (h-1) en comparación a 20°C (figura 20 B). En segundo lugar la tasa de producción (mg
proteína/ g biomasa/h), se ve favorecida a la mayor temperatura, en este caso a 28°C en las horas
finales del cultivo, cuando la biomasa se encuentra en mayor concentración (figura 13). El
rendimiento de la proteína en relación al sustrato presenta mayores niveles en condiciones de
28°C de temperatura; sin embargo para esta temperatura el rendimiento producto/biomasa es
menor puesto que la proteína es menor (0,64 mg/mL) en relación con el cultivo a 20°C (0,91
mg/mL) (figura 21A y 21B). Con relación a las productividades hay que destacar que para el cultivo
a 28°C se observa una relación de formación de producto asociada al crecimiento de biomasa
debido a la tendencia similar presentada; a 20°C las tendencias muestran que la formación de
producto no está asociada al crecimiento, ya que a medida que la productividad de biomasa
disminuye, la productividad de proteína tiene la tendencia a aumentar.
Al realizar la caracterización de la enzima FTasa se observó que los valores más altos de actividad
enzimática se logran a 45°C, pH 4, 1,7 M (60% p/v) de sacarosa y 4 horas de reacción Estos
resultados son similares a los reportados por Sánchez et al, (2010) quienes realizaron la
caracterización de la enzima FTasa a partir de extractos de Aspergillus oryzae N74 de dos formas,
la primera de cultivos implementados con sacarosa y segundo con la biomasa realizando un
análisis de varianza (ANOVA). Sus resultados mostraron que un aumento en la temperatura
favorece la actividad tanto hidrolítica como de transfructolisación y un aumento en la
concentración de sacarosa favorece la actividad de transfructolisación; obteniendo que la máxima
40
actividad de transfructolisación fue obtenida a 60 °C a pH 5,5 y concentraciones superiores a 50%
(p/v) de sacarosa.
CONCLUSIONES
Se obtuvieron 15 clones de Pichia pastoris GS115 transformados con el vector de
expresión pPic9-FTasaopt portando el gen optimizado del gen de la FTasa de Aspergillus
oryzae N74.
Se seleccionaron 5 clones para escalar a 100 mL, de los cuales solo uno mostro una
actividad volumétrica y específica de 2,3mg glucosa/h/mL y específica de 0,8mg
glucosa/h/mg proteína, respectivamente. Este clon de fenotipo Muts fue seleccionado
para ser escalado a 1,7L.
La caracterización de la producción de la enzima FTasa a escala de biorreactor determino
que la temperatura de 28°C durante la fase de inducción permite alcanzar mayores
niveles de proteína 5,24 mg/mL así como valores de actividad FTasa más altos en
comparación con trabajos anteriores (93,5 veces más), además de presentar valores de
actividad proteolítica 113 veces menores que los obtenidos a a 20°C.
El efecto de las condiciones de pH, temperatura de reacción, tiempo de incubación y
concentración de sacarosa afectan directamente la actividad enzimática, inhibiendo o
aumentando su acción. Los resultados sugieren los siguientes parámetros: temperatura de
reacción 45°C, 4h de incubación, concentración de sacarosa 1,7M y pH 4.
RECOMENDACIONES
Emplear otros métodos que permitan establecer el fenotipo de los clones de Pichia
pastoris GS115- FTasaopt como el uso de PCR con ADN genómico, utilizando cebadores
que detecten la presencia de uno o dos genes AOX.
Realizar la cuantificación de glucosa, fructosa, sacarosa y FOS mediante HPLC.
Purificar la enzima FTasa recombinante, y caracterizar su comportamiento bajo diferentes
condiciones de reacción.
Emplear células de P. pastoris pPIC9-FTasaopt completas para mediar la síntesis de FOS,
dada la presencia de la enzima recombinante en el periplasma.
41
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45
ANEXOS
Anexo 1
i. Miniprep
a) Pasar los cultivos a viales de 1.5 mL.
b) Centrifugar a 13000 rpm por 1 min a temperatura ambiente.
c) Descartar el sobrenadante y adicionar el cultivo restante.
d) Centrifugar nuevamente a 13000 rpm por 1 min y descartar el sobrenadante.
e) Agregar a cada tubo 100 μL de solución I y mezclar por vórtex (si es posible adicionar
RNAsa de 10 -15 μg/mL).
f) Adicionar 200 μL de solución II a cada y dejar actuar entre 3-5 min.
g) Adicional 150 mL de solución III fría.
h) Incubar 30 min en hielo.
i) Centrifugar 10 min a 4 °C a 13000 rpm.
j) Pasar el sobrenadante a otro tubo y adicional 2 volúmenesisopropanol frío.k) Centrifugar
a 15 min a 4 °C a 13000 rpm velocidad descartar el sobrenadante.
k) Lavar 2 veces con etanol a 70% por 5 min a 13000 rpm.
l) Dejar secar el pellet a temperatura ambiente por aproximadamente 10 min.
m) Reconstituir el pellet en buffer TE 1X.
Anexo 2
ii. Método de Follin-Lowry
a) Agregar 10 μL de cada muestra en un tubo de vidrio.
b) Adicionar 100 μL de SDS (dodecil sulfato de sodio) al 1 % y 100 μl de reactivo de cobre.
c) Mezclaron los tubos y dejar en incubación a temperatura ambiente durante 10 min.
d) Adicionaron 400 μl de reactivo de Folin.
e) Mezclar e incubar en baño serológico por 5 minutos a 55 °C
f) Incubación durante 5 minutos a 4 °C.
g) Leer absorbancias a 610 nm en espectrofotómetro
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Anexo 3
iii. Protocolo de Determinación de Actividad Proteolítica:
a) Tomar 1 ml de cada una de las muestras en estudio o de la dilución de las mismas.
b) Agregar a cada una 1 ml de la solución de caseína al 1% (p/v).
c) Preparar el blanco mezclando 1 ml de agua destilada y 1 ml de la solución de caseína al 1%
(p/v).
d) Incubar las muestras a 37ºC durante 30 minutos.
e) Agregar a cada muestra 1 ml de la solución de ácido tricloroacético al 15% (p/v).
f) Colocar las muestras a 4ºC durante 5 minutos para detener la reacción.
g) Centrifugue 20 minutos a 5000 r.p.m.
h) Lea el sobrenadante en espectrofotómetro de luz U.V a 280 nm