INMUNOHISTOQUÍMICA

Métodos inmunoenzimáticos

Métodos inmunoenzimáticos

Utilizan reacciones enzima-sustrato

Fundamento: localizar el producto de reacción de la enzima precipitándolo con un reactivo que permita su visualización al microscopio

Técnicas de inmunoperoxidasas

Son un conjunto de métodos de inmunomarcación que tienen en común la enzima peroxidasa.Cada molécula de peroxidasa es capaz de desdoblar múltiples moléculas de sustrato.La peroxidasa es de origen vegetal y es estable y activa a pH cercano a la neutralidad.

Importancia: Altamente sensible. Pueden ser aplicadas a cortes incluidos en parafina. Costo final bajo.

PEROXIDASA+ AGUA OXIGENADA COMPLEJO PRIMARIO(Enz. Reducida) (Sustrato) (Oxidación del grupo hemo)

DAB (Dador de elect.)

COMPLEJO SECUNDARIO Se disocia

Enz. Reducida DAB oxidado Precipitado marrón insoluble

Solubles en solventes orgánicos: 4-Cl-1-Naftol (Azul) y el 9 etil-3 aminocarbazol (Rojo)

INMUNOFLUORESCENCIA INMUNOPEROXIDASA

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Menor sensibilidad Mayor sensibilidad-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Cortes frescos o congelados Cortes congeladosCortes incluidos en parafina Cortes flotantes

Cortes incluidos en parafina ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Pobre conservación de la morfología Excelente conservación de la morfología. -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Breve conservación de la marcación Conservación indefinida de la por pérdida paulatina de la fluorescencia marcación------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Se utiliza microscopio de fluorescencia Se utiliza microscopio de campo claro ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Buena marcación de antígenos Buena marcación de antígenos

extracelulares y ligandos de membrana citoplasmáticos y nucleares

------------------------------------------------------------------------------------------------------------ -----------------

Método Directo

Métodos de coloración

Método Indirecto

Método con anticuerpo antiperoxidasa

Métodos de coloración

Complejo peroxidasa-antiperoxidasa

Reacción de PAP

Métodos de coloración

Técnicas que utilizan la proteína A

Métodos de coloración

Métodos de coloración

Métodos que utilizan biotina-(strept)avidina

Tecnología LAB o LSAB

Métodos que utilizan biotina-(strept)avidina

Tecnología ABC

Métodos de coloración

Métodos de coloración

FORMAS DE AMPLIFICAR LAS INMUNOMARCACIONES

Repitiendo una o dos veces el 2do o 3er paso. Amplificación catalizada de la señal: Se realiza la primer reacción con LSAB o ABC. Se agrega un sustrato fenólico biotinilado

(Biotiniltiramida). Se depositan fenoles biotinilados insolubles. Se realiza la segunda reacción con LSAB o ABC. Se revela con DAB.

Métodos de coloración

Amplificación catalizada de la señal

Tecnología de polímeros conjugados. Método Indirecto

Polímeros polivalente

Métodos de coloración

LOCALIZACIÓN SIMULTÁNEA DE DOS ANTÍGENOSLOCALIZACIÓN SIMULTÁNEA DE DOS ANTÍGENOS

Realizar un único desenmascaramiento.Realizar un único desenmascaramiento. Primera determinación:Primera determinación: El antígeno que está en mayor proporción.El antígeno que está en mayor proporción. Antígeno nuclear.Antígeno nuclear. El anticuerpo primario preferiblemente policlonal.El anticuerpo primario preferiblemente policlonal. Revelado con DAB.Revelado con DAB. Elución ácida.Elución ácida. Segunda determinación:Segunda determinación: Revelado con Revelado con 4-Cl-1-Naftol (Azul) o el 9 etil-3 4-Cl-1-Naftol (Azul) o el 9 etil-3

aminocarbazol (Rojoaminocarbazol (Rojo). Montaje en medio acuoso.Montaje en medio acuoso.

ERRORES Y PROBLEMAS EN LAS TECNICAS DE INMUNOMARCACION

I) Sobremarcación. El problema del background (Coloración de fondo inespecífica).

a) Errores de la fijación. Posible difusión de antígenos solubles. Fenómenos de autólisis. Algunos tejidos no fijados o mal fijados. Excesiva fijación con formalina.

b) Errores en los procesos posteriores. Los alcoholes en general no alteran la marcación. De los aclarantes sólo el acetato de butilo produce un background importante. No renovar los solventes.

c) Errores en la inclusión.Utilizar parafina de bajo punto de fusión. No es recomendable usar celoidinaEn general el background está en relación directa con el tiempo y la temperatura de inclusión.

d) Errores en el corte.-Corte de tejido demasiados gruesos.-La porción cortada contiene efectos de aplastamiento.

e) Errores en el colado. Se recomienda trabajar con portas nuevos y lavados con solución alcohol-ácida. No utilizar albúmina de huevo (Albúmina de Meyer). No utilizar adhesivo en exceso o aplicado irregularmente sobre los portas. Se recomienda derretir la parafina colocando los cortes montados en estufa de 56ºC durante 24 hs. Precaución si el tejido se despegó parcialmente. f) Errores en la eliminación de la parafina.La remoción incompleta del medio de inclusión provoca una tinción de fondo limitada a áreas del tejido.

g) Errores en las incubaciones. Coloración de fondo debido a interacciones hidrofóbicas Coloración de fondo producida por interacciones iónicas Un mal bloqueo de la peroxidasa endógena Actividad endógena ligadora de (Strepta)avidina Incubación con el Ac 1rio Receptores Fc. Reactividad cruzada.

h) Errores en los lavados.

i) Errores del revelado.Tiempo excesivo de revelado.

j) Errores en el contraste. Tiempo excesivo en el contraste.

k) Fuentes misceláneas.La coloración difusa de todos o de la mayoría de los elementos del tejido dentro de un área, puede ser causada por lesión física al tejido o porque tejido se secó antes de la fijación o durante el proceso de IHQ.

II) Submarcación.a) Errores en la fijación e inclusión.Esto es debido fundamentalmente a la destrucción o enmascaramiento del antígeno por un tratamiento indebido o el uso de un reactivo inadecuado.

b) Cortes demasiados finos.

c) Errores en las incubaciones. Se recomienda la no reutilización de los buffer. Utilización de buffer salinos con Anticuerpos monoclonales. Bloqueo excesivo de la peroxidasa endógena. En algunos casos utilizar Tritón X 100 al 0,1-0,4 %. Mala conservación de los anticuerpos. Errores en las incubación con los anticuerpos. Exceso de reactivo que queda en el corte de tejido.

d) Errores en los lavados.

e)Errores del revelado.Esto es debido a tiempos cortos de revelado o la mala composición de la solución reveladora.

f)Fuentes misceláneas.Se debe evitar el uso de azida sódica en diluyentes y buffer.

Inmunohistoquímica aplicada a extendidos citológicos

Recomendaciones:

•Fijación inmediata

•Usar portas silanizados o con carga positiva

•Los extendidos finos en monocapa

•Aplicar técnica de rehidratación (si son muestras hemáticas)

•Fijadores: alcohol 96º (extendidos), metanol frío o acetona fría (cultivos celulares)

•No realizar digestión enzimática como método de recuperación antigénica

•Recuperación con calor a menor temperatura y menor tiempo. Se puede agregar una pequeña cantidad de detergente a la solución recuperadora

•Tratamiento con cloroformo para ciertos antígenos de membrana

•Mayor bloqueo de peroxidasa endógena

•Bloqueo de biotina (si se utiliza biotina-avidina)

•El contraste nuclear se hará con mayor tiempo de coloración y virado