aislamiento y caracterizaciÓn de la enzima
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Instituto de Ciencias Biológicas
Programa de Doctorado en Ciencias, Mención Ingeniería Genética Vegetal
AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE LA ENZIMA
RAMNOGALACTURONANO ENDOLIASA INDUCIDA DURANTE LA
MADURACIÓN DE FRUTOS DE FRAGARIA CHILOENSIS (L.) MILL.
ANGELA ARLETTE MÉNDEZ YÁÑEZ
Doctora en Ciencias, Mención Ingeniería Genética Vegetal
Directora de Tesis: Dra. María Alejandra Moya León
Talca, Septiembre de 2019
II
“Es, pues, la fe la certeza de lo que se espera, la convicción de lo que no se ve”
Hebreos 11:1
III
“Aislamiento y caracterización de la enzima ramnogalacturonano endoliasa inducida durante la
maduración de frutos de Fragaria chiloensis (L.) Mill.”
“Isolation and characterization of rhamnogalacturonan endolyase enzyme induced during the
ripening of Fragaria chiloensis (L) Mill. fruit”
Candidata a Doctora: Angela Arlette Méndez Yáñez
Fecha de inicio : Noviembre 02 de 2014
Fecha de término : Enero 31 de 2018
Profesor Guía
Dra María Alejandra Moya León
Instituto de Ciencias Biológicas
Universidad de Talca
2 Norte 685, Casilla 747, Talca
Integrantes de la Comisión Evaluadora
Dr. Carlos Figueroa Lamas
Universidad de Talca
Dr. Mauricio Arenas Salinas
Universidad de Talca
Dr. Michael Geoffrey Handford
Universidad de Chile
IV
AGRADECIMIENTOS
Agradezco a Dios el regalo esta maravillosa oportunidad de poder ver su gloria y majestad
en todo lo creado a través de esta investigación. Como dice en Romanos 1:20: “Porque las cosas
invisibles de Él, su eterno poder y deidad, se hacen claramente visibles desde la creación del
mundo, siendo entendidas por medio de las cosas hechas, de modo que no tienen excusa”.
A mi padres, Angélica y Carlos, agradezco por sus constantes oraciones, inefable amor y
paciencia durante toda la vida, y en particular durante estos últimos años.
Al amor de mi vida, que hoy crece en mi vientre, agradezco la energía y las fuerzas que
me ha regalado para alcanzar la meta de titulación del grado académico de Doctora.
A mis hermanos Carolina y Mauricio, y a los regalones de mi corazón Matías, Anais y
Rafaela, agradezco el amor incondicional que me han brindado.
A la Doctora María Alejandra Moya, por su apoyo incesante y por las sugerencias
brindadas, las cuales fueron claves para construir y pulir este trabajo.
Al personal del Instituto de Ciencias Biológicas, especialmente a Victoria Ruz y Felicindo
Chávez, quienes alegraron mis días con sus sonrisas y palabras de aliento.
Finalmente, agradezco a CONICYT por el financiamiento otorgado a través de la Beca
Doctorado Nacional y al Programa de Doctorado en Ciencias mención Ingeniería Genética
Vegetal de la Universidad de Talca, que financió mi asistencia a la Reunión de Biología Vegetal
entre los años 2014 y 2017.
V
ÍNDICE DE MATERIAS
PRIMERA PÁGINA III
AGRADECIMIENTOS IV
ÍNDICE DE MATERIAS V
ABREVIATURAS X
RESUMEN XIII
ABSTRACT XV
VI
INTRODUCCIÓN GENERAL 1
1. FORMULACIÓN DEL MARCO TEÓRICO 2
2. ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS 4
2.1. Fragaria chiloensis: madre de la frutilla comercial ............................................................. 4
2.2. Genética de Fragaria chiloensis ........................................................................................... 5
2.3. La maduración de frutos ....................................................................................................... 6
2.4. Regulación hormonal en la maduración de frutos ................................................................ 7
2.5. La pared celular vegetal ........................................................................................................ 8
2.6. Pectinas ................................................................................................................................. 9
2.7. Ramnogalacturonano-I ........................................................................................................ 11
2.8. Enzimas remodeladoras de pared celular vegetal ............................................................... 13
2.9. Ramnogalacturonano endoliasa .......................................................................................... 14
3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 18
4. FORMULACIÓN DE LA HIPÓTESIS 19
5. OBJETIVOS GENERALES Y ESPECÍFICOS 20
5.1. Objetivo general .................................................................................................................. 20
5.2. Objetivos específicos .......................................................................................................... 20
CAPÍTULO I: BÚSQUEDA E IDENTIFICACIÓN DEL GEN FchRGL1 21
1. INTRODUCCIÓN 22
1.1. Fisiología y maduración de frutos ...................................................................................... 22
1.2. Enzimas de maduración del género Fragaria ...................................................................... 24
1.3. Ramnogalacturonano endoliasa: pasado y presente ............................................................ 25
2. MATERIALES Y MÉTODOS 30
2.1. Material biológico vegetal .................................................................................................. 30
2.2. Determinación de parámetros fisiológicos .......................................................................... 30
VII
2.3. Búsqueda in silico del gen FchRGL1 ................................................................................. 33
2.4. Extracción de RNA ............................................................................................................. 34
2.5. Síntesis de cDNA ................................................................................................................ 34
2.6. Amplificación del marco abierto de lectura del gen FchRGL1 .......................................... 35
2.7. Clonamiento del marco de lectura abierto y secuenciación ................................................ 36
2.8. Análisis bioinformático de la secuencia ............................................................................. 37
2.9. Expresión génica de FchRGL1 en fruto completo y tejido vegetativo ............................... 37
2.10. Análisis estadístico de RT-qPCR ........................................................................................ 38
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 39
3.1. Análisis de parámetros fisiológicos: peso, tamaño y firmeza ............................................. 39
3.2. Análisis de color ................................................................................................................. 43
3.3. Análisis de parámetros fisiológicos: sólidos solubles y acidez titulable ............................ 44
3.4. Obtención del gen FchRGL1 .............................................................................................. 47
3.5. Obtención experimental y análisis in silico del gen FchRGL1 ........................................... 52
3.6. Expresión relativa de FchRGL1 en fruto y tejido vegetativo ............................................. 58
4. CONCLUSIONES 62
CAPÍTULO II: CLONAMIENTO, EXPRESIÓN HETERÓLOGA Y CARACTERIZACIÓN DE
LA ENZIMA FchRGL1 64
1. INTRODUCCIÓN 65
1.1. Expresión heteróloga de proteínas recombinantes .............................................................. 65
1.2. Expresión heteróloga de enzimas de plantas ...................................................................... 66
1.3. Caracterización de RG-liasas .............................................................................................. 66
2. MATERIALES Y MÉTODOS 69
2.1. Clonamiento de FchRGL1 en el vector de expresión ......................................................... 69
2.2. Electrotransformación de P. pastoris X-33 con el vector de expresión ............................. 70
2.3. Crecimiento de P. pastoris X-33 transformadas heterólogamente ..................................... 72
2.4. Purificación de la proteína .................................................................................................. 72
2.5. Cuantificación de actividad RGL y caracterización de la proteína heteróloga ................... 73
VIII
2.6. Estructura tridimensional de la enzima FchRGL1 .............................................................. 74
2.7. Minimización y docking de la enzima FchRGL1 con RG-I ............................................... 75
3. RESULTADOS 76
3.1. Expresión heteróloga de FchRGL1 ..................................................................................... 76
3.2. Ensayos de actividad enzimática de FchRGL1 ................................................................... 81
3.3. Estructura 3D de FchRGL1 y su interacción proteína – ligando in silico .......................... 93
4. CONCLUSIONES 104
CAPÍTULO III: REGULACIÓN HORMONAL DE LA TRANSCRIPCIÓN DE FchRGL1 105
1. INTRODUCCIÓN 106
1.1. Regulación transcripcional de enzimas de pared celular .................................................. 106
1.2. Regulación hormonal de la expresión génica en frutos .................................................... 107
2. MATERIALES Y MÉTODOS 109
2.1. Material vegetal ................................................................................................................ 109
2.2. Tratamientos hormonales con ABA y AUX y sus respectivos inhibidores ...................... 109
2.3. Extracción de RNA y síntesis de cDNA ........................................................................... 111
2.4. Análisis de la expresión génica de FchRGL1 por RT-qPCR en frutos con tratamientos
hormonales .................................................................................................................................... 111
2.5. Análisis estadísticos de RT-qPCR .................................................................................... 111
2.6. Extracción de DNA genómico .......................................................................................... 111
2.7. Construcción de librerías y Genome Walking en DNA de F. chiloensis ......................... 112
2.8. Búsqueda y análisis in silico de los elementos en cis de F. vesca .................................... 112
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 113
3.1. Expresión relativa del gen FchRGL1 en frutos con tratamientos hormonales .................. 113
3.2. Tratamientos con ABA y FLUO ....................................................................................... 114
3.3. Tratamientos con AUX y TIBA ........................................................................................ 114
3.4. Elementos en cis presentes en el promotor de RG-liasa de F. vesca ................................ 117
IX
4. CONCLUSIONES 122
CONCLUSIONES GENERALES 123
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 127
ANEXOS 146
1. Presentaciones a congresos 147
1.1. Resumen IX Reunión de Biología Vegetal, La Serena – Chile, 2014 .............................. 147
1.2. Resumen X Reunión de Biología Vegetal, Valdivia – Chile, 2015 ................................. 149
1.3. Resumen International Plant Molecular Biology Congress, Iguazú – Brasil, 2015 ......... 150
1.4. Resumen XI Reunión de Biología Vegetal, Termas de Chillán – Chile, 2016 ................. 151
1.5. Resumen XII Reunión de Biología Vegetal, Pucón – Chile, 2017 ................................... 152
1.6. Resumen Second International Conference in Bioinformatics, Simulations and Modeling
(iCBSM) 2017 ............................................................................................................................... 153
2. Publicaciones 154
2.1. Glycosylation is important for FcXTH1 activity as judged by its structural and biochemical
characterization .............................................................................................................................. 154
2.2. Characterization of a ripening-related transcription factor FcNAC1 from Fragaria
chiloensis fruit. .............................................................................................................................. 155
2.3. Isolation of a rhamnogalacturonan lyase from the Chilean strawberry fruit and its biochemical
characterization .............................................................................................................................. 156
MATERIAL SUPLEMENTARIO 157
X
ABREVIATURAS
°Bx : Grados brix
ABA : Ácido abscísico
AFasa : α-arabinofuranosidasa
AGPs : Arabinogalactanos
ANA : Ácido naftalen acético
Ara : Arabinosa
AT : Acidez titulable
AUX : Auxina
AX : Arabinoxilano
βGal : β-galactosidasa
BMGY : Buffered Glycerol-complex Medium
BMMY : Buffered Methanol-complex Medium
pb : Pares de bases
βXil : β-xilosidasa
C* : Croma
CAZy : Carbohydrate-Active enZYmes Database
CBM : Módulo de unión a carbohidratos
CDD : Conserved Domains Database
cm : Centímetro
CSS : Contenido de sólidos solubles
CTAB : Bromuro de cetilmetilamonio
CZE : Capillary zone electrophoresis
DE : Desviación estándar
DEPC : Pirocarbonato de dietilo
DNA : Ácido desoxirribonucleico
EC : Enzyme commission
EGasa : Endoglucanasa
XI
FLUO : Fluoridona
FnIII : Fibronectina tipo III
FPKMs : Fragmentos por kilobase de exón por millón
Fuc : Fucosa
Gal : Galactosa
GalA : Ácido galacturónico
GAPDH : Gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa
Glc : Glucosa
GlcA : Ácido glucurónico
h° : Hue
HEPES : 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid
HGA : Homogalacturonano
kV : Kilovolts
LAXI : Lb, ampicilina, X-Gal e IPTG
LB : Luria-Bertani
LG : Fruto estadio verde grande
MCS : Sitio múltiple de clonamiento
min : Minutos
mRNA : RNA mensajero
mU : Miliunidades
N : Newton
NDGA : Ácido nordihidroguaiarético
NMR : Resonancia magnética nuclear
ns : nanosegundos
OD : Densidad óptica
OD600 : Densidad óptica cuantificada a 600 nm de absorbancia
ORF : Marco abierto de lectura
PDB : Protein Data Bank
PG : Poligalacturonasa
PIPES : Piperazine-N,N’-bis(2-ethanesulfonic acid)
R : Fruto estadio maduro
XII
Rha : Ramnosa
RG-I : Ramnogalacturonano-I
RG-II : Ramnogalacturonano-II
RG-liasa : Ramnogalacturonano endoliasa
RNA : Ácido ribonucleico
rxn : Reacción
seg : Segundos
SG : Fruto estadio verde pequeño
T : Fruto estadio de transición
TE : Tris y EDTA
TIBA : Ácido 2, 3, 5-triiodobenzoico
U : Unidades
VMD : Visual Molecular Dynamics
XG : Xiloglucano
XTH : Xiloglucano endotransglicosilasa/hidrolasa
Xyl : Xilosa
YPD : Yeast Extract Peptone Dextrose Medium
YPDS : YPD + sorbitol
XIII
RESUMEN
La maduración de frutos es un proceso que involucra la sumatoria de eventos que ocurren
a nivel molecular. La coordinación espacio-temporal de ellos favorece cambios que inducen el
desarrollo de un fruto atractivo para el consumo, con cualidades particulares como aroma, sabor,
textura y color, que lo hacen único. Particularmente, las modificaciones de la textura durante la
maduración se encuentran estrechamente relacionadas con el metabolismo de la pared celular,
donde se aprecia la activa participación de enzimas como glicosil hidrolasas y liasas.
Fragaria chiloensis (L.) Mill. es un fruto endémico de Chile con exóticas cualidades
organolépticas, sin embargo su comercialización y consumo se ve dificultado a causa de su
rápida pérdida de firmeza, responsable de su breve vida útil de postcosecha. Se ha comprobado
que el principal polisacárido metabolizado y solubilizado durante la maduración de este fruto
son las pectinas, principalmente ramnogalacturonano I (RG-I). Hoy en día, se conocen enzimas
pertenecientes a la propia maquinaria molecular del fruto que actúan modificando las cadenas
laterales de RG-I, no obstante la información reportada sobre la escisión del esqueleto central
de este polisacárido es escasa.
A partir del transcriptoma de frutos de F. chiloensis, se identificó un contig que codificaría
para una enzima con actividad catalítica sobre el esqueleto de RG-I, una ramnogalacturonano
endoliasa (RGL4, EC number 4.2.2.23), cuyos niveles de FPKMs (Fragmentos por kilobase de
exón por millón) incrementan a través del proceso de maduración del fruto. Se aisló la secuencia
codificante completa de FchRGL1 de 3.328 pb, que codifica para una proteína de 676 residuos
aminoacídicos. Por medio de análisis in silico se comprobó que ésta proteína presenta los tres
dominios funcionales de las RG-liasas: dominio RGL4, fibronectina tipo III (FNIII) y módulo
de unión a carbohidratos (CBM). Además, presenta los residuos aminoacídicos clave para la
actividad enzimática y de coordinación con ion Ca2+. Mediante análisis de RT-qPCR se
corroboró que la expresión del transcrito se incrementa a lo largo del proceso de maduración del
fruto de F. chiloensis; también se expresa en tejidos en constante expansión como tallo, estolón
y raíz. La cuantificación de actividad RG-liasa en extractos proteícos de fruto evidenció un
notable incremento a medida que el fruto madura.
XIV
Se realizó el modelado por homología de la enzima, utilizando como estructura de
referencia el cristal de una RG-liasa del hongo saprófito Aspergillus aculeatus, donde ambas
secuencias comparten un 28% de identidad. El modelo fue evaluado con servidores
bioinformáticos que permitieron determinar la construcción de una estructura robusta. La
proteína fue colocada en una caja de agua neutralizada con CaCl2. Luego de 1,5 ns de dinámica
molecular, la proteína alcanzó su estabilidad con un valor de RMSD de ~5,4 Å.
La expresión heteróloga de la secuencia codificante (FchRGL1) en la levadura Pichia
pastoris permitió purificar la proteína y con ella realizar la caracterización bioquímica. Las
condiciones óptimas para la cuantificación de actividad enzimática son: pH 5,0, entre 20ºC y
30ºC, 0,2 mg/mL RG-I de papa como sustrato y presencia de 2 mM Ca2+. El valor de KM para
RG-I de papa es de 0,2 mg/mL y Vmáx de 769,2 mU/mg. Adicionalmente, la enzima sufre
inhibición a concentraciones elevadas de sustrato. Por otro lado, la enzima es capaz de degradar
el mucílago producido por semillas de Arabidopsis thaliana en germinación que es rico en RG-
I.
Tratamientos de frutos con hormonas permitieron demostrar que ABA induce la expresión
del gen FchRGL1, mientras que AUX la inhibe. En el análisis in silico del promotor del gen que
codifica para la enzima RG-liasa en Fragaria vesca, se observó la presencia de elementos en
cis capaces de responder a dichas hormonas.
El conocer las propiedades de esta enzima que es capaz de degradar el esqueleto central
de RG-I, componente importante de las pectinas, contribuye a comprender de mejor manera el
desensamblaje de la pared celular que se produce durante la maduración de frutos de frutilla y
que conduce al ablandamiento de los frutos y a su breve vida útil.
XV
ABSTRACT
Fruit ripening is a process that involves the sum of events that occur at the molecular level.
The spatio-temporal coordination of them promotes several changes that induce the
development of an attractive fruit to eat, with particular qualities such as aroma, taste, texture
and color, which makes it unique. Particularly, texture modifications during ripening are closely
related to the cell wall metabolism, where the active participation of enzymes such as glycosyl
hydrolases and lyases is observed.
Fragaria chiloensis (L.) Mill. is a Chilean endemic fruit with exotic organoleptic
properties, however its commercialization and consumption has been difficult due to its fast loss
of firmness, responsible of its short postharvest shelf-life. It has been proven that the main cell
wall polysaccharide metabolized and solubilized during ripening are the pectins, primarily
rhamnogalacturonan I (RG-I). Nowadays, it is already known that enzymes belonging to the
fruit molecular machinery act on the side chains of RG-I, however the information reported on
the cleavage of the backbone of this polysaccharide is scarce.
From the transcriptome of F. chiloensis´s fruit a contig was identified that could code for
an enzyme with catalytic activity on the backbone of RG-I, a rhamnogalacturonan endolyase
(RGL4, EC number 4.2.2.23), whose FPKMs (Fragments Per Kilobase Million) values
increased throughout the ripening process. The coding sequence of FchRGL1 of 3328 pb was
isolated, which codes for a protein of 676 amino acid residues. In silico analysis demonstrated
that the translated protein presents the three functional domains of RG-Lyases: RGL4 domain,
fibronectin type III (FNIII) and carbohydrate binding module (CBM). In addition, it presents
the key amino acid residues for activity and coordination with Ca2+. Analysis by RT-qPCR
confirmed that the expression level of FchRGL1 transcripts increases throughout the ripening
process of F. chiloensis fruit, and that it is also expressed in constantly expanding tissues such
as stem, runners and roots. The quantification of RG-lyase activity in protein extracts prepared
from fruits evidenced a remarkable increase as the fruit ripens.
The homology modeling of the enzyme was performed using as reference the structure of
RG-lyase of the saprophyte fungus Aspergillus aculeatus, where both sequences share 28%
XVI
identity. The model was evaluated with bioinformatic servers that allowed the construction of a
robust structure. The protein was placed in a water box neutralized with CaCl2. After 1.5 ns of
molecular dynamics, the protein reached its stability with a RMSD value of ~5.4 Å.
The heterologous expression of the coding sequence (FchRGL1) in Pichia pastoris
allowed the purification of the protein and its biochemical characterization. The optimum
conditions for the enzymatic assay are: pH 5.0, between 20ºC and 30ºC, 0.2 mg/mL of potato
RG-I as substrate and the presence of 2 mM Ca2+ ions. The KM value for potato RG-I is 0.2
mg/mL and VMAX of 769.2 mU/µg. Additionally the enzyme undergoes inhibition at high
substrate concentrations. On the other hand, the enzyme is able to degrade the mucilage
produced by germinating Arabidopsis thaliana seeds which is rich in RG-I. Finally, the
quantification of RG-lyase activity in fruit protein extracts showed a remarkable increase in
RGL activity as the fruit ripens.
Hormonal treatments allowed us to demonstrate that ABA induces the expression of
FchRGL1 gene, while AUX inhibits it. The in silico analysis of the promoter of the gene
encoding for RG-lyase in Fragaria vesca contains cis elements able to respond to these
hormones.
Knowing the properties of this enzyme that is capable to degrade the central backbone of
RG-I, an important component of pectins, helps to better understand the disassembly of the cell
wall that occurs during the ripening of strawberry fruits that leads to the softening of the fruit.
1
INTRODUCCIÓN GENERAL
2
1. FORMULACIÓN DEL MARCO TEÓRICO
Chile, país lleno de bondades agronómicas y forestales, posee una riqueza incalculable en
flora y fauna. Según los reportes entregados por la Sociedad Nacional de Agricultura de Chile
en el año 2014, se utilizaron 221.995 hectáreas plantadas con variedades frutales, y se generaron
US$1.985 millones FOB gracias a las exportaciones de 2,14 millones de toneladas de fruta
fresca (ODEPA, 2014). Dentro de este contexto, existe un gran potencial a nivel territorial y de
especies que pueden ser cultivadas a gran escala, debido a su valor y calidad nutricional tales
como arándanos, maqui, calafate y frutilla blanca, entre otros.
En la localidad de Purén, ubicada a 617 kilómetros al sur de Santiago, se encuentran los
principales huertos productores de frutilla blanca o Fragaria chiloensis (L.) Mill. A pesar de ser
poco conocida a nivel nacional, quienes han tenido la oportunidad de conocer este fruto lo
describen como exótico y aromático. Cada hectárea cultivada puede producir potencialmente 11
toneladas (Ortega, 2013), sin embargo el escaso interés en su producción y su breve período de
producción y comercialización, lo hacen un fruto poco rentable. Para los investigadores y
científicos, F. chiloensis se ha convertido en un fruto de estudio relevante debido a las
cualidades organolépticas que posee y sobre todo, porque a partir de la cruza de esta especie con
F. virginiana se originó F. x ananassa, la variedad de frutilla comercializada a nivel mundial
que se ha adaptado a una gran variedad de climas. Fenotípicamente, F. chiloensis se diferencia
de su descendiente F. x ananassa en el color del receptáculo, donde la primera presenta un
receptáculo blanco rosáceo en la madurez. Además, los aquenios debido a la acumulación de
antocianinas, presentan un color rojizo a partir del estadio verde grande. Los frutos de F.
chiloensis presentan un particular e intenso aroma que rememora a las piñas. La vida útil de
postcosecha de este fruto es breve, dado que pierde rápidamente su firmeza y al cabo de un par
de días a temperatura ambiente es colonizado completamente por microorganismos (Méndez-
Yáñez 2018, datos no publicados).
Estudiar el fenómeno de maduración y pérdida de firmeza desde diferentes aristas, podría
contribuir al descubrimiento de factores claves que aceleran o retardan este proceso. Algunos
investigadores han logrado determinar algunas de las causas que contribuyen al fenómeno de
ablandamiento: (1) cambios en la composición de los polisacáridos de la pared celular; (2)
producción espacio temporal de diversas hormonas; (3) participación de una multiplicidad de
proteínas/enzimas. Dentro de este último grupo, se ha descrito un sinnúmero de proteínas y
3
enzimas, tales como hidrolasas y liasas, que actúan sobre los carbohidratos de la pared celular,
las cuales incrementan o disminuyen a través de los distintos estadios de desarrollo del fruto.
En el caso particular de F. chiloensis, se sabe que en etapas intermedias del desarrollo, entre los
estadios verde grande y de transición, hay una disminución de un 33% en la cantidad de pectinas
totales (Figueroa, 2008). Esto, estaría asociado a la pérdida de azúcares neutros como ramnosa
(Rha), arabinosa (Ara) y glucosa (Glc). En el caso de Fragaria x ananassa, se ha observado una
mayor despolimerización en la etapa final de la maduración (Figueroa, 2008). La mayor
solubilización de pectinas en F. chiloensis fue determinada en la fracción unida covalentemente,
donde se encontrarían las pectinas del tipo ramnogalacturonano I (RG-I). Por otra parte, al
evaluar la composición de monosacáridos que componen la pared celular, los constituyentes de
pectinas varían de forma notable durante el desarrollo de frutos de F. chiloensis, particularmente
en el contenido de galactanos correspondientes a RG-I. Este cambio se presenta sólo en F.
chiloensis y no en F. x ananassa (González, 2012).
Al día de hoy, se ha identificado en el transcriptoma de F. chiloensis 18 secuencias génicas
que potencialmente codificarían para RG-liasa (Méndez-Yáñez 2018, datos no publicados).
Entre ellas, existe una secuencia que presenta un notorio incremento en sus niveles de transcritos
a medida que el fruto madura y pierde su firmeza. El disponer de mayor información acerca del
rol que cumple esta enzima en el desensamblaje de la pared celular podría contribuir a una
comprensión integral de los mecanismos moleculares involucrados en el desensamblaje de la
pared celular que se aprecia durante la maduración de frutos de F. chiloensis.
4
2. ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS
2.1. Fragaria chiloensis: madre de la frutilla comercial
Previo a la llegada de los españoles a Chile, la literatura describe que F. chiloensis era un
fruto cultivado únicamente por Mapuches y Huilliches. En una de las batallas de la Guerra de
Arauco donde los españoles ganaron, se encontraron con este delicioso premio: cultivares de F.
chiloensis. Lo anterior, permitió que este fruto fuera llevado a Cuzco, Perú en el año 1557 y
apodado “Chili”. A comienzos del siglo XVIII, F. chiloensis realizó un gran viaje cruzando
inclusive mares, para convertirse en la madre de la frutilla comercial. Por encargo del Rey Luis
XIV, el teniente coronel Amédée François Frézier, ingeniero de profesión y botánico de afición,
fue enviado a una misión de reconocimiento para estudiar las fortificaciones construidas en las
colonias españolas de Chile y Perú. Específicamente, en la ciudad de Concepción fue donde
Frézier encontró plantas de F. chiloensis, donde las describió y dibujó en un trozo de papel
(Figura 1). Del total de plantas colectadas desde este lugar de origen, solo cinco resistieron el
largo viaje de seis meses por los mares y arribaron finalmente a Marsella en agosto de 1714, a
la corte del Rey Luis XIV (Darrow, 1966).
Una vez que F. chiloensis llegó a Francia, las cinco plantas que resistieron el viaje fueron
repartidas y rápidamente prosperaron ya que el clima era idóneo para su crecimiento, sin
embargo, los botánicos de la época se encontraron con la problemática de que las plantas no
fructificaban. Sólo las plantas hembras que eran fertilizadas con polen de algunas especies en
particular eran fructíferas (Duchesne, 1766). Entre cultivares de Fragaria virginiana y Fragaria
moschata, fue plantada F. chiloensis. Los botánicos de ese tiempo asombrados, mencionan en
la literatura que obtuvieron frutos de siete pulgadas y media de circunferencia, llamándolas
barbary strawberries. Duchesne vio por primera vez un fruto de su híbrido de F. x ananassa en
1765, y en sus escritos de 1766, aclara que dadas las características fenotípicas de la nueva
especie obtenida, los parentales no podían ser otros que F. chiloensis y F. virginiana. Esta nueva
especie fue colocada en el árbol genealógico como un intermediario entre ambas especies
mencionadas anteriormente, donde F. chiloensis sería la madre de F. x ananassa, fertilizada por
F. virginiana.
5
Figura 1. Fragaria chiloensis encontrada en lo que hoy es Concepción, Chile y trasladada por
Amédée François Frézier a Francia en el año 1714. La imagen fue descrita por Frézier: “La fresa
chilena dibujada en su tamaño natural, mostrando frutas, pero no flores; y en latín: "Fragaria
Chiliensis, fructu máximo, foliis carnosis hirsutis, vulgo frutilla”, que traducido al español dice:
“Fresa chilena con frutas grandes y correosas, hojas hirsutas comúnmente conocida como
frutilla”. Imagen extraida de Darrow, 1966.
2.2. Genética de Fragaria chiloensis
F. chiloensis es un fruto perteneciente a la familia Rosaceae, dentro de la cual existen
~2500 especies subclasificadas en ~90 géneros. Los miembros de la familia se encuentran
6
distribuidos en todo el mundo, dependiendo del clima, su importancia comercial radica en el
hecho de que es posible comercializarlas como plantas ornamentales y como frutos frescos y
secos (Yamamoto y Terakami, 2016).
A nivel genómico, la ploidía de las especies pertenecientes a la familia Rosaceae varía.
Particularmente en el género Fragaria, existen cinco niveles de ploidía, desde diploide hasta
decaploide. F. chiloensis es una especie octoploide (2n = 8x= 56) de la cual no se sabe qué
especies ancestrales diploides contribuyeron al genoma octoploide de ésta (Yang y Davis,
2017). A nivel de diversidad y estructura genética, se ha establecido que las poblaciones de F.
chiloensis en la costa de California están compuestas por diversos genotipos, posiblemente
atribuido a la dispersión de semillas. En el caso de las plantas encontradas en nuestro país, el
cultivo y domesticación sería la principal causa de la reducida diversidad genética (Carrasco y
cols., 2007). En F. x ananassa se observa un fenómeno contrastante, donde los perfiles genéticos
son muy diversos, mostrando alta heterocigocidad y diversidad genética (Ferreira y cols., 2013).
2.3. La maduración de frutos
En frutos, la maduración es la suma de eventos bioquímicos y moleculares que ocurren a
nivel celular y tisular, que le permiten a éste desarrollar características organolépticas atractantes
para animales e insectos para que puedan dispersar sus semillas (Brummell, 2006). Los cambios
que ocurren en la textura, sabor, aroma y color son característicos en cada género y especie,
donde además pueden influir factores genéticos y ambientales en el proceso. Para que un fruto
alcance el estadio de fruto maduro, deben ocurrir diferentes cambios fisiológicos a lo largo de
su vida: (1) reducción en el contenido de clorofila y acumulación de carotenoides y/o
flavonoides, que le otorgan el color al fruto; (2) cambios en los perfiles de azúcares, ácidos
orgánicos y compuestos volátiles que influyen en la calidad nutricional, sabor y aroma; y (3)
modificación en el contenido y conformación de los polisacáridos de la pared celular que afectan
la textura del fruto (Giovannoni, 2004).
Una de las características que cambia drásticamente en el proceso de maduración es la
textura, donde la pérdida de firmeza está estrechamente relacionada con la breve vida útil de
postcosecha. La compleja red de polisacáridos de la pared celular se ve alterada con la aparición
de especies reactivas de oxígeno, quelación de iones de Ca2+ y cross-linking de borato (Fry,
7
2004). La actividad catalítica de enzimas presentes en la pared celular, facilita la escisión de los
diferentes polisacáridos, rompiendo así las fuerzas intra e intermoleculares que mantienen a esta
red firmemente unida (Payasi y cols., 2009).
En el caso particular de la frutilla, la degradación de la lamela media de las células
corticales del parénquima, genera un mayor espacio intercelular y con ello el ablandamiento del
fruto (Perkins-Veazie y Huber, 1992; Redgwell y Fry, 1993). Es por esta razón que su
comercialización debe ser rápida para evitar las mermas a causa de la pérdida de las cualidades
organolépticas.
2.4. Regulación hormonal en la maduración de frutos
Se ha establecido una clasificación general en la maduración de frutos de acuerdo a los
mecanismos regulatorios involucrados: frutos climatéricos y no climatéricos (Tripathi y cols.,
2016). Los frutos climatéricos presentan un incremento en los niveles de etileno y de la tasa
respiratoria (Lelievre y cols., 1997). Etileno, es una hormona que induce y coordina la
maduración de frutos climatéricos. En tomate, se han identificado mutantes que presentan
deficiencia en la producción de etileno cuyos frutos nunca alcanzan el estadio de fruto maduro:
ripening-inhibitor (rin), nonripening (nor) y colourless non-ripening (cnr); además éstos
mutantes no responden a las aplicaciones exógenas de etileno (Gapper y cols., 2013). Por otra
parte, en los frutos no climatéricos como uva, naranja y piña, existe ausencia del peak
respiratorio y no existe alza de producción de etileno. Dentro del grupo de los frutos no
climatéricos, frutilla es uno de los más estudiados debido a su apetecido consumo por los
compradores, fácil propagación, tamaño pequeño, breve periodo vegetativo y rápido desarrollo
frutal (Perkins-Veazie, 1995).
Además de la influencia del etileno en la maduración de frutos, existen otras hormonas
que pueden acelerar o retardar el proceso. Por ejemplo, la aplicación exógena de ácido abscísico
(ABA) retarda la maduración en frutos de arándano (Buran y cols., 2012) y la promueve en
frutos de F. x ananassa (Jia y cols., 2011). Tratamientos con el inhibidor de la biosíntesis de
ABA, fluoridona o ácido nordihidroguaiacético (NDGA), retardan la maduración y
ablandamiento de frutos de Solanum lycopersicum (Zhang y cols., 2009). La hormona auxina
(AUX), también puede influir en el retraso o inhibición de la maduración, además de alterar la
8
expresión de genes que regulan el desarrollo (Trainotti y cols., 2005; Cohen, 1996; Davies y
cols., 1997); su efecto se ha comprobado mediante la aplicación del inhibidor del transporte
polar de AUX, ácido 2, 3, 5-triiodobenzoico (TIBA) (Li y cols., 2012).
Symons y cols. (2012), han sugerido la existencia de patrones hormonales en F. x
ananassa que difieren a lo observado en otros frutos no climatéricos, ya que el fruto verdadero
corresponde a los aquenios presentes en la capa epidermal. En ellos, se sintetiza AUX en los
estadios tempranos del desarrollo disminuyendo gradualmente para dar paso al incremento de
ABA en estadios tardíos. En F. chiloensis, los cambios hormonales mencionados anteriormente
en ABA y AUX son transcendentales en la regulación transcripcional de genes que codifican
para enzimas de pared celular como FcXTH1 y FcXTH2 (Opazo y cols., 2013), FcEXP2
(Figueroa y cols., 2009) y FcEG y FcPG (Lizana 2015, datos no publicados). Estas, entre otras
enzimas, modifican esta compleja red por medio de reacciones como hidrólisis,
transglicosilaciones y b-eliminaciones, entre otras.
2.5. La pared celular vegetal
La pared celular de plantas superiores es una red fuerte y compleja formada
principalmente por la interacción de polisacáridos, iones y proteínas (Cosgrove, 2005). Esta
estructura debe adaptarse a los cambios en las células a través del desarrollo, donde ocurre una
expansión irreversible y coordinada con las células vecinas (Somerville y cols., 2004). La
composición de la pared celular puede variar en cada tejido y especie (Burton y cols., 2010;
Sorensen y cols., 2011), y puede sufrir modificaciones espacio-temporales que promueven
cambios dinámicos a lo largo de la vida de la célula.
Los polisacáridos representan ~90% del peso seco de la pared celular primaria (Pettolino
y cols., 2012). En plantas dicotiledóneas, los principales componentes son celulosa y pectinas,
y en menor proporción hemicelulosas como xiloglucanos (Harris y Smith, 2006). Para la
formación de esta red, es necesaria la presencia de los tres polisacáridos mencionados
anteriormente, donde las microfibrillas de celulosa presentan extensas interacciones con
pectinas y el xiloglucano se intercala limitadamente entre las microfibrillas de celulosa (Dick-
Pérez y cols., 2011). Los componentes no celulósicos actúan como un “pegamento” que ayuda
9
a mantener esta estructura unida y con resistencia para soportar el estrés generado por el turgor
(Carpita y Gibeaut, 1993).
2.6. Pectinas
Descubiertas hace 200 años, las pectinas son abundantes en la pared celular primaria y
lamela media, de tal forma que constituyen ~30% en plantas dicotiledóneas. Se clasifican en
tres tipos principales: homogalacturonano (HGA), ramnogalacturonano-I (RG-I) y
ramnogalacturonano-II (RG-II), los cuales representan el ~65%, ~20-35% y ~10% del total de
pectinas de la pared celular, respectivamente (Mohnen, 2008; Atmodjo y cols., 2013). Las
pectinas son sintetizadas por un proceso de iniciación, elongación y terminación, donde las
investigaciones se han centrado en identificar y caracterizar principalmente las enzimas
glicosiltransferasas que elongan estos polisacáridos (Mohnen, 2002). Pasando por las distintas
cisternas del Golgi, éstas son transportadas a la pared celular por vesículas secretorias a través
de la ruta de tráfico de la membrana plasmática y luego son secretadas hacia la pared celular
(Kim y Brandizzi, 2014).
A nivel estructural, las pectinas se representan de la siguiente manera (Figura 2):
HGA: Esqueleto de ácido galacturónico (GalA) unido por enlaces α (1à4).
RG-I: Esqueleto de ácido galacturónico (GalA) alternado con residuos de ramnosa (Rha),
unidos por enlaces glicosídicos α (1à2) entre GalA y Rha, y α (1à4) entre Rha y GalA. Puede
presentar diversas ramificaciones unidas a Rha.
RG-II: Presenta el mismo esqueleto de GalA, sin embargo presenta decoraciones de azúcares
menos frecuentes como fucosa (Fuc), xilosa (Xyl) y ácido glucurónico (GlcA).
10
HGA RG-I RG-II
Figura 2. Representación estructural de las diferentes pectinas encontradas en la pared celular
vegetal. Imagen extraída y modificada de Leclere y cols. (2013).
En general, se ha descrito la importancia de las pectinas en la adhesión celular. Mutantes
de qua1, epc1 y ech en A. thaliana y nolac-H18 en tabaco, presentan alteraciones en las
cantidades de HGA, RG-I y RG-II, respectivamente (Daher y Braybrook, 2015). Baldwin y cols.
(2014) detallan a nivel de la pared celular cómo el cultivar Champagne de Pisum sativum se
aclimata a una condición ambiental diferente de la normal, modificando la composición de
pectinas para sobrellevar el estrés causado por el cambio de temperatura, incrementando el grado
de metilesterificación y los polisacáridos de HGA y xilogalacturonano (XG), además de
modificar las ramificaciones de arabinanos y galactanos en RG-I. En papas transformadas
(Solanum tuberosum), donde se redujeron las cadenas laterales de arabinanos y galactanos de
RG-I, se determinó que estas ramificaciones están implicadas en la capacidad de unión de agua.
Además, la ausencia de estas cadenas disminuyó el grosor de la pared celular entre un 2% y un
7% (Ulvskov y cols., 2004). Por otra parte, tanto los cross-linkings de Ca2+ en HGA como los
11
de borato con RG-II, contribuyen a fortalecer la pared celular (Caffall y Mohnen, 2009). Es
importante considerar que los azúcares presentes en las pectinas cambian espacio
temporalmente y entre especies; esto se evidencia al realizar la comparación de la composición
de residuos glicosil, donde la proporción de azúcares varía entre tejidos de sicómoro, tabaco y
A. thaliana. En ninguna de estas tres especies se ha observado una cantidad estándar de residuos
glicosídicos (Mohnen, 2002). Esto implica que la composición de la pared celular es específica
en cada especie, inclusive es posible que sea diferente en cada tejido de una misma planta.
En el caso de la maduración de frutos, ocurre una degradación enzimática de polisacáridos
estructurales y de estructuras de almacenamiento (Bartley y Knee, 1982), donde las pectinas son
el principal componente de la pared celular y lamela media. Debido a que contribuyen a la
textura y calidad de la fruta, su degradación causa ablandamiento en varias especies (Prasanna
y cols., 2007). Existen evidencias que sugieren que RG-I sería las pectina que se solubiliza
rápidamente al madurar el fruto (Figueroa, 2008). Además, los azúcares constituyentes de
pectinas varían en forma notable, particularmente en el contenido de galactanos
correspondientes a RG-I (González, 2012). Investigaciones realizadas en RG-I han sugerido que
este polisacárido sería clave en las propiedades mecánicas de las células vegetales (Cornuault y
cols., 2018). Se ha determinado que RG-I rico en cadenas laterales con galactanos contribuiría
a la firmeza de diferentes tejidos vegetales (McCartney y cols., 2000), mientras que RG-I con
abundancia de cadenas laterales de arabinanos se relacionaría con la elasticidad en células
guardianas (Jones y cols., 2003). La pérdida de las cadenas laterales mencionadas anteriormente
contribuiría a la solubilización, ya que estas cadenas anclarían las pectinas a la pared celular por
medio de enlaces glicosídicos (Popper y Fry, 2005; Zykwinska y cols., 2005). De acuerdo a lo
anterior, estudiar las enzimas que actúan sobre el esqueleto de RG-I sería relevante, ya que
permitiría dilucidar los mecanismos por los cuales éste es escindido y podría dar indicios de
cómo puede influir la degradación de éste.
2.7. Ramnogalacturonano-I
Es un polisacárido péctico también conocido como “regiones vellosas” de pectinas. En el
primer reporte de RG-I, McNeil y cols. (1980) purificaron y caracterizaron este polisacárido a
partir de células de sicómoro. Estructuralmente, RG-I está formado por un esqueleto de hasta
12
100 unidades repetidas del disacárido compuesto por Rha y GalA, unido por enlaces glicosídicos
[à2)-α-L-Rhap-(1à4)-α-D-GalpA-(1à], generalmente en una proporción Rha:GalA de 1:1.
Este esqueleto presenta ramificaciones de polisacáridos de azúcares neutros como arabinanos,
galactanos y arabinogalactanos (AGPs) tipo I y II (Figura 3) (Yapo, 2011), que están unidos a
Rha en C-4 y en menor proporción a C-3 (Visser y Voragen, 1996). GalA puede estar acetilado
en O-2 y/o O-3, lo que podría cambiar la carga e hidrofobicidad del polisacárido (Tan y cols.,
2013) y dificultaría la actividad de enzimas con actividad sobre RG-I. En la pared celular
vegetal, RG-I se encuentra unido por medio de enlaces glicosídicos a pectinas y hemicelulosas.
Uno de los modelos de interacción de polisacáridos de pared celular más reciente demuestra que
al menos cuatro o cinco residuos de GalA de HGA se encuentran embebidos dentro de RG-I.
Los residuos de GlcA presente en proteínas de AGPs se unen a Rha del esqueleto de RG-I, al
igual que la hemicelulosa arabinoxilano (AX) por medio de la unión entre Rha y Xyl (Tan y
cols., 2013).
Las proporciones de RG-I y la composición de sus azúcares pueden variar espacio
temporalmente (Bush y McCann, 1999; Ermel y cols., 2000). Por ejemplo, en Daucus carota L.
cv. Early Nantes se observó que en la región central del meristema radicular y en células en
proliferación, RG-I presenta una gran cantidad de ramificaciones de arabinanos, en contraste
con células de la cofia en diferenciación, corticales y células en elongación, en las que se observó
abundancia de galactanos (Willats y cols., 1999).
13
Figura 3. Representación esquemática de RG-I. El esqueleto central se compone de unidades
de disacáridos de Rha y GalA. Las cadenas laterales pueden variar, presentando ramificaciones
de arabinanos (A), galactanos (B), AGPs tipo I (C) y galactoarabinanos (D). La flecha verde
indica los enlaces sobre los cuales actúa la enzima RG-liasa. Figura extraída de Yapo (2011).
2.8. Enzimas remodeladoras de pared celular vegetal
En hongos saprófitos, existe una nutrida batería enzimática para escindir polisacáridos de
la pared celular de plantas para luego poder usarlos como fuente de carbono. Van den Brink y
de Vries (2011) publicaron un esquema donde presentan las principales enzimas que actuarían
principalmente sobre RG-I. Muchas de estas enzimas descritas en hongos están presentes
también en plantas. Como por ejemplo α-arabinofuranosidasa y β-galactosidasa que hidrolizan
las cadenas laterales de RG-I como arabinanos y galactanos, y pectina metilesterasa que
hidroliza los grupos metoxilos presentes en GalA, tanto en HGA como en RG-I.
Durante el proceso de maduración de un fruto, se evidencia un descenso en la firmeza
como consecuencia del desensamblaje y solubilización de la pared celular. Es importante tener
14
en cuenta que los cambios de la textura se encuentran estrechamente relacionados con el
metabolismo de la pared celular (Giovannoni, 2004), ya que el desensamblaje de ésta es uno de
los factores clave en la vida útil del fruto (Posé y cols., 2018). La evidencia indica la existencia
de una precisa coordinación en los niveles de transcritos de genes que codifican para enzimas
con actividad catalítica sobre polisacáridos de la pared celular. En F. chiloensis y F. x ananassa
las enzimas β-galactosidasa y β-xilosidasa, presentan un incremento en la actividad enzimática
que se correlaciona con la pérdida de firmeza (Figueroa y cols., 2010). Por otra parte, la enzima
XTH en diferentes especies, ha sido reportada como remodeladora de pared celular (Miedes y
cols., 2010; Han y cols., 2015; Han y cols., 2016) donde sus niveles de transcritos se ven
incrementados en F. chiloensis a medida que el fruto alcanza la etapa de madurez (Opazo y
cols., 2010).
En F. x ananassa, el gen que codifica para una enzima RG-liasa se encuentra ubicado en
un locus relacionado con la firmeza de la fruta. Mediante experimentos de RNAi se demostró
que la ausencia de esta enzima provoca alteraciones en el metabolismo de las pectinas
permitiendo concluir que RG-liasa participaría activamente en la degradación de éstas en la
lamela media, entre células parenquimáticas (Molina-Hidalgo y cols., 2013). La participación
de esta enzima en F. chiloensis aún no ha sido descrita.
El conocer nuevas enzimas que participen del proceso de desensamblaje de la pared
celular y comprender su relevancia para el ablandamiento del fruto, permitirá tener un mayor
conocimiento respecto del tema, lo que podría facilitar la implementación de nuevas
metodologías para retardar el ablandamiento o prolongar la vida útil del fruto.
2.9. Ramnogalacturonano endoliasa
El grupo de las enzimas polisacárido liasas (EC 4.2.2.-) se caracteriza por escindir el
enlace entre ácido urónico y otros azúcares por medio del mecanismo catalítico de β-
eliminación. CAZy, la base de datos de enzimas con actividad catalítica sobre carbohidratos
(http://www.cazy.org/), clasifica a estas enzimas de acuerdo al mecanismo catalítico que
utilizan, que puede ser syn o anti, dependiendo del lado en el cual se adicionan los sustituyentes
para que ocurra la reacción (Figura 4).
15
(i) (ii) (iii)
Figura 4. Mecanismo catalítico de β-eliminación de enzimas PL. En esta reacción se describen
principalmente tres eventos: (i) Abstracción del protón del C-5 del anillo del ácido urónico o
éster, por medio de la cadena lateral de un aminoácido básico; (ii) Estabilización del anión
resultante por deslocalización de cargas en el grupo carbonilo del C-6; (iii) Escisión lítica del
enlace O-4:C-4, facilitada por los protones donados por el ácido catalítico. Finalmente, en el
extremo no reductor, se formará una fracción de ácido hexenurónico (HexA, ácido 4-deoxi-4-
hexen urónico). En la figura, se puede observar la cadena lateral del aminoácido básico (B:),
donación del protón desde un ácido catalítico (B:H) y la estabilización de la reacción por
cationes de Ca2+ o una cadena lateral con carga positiva (Imagen extraida de Lombard y cols.,
2010).
Perteneciente a la familia polisacárido liasa cuatro (PL4), la α-L-ramnopiranosil-(1à4)-
α-D-galactopiranosiluronato endoliasa, RGL4 o RG-liasa (EC 4.2.2.23), presenta actividad
catalítica sobre RG-I, particularmente sobre el enlace α-(1à4) entre Rha y GalA, por medio del
mecanismo de β-eliminación. RG-liasa se encuentra en bacterias y en organismos eucariontes
como hongos y plantas. El primer reporte de esta enzima data de 1994 (Kodof y cols., 1994),
donde se clonaron y caracterizaron estructural y funcionalmente dos “ramnogalacturonasas”
16
divergentes del hongo saprófito Aspergillus aculeatus, denominadas ramnogalacturonasa A y
B. Posteriormente en la investigación de Mutter y cols. (1996), se comprobó que
ramnogalacturonasa B correspondía a una enzima con actividad catalítica de tipo liasa (Azadi y
cols., 1995), la cual fue clasificada posteriormente como una ramnogalacturonano endoliasa.
En plantas, pocos son los trabajos existentes acerca de RG-liasa. En Gossypium hirsutum
L. se ha detectado e identificado actividad in vivo de RG-liasa, donde a pesar de presentar bajos
niveles de actividad detectados en espacios intercelulares de cotiledones en crecimiento, se
observó un incremento de la actividad enzimática RG-liasa en tejidos con células en expansión
(Naran y cols., 2007). En Fragaria x ananassa Duch. se identificó el gen FaRGLiasa1 que
codifica para RG-liasa y que está involucrada en la pérdida de firmeza y degradación de la
lamela media del receptáculo (Molina-Hidalgo y cols., 2013). Los autores, lograron determinar
que existe un aumento en los niveles de transcritos de FaRGLiasa1 en la maduración del fruto.
Además, el gen es regulado positivamente por ABA y negativamente por auxina. El
silenciamiento de este gen permitió generar frutos más firmes, con una pared celular más integra
y más densa, con una notable disminución en el espacio intercelular (Molina-Hidalgo y cols.,
2013). Por otra parte, Oomen y cols. (2002) introdujeron el gen de RG-liasa de A. aculeatus en
S. tuberosum L., donde detectaron actividad enzimática. Sin embargo, observaron tubérculos
con alteraciones morfológicas, inflamación radial de las células de la peridermis y desarrollo de
espacios intercelulares en el córtex. Con un análisis de composición de azúcares, se comprobó
una reducción de galactosa (Gal), Ara y de las cadenas laterales de arabinanos y galactanos de
RG-I. Como conclusión, los autores sugieren que RG-I es clave en el desarrollo normal de la
peridermis y en el anclaje de galactanos y arabinanos como cadenas laterales.
A nivel de estructura terciaria, RG-liasa de A. aculeatus encontrada en PDB (Protein Data
Bank) se compone de tres dominios modulares (Figura 5) (McDonough y cols., 2004):
Dominio I: Comprende 257 residuos aminoacídicos. Su estructura secundaria está conformada
por ocho sábanas beta antiparalelas. Además, existen dos enlaces disulfuro entre los residuos
30-73 y 164-173, y dos iones sulfato asociados.
Dominio II: También llamado fibronectin III-like, comprende entre los residuos aminoacídicos
258-336, formando una estructura de llave griega.
17
Dominio III: Módulo de unión a carbohidratos (CBM). Presenta una estructura de β-sandwich.
Dos iones de sulfato son necesarios y un ion de calcio hexacoordinado, clave a nivel estructural.
Este dominio está conformado por los residuos aminoacídicos 337-508.
Figura 5. Estructura cristalográfica de RG-liasa de A. aculeatus (PDB ID: 1NKG). Mediante
diferentes colores se pueden apreciar los diferentes dominios: dominio I (azul), dominio II
(naranjo) y dominio III (cian).
III
II
I
18
3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Del proceso de maduración y pérdida de firmeza de F. chiloensis se tiene conocimiento
que los principales azúcares y enlaces glicosídicos que se degradan son las pectinas, y
particularmente los presentes en las cadenas laterales y esqueleto de RG-I. Se tiene información
de algunas enzimas con actividad catalítica sobre sus cadenas laterales, pero poco se sabe sobre
la actividad enzimática en el esqueleto de RG-I. Gracias a la identificación de 18 contigs de RG-
liasa en el transcriptoma de F. chiloensis, se logró observar que uno en particular presenta un
incremento en los niveles de FPKMs a medida que el fruto madura y pierde su firmeza.
Teniendo en consideración que: (1) F. chiloensis presenta una cantidad importante de
pectinas; (2) La existencia de estudios previos en el género Fragaria que indican que RG-liasa
sería clave en la pérdida de firmeza del fruto; (3) Conocer cómo esta enzima participa en el
desensamblaje de la pared celular podría contribuir a una comprensión integral de los
mecanismos moleculares presentes en la maduración de F. chiloensis; (4) Conocer de manera
completa el desarrollo y vida de postcosecha de este fruto podría incrementar la producción,
venta y exportación de este fruto, y sobre todo beneficiar a pequeños y medianos agricultores;
(5) Como chilenos, es deber nuestro promover la conservación y cuidado de este fruto nativo
como riqueza alimentaria nacional. De acuerdo a los argumentos mencionados anteriormente es
que en este trabajo de tesis doctoral se caracterizará la enzima RG-liasa de F. chiloensis,
evaluando sus parámetros bioquímicos y la variación en los niveles de transcritos en los
diferentes estadios de maduración y en diferentes tejidos vegetativos. Adicionalmente, se
evaluará la influencia de las fitohormonas ABA y AUX con sus respectivos inhibidores
fluoridona y TIBA, en la expresión del gen.
19
4. FORMULACIÓN DE LA HIPÓTESIS
Dado que:
1. En F. chiloensis existe un significativo descenso de firmeza entre los estadios LG y
T.
2. Durante la maduración de F. chiloensis se reportan pérdidas de azúcares neutros que
evidencian la metabolización de pectinas solubles en HCl tales como RG-I.
3. No se dispone de información respecto de las enzimas que participan en el
metabolismo de RG-I en F. chiloensis.
Se proponen las siguientes hipótesis:
1. “La enzima RG-liasa de frutos de F. chiloensis participa en el desensamblaje de RG-
I”.
2. “Las hormonas vegetales ABA y AUX regulan la transcripción de RG-liasa, de
manera positiva y negativa respectivamente”.
20
5. OBJETIVOS GENERALES Y ESPECÍFICOS
5.1. Objetivo general
Analizar la regulación hormonal, dinámica de expresión génica y actividad enzimática
asociada a RG-liasa durante la maduración de frutos de F. chiloensis.
5.2. Objetivos específicos
1. Identificar y caracterizar bioquímicamente la enzima RG-liasa de frutos de F.
chiloensis.
2. Analizar el rol de las hormonas ABA y AUX sobre la regulación transcripcional de
RG-liasa asociada a la maduración de frutos de F. chiloensis.
21
CAPÍTULO I
BÚSQUEDA E IDENTIFICACIÓN DEL GEN
FchRGL1
1. INTRODUCCIÓN
En este capítulo se aborda la fisiología y bioquímica de la maduración de frutos, centrado
en el género Fragaria. Se describen enzimas remodeladoras de la pared celular y se presenta la
información bibliográfica existente al día de hoy sobre la enzima RG-liasa, donde se menciona
su importancia, sus dominios y su actividad enzimática sobre RG-I.
A nivel experimental, se realiza un seguimiento de los parámetros fisiológicos durante la
maduración de los frutos estudiados. In silico, se plantean las estrategias abordadas para buscar
y encontrar en el RNA-seq de F. chiloensis un contig que codifique para una RG-liasa
putativamente involucrada en la maduración de frutos.
1.1. Fisiología y maduración de frutos
Cuando se habla del fruto, se debe tener en cuenta que su finalidad es proteger a la semilla
y atraer a insectos y animales para que sean medios de dispersión de éstas, particularmente en
el caso de las angiospermas. Por tal razón, el fruto es el escudo protector del material genético
y el perpetuador espacio-temporal de la especie. Una vez que el óvulo es fecundado, ocurrirán
fenómenos bioquímicos y moleculares como degradación de la clorofila y biosíntesis de
compuestos que le otorgan el color al fruto; cambios en los azúcares, ácidos y volátiles que
influyen en la calidad nutricional y organoléptica; modificación en los polisacáridos de la pared
celular que están estrechamente relacionados con los cambios de textura (Giovannoni, 2004).
En la fisiología del fruto, existen múltiples factores que pueden influir en su desarrollo y
características organolépticas finales. Por ejemplo, el incremento de la temperatura puede
aumentar la tasa respiratoria (Machuca y cols., 2010), el genotipo y condiciones climáticas
influyen en la capacidad antioxidante (D’Ambrosio y cols., 2013). La aplicación de fungicidas
puede afectar el desarrollo frutal (Esteves y cols., 2018).
1.1.1. Producción y maduración de frutos del género Fragaria
La producción de frutillas a nivel global en los últimos 20 años ha tenido un incremento
lento pero sostenido. El año 1997 se cosecharon tres millones y medio de toneladas de frutillas,
y al año 2016 según las estadísticas del Food and Agriculture Organization of the United
23
Nations (FAO) más de nueve millones de toneladas fueron cosechadas, incrementando casi tres
veces su producción en sólo nueve años (Figura 6). La ventaja del cultivo de frutillas es que esta
especie ha sido capaz de adaptarse a climas tropicales y subtropicales como los presentes en
México, Colombia, Costa Rica y Guatemala. Asimismo, tolera temperaturas en diferentes
altitudes y áreas continentales como Polonia, Rusia, Alemania, Bélgica y Escandinavia (Darnell
y cols., 2002). El aumento de la temperatura influye en el consumo de nutrientes (Li y cols.,
2010), formación de flores y calidad de la fruta (Klamkowski y Treder, 2008). Se ha
comprobado también la estrecha relación que existe entre el rendimiento y la temperatura, y
entre la radiación solar y el rendimiento (Palencia y cols., 2013). Por otra parte, el color del fruto
se afecta drásticamente por las concentraciones de CO2: si los frutos se someten a elevadas
concentraciones de este gas la coloración interna se degrada debido a la acción de éste sobre los
compuestos fenólicos. En el caso de los tejidos externos el CO2 casi no tuvo incidencia en el
contenido de antocianinas (Gil y cols., 1997).
Figura 6. Producción mundial de frutillas entre los años 1996 y 2016, expresada en millones de
toneladas. Fuente: FAO.
24
Existen eventos moleculares relacionados estrechamente con los cambios fisiológicos del
fruto tales como activación de genes, hidrólisis enzimática y hormonas, entre otros. En el caso
particular de estas últimas, el crosstalk entre ellas regula diferentes aspectos de la maduración.
Por ejemplo, se ha comprobado que el incremento de los niveles de ABA es relevante en la
elongación del receptáculo y maduración de éste, y AUX es necesaria para la maduración de la
semilla (Symons y cols., 2012). Más información respecto al rol hormonal en la maduración de
frutos se encuentra descrita en el Capítulo III. La actividad de enzimas pertenecientes a la ruta
de los fenilpropanoides promueven el desarrollo del color del fruto en frutilla, las enzimas
alcohol acil transferasas están involucradas en la producción del aroma, y aquellas que
modifican la estructura de polisacáridos de pared están relacionadas con la pérdida de firmeza
y relacionadas con el desarrollo de sabor y textura del fruto.
1.2. Enzimas de maduración del género Fragaria
Los cambios en la pared celular son transcendentales en la maduración de frutos.
Hidrolasas, liasas, transferasas y esterasas, son las principales enzimas que actúan sobre los
enlaces glicosídicos de los polisacáridos de la pared celular vegetal que son degradados,
modificados o creados (Lombard y cols., 2014). La cuantificación de los niveles de transcritos
por RT-qPCR ha sido una de las técnicas experimentales más utilizadas para determinar la
presencia o ausencia de ellos en determinado tejido o estadio de desarrollo. En cuanto a la
evidencia actual de enzimas relacionadas con la maduración y pérdida de firmeza en frutos del
género Fragaria, se sabe que en F. vesca, de los 21 genes de xiloglucano
endotransglicosidasa/hidrolasa (XTH) descritos, solo cuatro presentan un incremento en los
niveles de expresión relativa asociados al ablandamiento de fruto (Opazo y cols., 2017). En F.
chiloensis sólo las isoformas FaEXP2 y FaEXP5 que están presentes en fruto estarían
relacionados con la pérdida de firmeza de éste (Figueroa y cols., 2009). Ensayos de actividad
enzimática en extractos proteicos de frutos lograron demostrar que las enzimas
poligalacturonasa (PG), endoglucanasa (EGasa), α-arabinofuranosidasa (AFasa), β-
galactosidasa (βGal) y β-xilosidasa (βXil) presentan mayor actividad en frutos de F. chiloensis,
que presenta una rápida disminución de la firmeza, en comparación a frutos de F. x ananassa
(Figueroa y cols., 2010).
25
La información existente indica que para el desensamblaje de la pared celular se requiere
de una variada batería enzimática ya que es necesario actuar sobre una matriz muy diversa de
polisacáridos. Para frutos del género Fragaria se dispone de cierta información de enzimas e
isoenzimas participantes en su ablandamiento, pero aún falta comprender el metabolismo de
ciertas estructuras, como por ejemplo la cadena central de RG-I.
1.3. Ramnogalacturonano endoliasa: pasado y presente
En el año 1994, dos publicaciones reportaron la existencia de dos enzimas
ramnogalacturonano hidrolasas, aisladas desde el hongo Aspergillus aculeatus. Estas enzimas
llamadas ramnogalacturonasa A y B, escindían los enlaces α-(1à2) y α-(1à4) de RG-I,
respectivamente. Los parámetros enzimáticos óptimos como pH, temperatura y punto
isoeléctrico eran muy diferentes y además las secuencias de estas enzimas eran tan divergentes
que los autores sugirieron clasificarlas en dos grupos de glicosil hidrolasas diferentes (Kodof y
cols., 1994; Mutter y cols., 1994). No fue hasta 1995 cuando Azadi y cols. determinaron que
ramnogalacturonasa A presentaba actividad endohidrolasa, mientras que ramnogalacturonasa B
tenía actividad endoliasa, dejando en el extremo no reductor un residuo hex-4-
enopiranosiluronico (Figura 7), por tanto la enzima descubierta se le asignó el nombre aceptado
según la Enzyme Commission (EC) como ramnogalacturonano endoliasa. Otros nombres
aceptados son α-L rhamnopiranosil-(1,4)-α-D-galactopiranosiluronido liasa y RG-liasa, entre
otros. Hoy en día, RG-liasa ha sido clasificada en el grupo EC 4.2.2.23 para las endoliasas y EC
4.2.2.24 para las exoliasas (Ochiai y cols., 2007).
26
Figura 7. Escisión del RG-I mediante las enzimas ramnogalacturonano endohidrolasa (derecha)
y endoliasa (izquierda). Al centro se muestra una cadena de RG-I sin escindir. Imagen extraída
de Azadi y cols., 1995.
1.3.1. Filogenia de la enzima RG-liasa
Filogenéticamente, las RG-liasas están distribuidas en dos familias de polisacárido liasas:
PL4 y PL11. A pesar de que tienen idéntica actividad enzimática, estructuralmente son
totalmente divergentes (Figura 8) (Garron y Cygler, 2010; Silva y cols., 2016). Este fenómeno
ocurre en varias familias de las polisacárido liasas (PL) y esto se debe a que estas enzimas han
sido creadas más de una vez durante la evolución a partir de scaffolds totalmente distintos
(Lombard y cols., 2010). En cuanto a su procedencia, RG-liasa pertenecientes a la familia PL4
han sido extraídas y caracterizadas desde los hongos A. aculeatus, Aspergillus nidulans,
Penicillium chrysogenum y desde la bacteria Dickeya dadantii.
En plantas, la primera identificación de RG-liasa data del año 2000, encontrada en raíces
y silicuas de A. thaliana. Estudiando la organización y evolución estructural de cuatro familias
multigénicas, encontraron siete genes parálogos llamados MYST, los cuales eran específicos de
plantas pero sin función identificada. De acuerdo al análisis realizado de las secuencias génicas
de MYST, se sugirió un ancestro común para todos los parálogos encontrados ya que además se
encontró una identidad de secuencias entre 67,1% y 78,9% (Tavares y cols., 2000). Existe otra
27
evidencia, donde en cotiledones de G. hirsutum L., se detectó e identificó actividad RG-liasa in
vivo en tejidos en expansión, donde oligomeros etiquetados con fluorescencia fueron inyectados
en espacios intercelulares en algodón y el producto de la digestión enzimática fue identificada
por electroforesis de zona capilar (CZE) (Naran y cols., 2007). La referencia más reciente de
RG-liasa detectada en plantas es del año 2013, donde Molina-Hidalgo y cols. detectaron una
enzima involucrada en el proceso de degradación de la lamela media, reduciendo la firmeza en
frutos de F. x ananassa.
Las enzimas pertenecientes a la familia PL11 han sido encontradas únicamente en las
bacterias Pseudomonas cellulosa, Clostridium cellulolyticum, Bacillus licheniformis y Bacillus
subtilis.
Figura 8. Árbol filogenético de las enzimas RG-liasas descritas hasta ahora en la literatura y
clasificadas en el grupo PL4 (círculo verde) y PL11 (círculo azul). Las proteínas se encuentran
nombradas de acuerdo a su código de referencia UniProt. Imagen extraída de Silva y cols., 2016.
28
1.3.2. Estructura tridimensional de la enzima RG-liasa
Debido a la divergencia de los scaffolds de los cuales evolucionaron las enzimas RG-
liasas, la estructura tridimensional de la familia PL4 y PL11 es totalmente divergente entre sí,
no obstante tienen la misma actividad enzimática. Las enzimas de la familia PL4 presentan tres
dominios modulares denominados I, II y III. El primer dominio, presenta estructura de β-súper
sándwich, compuesto de sábanas beta antiparalelas y en su estructura se encuentran los
aminoácidos claves para la actividad catalítica. El segundo dominio, presenta una estructura del
tipo fibronectina tipo III (FnIII) con una estructura de llave griega; no se cuenta con información
exacta sobre la función de este dominio, pero se sabe que este dominio se encuentra en varias
enzimas secretadas a la pared celular. Finalmente, el dominio III tiene una estructura de β-
sandwich jelly roll y es el módulo de unión a carbohidratos (CBM), que es el encargado de
unirse a los polisacáridos adyacentes al RG-I. La baja homología del dominio I entre plantas y
hongos revela la divergencia evolutiva de la subfamilia, donde la maquinaria catalítica ha sido
mantenida a través del tiempo, pero el reconocimiento al sustrato ha sufrido modificaciones
(Figura 9) (McDonough y cols., 2004).
Estructuralmente, la familia PL11 se compone de dos dominios, donde el dominio N-
terminal tiene tres hebras antiparalelas de sábanas beta, seguidas por ocho hojas β-propeller. En
cada hoja existen cuatro β-strands antiparalelas y con excepción de la hoja D, todas contienen
un motivo de unión a Ca2+ (Figura 10) (Ochiai y cols., 2009).
29
Figura 9. Estructura tridimensional de la enzima RG-liasa pertenciente a la familia PL4. Esta
estructura fue cristalizada a partir del hongo saprófito A. aculeatus a una resolución de 1,5 Å.
Se destacan los tres dominios descritos; las sábanas beta en color rosa corresponden a regiones
donde se encuentran aminoácidos claves para la actividad catalítica. Imagen extraída de
McDonough y cols., 2004.
Figura 10. Estructura topológica de la enzima perteneciente al grupo PL11 (izquierda) y
estructura tridimensional de la enzima completa (derecha). Imagen extraída de Ochiai y cols.,
2009.
30
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1. Material biológico vegetal
Frutos de F. chiloensis fueron cosechados en diciembre del año 2015 y 2016, desde un
huerto comercial ubicado en la comuna de Purén (Latitud: 38°04′8.6″S; Longitud:
73°14′2.96″O) en la Región de la Araucanía, Chile. Los frutos fueron trasladados a la
Universidad de Talca Campus Lircay, Región del Maule y fueron clasificados en cuatro estadios
de desarrollo de acuerdo a Figueroa y cols. (2008): SG (verde pequeño), fruto pequeño con
receptáculo y aquenios verdes; LG (verde grande), fruto grande con receptáculo verde y
aquenios rojos; T (transición), fruto grande con receptáculo blanco y aquenios rojos; R
(maduro), fruto maduro con receptáculo rosa y aquenios rojos. Todo el material biológico
vegetal fue trozado, congelado en nitrógeno líquido y almacenado a -80°C, para su posterior
utilización.
2.2. Determinación de parámetros fisiológicos
En muestras representativas de 30 frutos por cada estadio se midieron parámetros de
calidad como peso, firmeza, color, sólidos solubles y acidez titulable.
2.2.1. Peso, tamaño y firmeza
El peso fresco de los frutos fue cuantificado utilizando la balanza modelo BBA-600
(M.R.C.). Las medidas de tamaño, considerando alto y ancho del fruto, se evaluaron con el pie
de metro digital KSOL (SZ-KSOL-I016325, JAKEMY).
La firmeza fue determinada con el Analizador de Textura modelo CT3 4500 (Brookfield
Engineering Lab), utilizando el software TexturePro CT V1.5 (Brookfield Engineering Lab,
2007). El equipo fue programado para que la sonda de 2 mm de diámetro TA39, a una velocidad
de 1 mm/seg, penetrara el fruto con un valor de carga de 0,33 Newton (N). La firmeza se expresó
en Newton (N). Cada fruto fue testeado dos veces en caras opuestas en la región ecuatorial,
evitando el impacto sobre los aquenios.
31
2.2.2. Color
El color de los frutos puede ser descrito por su luminosidad, ángulo de matiz y saturación
del color. Existen diferentes escalas para cuantificar el color, sin embargo la más utilizada y
uniforme es la escala CIE L*A*B*. El color fue medido con el equipo Chroma Meter Modelo
CR-400 (Konica Minolta Optics). El blanco de referencia fue medido en la escala Yxy según
las especificaciones del fabricante. Cada fruto se midió dos veces en caras opuestas en la región
ecuatorial. Se registraron los valores CIE L*A*B*: a* en un rango entre verde y rojo; b* en un
rango entre amarillo y azul; y L* corresponde al índice de luminosidad. Los valores de croma
(C*) y hue (h°), que cuantifican la saturación del color y el ángulo de matiz respectivamente,
fueron calculados a partir de los valores a* y b* de acuerdo a las fórmulas (1) y (2) (McGuire,
1992). Las diferencias de color fueron calculadas de acuerdo a la fórmula (3), donde indica
la magnitud de la diferencia total de color.
Fórmula (1)
Fórmula (2)
Fórmula (3)
De acuerdo a lo anterior, se pueden resumir los parámetros de color de la siguiente manera
(X-Rite, 2002):
- DL*: Diferencia en el valor de claridad/oscuridad. Un valor positivo indica que es más
claro, en comparación a un valor negativo.
- Da*: Diferencia en el eje rojo/verde. Un valor positivo indica que el color se aproxima al
color rojo, mientras que más negativo indica que se aproxima al color verde.
32
- Db*: Diferencia en el eje de los colores amarillo/azul. Un valor positivo indica una
aproximación al color amarillo, mientras que un valor negativo indica una
aproximación hacia el color azul.
- DC*: Diferencia en el croma. Un valor positivo indica que el color es más brillante,
mientras que un valor negativo indica un color más opaco.
- DH°: Diferencias en el matiz.
2.2.3. Contenido de sólidos solubles
Cinco gramos de tejido congelado obtenido a partir de un bulk de tres frutos fueron
triturados con el equipo Ultra-Turrax (IKA T25 digital Ultra-Turrax). El homogeneizado fue
filtrado dos veces por gasa y luego enrasado a 20 mL con agua destilada. Se tomó una gota de
la solución y se midió el contenido de sólidos solubles (CSS) con un refractómetro digital
(Pocket Pal-1, Atago) en tres réplicas, el cual fue previamente calibrado con agua destilada. CSS
fue expresado como gramos de azúcar en 100 gramos de peso fresco.
2.2.4. Acidez titulable
El parámetro fisiológico de acidez titulable (AT) cuantifica a los ácidos orgánicos de la
muestra, determinándolos por titulación con una base fuerte como NaOH y representada como
el porcentaje de ácido orgánico predominante. A partir del homogenizado obtenido para
cuantificar CSS, se tomaron tres réplicas individuales 5 mL y se enrasaron hasta 20 mL en un
vaso precipitado; la muestra fue agitada gentilmente en un agitador magnético (Nuova Stirrer,
Thermolyne) y titulada con el titulador automático Crison PH-Burette 24 hasta pH 8.2 utilizando
como base fuerte NaOH 20 mM. El contenido de AT fue expresado como gramos de ácido
cítrico en 100 gramos de peso fresco.
33
2.3. Búsqueda in silico del gen FchRGL1
En la base de datos de NCBI, secuencias nucleotídicas correspondientes a RG-liasa fueron
buscadas con la palabra clave rhamnogalacturonan lyase. Como parámetros de filtro, se buscó
como molécula tipo mRNA con un largo entre 1500-2500 pares de bases y familias
pertenecientes a plantas superiores. Las secuencias obtenidas fueron alineadas por TBLASTX
contra el transcriptoma de F. chiloensis que cuenta con librerías de expresión de frutos en
distintos estadios del desarrollo (datos no publicados). Se seleccionaron todos aquellos hits con
una identidad superior a 75%, E-value superior a 10-6 y largo de secuencia superior a 100 pares
de bases. Para evitar redundancia de resultados, se redujo el número de transcritos de acuerdo a
un código único de identificación en el transcriptoma de F. chiloensis. Los transcritos
seleccionados fueron traducidos con el servidor web Translate Tool (ExPASy), que realiza la
traducción de secuencia nucleotídica a aminoacídica en todos los posibles marcos de lectura
abiertos (Artimo y cols., 2012) y GENSCAN (Burge y Karlin, 1998). Para determinar con
exactitud a qué corresponde la secuencia encontrada, se realizó BLAST en contra de la base de
datos de la colección nucleotídica no redundante, considerando a todos los organismos (nt/nr)
(Altschul y cols., 1990). Las secuencias aminoacídicas predichas fueron analizadas con el
servidor web NCBI Conserved Domains Database (CDD) en su versión v3.16 PSSMs
(Marchler-Bauer y cols., 2011) para determinar la presencia de dominios conservados en RG-
liasas, sitio catalítico, sitios de unión a sustrato y unión a Ca2+, de acuerdo a lo descrito en la
literatura para otras RG-liasas (McDonough y cols., 2004; Jensen y cols., 2010). Para las
secuencias preseleccionadas se obtuvieron los valores de FPKMs de fruto completo y en los
distintos estadios, con la finalidad de seleccionar el gen que podría estar involucrado en el
desensamblaje de RG-I durante el proceso de maduración y pérdida de firmeza en F. chiloensis.
Una vez que se haya comprobado in silico y experimentalmente que la secuencia codifica
para una RG-liasa, se depositará en la base de datos de secuencias de NCBI, por medio de la
utilidad del servidor web BankIt. Esta herramienta facilita el envío de secuencias a la base de
datos de GenBank, del NCBI. Se solicitará a la plataforma que la información de la secuencia
sea liberada un año después de ser depositada.
34
2.4. Extracción de RNA
Se realizó la extracción de RNA total de frutos a partir de cada uno de los cuatro estadios
de maduración y de tejidos vegetativos como estolones, flores, hojas, raíces y tallos. Se utilizó
el método CTAB con modificaciones (Chang y cols., 1993), donde un bulk de muestra, fue
pulverizado con mortero y nitrógeno líquido. En un tubo de polipropileno se colocaron 200 mg
del bulk, para luego añadir 2 mL de buffer de extracción (2% CTAB, 2% PVP, 100 mM Tris-
HCl pH 8,0, 25 mM EDTA y 2 M NaCl), 20 µL de β-mercaptoetanol y 2 µL de espermidina.
Esto se realizó en triplicado. El contenido fue incubado a 65°C en baño termorregulado,
realizando agitaciones energéticas cada cinco minutos. Se agregó 1 mL de cloroformo:alcohol
isoamílico (24:1) y se centrifugó a 10.000 RPM por 25 min y 4ºC. Se recogió el volumen
sobrenadante y se repitió el paso anterior, donde se añadió ¼ de volumen de LiCl 10 M. Se
dejaron las muestras en incubación a 4°C por toda la noche. Al día siguiente, se centrifugaron
las muestras a 13.000 RPM por 20 min y 4ºC y luego se descartó el sobrenadante. El pellet fue
resuspendido en 500 µL de buffer SSTE (NaCl 1 M, Tris-HCl 10 mM pH 8,0 y EDTA 1 mM)
precalentado a 65°C. Se adicionó a la muestra un volumen de cloroformo:alcohol isoamílico
(24:1) y se centrifugó a 13.000 RPM por 25 min (4ºC). Se obtuvo el sobrenadante y se
adicionaron 2,5 volúmenes de etanol absoluto; se incubaron las muestras a -80°C por 45 min.
Posteriormente, se centrifugó a 13.000 RPM por 25 min a 4ºC y se descartó el sobrenadante; el
pellet fue secado a 37°C y luego resuspendido en pirocarbonato de dietilo (DEPC) a 65°C. La
concentración de las muestras fue cuantificada en el espectrofotómetro Nanodrop
Spectrophotometer ND-1000 a través del software ND-1000 V3.8.1. La integridad del RNA fue
comprobada mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,5%.
2.5. Síntesis de cDNA
Para construir las librerías de RNA, éste fue previamente tratado con el kit TURBO DNA-
free™ (Invitrogen) con el objetivo de eliminar contaminantes y cationes divalentes de la
muestra. Al RNA total obtenido se le agregaron 5 µL de buffer 10X TURBO DNasa, 1 µL de
TURBO DNasa (2 U/µL) y 24 µL de agua DEPC, mezclando todo gentilmente. Las muestras
fueron puestas a 37°C por 30 min y luego se adicionaron 5 µL de reactivo de inactivación de
35
DNasa, incubando la mezcla por 3 min a 25°C y centrifugando a 10.000 x g por 2 min (4ºC).
Las concentraciones de RNA fueron medidas en Nanodrop y la integridad de éste fue chequeada
en un gel de agarosa al 1,5%. Adicionalmente, se realizó una reacción de polimerización en
cadena (PCR) para cerciorarse de que no existieran restos de DNA en la muestra, utilizando el
termociclador Techne TC-5000 y partidores de FchGAPDH. Las condiciones de amplificación
usadas fueron: 1 ciclo de 5 min a 94°C; 35 ciclos de: 30 seg a 94°C, 45 seg a 60°C y 45 seg a
72°C; extensión final de 15 min a 72°C. La amplificación fue chequeada en electroforesis en
gel de agarosa al 1,5%.
Posterior al tratamiento con DNasa, se sintetizaron las librerías de cDNA con el kit
IMPROM-II™ Reverse Transcription System a partir de 1 µg de RNA. El RNA fue incubado
con 1 µL de Oligo (dT)15 Primer por 5 min a 70°C. Los tubos con las muestras fueron puestos
en hielo y luego incubados con la siguiente mezcla de reacción experimental por muestra: 7 µL
de agua libre de nucleasas, 4 µL de buffer de reacción Improm-II™ 5X, 2 µL de MgCl2 (2,5
mM), 1 µL de mix dNTPs y 1 µL de transcriptasa reversa Improm-II™. Las muestras fueron
dispuestas por 5 min a 25°C, 60 min a 42°C y 15 min a 70°C. El cDNA obtenido fue evaluado
por PCR utilizando partidores de FchGAPDH y el mismo equipo y ciclos mencionados
anteriormente.
2.6. Amplificación del marco abierto de lectura del gen FchRGL1
Para amplificar el marco de lectura abierto (ORF) del transcrito seleccionado, se diseñaron
partidores desde los resultados obtenidos en el apartado 2.3 de materiales y métodos de éste
capítulo (Tabla I). Se evaluó la calidad de los partidores con la aplicación web OligoAnalyzer
(PrimerQuest® IDT) y OligoCalc (Kibbe, 2007). El ORF fue amplificado desde cDNA de frutos
de F. chiloensis en estadio T y R por PCR convencional en el termociclador MultiGene Optimax
(Labnet International, Inc.) utilizando los siguientes volúmenes y concentraciones: 2,5 µL de
Buffer PCR 10X; 0,5 µL de dNTP mix (10 mM); 0,5 µL de cada partidor (10 µM); 0,1 µL
Platinum® Taq DNA Polimerasa (2 U/rxn) (Invitrogen); 0,75 µL MgCl2 (50 mM); 19,65 µL
H2O y 0,5 µL de templado. El programa utilizado para la amplificación fue el siguiente: un ciclo
de 5 min a 94°C; 35 ciclos de: 1 min a 94°C, 1 min de alineamiento de los partidores a 55°C,
36
2,5 min de extensión a 72°C; extensión final de 7 min a 72°C. El producto de PCR fue
visualizado en electroforesis en gel de agarosa al 1,5%.
Tabla I. Partidores diseñadores para amplificar el ORF de FchRGL1.
2.7. Clonamiento del marco de lectura abierto y secuenciación
El producto amplificado en el paso anterior, fue purificado desde el gel de agarosa al 1,5%
con el kit UltraClean® 15 DNA Purification (Mo Bio Laboratories, Inc). Luego, el producto fue
ligado al vector pGEM®-T Easy, utilizando el kit pGEM®-T Easy (Promega) de acuerdo a las
condiciones del fabricante. Cepas de Escherichia coli JM109 fueron transformadas utilizando 3
µL de la ligación. Luego de 30 min en hielo, las muestras fueron colocadas en termobloque
digital (Select BioProducts modelo SBD 120-2) a 42°C por 45 seg para crear poros en la
membrana plasmática bacteriana que permitan el ingreso del plásmido a la célula. Después de
15 min en recuperación, las células transformadas se colocaron en medio LB con glucosa 2 M
a 37°C y en agitación por 90 min. Las células fueron inoculadas en placas LAXI, las cuales
contienen medio Luria-Bertani, con 0,1 mg/mL de ampicilina como antibiótico, 0,08 mg/mL X-
Gal y 0,5 mg/mL IPTG. Las placas fueron colocadas en una incubadora a 37°C durante 18 h.
Tres colonias positivas por placa fueron seleccionadas, con las cuales se realizó un PCR colonia
para verificar la ligación del producto y la transformación de las colonias. Una vez realizados
los chequeos correspondientes, se inocularon 5 mL de LB con ampicilina a una concentración
de 100 mg/mL con las colonias transformadas a 37°C durante 18 h. Los plásmidos fueron
extraídos con el kit GeneJET Plasmid Miniprep (Thermo Scientific) y se enviaron a secuenciar
a Macrogen (Corea).
DESCRIPCIÓN SECUENCIA (5’à3’) Tm (°C)
Partidor fragmento completo 5’ GAA TTC GCA AGA TCA CCA GGA AGT 63,60
Partidor fragmento completo 3’ TCT AGA TGG CTT CTC AGC AGG T 62,10
Partidor chequeo interno 5’ GGT ACT GGG ATG TGG TTT GG 60,09
Partidor chequeo interno 3’ TCC AAC CAT GCA CCT TGA TA 59,92
37
2.8. Análisis bioinformático de la secuencia
La secuenciación recibida desde Macrogen fue ensamblada in silico con el web server
CAP3 (Huang y Madam, 1999) y luego alineada con la secuencia del contig seleccionado
previamente de acuerdo a los resultados obtenidos con anterioridad, con el software ClustalX
V2.1 (Larkin y cols., 2007). Se utilizó la matriz de peso de proteínas Blosum 62 y se realizaron
iteraciones en cada paso del alineamiento. La secuencia del péptido señal fue predicha con tres
aplicaciones Signal-3L 2.0 (Zhang y Shen, 2017), SignalP-4.1 (Petersen y cols., 2011) y PrediSi
(Hiller y cols., 2004), con la finalidad de llegar a un consenso del lugar de corte del péptido. Los
putativos sitios de N-glicosilación y puentes disulfuro fueron predichos con el servidor web
NetNGlyc 1.0 (Gupta y cols., 2004) y DiANNA 1.1 (Ferre y Clote, 2005), respectivamente.
El alineamiento para construir el árbol filogenético de diferentes secuencias de RG-liasas,
descargadas desde NCBI, fue realizado con el software ClustalX V2.1 considerando los mismos
parámetros anteriormente mencionados. El árbol se construyó usando el software MEGA V6.06
(Tamura y cols., 2007), con el algoritmo Neighbor-Joining, considerando una estimación de
confianza de 10.000 bootstrap (Efron y cols., 1996).
2.9. Expresión génica de FchRGL1 en fruto completo y tejido vegetativo
A partir de la región 5′-UTR de FchRGL1 se diseñaron partidores para el análisis de
expresión mediante RT-qPCR con el servidor web Primer3 v. 0.4.0 (Untergasser y cols., 2012).
Cabe mencionar que se descartó diseñar partidores desde la región codificante (CDS) por causa
de la existencia de familias multigénicas, lo que puede ocasionar problemas como falsos
positivos al momento de realizar un RT-qPCR. También, se descartó la región 3¢-UTR, debido
a que los tratamientos con DNasa pueden provocar daños en esta región.
Los partidores fueron evaluados con los servidores web OligoAnalyzer y OligoCalc. En
el equipo Agilent Mx3000P QPCR Systems, se realizó RT-qPCR bajo las siguientes
condiciones: un ciclo de 10 min 95°C; 40 ciclos de 30 seg 95°C, un min a 60°C y un min 72°C;
un ciclo de un min 95°C, 30 seg 55°C y 30 seg 95°C. Como gen normalizador fue utilizado
FchGAPDH. Para cada muestra analizada se realizaron tres extracciones de RNA
independientes seguidas de preparación de cDNA (tres réplicas biológicas) y en el análisis de
38
RT-qPCR se utilizaron tres réplicas técnicas de cada réplica biológica. Para los cálculos de
expresión relativa se utilizó el método Pfaffl, donde se consideran los cambios en las eficiencias
de la amplificación. De esta manera, es posible realizar un cálculo más preciso de la expresión
relativa del gen de interés con respecto al gen de referencia (Pfaffl, 2001). Los valores de
expresión fueron normalizados con FchGAPDH y calibrados con los valores obtenidos en el
estadio SG, en el caso de la evaluación de la expresión relativa en fruto completo, y en flores en
el caso del análisis en los diferentes tejidos vegetativos.
2.10. Análisis estadístico de RT-qPCR
Los análisis estadísticos se realizaron con el software Microsoft Office v16.25. Los
análisis de varianza fueron realizados considerando la prueba LSD de Fisher con un nivel de
significancia de p ≤ 0,05.
39
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1. Análisis de parámetros fisiológicos: peso, tamaño y firmeza
Los frutos fueron colectados entre la segunda y tercera semana de diciembre en los años
2015 y 2016. Treinta frutos de cada estadio clasificados de acuerdo a Figueroa y cols. (2008)
fueron seleccionados aleatoriamente para medir los parámetros fisiológicos de peso, tamaño,
color y firmeza.
Tanto en el año 2015 y 2016 se observa la tendencia del incremento del peso de los frutos
a medida que se alcanza la madurez (Figura 11). Se observan diferencias significativas en el
peso entre ambos años analizados para los estadios SG, T y R. Por otro lado, el peso de los frutos
del año 2016 es notoriamente inferior respecto al año 2015.
Figura 11. Cambios en el peso de frutos de F. chiloensis a lo largo del crecimiento y desarrollo
en las colectas de los años 2015 (color negro) y 2016 (color gris). Las siglas en el eje X
corresponden a cada uno de los estadios de maduración: SG (verde pequeño); LG (verde
grande); T (transición); R (maduro). El método de comparación para el análisis estadístico fue
LSD Fisher con un valor-p de 0,05. (*) indica diferencias significativas entre las colectas.
0
5
10
15
SG LG T R
Peso
(gr)
Estadio de Maduración
20152016
*
*
*
40
El diámetro y altura entregan información respecto del tamaño final del fruto. Se ha
descrito que en los primeros estadios de la frutilla ocurre el crecimiento y posteriormente se da
paso al proceso de maduración. En el género Fragaria, se ha observado que las frutillas, una vez
colectadas continúan su expansión celular.
De acuerdo a los resultados obtenidos para el diámetro de fruto, se observó un aumento
sostenido desde el estadio de desarrollo SG hasta fruto maduro (R). No se observaron diferencias
significativas para los estadios SG y T entre ambos años (Figura 12).
La altura de los frutos se incrementa a lo largo del desarrollo y maduración. Entre ambos
años sólo se observaron diferencias significativas en los estadios T y R (Figura 13).
Las diferencias encontradas entre ambas cosechas puede deberse a la influencia del clima
y del cuidado agronómico de los huertos familiares, aspectos que afectan drásticamente estas
características. Si se compara con frutos colectados el año 2004 (Figueroa, 2008) se aprecia una
merma considerable en comparación a los datos de los años 2015 y 2016.
Figura 12. Cambios en el diámetro de los frutos de F. chiloensis a través del crecimiento y
desarrollo en las colectas de los años 2015 (color negro) y 2016 (color gris). Las siglas en el eje
X corresponden a cada uno de los estadios de maduración: SG (verde pequeño); LG (verde
grande); T (transición); R (maduro). El método de comparación para el análisis estadístico fue
LSD Fisher con un valor-p de 0,05.
0
1
2
3
SG LG T R
Diá
met
ro (c
m)
Estadio de Maduración
20152016
*
*
41
Figura 13. Cambios en la altura de los frutos de F. chiloensis a través del crecimiento y
desarrollo en las colectas de los años 2015 (color negro) y 2016 (color gris). Las siglas en el eje
X corresponden a cada uno de los estadios de maduración: SG (verde pequeño); LG (verde
grande); T (transición); R (maduro). El método de comparación para el análisis estadístico fue
LSD Fisher con un valor-p de 0,05.
Los resultados obtenidos en las mediciones de firmeza de ambos años evidenciaron que
ésta declina a través del proceso de maduración del fruto. En las dos temporadas se observó la
misma tendencia, sin embargo existen diferencias significativas para los estadios T y R (Figura
14). Si se compara la pérdida de firmeza entre dos estadios, considerando que la firmeza del
estadio previo se considera como 100%, se obtiene que para la cosecha del año 2015 existe un
61% de pérdida de firmeza entre los estadios SG y LG, 66% entre los estadios LG y T y 22%
entre los estadios T y R. En tanto para la cosecha del año 2016, la pérdida de firmeza entre
estadios fue de 60% entre los estadios SG y LG, 51% entre los estadios LG y T, 67% entre los
estadios T y R. Opazo y cols. (2012) asimismo describe el mayor descenso en firmeza entre los
0
1
2
3
SG LG T R
Altu
ra (c
m)
Estadio de Maduración
20152016
*
*
42
estadios LG y T (72%), y de 58% entre los estadios T y R. Si bien estos resultados no son del
todo coincidentes con los encontrados en este estudio, confirman que el fruto experimenta un
importante descenso en su firmeza a partir del estadio LG. La diferencia entre ambos estudios
podría ser explicada por posibles errores de medición o por la diferencia de la sensibilidad en
los equipos, dado el mejoramiento de las tecnologías. Adicionalmente, las condiciones
ambientales, la genética, el microclima, la localización de los huertos y el manejo agronómico
pueden influir drásticamente en el desarrollo y comportamiento del fruto.
Figura 14. Evolución de la firmeza de frutos de F. chiloensis a través del crecimiento y
desarrollo en las colectas de los años 2015 (color negro) y 2016 (color gris). Las siglas en el eje
X corresponden a cada uno de los estadios de maduración: SG (verde pequeño); LG (verde
grande); T (transición); R (maduro). El método de comparación para el análisis estadístico fue
LSD Fisher con un valor-p de 0,05.
0
1
2
3
4
5
SG LG T R
Firm
eza
(N)
Estadio de Maduración
2015
2016
* *
43
3.2. Análisis de color
Se observó para la temporada 2015 que la luminosidad de los frutos (L*) incrementa desde
los estadios SG a T, mientras que para el año 2016 este parámetro fisiológico aumenta
únicamente en los estadios SG y LG. En ambos años, la luminosidad del fruto decae en el estadio
R (Tabla II).
Tabla II. Color de frutos de F. chiloensis en diferentes estadios de desarrollo colectados en los
años 2015 y 2016. Las siglas en la columna izquierda corresponden a cada uno de los estadios
de maduración: SG (verde pequeño); LG (verde grande); T (transición); R (maduro). Valor
corresponde a promedio ± desviación estándar (DE).
Estadio de
Maduración Año L* a* b* Croma (C*) Hue (h°)
SG 2015 52,60 ± 1,25 -3,18 ± 0,46 34,23 ± 1,02 34,70 ± 0,72 275,05 ± 0,61
2016 37,00 ± 3,06 -3,14 ± 1,25 23,20 ± 1,83 23,48 ± 1,84 277,72 ± 1,46
LG 2015 53,61 ± 2,45 4,46 ± 0,78 28,39 ± 0,67 29,81 ± 0,73 78,78 ± 3,03
2016 52,24 ± 2,96 3,25 ± 0,74 30,81 ± 1,60 30,91 ± 1,21 79,43 ± 4,97
T 2015 60,77 ± 1,46 2,98 ± 0,48 27,79 ± 0,42 28,25 ± 0,72 176,51 ± 1,87
2016 51,61 ± 0,64 9,12 ± 0,48 25,68 ± 0,56 28,35 ± 0,42 166,59 ± 4,36
R 2015 52,34 ± 0,94 14,12 ± 2,04 19,69 ± 0,99 25,33 ± 0,69 56,65 ± 4,21
2016 52,15 ± 0,17 14,40 ± 1,72 21,61 ± 1,52 26,42 ± 0,50 61,85 ± 5,18
La escala de valores de a* va desde -60 que corresponde a color verde a +60 que indica
color rojo. En tanto que b* va desde un valor +60 que corresponde a color amarillo a -60 que
corresponde a color azul. Los valores detectados (a* y b*) indican que el estadio SG está en un
rango de color verde, pasando por la transición al amarillo en el estadio de maduración (LG). El
receptáculo alcanza una coloración blanquecina en el estadio T. En la última etapa del
desarrollo, el receptáculo se torna blanco y en algunos frutos se alcanza una coloración rosácea.
La saturación del color se relaciona con la intensidad del color, es decir que mientras
mayor sea, más intenso es. El valor de croma (C*) va desde cero a 100, donde cero es
considerado acromático; un valor de 50 es semisaturado o moderado y un valor de 100 está
44
completamente saturado. En F. chiloensis se observó en ambas temporadas de colecta un valor
de saturación entre ~23 y ~35, que corresponden a colores semineutros o moderados en
saturación.
Dentro de la escala CIE L*A*B* se calculó Hue (h°), parámetro relacionado con las
longitudes de onda y/o mezclas de éstas. En ambas temporadas se observó que en el estadio LG
los frutos tienen una coloración en el rango de verde – amarillo, que puede ser afectado por el
cambio de coloración de los aquenios, ya que en este estadio el receptáculo tiene un color verde
y los aquenios presentan una coloración roja. En el estadio T la clorofila se degrada. De esta
manera ocurre la transición del color del receptáculo desde verde, pasando por una tonalidad
amarilla en algunos casos, hasta alcanzar la coloración blanca rosácea.
3.3. Análisis de parámetros fisiológicos: sólidos solubles y acidez titulable
Uno de los cambios involucrados en la maduración de los frutos es el contenido de sólidos
solubles (CSS). Esto se debe a la hidrólisis de polisacáridos como almidón y pectinas, y
oligosacáridos escindidos de la pared celular, entre otros (Torres y cols., 2013). La estación de
crecimiento, la geolocalización, la especie y el cultivar son todos factores que pueden influir en
este parámetro fisiológico de calidad (Arribillaga e Hidalgo, 2013). La cuantificación de CSS
se realiza en grados brix (°Bx) que indica la cantidad de azúcares disueltos en un líquido. En
esta investigación, a partir del valor de °Bx, se han calculado los gramos de azúcar en 100
gramos de peso fresco. En los resultados obtenidos, se observaron diferencias estadísticamente
significativas entre los datos del año 2015 y los del año 2016. En este último, se observa un
incremento sostenido y una mayor acumulación del sólidos solubles a partir del estadio LG hasta
el R. A diferencia de la temporada anterior, se evidenció una leve declinación en el estadio LG,
que se ve incrementada en el estadio T y se mantiene en R (Figura 15 A).
En relación a la acidez titulable, se presentan diferencias significativas entre ambas
temporadas para todos los estadios, donde la acidez disminuye a través del proceso de
maduración del fruto. Teóricamente, esto es lo esperado ya que la transformación de los ácidos
orgánicos en otros compuestos influye en la disminución de este parámetro. Los resultados
obtenidos concuerdan con lo esperado; no obstante, los frutos de la temporada 2016 terminaron
en estadio maduro con valores de acidez cercano al doble del año 2015 (Figura 15 B).
45
La relación entre CSS y AT también es utilizado como índice de madurez (Olmo y cols.,
2000). De acuerdo a los resultados obtenidos, se observó que en ambos años se presenta el
mismo comportamiento (Figura 16). La relación sólidos solubles/acidez se mantiene constante
en los estadios SG y LG, pero aumenta en el estadio T, valor que se mantiene en estadio R
(Figura 15 A y 15 B).
A)
0.00
0.01
0.02
0.03
SG LG T R
Gra
mos
de
azúc
ar e
n 10
0 gr
amos
de
peso
fres
co
Estadio de Maduración
2015
2016
* *
* *
46
B)
Figura 15. Cambios en el contenido de sólidos solubles (A) y acidez titulable (B) a través del
desarrollo de F. chiloensis en las colectas de los años 2015 (color negro) y 2016 (color gris).
Las siglas en el eje X corresponden a cada uno de los estadios de maduración: SG (verde
pequeño); LG (verde grande); T (transición); R (maduro). El método de comparación para el
análisis estadístico fue LSD Fisher con un valor-p de 0,05.
0
4
8
12
SG LG T R
Gra
mos
de
ácid
o / 1
00
gram
os d
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so fr
esco
Estadio de Maduración
2015
2016
*
*
* *
47
Figura 16. Relación entre el contenido de CSS y AT en las colectas de los años 2015 (línea
color negro) y 2016 (línea color gris). Las siglas en el eje X corresponden a cada uno de los
estadios de maduración: SG (verde pequeño); LG (verde grande); T (transición); R (maduro).
3.4. Obtención del gen FchRGL1
La búsqueda inicial realizada en la base de datos NCBI entregó un total de 8.148 items,
por lo cual se aplicaron los filtros de especie, tipo de molécula y largo de secuencia, para reducir
la cantidad de resultados a 394 items. Para enriquecer la búsqueda, cinco familias de plantas
fueron posteriormente seleccionadas para encontrar todas las posibles secuencias de RG-liasas:
sapindales, solanaceae, monocotyledoneae, rosaceae y brassicaceae (Tabla S-I, material
suplementario). Las secuencias obtenidas fueron utilizadas como entrada para realizar
TBLASTX en contra de la librería de RNA-seq preparada a partir del estadio LG, tanto en frutos
completos o sólo receptáculo. La búsqueda por medio de algoritmos computacionales, compara
las secuencias del RNA-seq con las descargadas de NCBI, entregando un score de los
alineamientos. Como resultado, se obtuvieron todos aquellos contigs que tuvieron alguna
0
0.001
0.002
0.003
0.004
0.005
SG LG T R
CSS
/AT
Estadio de Maduración
2015
2016
48
identidad con las secuencias de entrada. Para evitar la redundancia de información y secuencias
no informativas, se consideraron solo aquellas que obtuvieron un E-value superior a 10-6,
porcentaje de identidad sobre 75% con la secuencia que fue alineada por el algoritmo, y un largo
de secuencia alineada de al menos 100 nucleótidos. De acuerdo a lo anterior, 1201 contigs del
RNA-seq se alinearon con las secuencias de entrada, con excepción de la familia
monocotyledoneae. Se redujo la repetición de contigs, considerando el total de familias de
plantas, dejando solo un código único del total de secuencias encontradas; así, el número total
de contigs hallados, que codificarían para RG-liasas, fue de 43. Considerando las variantes de
ensamble este número se reduciría solo a 18 secuencias de RG-liasas encontradas en el RNA-
seq de F. chiloensis (Tabla S-II, material suplementario).
Al comparar los niveles de FPKMs en los diferentes estadios, se observó que sólo cuatro
contigs presentan diferencias importantes en sus niveles de transcritos a través del proceso de
maduración del fruto. Únicamente el contig comp3966_c0_seq11, con una longitud de
secuencia de 3.328 nucleótidos, presentó un incremento de los FPKMs en fruto completo, por
tanto fue considerado para realizar su respectivo análisis in silico y así confirmar si corresponde
a una enzima RG-liasa.
Para determinar si la secuencia del contig seleccionado corresponde efectivamente a una
enzima RG-liasa se tradujo la secuencia nucleotídica del contig en Translate Tool, donde en el
primer ORF se obtuvo una lectura en dirección 5’à3’ con un largo de secuencia de 676
aminoácidos, lo que fue confirmado con el servidor web GENSCAN ya que se obtuvo un
resultado idéntico (Figura 17).
atgaggaatctgaaggcgttattattaacggggattgttctttgttgttctagctttgtt
M R N L K A L L L T G I V L C C S S F V
gatggcactgcggcaagatcaccaggaagtcatggactaccaagtcaagaaaatgcggtc
D G T A A R S P G S H G L P S Q E N A V
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E I K M V K N G V V L D N K L V Q I T F
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S N P G G D V I A I S Y G G I D N L L E
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I N N V E G N R G Y W D V V W D N V A E
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T V H T Q N K L P G T Q F K V I T Q S P
49
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G V T V P M N I D K R Y I L Q Q G R T G
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F Y T Y A I F E R L Q G W P G G R M E T
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L R V A F K L L G A K F R Y M A V S D T
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R Q R F M P T A Q D R A R G K P L A Y K
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K Y Q Y S A E D K D I K V H G W I S M A
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K Q D L T S H V G P T S M T V F S C S H
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G P V F V Y L N S A A P S S H S S S M I
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G V M Y D Y I R L E G P A E K P *
Figura 17. Traducción de la secuencia nucleotídica del contig seleccionado.
En el análisis de BLAST se encontró una alta identidad (96%) con la secuencia que
codifica para ramnogalacturonano liasa B de Fragaria vesca (NCBI accesión
XM_004287274.2), con una cobertura del 68% (E-value = 0.0). Al realizar un análisis de la
secuencia en la bases de datos de dominios conservados (CDD) (Figura 18), se encontró que
desde los nucleótidos 877 al 1.488 se ubica el dominio catalítico conservado de la familia
RGL4_N, correspondiente a la familia PL4 de las RG-liasa (CDD accesión cl15675). Desde el
nucleótido 1.891 al 2.187, se encontró el dominio conservado RGL4_M presente en dichas
enzimas, que corresponde a FNIII (CDD accesión cd10316). Entre los nucleótidos 2.215 hasta
el 2.781 se pudo determinar la existencia del tercer dominio característico conservado,
correspondiente a CBM-like o módulo de unión a carbohidratos (CDD accesión pfam14683).
51
Figura 18. Predicción de dominios presentes en el contig encontrado en la base datos del RNA-
seq de F. chiloensis, el cual correspondería a una enzima de tipo RG-liasa. Se presentan los tres
dominios característicos de la enzima: Dominio RG-liasa (rosado), dominio FNIII (amarillo) y
dominio CBM (verde). Los aminoácidos claves también fueron destacados: aminoácidos del
sitio activo (flechas color rosado), aminoácidos del sitio catalítico (flechas color morado),
aminoácidos de unión al sustrato (flecha color celeste) y aminoácidos de unión a Ca2+ (flechas
color naranjo).
Traducida la secuencia, se evaluó si ésta presenta péptido señal de secreción extracelular
en el extremo N-terminal, con el objetivo de diseñar partidores que amplifiquen un fragmento
sin considerarlo para su posterior expresión heteróloga. Se utilizaron tres servidores web para
identificar el correcto sitio de escisión, sin embargo no se logró una convergencia de resultados
debido a que se obtuvo diferentes sitios de corte entre éstos. En el caso de SignalP-4.1, la
secuencia es escindida entre los aminoácidos 25 y 26 (Figura 19 A), en cambio PrediSi indica
la escisión entre los aminoácidos 22 y 23 (Figura 19 B); Signal-3L en cambio, sugiere que el
sitio de corte está entre los aminoácidos 24 y 25 a partir del aminoácido del inicio de la
traducción. Para resolver esta diferencia se decidió realizar el corte entre los aminoácidos 25 y
26, que fue predicho por SignalP-4.1 y que además fue lo reportado en la publicación de Molina-
Hidalgo y cols. (2013), quienes describieron una RG-liasa involucrada en la degradación de la
lamela media.
Se corrobora finalmente, que el contig seleccionado corresponde a una secuencia que
codifica para una enzima de tipo RG-liasa. Sin embargo, la secuencia nucleotídica encontrada
debe ser verificada con resultados experimentales.
52
A) B)
Figura 19. Predicción de péptido señal de la secuencia que codifica para una RG-liasa. A)
SignalP-4.1 señala que el sitio de corte corresponde entre los aminoácidos 25 y 26. B) PrediSi
indica que el sitio de corte corresponde entre los aminoácidos 22 y 23.
3.5. Obtención experimental y análisis in silico del gen FchRGL1
Los resultados descritos en el apartado 3.4 de este capítulo confirman la detección de una
secuencia que codifica para una RG-liasa en frutos de F. chiloensis, sin embargo es necesario
confirmar si la secuencia efectivamente existe en la planta o si el contig seleccionado es sólo un
falso positivo. En caso de que la secuencia sea hallada experimentalmente, se debe determinar
la identidad de secuencias entre lo encontrado in silico y lo obtenido a través de la secuenciación.
Se realizó la extracción de RNA, tratamiento con DNAsa y construcción de librerías de
cDNA en frutos de los cuatro estadios de F. chiloensis. Se diseñaron partidores desde la región
codificante del contig seleccionado, sin considerar el péptido señal. A partir de un bulk de cDNA
de frutos considerando desde el estadio LG a T, se obtuvo experimentalmente la secuencia
nucleotídica correspondiente a la enzima RG-liasa, donde los resultados encontrados in silico y
experimentalmente coincidieron con un 100% de identidad (Figura S-I, material suplementario).
Para complementar la información hasta ahora obtenida de la enzima, se realizó la
predicción de putativos sitios de N-glicosilación. La secuencia presenta dos sitios
correspondientes a las secuencias NASL y NETS. Según la predicción, no existen puentes
disulfuro en la secuencia. Otros parámetros de RG-liasa de F. chiloensis se encuentran descritos
en la Tabla III.
53
Previo a la construcción del árbol filogenético, se realizó un alineamiento de secuencias
con otras RG-liasas de plantas, considerando las entradas utilizadas en la investigación de
Molina-Hidalgo y cols. (2013) (Figura 20).
Tabla III. Parámetros de la enzima RG-liasa de F. chiloensis (sin péptido señal). Análisis fue
realizado con el servidor web ExPASy.
PARÁMETRO VALOR
Peso molecular 75495 kDa
Nombre de la proteína Ramnogalacturonano endoliasa
Nombre del gen FchRGL1
Punto isoeléctrico 6,91
Largo (pb) 1956
Número de residuos 652
Putativo sitio de N-glicosilación NASL, NETS
Putativos puentes disulfuro No existen
Función molecular Liasa
Número EC 4.2.2.23
54
55
Figura 20. Alineamiento de secuencias de varias RG-liasas de plantas correspondientes a:
FaRGL, F. x ananassa; FvRGL, F. vesca; FchRGL, F. chiloensis (BankIt 2155915, con fecha
de liberación octubre 05 de 2019); AlRGL, Arabidopsis lyrata; AtRGL, A. thaliana; PtRGL,
Populus trichocarpa; BdRGL, Brachypodium distachyon; HvRGL, Hordeum vulgare; OsRGL,
Oryza sativa; SbRGL, Sorghum bicolor; GmRGL, Glycine max; MtRGL, Medicago truncatula;
VvRGL, Vitis vinífera; SlRGL, Solanum licopersicum. La línea de color naranjo que subraya
las secuencias en el extremo N-terminal corresponde al péptido señal predicho en cada una de
ellas.
Los aminoácidos en columnas rojas con letras blancas indican aminoácidos estrictamente
conservados en todas las secuencias alineadas; las columnas en color amarillo y letras negras
representan a los aminoácidos parcialmente conservados, los cuales mantienen en la misma
posición diferentes aminoácidos pero con cargas o propiedades similares.
El péptido señal que aparece subrayado con una línea roja en todas las secuencias y que
fue predicho con el servidor SignalP 4.1, es muy variable; solo entre algunas especies existe una
mayor identidad de secuencias, dependiendo de la cercanía evolutiva. Con asterisco azul se
destacan los aminoácidos del sitio catalítico, donde en las posiciones M/L/I180, A/V186,
56
E/P228, M/L293 y V/M/I295 existe una conservación parcial de los aminoácidos; únicamente
las posiciones R184, K188, Y219, K241, Y242 y H300 se encuentran estrictamente conservadas
en todas las secuencias. Las flechas de color verde indican a los aminoácidos del sitio activo
K241 y H300. Empíricamente, se ha demostrado que la mutación de alguno de éstos
aminoácidos puede inhibir la actividad enzimática (Jensen y cols., 2010). De los aminoácidos
de sitio de unión a sustrato en color rojo, la posición D/K/R/G616 se encuentra parcialmente
conservada y N618 y R622, se encuentran estrictamente conservados. Los aminoácidos de unión
a Ca2+ D490 y D665, en color celeste, se conservan en todas las secuencias estudiadas.
En la Figura 21, se detalla en diferentes colores los dominios correspondientes a la enzima
FchRGL1, los aminoácidos clave en la actividad catalítica, y de unión a Ca2+ y a sustrato.
ARSPGSHGLPSQEN AVEIKMVKNGVVLDNKLVQ ITFSNPGGDVIAISYGGID
NLLEINNVEGNRGYWDVVW DNVAETVHTQNKLPGTQFK VITQSPDQVEISFITTYNA
SLHRGDNGVTVPMNIDKRY ILQQGRTGFYTYAIFERLQ GWPGGRMETLRVAFKLLGA
KFRYMAVSDTRQRFMPTAQ DRARGKPLAYKEAVLMNNE TSSPEFSGEVDDKYQYSAE
DKDIKVHGWISMAPPVGFW MITPSDESRIAGPFKQDLT SHVGPTSMTVFSCSHYVGK
EVGLKFQEGEAWKKVFGPV FVYLNSAAPSSHSSSMIRT LWNNAKDQMLEEVKSWPYN
FISSQDYPSSNQRGSVSGQ LLVNDPYIPGIPVASSAYV GLAAPGEVGSWQRESKGYQ
FWTQTDAKGNFFIEHVRPG HYNLYASVPGIVGDYKYEV DIIIKPGSKIELASITYKP
PRIGPTLWEIGIPDRSAAE FYIPDPYPTLMNKLYKGSE LDKFRQYGLWSRYYELYPH
KDLIYNVGANNYGDDWFYA QVTRSVGNNKYVGTTWQIQ FELNAVNPGIYTLQLALAS
ATYAELEVRVNNANAKPPL FSTGLIGDDNAIARHGIHG LYWFWSIKVPSTLLHKGSN
TIYLTQTRGGTPLQGVMYD YIRLEGPAEKP
Figura 21. Secuencia aminoacídica de la enzima FchRGL1. Los colores representan lo
siguiente: dominio RGL4 (naranjo), dominio FNIII (verde), dominio CBM (azul), aminoácidos
del sitio activo (amarillo), aminoácidos del sitio catalítico (rojo), sitio de coordinación de ión de
Ca2+ (celeste) y sitio de unión al sustrato (gris).
57
El árbol filogenético construido a partir del alineamiento múltiple hecho con anterioridad,
claramente separa a las secuencias alineadas en dos grupos (Figura 22): en el primero están las
secuencias de FaRGL, FvRGL, FchRGL, SlRGL, PtRGL, AlRGL y AtRGL. Dentro de este
primer grupo, se forman dos clasificaciones, donde en un clado se encuentran agrupadas
secuencias de frutos con una rápida pérdida de firmeza: las tres secuencias del género Fragaria
y la secuencia de S. licopersicum. En el segundo clado se agruparon las secuencias de Populus
trichocarpa (álamo) y de A. thaliana y Arabidopsis lyrata. El segundo grupo también se divide
en dos clados: el primero contiene a las secuencias de las leguminosas Glicine max (soya) y
Medicago truncatula (carretón) y la planta de Vitis vinífera (vid). El segundo clado contiene las
secuencias de Brachypodium distachyon, Hordeum vulgare (cebada), Oryza sativa (arroz) y
Sorghum bicolor (sorgo), todas especies pertenecientes a la familia de las gramíneas.
Un análisis más detallado del grupo donde se encuentran las secuencias del género
Fragaria, se observa que la secuencia de FchRGL se encuentra clasificada dentro del mismo
clado que FaRGL y FvRGL. El alineamiento de secuencias entre F. x ananassa y F. vesca,
indica que comparten una identidad de secuencia del 99% y una cobertura del 100% entre ellas;
la única diferencia observada corresponde a la posición 463, donde en F. x ananassa aparece
Ala, mientras que en F. vesca existe Gly. Del total de las secuencias alineadas en la Figura 20,
FaRGL es la única que presenta una Ala en esta posición. Entre F. x ananassa y F. chiloensis,
existe un 100% de cobertura pero sólo un 93% de identidad. De los 676 aminoácidos de largo
total del alineamiento existen 40 similitudes de las cuales hay 20 aminoácidos que presentan
diferencias en sus cadenas laterales y además no están presentes en posiciones claves como sitio
de unión a sustrato o sitio catalítico. Otros 20 aminoácidos presentan similitudes con
propiedades similares en cuanto a las cargas. Las diferencias anteriormente mencionadas,
influyen en el alineamiento y la posterior construcción del árbol filogenético. La enzima será
llamada FchRGL1, ya que ha sido encontrada en F. chiloensis y es la primera enzima de este
tipo reportada en este fruto.
A la fecha, no existe una clasificación estandarizada de las RG-liasas de plantas. Ensayos
experimentales de actividad enzimática realizados en plantas sólo se presentan en este trabajo
(Capítulo II), por lo cual una mayor información podría facilitar la clasificación de las diferentes
RG-liasas en plantas.
58
Figura 22. Árbol filogenético de diferentes RG-liasas de plantas. Las 15 secuencias fueron
alineadas con ClustalX v2.1. y corresponden a: AlRGL, XP_020884240.1; AtRGL,
NP_179847.1; BdRGL, XP_010235392.1; FaRGL, Molina-Hidalgo y cols. (2013); FcRGL
(FchRGL), Méndez-Yáñez y cols. (BankIt 2155915, con fecha de liberación octubre 05 de
2019); FvRGL, XP_004287322.1; VvRGL, XP_010664440.1; GmRGL, XP_003526529.1;
HvRGL, BAK04420.1; MtRGL, XP_003603709.2; OsRGL, XP_015650024.1; PtRGL,
XP_002308510.2; SbRGL, XP_002445711.1; SlRGL, XP_019066804.1. Los números en cada
nodo del árbol corresponden a los valores obtenidos al realizar 10.000 bootstrap.
3.6. Expresión relativa de FchRGL1 en fruto y tejido vegetativo
El primer reporte de la presencia del gen RG-liasa en tejidos vegetales data del año 2000,
donde fue encontrado en raíces y silicuas (Tavares y cols., 2000). En G. hirsutum, ha sido
posible relacionarla a tejidos en expansión, midiendo la elongación de cotiledones (Naran y
cols., 2007) y en F. x ananassa se ha asociado con la maduración y pérdida de firmeza. Además,
se reportó que FaRGLiasa1 se expresa principalmente en receptáculo y en menor proporción en
flores (Molina-Hidalgo y cols., 2013).
Con partidores diseñados a partir de la región 5’UTR de FchRGL1 (Tabla IV), fue posible
determinar una variación en los niveles de transcritos a través del proceso de maduración. En
59
los estadios SG y LG casi no existe expresión del gen. Es en el estadio T donde se observa un
incremento en los niveles de transcritos, el cual se quintuplica en el estadio R (Figura 23 A).
Los datos anteriores, se correlacionan con los datos extraidos del análisis transcriptómico
masivo (RNA-seq) (Figura 23 B), ya que los FPKMs reportados del contig que codifica para el
gen de FchRGL1 presenta la misma tendencia que los análisis por RT-qPCR.
Tabla IV. Partidores diseñados para determinar los niveles de expresión de FchRGL1.
DESCRIPCIÓN SECUENCIA (5’à3’) Tm (°C)
Partidor RT-qPCR 5’ GAA TTC ATG AGG AAT CTG AAG GCG T 64,1
Partidor RT-qPCR 3’ TCT AGA TGG CTT CTC AGC AGG T 62,1
A)
0
100
200
300
400
500
SG LG T R
Exp
resi
ón r
elat
iva
Estadio de Maduración
a
b
b b
60
B)
Figura 23. Cambios en la abundancia de transcritos del gen FchRGL1 en fruto completo. (A)
La determinación de transcritos fue realizada mediante RT-qPCR, utilizando FchGAPDH como
gen normalizador. Letras distintas indican diferencia significativa (p≤ 0,05) mediante test LSD
Fischer. (B) Valores de FPKMs obtenidos desde RNA-seq.
En tejido vegetativo, se observó una baja expresión del gen en flores y hojas, no obstante
en tallo, estolón y raíz los niveles de expresión son superiores, sugiriendo que la presencia de
FchRGL1 en tejidos vegetativos podría estar relacionada con la expansión de éstos (Figura 24).
En el caso de F. x ananassa, la expresión relativa fue evaluada en hoja, estolón y flores, donde
se observó únicamente en flores la presencia del gen (Molina-Hidalgo y cols., 2014). En líneas
transgénicas de tomates transformados con el gen de RG-liasa de manera constitutiva con el
promotor CAMV35S, se observó un incremento en la expresión relativa en raíz y hoja, con
niveles de transcritos superiores a los determinados en frutos (Ochoa-Jiménez y cols., 2018).
0
20
40
60
80
LG T R
FPK
Ms
Estadio de Maduración
61
Figura 24. Cambios en la expresión relativa del gen FchRGL1 en tejidos vegetativos de hoja
(H), tallo (T), estolón (E), raíz (R) y flor (F). Los análisis de varianza fueron realizados
considerando la prueba LSD de Fisher con un nivel de significancia de p ≤ 0,05.
a
b
d
d
Tejido vegetativo
Exp
resi
ón r
elat
iva
c
62
4. CONCLUSIONES
En primer lugar, es importante señalar que la clasificación fenotípica inicial de los frutos
de acuerdo a lo establecido por Figueroa y cols. (2008), permite segregar frutos que difieren en
parámetros fisiológicos como peso, tamaño, firmeza y color. Esto es importante para esta tesis
que tiene como objetivo comprender el fenómeno el ablandamiento de estos frutos.
Se observaron diferencias entre los frutos de las temporadas 2015 y 2016 en los
parámetros de peso, tamaño, CSS y AT, siendo los frutos de la temporada 2015 más grandes y
de color más intenso que los de la temporada 2016. No se puede establecer fehacientemente la
causa precisa de las variaciones fenotípicas, ya que existen múltiples factores biológicos y
ambientales que pueden influir en el desarrollo de los frutos.
Utilizando la información generada a través de un RNA-seq, preparada a partir de frutos
de F. chiloensis durante el proceso de maduración fue posible seleccionar un contig (Tabla S-
II, comp3966_c0_seq11) que resultó corresponder al gen codificante de la enzima RG-liasa, la
cual fue llamada FchRGL1. El gen codifica para una proteína de 652 aminoácidos de extensión,
sin considerar el péptido señal. La secuencia fue confirmada de manera experimental, mediante
la amplificación del ORF y posterior secuenciación. El alineamiento del contig con el ORF de
RG-liasa clonado experimentalmente comparten 100% de identidad de secuencia, por lo tanto
se confirma la secuencia en la especie F. chiloensis.
En cuanto a la expresión relativa del gen FchRGL1, se comprobó la correlación entre los
datos de FPKMs y los obtenidos experimentalmente por la técnica de RT-qPCR, donde existe
un aumento en los niveles de transcritos a medida que el fruto madura. Por otra parte, en tejidos
vegetativos se observó una baja expresión relativa en flor y hoja, pero en tallo, estolón y raíz el
gen se expresa en niveles superiores que el fruto, sugiriendo que su expresión puede estar
relacionada con tejido vegetativo en expansión.
El análisis in silico de la secuencia codificante de FchRGL1, revela que ésta presenta los
tres dominios claves de una enzima RG-liasa del tipo PL4: RGL4, FNIII y CBM. Además, se
comprobó la presencia de los aminoácidos claves para la actividad catalítica, de unión a sustrato
y a Ca2+. La enzima además es secretada al medio extracelular para cumplir con su actividad
funcional en la pared celular.
El árbol filogenético, clasifica las enzimas RG-liasas de plantas en dos grupos; sin
embargo a la fecha no existe evidencia científica o investigaciones que permitan explicar la
63
segregación de los grupos. Se hace imprescindible por tanto, realizar estudios más detallados
que entreguen indicios sobre regiones o estructuras secundarias claves que expliquen las
agrupaciones. Ensayos de mutaciones sitio dirigidas que provoquen cambios estructurales
podrían ayudar a realizar una primera clasificación de estas enzimas.
Hoy en día, existe evidencia experimental en F. x ananassa de la importancia de la enzima
RGL para la textura de frutos de frutilla. Mediante experimentos de RNAi, se demostró en frutos
que no presentan transcritos para RG-liasa que la lamela media de éstos presenta un marcado
engrosamiento, destacando el rol que RG-liasa tendría en el desensamblaje del RGI presente en
la fracción péctica de la pared celular y lamela media. Adicionalmente, en tomates
transformados constitutivamente con el gen RG-liasa del mismo, se observó el fenómeno de
cosupresión de la copia endógena, desarrollando un fruto firme por mucho más tiempo en
comparación al control. Estas evidencias, en adición al incremento en los niveles de transcritos
a lo largo del proceso de maduración y coincidente con el ablandamiento del fruto, podrían
sugerir que este gen podría estar relacionado con la pérdida de firmeza en frutos de F. chiloensis.
64
CAPÍTULO II
CLONAMIENTO, EXPRESIÓN HETERÓLOGA Y
CARACTERIZACIÓN DE LA ENZIMA FchRGL1
65
1. INTRODUCCIÓN
1.1. Expresión heteróloga de proteínas recombinantes
Las proteínas recombinantes surgieron a partir de la necesidad de curar enfermedades.
Proteínas, enzimas y hormonas homólogas, antiguamente fueron extraídas desde animales para
curar un sinnúmero de males. Sin embargo, la escasa cantidad obtenida y la falta de escalabilidad
de la producción de estas moléculas biológicas, prometía la cura sólo a los más acomodados.
No fue hasta los años setenta, donde un grupo de investigadores demostraron la recombinación
del ADN y con ello surgió la idea de manipularlo a nivel genético (Jackson y cols., 1972; Cohen
y cols., 1973; Cohen y Chang, 1973). En 1974, Jaenisch y Mintz lograron obtener el primer
animal genéticamente modificado. En 1980, la FDA aprobó para uso clínico insulina
recombinante producida heterólogamente en la bacteria Escherichia coli, siendo la primera
proteína comercial de este tipo en ingresar al mercado (Johnson, 1983). En 1983, utilizando
Agrobacterium tumefasciens se logró transformar la primera planta de tabaco (Bevan y cols.,
1983).
Gracias al desarrollo en investigación de vectores genéticos la técnica de PCR, ha sido
posible, entre otras cosas, clonar un fragmento de ADN y obtener una enorme cantidad de copias
de éste. La basta gama de opciones para experimentar posteriormente con el fragmento clonado,
es infinita.
Existen a la fecha varios tipos de células hospederas para realizar expresión heteróloga:
desde procariontes como bacterias del género bacillus, hasta eucariontes como células de
hongos, insectos, mamíferos y plantas. Los principales organismos utilizados corresponden a E.
coli, Sacharomyces cerevisiae y células de mamíferos, las cuales abarcan más del 80% del
mercado de producción de proteínas recombinantes. Hirudina, interferon a-2b y la vacuna de la
hepatitis B, son una de las tantas proteínas terapeúticas recombinantes exitosamente producidas
(Martínez y cols., 2012). Gracias al éxito de esta técnica de producción de proteínas, cerca del
25% de los farmaceúticos comerciales corresponden a biofarmacéuticos (Redwan, 2007), donde
cerca de la mitad de las ventas mundiales se encuentran en Estados Unidos con anticuerpos
monoclonales con ventas superiores a 18 billones de USD, seguido de hormonas con 11 billones
66
de USD y factores del crecimiento con una venta de más de 10 billones de USD (Aggarwal,
2011). Al año 2012 las ventas alcanzaron los 165 billones de USD (Rader, 2013).
1.2. Expresión heteróloga de enzimas de plantas
La utilización de enzimas de plantas en la industria ha producido una revolución en la
agricultura, biotecnología y bioenergía, entre otras áreas de la producción (Phitsuwan y cols.,
2013). Hoy en día, la expresión heteróloga de enzimas de origen vegetal es utilizada en la
producción de algodón y papel, detergentes, extracción de jugos, aditivos alimenticios y
biocombustibles (Bhat, 2000). Los sistemas de expresión más comunes son bacterias, levaduras
y plantas. Cada sistema de expresión tiene beneficios y desventajas y son elegidos dependiendo
de las modificaciones postraduccionales, eficiencia del sistema, adición o eliminación de
azúcares específicos, y del metabolismo del hospedero. En humanos, se sabe que sobre el 50%
de las proteínas son predichas como glicosiladas (Apweiler y cols., 1999). La glicosilación es
una de las modificaciones postraduccionales más relevantes y puede afectar a la actividad de
una enzima heteróloga. Se ha descrito que presentan un rol importante en la estabilidad térmica,
reacción cinética, solubilidad, actividad in vivo y unión a ligando de las enzimas y proteínas
(Geyer y Geyer, 2006; Tsuchiya y cols., 2012; Wang y cols., 2009). Su ausencia podría inclusive
causar la pérdida total de la actividad enzimática. Por ejemplo, la enzima FcXTH1 posee un
sitio de N-glicosilación conservado adyacente a los residuos catalíticos. Se ha determinado in
silico que existe una mejor energía de interacción para el complejo proteína-ligando con la
enzima glicosilada (Méndez-Yáñez y cols., 2017). Experimentalmente, la desglicosilación con
PNGasa-F incrementa la KM, reduce kcat/KM y reduce la estabilidad de la enzima.
1.3. Caracterización de RG-liasas
El conocimiento de la conformación estructural de la pared celular ha contribuido a la
comprensión de los mecanismos moleculares que participan en su desensamblaje. En una escala
mayor, estos cambios se ven reflejados en las variaciones de calidad organoléptica del fruto.
Los polisacáridos de la pared celular, se encuentran distribuidos de manera diferencial,
dependiendo del tejido y las condiciones ambientales. En el caso particular de las pectinas, su
67
relevancia se centra en el hecho de que son el componente más importante en el crecimiento,
maduración y senescencia de frutas y vegetales (Fry, 1988).
La primera enzima caracterizada con actividad catalítica sobre RG-I data del año 1990
(Schols y cols., 1990). Extraída desde A. aculeatus, se logró determinar que esta enzima
correspondía a una ramnogalacturonasa, ya que escinde el enlace a(1à2) entre GalA y Rha sin
la formación de un doble enlace en GalA. En 1994, se reportó la primera liasa denominada
ramnogalacturonasa B (Kodof y cols., 1994). Sin embargo Azadi y cols. (1995) observaron que
la actividad de esta enzima era de tipo liasa y además escindía el enlace a(1à4) entre Rha y
GalA por b-eliminación, formando ácido hexenurónico en GalA.
A la fecha, todas las liasas e hidrolasas caracterizadas heterólogamente y con actividad
enzimática sobre el esqueleto de RG-I, han sido extraídas desde bacterias y hongos.
Dependiendo si la actividad enzimática es sobre el enlace glicosídico terminal o sobre un enlace
aleatorio en el esqueleto del RG-I, se clasifican en endoliasas (EC 4.2.2.23) y exoliasas (EC
4.2.2.24) (Lombard y cols., 2014). Estas enzimas, además están clasificadas en dos grupos de
polisacárido liasas diferentes, PL4 y PL11. A pesar de presentar idéntica actividad enzimática,
estructuralmente son completamente diferentes. Investigaciones sugieren que esta enzima ha
tenido que reinventarse varias veces a través de la evolución. En la Tabla V, se describen las
liasas del grupo PL4 y PL11 encontradas hasta 2015 (Silva y cols., 2016). En plantas, se ha
reportado la presencia de liasas en A. thaliana (Lin y cols., 1999), algodón (Naran y cols., 2007)
y frutilla (Molina-Hidalgo y cols., 2013), sin embargo al día de hoy no existen reportes que
muestren la caraterización de liasas de plantas.
68
Tabla V. Parámetros bioqumícos de enzimas ramnogalacturonano endoliasas y exoliasas
caracterizadas hasta el año 2016, pertenecientes a los grupos PL4 y PL11. Extraido con
modificaciones de Silva y cols. (2016).
Especie Enzima pI PM (kDa)
pH óptimo
Temperatura óptima (ºC) Referencia
PL4 EC 4.2.2.23
Erwinia chrysanthemi
RhiE 7,8 65 6,0 - Laatu y Condemine, 2003
Aspergillus aculeatus
RhgB 5,2 55 6,0 50 Mutter y cols., 1998
Penicillium chrysogenum
PcRGL4A 6,4 51 7,0-8,0 40 Iwai y cols., 2015
PL11 endoliasa EC 4.2.2.23
Cellvibrio japonicus
Rgl11A 5,9 93 9,5 - Mckie y cols., 2001
Clostridium cellulolyticum
Rgl11Y 5,0 74 8,5 - Pages y cols., 2007
Bacillus subtilis YesW 6,0 68 8,0 65 Ochiai y cols., 2007
Bacillus licheniformis
YesW_BI 5,8 65 8,1 61 Silva y cols., 2011
PL 11 exoliasa EC 4.2.2.24
Bacillus subtilis YesX 5,4 68 8,5 60 Ochiai y cols., 2007
69
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1. Clonamiento de FchRGL1 en el vector de expresión
Luego de verificar que la secuencia del gen FchRGL1 correspondía a la misma secuencia
seleccionada desde el RNA-seq de F. chiloensis, se realizó un análisis de ésta con el servidor
web NEBCutter V2.0 (Vincze y cols., 2003) para determinar las enzimas de restricción a utilizar
para el clonamiento en el vector de expresión. Posteriormente, se realizó un PCR convencional
utilizando los partidores de amplificación del ORF, de acuerdo a las condiciones descritas en el
apartado 2.6 del Capítulo I. El producto de PCR fue visualizado por electroforesis en gel de
agarosa al 1,5%, y luego de confirmado su tamaño se procedió a la purificación de la banda con
el kit UltraClean® 15 DNA Purification (Mo Bio Laboratories, Inc). Al mismo tiempo, cepas
de E. coli Top10 fueron transformadas con 5 µL del vector de expresión pPICZαA de acuerdo
al protocolo de transformación bacteriana descrito en el apartado 2.7 del Capítulo I. Se verificó
que las colonias que crecieron en las placas hayan sido efectivamente transformadas por medio
de PCR colonia en el termociclador Techne TC-5000, utilizando los partidores propios del
vector de expresión pPICZaA 5’AOX1 (5’-CTG GTT CCA ATT GAC AAG C-3’) y 3’AOX1
(5’-TGG CAT TCT GAC ATC CTC-3’) y los siguientes volúmenes para la mezcla: 2,5 µL de
Buffer PCR, 0,4 µL de dNTP mix (10 mM); 0,3 µL de cada partidor (10 µM); 0,2 µL Paq5000™
DNA Polimerasa (Agilent Technologies); 21,3 µL H2O y 1 µL de templado. Los ciclos para la
amplificación fueron los siguientes: 1 ciclo de 5 min a 94°C; 35 ciclos de: 30 seg a 94°C, 45 seg
a 55°C y 45 seg a 72°C; extensión final de 15 min a 72°C. La amplificación fue verificada en
electroforesis en gel de agarosa al 1,5%. Las colonias positivas fueron inoculadas en medio LB
con Zeocina (100 µg/mL) y puestas a crecer en incubadora a 37°C y 200 RPM por 18 h. Los
plásmidos fueron extraídos con el kit GeneJET Plasmid Miniprep (Thermo Scientific). Para
ligar el vector de expresión con el ORF de RG-liasa amplificado previamente, se hizo una
primera digestión con la enzima EcoRI utilizando la siguiente mezcla de reacción: 16 µL de
agua libre de nucleasas, 2 µL de 10X Buffer EcoRI, 1 µL de vector (500 ng/µL) y 1 µL de EcoRI
(10 U/µL). Se incubó en termociclador Techne TC-5000 a 37°C por 2h y luego a 65°C por 20
min para inactivar la enzima. Se verificó el producto de la digestión mediante electroforesis en
gel de agarosa al 1% y se purificó la banda con el kit UltraClean® 15 DNA Purification (Mo
70
Bio Laboratories, Inc). El producto purificado fue utilizado para realizar una segunda digestión,
utilizando la siguiente mezcla de reacción: 11 µL agua libre de nucleasas, 2 µL de 10X Buffer
Tango, 6 µL de vector pPICZαA y 1 µL de XbaI (10 U/µL). Se incubó bajo las mismas
condiciones que la primera digestión y luego se verificó el producto de la digestión por
electroforesis en gel de agarosa al 1% y se purificó banda con el kit UltraClean® 15 DNA
Purification (Mo Bio Laboratories, Inc). El producto de purificación de la doble digestión
secuencial del vector pPICZαA y la secuencia ORF de FchRGL1 fueron ligados utilizando 5 µL
de 2X Buffer de Ligación, 2 µL de vector digerido, 2 µL del producto de PCR y 1 µL de T4
DNA Ligasa. La mezcla se incubó a 4°C por toda la noche. Al día siguiente, cepas de E. coli
Top10 fueron transformadas con 5 µL del producto de la ligación, de acuerdo al protocolo
descrito en el apartado 2.7 del Capítulo I. Las colonias positivas que crecieron en las placas
fueron verificadas por PCR colonia utilizando la combinación de partidores 5’AOX1 y el
partidor de chequeo interno 3’AOX1, considerando los mismos volúmenes mencionados
anteriormente con la enzima Paq5000™ DNA Polimerasa. Las colonias positivas fueron
inoculadas en medio LB con Zeocina (100 µg/mL) y puestas a crecer en incubadora a 37°C y
200 RPM por 18 h. Los plásmidos fueron extraídos con el kit GeneJET Plasmid Miniprep
(Thermo Scientific).
2.2. Electrotransformación de P. pastoris X-33 con el vector de expresión
Células electrocompetentes de P. pastoris X-33 fueron crecidas en medio YPD (1%
extracto de levadura, 2% peptona y 2% dextrosa) a 30°C por 16 h. A continuación, las células
fueron centrifugadas a 1500 x g y 4ºC por 5 min, e inoculadas en 125 mL de medio YPD fresco,
hasta alcanzar una OD600=1,3-1,5. Las células fueron centrifugadas a 4ºC y 1500 x g por 5 min,
y resuspendidas en 65 mL en agua ultra pura Milli-Q; este paso fue repetido dos veces. Se
centrifugó de la misma manera que en el paso anterior y se descartó el sobrenadante. Se
resuspendieron las células dos veces en 20 mL de sorbitol 1M. Finalmente, las células fueron
centrifugadas y resuspendidas en 1,5 mL de sorbitol 1M. La siguiente mezcla se colocó en la
cubeta de electrotransformación Gene Pulser®/MicroPulser™ con un espacio de 2 mm (BIO-
RAD): 100 µL de P. pastoris X-33, 10 µl de Buffer TE y 20 µg de vector linearizado con la
71
enzima de restricción SacI. La cubeta fue incubada previamente por 5 min en hielo y colocada
en el equipo ECM 399 Electroporation System BTX, donde se electrotransformaron las células
de acuerdo a la Fórmula (4), aplicando 2500 V en un pulso de milisegundos.
Se adicionó 1 mL de sorbitol a las células electrotransformadas, para luego colectarlas y
colocarlas en un tubo de polipropileno de 15 mL, el cual fue puesto en agitación a 30°C y 100
RPM por 2 h con el objetivo de recuperar el cultivo. Las células fueron centrifugadas a 5000 x
g y 4°C por 5 min, donde posteriormente se resuspendieron en agua Milli-Q y se sembraron en
placas YPDS (YPD, sorbitol 1M y 2% agar) con Zeocina (100 µg/mL). Las placas se dejaron
en incubadora por tres días a 30°C. Las colonias de levaduras que crecieron aisladas fueron
transferidas luego a una placa con una grilla para una segunda selección, donde nuevamente
fueron colocadas en incubadora por tres días a 30°C. Para verificar el éxito de la
electrotransformación se realizó PCR colonia, seleccionado tres colonias por placa de las cuales
se tomó una muestra de cada una y se inocularon en 25 µL de buffer TE y 1 µL de liticasa (25
µg/µL) de Arthrobacter luteus (Merck) para hidrolizar enzimáticamente la pared celular de las
levaduras. Se programó un ciclo de 37°C por 30 min y luego 95°C por 10 min. Las muestras
fueron dispuestas por 5 min en hielo y fueron centrifugadas a máxima RPM para decantar
organelos y restos celulares. El sobrenadante anterior, fue utilizado para comprobar el éxito de
la transformación, utilizando el termociclador Techne TC-5000 y la combinación de partidores
5’AOX1 como forward y el partidor reverso del ORF de RG-liasa como reverse, considerando
los mismos volúmenes mencionados en el apartado 2.1 de este Capítulo. El producto fue
visualizado en electroforesis en gel de agarosa al 1,5%.
Fórmula (4)
Donde:
X= Campo de fuerza requerido para la electrotransformación.
A = Ancho de la cubeta en centímetros.
Y = Campo de fuerza que se debe aplicar para la electrotransformación.
kV = Kilovolts.
72
2.3. Crecimiento de P. pastoris X-33 transformadas heterólogamente
Tres colonias transformadas a partir de la segunda selección fueron colocadas en
crecimiento. Se preparó para ello el medio de pre inducción BMGY el cual contiene 1% de
extracto de levadura, 2% de peptona, 100 mM de fosfato potasio (pH 6.0), 1,34% YNB, 4 x 10-
5% de biotina y 1% glicerol. Las levaduras fueron inoculadas en BMGY dispuesto en matraces
calados con un máximo de volumen del 10% de la capacidad total de cada matraz, con la
finalidad de optimizar el intercambio gaseoso del cultivo. Los matraces fueron colocados en una
incubadora con movimiento horizontal a 300 RPM y 30°C hasta alcanzar una densidad óptica
OD600= 2-6, ya que las células se encuentran en fase de crecimiento. Una vez alcanzada la OD
deseada, el volumen de cultivo fue colectado y centrifugado a temperatura ambiente a 3000 x g
por 5 min. El pellet fue resuspendido en medio BMMY, que induce la producción de proteínas.
Este medio contiene los mismos ingredientes y proporciones que el medio BMGY, con
excepción del glicerol que es reemplazado por MeOH al 0,5%. Cada 24h se adicionó MeOH a
una concentración final de 0,5% para mantener la inducción. Las levaduras fueron mantenidas
en el medio de cultivo y agitación hasta llegar a la meseta de crecimiento y alcanzar el máximo
nivel de producción de proteína heteróloga.
2.4. Purificación de la proteína
Al finalizar el proceso de crecimiento y producción de la proteína heteróloga, se colectó
todo el cultivo y se centrifugó a 5.000 x g y 4ºC por 1h. El sobrenadante con las proteínas
secretadas al medio extracelular de las levaduras, fue filtrado en una botella reutilizable PSF de
45 mm (Thermo Scientific Nalgene), utilizando una membrana Durapore (Merck). Todo el
volumen obtenido después de la filtración, llamado desde ahora en adelante extracto crudo, fue
colocado en membranas de diálisis SnakeSkin® Dialysis tubing de 35 mm con corte de peso
molecular de 10K (Thermo Scientific). Se dializó el extracto crudo en cuatro litros de buffer
fosfato de sodio 50 mM (pH 7,4) a 4°C durante toda la noche. A continuación, las proteínas
dializadas fueron precipitadas a 4°C en (NH4)2SO4 hasta alcanzar 80 % de saturación. Luego de
centrifugar el total de proteínas concentradas a 10.000 x g y 4ºC por 20 min, se resuspendió el
pellet en buffer fosfato de sodio 50 mM (pH 7,4). El volumen obtenido fue desalado en columnas
PD-10 con Sephadex G-25 (GE Healthcare Life Sciences). Finalmente, las proteínas producidas
73
heterólogamente fueron separadas por medio de cromatografía de afinidad (His-Tag) utilizando
resina TALON® Metal Affinity (Clontech). Las proteínas fueron purificadas de acuerdo a lo
sugerido por el catálogo de la resina, eluyendo con buffer acetato de sodio 50 mM a pH 5,0, 300
mM NaCl y 300 mM imidazol. Se cuantificaron las proteínas en cada una de las etapas desde el
extracto crudo hasta la purificación por medio del ensayo de Bradford (Bradford, 1976).
2.5. Cuantificación de actividad RGL y caracterización de la proteína heteróloga
Para montar el protocolo de cuantificación de actividad enzimática de RG-liasa de F.
chiloensis, se consideraron las metodologías descritas para RG-liasas presentes en bacterias y
hongos (Ochiai y cols., 2006; Ochiai y cols., 2007; Jensen y cols., 2010) pero con
modificaciones para llevarlo a cabo en plantas. Para caracterizar la enzima heteróloga, se
realizaron curvas de pH en un rango entre pH 4,0 y pH 8,0 con los siguientes buffers: acetato
de sodio 0,2 M entre pH 4.0 y pH 5.5; PIPES 0,2 M entre pH 6,1 y pH 6,5; HEPES 0,2 M entre
pH 7,0 y pH 8,0. Las curvas de concentración de sustrato se realizaron entre 0 y 6 mg/mL de
RG-I de papa (Megazyme) para determinar KM y Vmax. Se utilizó CaCl2, MnCl2, MgCl2, FeCl3
y EDTA para determinar el efecto de los iones en la actividad enzimática de acuerdo a lo
reportado por Ochiai y cols. (2007).
La preparación de extractos proteicos obtenidos desde frutos de F. chiloensis se realizó de
acuerdo al protocolo de Miedes y Lorences (2009), con modificaciones menores. Diez gramos
de frutos fueron homogeneizados en 20 mL de buffer de extracción (buffer acetato de sodio 40
mM pH 5,0, 13 mM de EDTA, 1% de PVP 10 y 1 M NaCl), adicionando 14 µL de β-
mercaptoetanol y 20 µL de PMSF (1 mM). La homogenización se realizó en el equipo Ultra-
Turrax (IKA T25 digital Ultra-Turrax) y la mezcla se dejó en agitación a 4°C durante 12h. El
homogeneizado fue filtrado dos veces a través de gasa y luego centrifugado a 15.000 x g, 4ºC
por 30 min. Se adicionó al sobrenadante obtenido (NH4)2SO4 hasta conseguir una saturación de
80%, para luego centrifugar en tubos de polipropileno a 15.000 x g y 4ºC por 30 min.
Finalmente, el pellet obtenido fue resuspendido en buffer acetato de sodio 40 mM (pH 5,0) y
luego fue desalado en columnas PD-10 con Sephadex G-25 en presencia del mismo buffer. Para
medir la actividad enzimática RG-liasa se utilizó como sustrato RG-I de papa (Megazyme),
74
buffer acetato de sodio 0,2 M (pH 5,0) y CaCl2 2mM. La absorbancia de las muestras fue leída
a 235 nm, ya que en esta absorbancia es posible detectar la formación del producto (ácido
hexenurónico). Para ello, se utilizó el equipo Epoch 2 Microplate Spectrophotometer (BioTek®)
provisto del software Gen5 V2.09, realizando lecturas cada 1 min durante una hora a 30°C con
agitación orbital suave durante la incubación. De la parte inicial de las curvas de reacción se
obtuvo la pendiente, con la cual se realizó el cálculo de actividad enzimática. Una unidad de
actividad enzimática corresponde a la cantidad de enzima requerida para producir el cambio de
0,001 unidad de absorbancia por hora.
Se realizaron además ensayos de actividad enzimática in vivo sobre el mucílago generado
por semillas de A. thaliana en germinación, ya que se ha demostrado que el principal
polisacárido que lo compone corresponde a RG-I con escasas ramificaciones (Macquet y cols.,
2007). Para ello, 5 mg de semillas fueron incubadas en agitación por 10 min con 500 µL de agua
destilada para extraer el mucílago soluble. Se centrifugó a 10.000 RPM por 5 min a temperatura
ambiente y se descartó el sobrenadante; este paso fue repetido dos veces. Las semillas con
mucílago adherido fueron enjuagadas con acetato de sodio 0,2 M (pH 5,0) y luego se le
adicionaron 300 µL de RG-liasa expresada heterólogamente; se mantuvieron las semillas en
agitación orbital suave por toda la noche a 30°C. Al día siguiente, se realizó la tinción de
mucílago con rojo rutenio al 0,05%.
2.6. Estructura tridimensional de la enzima FchRGL1
A partir de la secuencia obtenida en el Capítulo I, se realizó el modelamiento por
homología de la proteína. Previo a esto, se predijo la estructura secundaria de la secuencia
obtenida con el servidor web PSIPRED (Jones, 1999; Buchan y cols., 2013). Se realizó un Blast
Protein para encontrar la estructura de referencia, considerando en la búsqueda únicamente a la
base de datos de Protein Data Bank (PDB) y el algoritmo Protein-Protein Blast. De la estructura
con mayor porcentaje de identidad y cobertura, se descargó el cristal en formato pdb y la
secuencia aminoacídica para realizar a continuación un alineamiento entre esta secuencia y la
de RG-liasa de F. chiloensis con el software ClustalX V2.1. Se optimizó el alineamiento de
secuencias con el resultado de la predicción de estructura secundaria y el software BioEdit
75
v7.0.5 (Hall, 1999). El modelamiento por homología fue realizado con el software MODELLER
v9.19 (Sali y Blundell, 1993), donde se construyeron 10 modelos y se eligió el que obtuvo el
mínimo valor de DOPE. Para evaluar la torsión de los ángulos phi y psi de la estructura
modelada, se realizó un gráfico de Ramachandran con el servidor web RAMPAGE (Lovell y
cols., 2002). Adicionalmente, para validar la calidad del modelo generado se utilizó el servidor
web ProSA-web (Sippl, 1993; Wiederstein y Sippl, 2007) y Verify3D (Bowie y cols., 1991;
Lüthy y cols., 1992).
2.7. Minimización y docking de la enzima FchRGL1 con RG-I
A la estructura obtenida en el apartado 2.7 de este Capítulo, se le realizó una minimización
molecular para determinar la estructura conformacional energéticamente estable. Para ello, en
Visual Molecular Dynamics (VMD) (Humphrey y cols., 1996) se construyó un sistema en el
cual se embebió la proteína en una caja de agua y se neutralizó con CaCl2. Se realizaron 100.000
pasos de minimización y un equilibrio termodinámico de 2 ns con el software NAMD V2.12
(Phillips y cols., 2005). La estructura con la mínima energía fue evaluada con las aplicaciones
web RAMPAGE, ProSA-web y Verify3D, con la finalidad de compararla con el modelo inicial.
Luego de obtener una estructura proteica energéticamente estable, se construyó el sustrato
de RG-I que desde ahora en adelante será llamado ligando. De acuerdo a la publicación de
Mutter y cols. (1998) se utilizó el polisacárido cristalizado en el PDB ID: 3NJX de 6 unidades
intercaladas de GalA y Rha, sin ningún tipo de ramificaciones. Los parámetros del ligando
fueron obtenidos a través del servidor web SwissParam (Zoete y cols., 2011). Tanto el ligando
como la proteína fueron transformados a formato .pdbqt para utilizarlos como entrada para
construir un sistema de interacción proteína – ligando. Utilizando el software AutoDock 4.2
(Morris y cols., 2009), se construyó una caja de las dimensiones del sitio activo y ubicado en el
bolsillo más grande localizado en la proteína. El sistema de interacción proteína – ligando fue
evaluado con el software Autodock Vina (Trott y Olson, 2010). Nueve ligandos fueron
generados, y se eligió al que presentó la menor energía de interacción.
76
3. RESULTADOS
3.1. Expresión heteróloga de FchRGL1
En el Capítulo I, a partir de la búsqueda en el RNA-seq de F. chiloensis, se obtuvo un
contig con la secuencia codificante para el gen FchRGL1. Los análisis posteriores y la
secuenciación de la región aislada, confirmaron que se trata de un ORF de una enzima RG-liasa.
Para realizar la expresión heteróloga de FchRGL1 fue necesario previamente realizar varios
análisis con la finalidad de evitar que el ORF sea escindido por enzimas de restricción, y así
obtener una enzima heteróloga con todos los elementos necesarios para que sea producida y
secretada al medio extracelular. Se compararon los putativos sitios de corte de diversas enzimas
de restricción en el sitio múltiple de clonamiento (MCS) de los tres posibles vectores de
expresión pPICZa A, B y C y en la secuencia codificante de FchRGL1, mediante NEBCutter
V2.0 (Figura 25). Se pudo determinar que el ORF presenta sitios de reconocimiento para las
enzimas EcoRI y XbaI, por lo que se decidió utilizarlas para digerir el vector de expresión
pPICZaA para relizar el constructo para la expresión heteróloga de FchRGL1 (Figura 26).
Figura 25. Mapa de putativos sitios de corte de enzimas de restricción comerciales sobre el
ORF de FchRGL1. Análisis realizado mediante NEBCutter V2.0 Los colores en el análisis
indican lo siguiente: disponibilidad de la enzima en New England BioLabs (rojo); enzimas
disponibles desde otros fabricantes (celeste); no comercialmente disponibles (verde); escisión
afectada por la metilación CpG (*); escisión afectada por otro tipo de metilaciones (#); sitio
ambiguo (negro).
77
De acuerdo a lo anterior, a los partidores descritos en la Tabla I se les adicionó en el
extremo 5’ y 3’ la secuencia correspondiente los sitios de corte de las enzimas de restricción
seleccionadas. El partidor forward, para amplificar el ORF completo, incluye la secuencia
reconocida por EcoRI y el partidor reverse incluye la secuencia reconocida por la enzima XbaI.
Fue fundamental realizar también la construcción in silico del ORF dentro del vector de
expresión pPICZaA para determinar que se genere un único ORF, sin que existiera algún codón
de stop que interrumpiera la lectura de la secuencia (Figura 27). De acuerdo a su secuencia
proteica, FchRGL1 expresada heterólogamente debiera tener un peso molecular de ~76 kDa, sin
considerar modificaciones postraduccionales.
Figura 26. Representación esquemática de la construcción diseñada para el clonamiento
molecular del ORF de la enzima FchRGL1 en el vector de expresión pPICZaA.
α-factor FchRGL1 ORF c-myc epitope 6x HIS STOP
EcoRI XbaI
78
Figura 27. Construcción in silico del vector de expresión pPICZaA con la secuencia que
codifica para la enzima FchRGL1. Las regiones destacadas en colores corresponden a: a-factor,
que es el péptido señal de la levadura (negro); ORF de FchRGL1 (gris); C-MYC epítope, que
corresponde a una secuencia reconocida por un anticuerpo (celeste); cola de polihistidinas
(naranjo) y codón de stop (negro).
Para realizar la electrotransformación del vector de expresión pPICZaA ligado con el
ORF de FchRGL1 en el MCS, y de acuerdo a la Fórmula (4), se emplearon 2500V en un pulso
de milisegundos, considerando que las células de P. pastoris X-33 tienen un diámetro entre 2-
10 µm. Las colonias transformadas fueron aisladas por medio de una siembra por agotamiento
en estrías múltiples en placas YPDS y zeocina (Figura 28 A), ya que de esta manera se produce
un aislamiento de un mayor número de colonias. En una segunda selección se comprobó
fehacientemente la transformación de las levaduras, donde cada colonia aislada fue sembrada
en una placa grillada (Figura 28 B). Las placas fueron almacenadas a 4ºC y en oscuridad, debido
a la fotosensibilidad de la zeocina. Tres clones de la segunda selección fueron puestos a crecer
en medio BMGY y luego traspasados a medio BMMY, donde se observó que los tres
presentaron el mismo comportamiento en su crecimiento, por lo que se seleccionó una de las
tres colonias para ensayos posteriores. Para determinar cuánto tiempo se deben dejar en medio
BMMY las levaduras transformadas, se realizó una curva de OD600 y de proteínas totales hasta
96 h, donde se concluyó que el momento óptimo para colectar el cultivo se alcanza a las 72 h
MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEAEFARSPGSHGLPSQENAVEIKMVKNGVVLDNKLVQITFSNPGGDVIAISYGGIDNLLEINNVEGNRGYWDVVWDNVAETVHTQNKLPGTQFKVITQSPDQVEISFITTYNASLHRGDNGVTVPMNIDKRYILQQGRTGFYTYAIFERLQGWPGGRMETLRVAFKLLGAKFRYMAVSDTRQRFMPTAQDRARGKPLAYKEAVLMNNETSSPEFSGEVDDKYQYSAEDKDIKVHGWISMAPPVGFWMITPSDESRIAGPFKQDLTSHVGPTSMTVFSCSHYVGKEVGLKFQEGEAWKKVFGPVFVYLNSAAPSSHSSSMIRTLWNNAKDQMLEEVKSWPYNFISSQDYPSSNQRGSVSGQLLVNDPYIPGIPVASSAYVGLAAPGEVGSWQRESKGYQFWTQTDAKGNFFIEHVRPGHYNLYASVPGIVGDYKYEVDIIIKPGSKIELASITYKPPRIGPTLWEIGIPDRSAAEFYIPDPYPTLMNKLYKGSELDKFRQYGLWSRYYELYPHKDLIYNVGANNYGDDWFYAQVTRSVGNNKYVGTTWQIQFELNAVNPGIYTLQLALASATYAELEVRVNNANAKPPLFSTGLIGDDNAIARHGIHGLYWFWSIKVPSTLLHKGSNTIYLTQTRGGTPLQGVMYDYIRLEGPAEKPLEQKLISEEDLNSAVDHHHHHHStop
79
desde inducción del crecimiento de las levaduras (Figura 29). Posterior a este tiempo se observó
muerte celular. En el caso de OD600, la absorbancia inicial del cultivo debe ser siempre igual o
superior a uno. A las cinco horas de crecimiento en medio BMMY, rápidamente el cultivo entra
en la fase exponencial y luego, entre las 10 y 48 h hay un incremento más lento. Posteriormente
entre las 48 y 72 h el cultivo llega a la fase estacionaria, donde la velocidad de reproducción de
los microorganismos es igual a la velocidad de muerte, alcanzando un equilibrio celular
(Hernández y cols., 2008). El tiempo en alcanzar esta fase puede variar entre especies y entre
clones.
A) B)
Figura 28. P. pastoris X-33 electrotransformadas con pPICZaA ligado al ORF de FchRGL1.
A) Siembra en placas YPDS y zeocina por agotamiento en estrías múltiples. B) Las colonias
aisladas fueron sometidas a una segunda selección.
80
Figura 29. Curva de crecimiento de P. pastoris X-33 transformadas con el ORF de FchRGL1
(línea de color negro) y proteínas totales producidas en el extracto crudo del cultivo (línea de
color gris). En flechas de color negro se indica el punto en el cual se adicionó MeOH al cultivo
para inducir la síntesis de la proteína.
Durante la fase de crecimiento exponencial de las levaduras se encontró una rápida
producción de proteínas, evidenciando que a las 24 h de crecimiento se comienza a alcanzar la
meseta. A las 48 h disminuye la producción de proteínas, pero es ahí cuando se adiciona MeOH
y la cantidad de proteínas se ve incrementada debido a la inducción de la enzima FchRGL1.
Posterior a las 72 h, la cantidad de proteínas se mantiene constante en el tiempo.
A partir del comportamiento de los cultivos de levaduras transformadas, se diseñó un
flujo de trabajo desde el inóculo en medio BMGY hasta la purificación de FchRGL1 (Figura
30). En cada una de las etapas más relevantes, se guardó una alícuota de sobrenadante para
ensayos posteriores.
0
4
8
12
16
0
100
200
300
400
0 12 24 36 48 60 72
OD
600
Prot
eína
s tot
ales
(mg)
Tiempo de Fermentación (h)
Proteínas totales (mg)
OD600
81
3.2. Ensayos de actividad enzimática de FchRGL1
La caracterización enzimática de FchRGL1 fue realizada con la enzima expresada en P.
pastoris. Con ella se obtuvieron los parámetros bioquímicos como KM, Vmáx, y se evaluó la
dependencia de pH, temperatura y iones para la actividad. Esto permitió encontrar las
condiciones óptimas de actividad para FchRGL1. Se cuantificó luego la actividad RG-liasa en
extractos de proteínas de frutos de F. chiloensis en diferentes estadios de desarrollo y
maduración. En forma paralela, se realizó un ensayo de actividad enzimática in vivo sobre
mucílago de A. thaliana, el cual es rico en RG-I con escasas ramificaciones y decoraciones en
su backbone. Finalmente, se realizó el modelado por homología de la enzima RG-liasa de F.
chiloensis. Se analizó la interacción enzima-sustrato y se evaluaron los parámetros energéticos
y aminoácidos claves para la actividad enzimática.
82
Figura 30. Diagrama de flujo de trabajo desde el crecimiento de las levaduras hasta la obtención
de la enzima FchRGL1, lista para realizar ensayos de actividad enzimática.
83
3.2.1. Ensayos de actividad enzimática con RG-I de papa como sustrato
De cada una de las etapas de purificación de FchRGL1 se colectó una muestra para
cuantificar proteínas y realizar la medición de la actividad enzimática, considerando desde el
extracto crudo inicial hasta la fracción de proteína purificada. La cuantificación de proteínas
totales mediante el método de Bradford (Bradford, 1976) (Tabla VI) muestra que del total de
proteínas existentes en el extracto crudo, el 6,75% correspondería a la enzima producida de
manera heteróloga. El método de concentración de proteínas mediante (NH4)2SO4, denominado
su efecto salting-out, sustrae las capas de solvatación de la superficie de la proteína (Wingfield,
2016). Luego de la precipitación, las proteínas son solubilizadas y desaladas para volver a
recuperar la estructura tridimensional óptima de la enzima.
Una alta concentración de proteínas no siempre se correlaciona con una elevada actividad
enzimática, por lo tanto en cada una de las etapas de purificación se cuantificó la actividad
enzimática de FchRGL1, donde se consideraron las etapas cruciales de la purificación. La Tabla
VII, muestra que la fracción proteica obtenida al final de la purificación presenta una elevada
actividad RG-Liasa. Durante el protocolo de purificación empleado se consiguió incrementar
70 veces la actividad específica de la enzima, alcanzando valores de 312.813 mU/ug de proteína.
Tabla VI. Etapas de purificación de proteínas, desde el extracto crudo hasta la fracción de
proteína purificada. La cuantificación de proteínas se realizó utilizando el método de Bradford.
La curva estándar de calibración se realizó con BSA.
Etapa de Purificación Volumen (mL) Proteínas (µg) Concentración proteínas (µg/µL)
Extracto crudo sin dializar 170 5,4 0,270
Extracto crudo dializado 198 3,5 0,175
No precipitado en (NH4)2SO4 260 4,7 0,235
Precipitado con (NH4)2SO4 sin desalar 11 16 0,800
Proteínas desaladas en PD-10 14 2,9 0,145
No unido a la resina BD-Talon 20 4,5 0,225
Lavado de la resina 20 1,5 0,075
Elución con BD-Talon 7 0,8 0,040
84
Tabla VII. Tabla de purificación de FchRGL1 producida en un sistema heterólogo. Una unidad
de actividad enzimática corresponde a la cantidad de enzima requerida para producir el cambio
de 0,001 unidad de absorbancia por hora.
3.2.1.1. Parámetros bioquímicos: Efecto del pH
Una vez que se determinó que la enzima producida heterólogamente está activa y presenta
actividad enzimática de tipo RG-liasa, se evaluaron sus parámetros bioquímicos. La evidencia
científica indica que la pared celular vegetal durante el desarrollo en plantas tiene un pH entre
4,5-7,5 (Taiz, 1984). Recientemente se ha comprobado que la acidificación de la pared celular
en la pared celular causa la expansión celular y crecimiento de la planta. Un pH ácido permite
que polisacáridos como HGA y RG-I sean más menos rígidos, disminuyendo además las
interacciones entre celulosa-pectina y agua-polisacáridos. Estos cambios permiten el
aflojamiento de la pared celular y su respectiva expansión (Phyo y cols., 2018). En el fenómeno
fisiológico de la maduración de frutos se ha evidenciado que, en tomate, el pH 6,7 de un fruto
inmaduro cae abruptamente a pH 4.4 en un fruto completamente maduro (Almeida y Huber,
2002). Se esperaría que las enzimas con actividad catalítica sobre los diversos polisacáridos de
la pared celular, debieran tener un pH óptimo de actividad en el rango mencionado anteriomente.
Dentro de las consideraciones de la actividad enzimática, es necesario tener en cuenta el
tipo de tejido que se está utilizando para cuantificar la actividad, como en el caso de la enzima
b-galactosidasa de la planta medicinal Artemisia judaica L., alcanzando su actividad máxima a
pH 6,0 (Atrooz y cols., 2016). En general, estas enzimas presentan actividad enzimática en el
rango anteriormente mencionado: AtXTH3, que cataliza un cross-linking covalente entre
celulosa y un oligosacárido, presenta un rango de pH entre 4,5 y 5,0 (Shinohara y cols., 2017).
En granos de centeno sin germinar (Secale cereale L.) se reportó la actividad de tres enzimas de
Fracción Volumen
(mL)
Actividad
(mU/µL)
Proteína
(µg/µL)
Actividad específica
(mU/µg)
Purificación
(Veces)
Extracto crudo sin dializar 170 8229 0,270 30478 1,0
Extracto crudo dializado 198 3858 0,175 22048 0,7
Corte con (NH4)2SO4 14 6900 0,145 47586 3,5
Elución con BD-Talon 7 12513 0,040 312813 70,4
85
pared celular: b-D-xilosidasa, a-L-arabinofuranosidasa y endo-b-D-xilanasa, que presentaron
un pH óptimo de 4,5 (Rasmussen y cols., 2000). Otra enzima b-galactosidasa encontrada en
cotiledones de Hymenaea courbaril, presenta un pH óptimo de actividad entre 3,0 y 4,0 (de
Alcântara y cols., 2006).
En el caso de la actividad enzimática total de RG-liasas en plantas, existe el reporte de
Naran y cols. (2007) que demostraron actividad RGL sobre sustratos de RG-I etiquetados con
fluorescencia a pH de 4,0. Existen referencias adicionales de la actividad enzimática de RG-
liasas reportadas a partir de microorganismos, donde el pH óptimo fue 6,0 en el hongo saprófito
A. aculeatus (Jensen y cols., 2010) y pH 8,0 en la bacteria gram positiva B. subtilis (Ochiai y
cols., 2007).
El pH óptimo de la enzima RG-liasa de F. chiloensis producida en un sistema heterólogo
fue de 5,0 (Figura 31), lo que coincide con el rango de pH de la pared celular. Este valor es
similar al reportado por Naran y cols. (2007) donde la actividad fue ensayada a pH 4,0. La
actividad de la enzima FchRGL1 se reduce de manera importante bajo pH 4,0 y sobre pH 6,0.
Figura 31. Efecto de la dependencia del pH sobre la actividad de RG-liasa.
0
200
400
600
800
3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0
Act
ivid
ad R
GL
(mU
/µg)
pH
86
3.2.1.2. Parámetros bioquímicos: Efecto de la temperatura
La temperatura es uno de los parámetros obligatorios a estudiar al momento de
caracterizar una enzima. El principal efecto de la temperatura sobre las proteínas, es que influye
en su estabilidad estructural y funcional, pues sobre una determinada temperatura se pierde la
estructura tridimensional (Elias y cols., 2014). Con el incremento de la temperatura, la
hidrofobicidad de la mayoría de los aminoácidos se ve incrementada y los aminoácidos polares
puede sufrir pequeños cambios (Wolfenden y cols., 2015). La curva de temperatura realizada
para la enzima FchRGL1 abarcó desde los 20ºC hasta los 50ºC, en intervalos de 5ºC. A medida
que incrementa la temperatura, se aprecia un incremento en la actividad, alcanzando la máxima
actividad a los 30ºC; a partir de ese punto se observó un marcado descenso en la actividad
enzimática con nula actividad a partir de los 35°C. La temperatura óptima de actividad
enzimática se registró entre los 25 y 30ºC, donde se obtuvieron actividades de 251 y 286 mU/µg,
respectivamente (Figura 32). Los ensayos realizados con RG-liasas de hongos con actividad
endolítica, dan cuenta de una temperatura óptima de 50ºC y 60ºC para los hongos A. aculeatus
y P. chrysogenum, respectivamente. En el caso de las enzimas endolíticas de bacterias
clasificadas grupo PL11, se observó que la temperatura óptima correspone a 65ºC para B.
subtilis y 61ºC para B. licheniformis. La única exoliasa reportada, presentó una temperatura
óptima de 60ºC (Tabla V). Con excepción a las temperaturas anteriormente mencionadas, se
describen los resultados de Jensen y cols. (2010) que presenta una temperatura de ensayo de
30ºC. En las publicaciones de Oomen y cols. (2002) y Naran y cols. (2007) en donde utilizan
especies vegetales para medir actividad RG-liasa no se reportó el efecto de temperatura en el
ensayo de actividad enzimática.
87
Figura 32. Efecto de la temperatura sobre la actividad RGL de FchRGL1.
3.2.1.3. Parámetros bioquímicos: Efecto de los iones
En las publicaciones de McDonough y cols. (2004), Ochiai y cols. (2007) y Jensen y cols.
(2010), se reportaron estructuras cristalizadas de RG-liasas, donde todas tienen en común la
presencia de un ion de Ca2+. A pesar de que existe evidencia que indica que este ion no es
estrictamente necesario para la actividad enzimática, McDonough y cols. (2007) explica que la
presencia Ca2+, cercano al dominio CBM, sería principalmente estructural y tendría un efecto
positivo en la catálisis. El mecanismo de otras enzimas de la familia PL señala que la presencia
de Ca2+ sería fundamental para estabilizar al ácido urónico durante la catálisis (Seyedarabi y
cols., 2010), previo a la formación del doble enlace en el ácido hexenurónico. En los
experimentos realizados con la enzima FchRGL1 se evidenció que la presencia del ión Ca2+ es
fundamental para la actividad enzimática (Tabla VIII). Al realizar el ensayo enzimático en
ausencia de iones no se aprecia actividad, pero si se recupera al incorporar iones Ca2+ y Mn2+.
Extrañamente, se encontró actividad al agregar EDTA 1 mM al medio que es un quelante de
metales divalentes, por lo que se repitió el ensayo con enzima previamente tratada con EDTA y
posterior remoción de éste mediante desalado en columnas PD-10. Los resultados confirman
que la enzima FchRGL requiere de Ca2+ para su actividad catalítica.
0
100
200
300
400
20 25 30 35 40Act
ivid
ad R
GL
(mU
/µg)
Temperatura (°C)
88
Tabla VIII. Efecto de los iones sobre la actividad RGL. Los valores están expresados como
porcentaje de la máxima actividad.
3.2.1.4. Parámetros bioquímicos: Efecto de la concentración de sustrato
En los primeros ensayos realizados para demostrar la actividad RGL, se utilizó el sustrato
RG-I de papa comercial. La concentración inicial utilizada en los ensayos fue de 1 mg/mL de
acuerdo a lo descrito por Jensen y cols. (2010). Para evaluar el efecto de sustrato sobre la
actividad RGL se prepararon curvas de concentración de sustrato (RG-I de papa) desde 0 a 6
mg/mL, tal como lo realizado por Jensen y cols. (2010). Se utilizó la fracción purificada de la
proteína FchRGL1 eluida desde la columna BD-Talón. En la parte inicial de la curva se observa
un notorio incremento de la actividad a medida que aumenta la concentración de sustrato en el
medio de reacción, sin embargo a mayor concentración se aprecia inhibición de la actividad
RGL. La Figura 33, muestra la curva construida considerardo valores de sustrato hasta 3 mg/mL.
La mayor actividad se consiguió a concentración de RG-I de 0,2 mg/mL. A partir de una
concentración de 0,4 mg/mL de sustrato la actividad comienza a disminuir y sobre los 2 mg/mL
no se observó actividad enzimática.
A partir de la curva de concentración de sustrato es posible obtener los valores de KM y
Vmáx mediante el gráfico de Lineweaver-Burk (Figura 33). El KM encontrado para RG-I de papa
para la actividad RGL de FchRGL1 fue de 0,20 mg/mL. En dos publicaciones que estudian RG-
liasa perteneciente al grupo PL4 de A. aculeatus, se observó que los valores de KM fueron de
1,25 mg/mL (Jensen y cols., 2010) y 0,33 mg/mL (Mutter y cols., 1998). Otras publicaciones
Muestra Proteína purificada (%)
Proteína tratada previamente con EDTA 5mM (%)
Sin iones 0 0
CaCl2 2mM 100 100
MnCl2 2mM 51 0
CaCl2 y MnCl2 100 0
EDTA 1mM 60 0
EDTA 5mM 0 0
89
que describen estudios realizados con RG-liasas pertencientes al grupo PL11 en bacterias
saprófitas señalan para Bacillus subtilis valores de KM de 1,9 mg/mL para la cepa YesX y 0,135
mg/mL para YesW (Ochiai y cols., 2007), para Bacillus licheniformis se reporta un KM de 1,2
mg/mL (Silva y cols., 2011). Toda la evidencia anteriormente mencionada, indica que FchRGL1
tiene una muy buena afinidad por el sustrato RG-I, similar a las enzimas de los hongos A.
aculeatus y B. subtilis.
La Vmáx obtenida para FchRGL1 fue de 769,2 mU/mg (Tabla IX).
A)
Figura 33. Parámetros cinéticos de FchRGL1 producida heterólogamente. La actividad fue
determinada de acuerdo a Jensen y cols. (2010) usando RG-I de papa como sustrato
(Megazyme). La curva de saturación de Michaelis-Menten y gráfico de doble recíproco en la
esquina superior derecha. Se determinó una KM de 0,200 mg/mL RG-I y una Vmáx de 769,2
mU/mg. La enzima es inhibida a altas concentraciones de sustrato, efecto que no ha sido
reportado aún en ninguna RG-liasa de plantas ni de microorganismos.
0
100
200
300
400
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
Act
ivid
adR
GL
(mU
/µg)
Concentración RG-I (mg/mL)
90
Tabla IX. KM y Vmáx de RG-liasas de diferentes especies reportadas en publicaciones
científicas.
Especie Publicación KM (mg/mL) VMÁX
Fragaria chiloensis - 0,200 769,2 mU/mg
Bacillus licheniformis Silva y cols., 2011 1,200 68 U/mg
Aspergillus aculeatus Mutter y cols., 1998 - 28 U/mg
Bacillus subtilis YesX Ochiai y cols., 2007 1,900 11,3 U/mg
Bacillus subtilis YesW Ochiai y cols., 2007 0,350 511 U/mg
Aspergillus aculeatus Jensen y cols., 2010 1,250 -
Para complementar el resultado obtenido, la estructura tridimensional de la enzima
modelada por homología, fue analizada a través de un servidor web que permite, por medio de
algoritmos computacionales, predecir la curva de estabilidad de las proteínas en función de la
temperatura (Pucci y cols., 2017). De acuerdo a la estructura ingresada, se obtuvo que el mínimo
valor de energía obtenido fue de -13,8 kcal/mol obtenido a los ~25ºC (Figura 34).
Figura 34. Curva de Gibbs-Helmholtz generada como salida de servidor web SCooP v1.0. En
ella se puede observar que el mínimo valor de energía se encuentra a los 25ºC, con un valor de
DG de -13,8 kcal/mol.
91
3.2.2. Ensayo de actividad enzimática en extractos de fruto
El extracto de proteínas totales contiene todas las RG-liasas presentes en el fruto, además
de otras enzimas con actividad catalítica sobre los diversos polisacáridos que componen la pared
celular. Hay que tener en cuenta que también podrían estar dentro del extracto otras enzimas
que tengan la capacidad de escindir el enlace entre Rha y GalA. La actividad de RG-liasa
presentó un aumento desde el estadio SG con 44 mU/mg a 63 mU/mg en el estadio T, con un
incremento casi al doble en el estadio R con 119 mU/mg (Figura 35). El notorio aumento en la
actividad RGL en frutos entre el estadio T y R coincide con el drástico aumento en la expresión
relativa de FchRGL1 (Capítulo III) entre los mismos estadios.
Figura 35. Actividad RGL total en frutos de F. chiloensis en diferentes estadios de maduración.
Las siglas en el eje X corresponden a cada uno de los estadios de maduración: SG (verde
pequeño); LG (verde grande); T (transición); R (maduro).
0
40
80
120
160
SG LG T R
Act
ivid
ad R
GL
(mU
/mg)
Estadio de Maduración
92
3.2.3. Ensayo de actividad enzimática sobre mucílago de A. thaliana
El mucílago es una cubierta gelatinosa que cubre la semilla, compuesta principalmente
por polisacáridos de pared celular. En A. thaliana, la capa adherente de mucílago contiene un
35% RG-I (Voiniciuc y cols., 2016) y no presenta ningún tipo de ramificaciones, facilitando el
acceso de la enzima al sustrato (Macquet y cols., 2007). El mucílago de A. thaliana puede ser
teñido con rojo rutenio ya que éste tiñe polisacáridos ácidos (Frey-Wyssling, 1976). Luego de
varios lavados de las semillas, solo el mucílago interno queda adherido a la semilla debido a que
para extraerlo es necesario realizar tratamientos con químicos agresivos como ácidos y bases
fuertes o realizar digestión enzimática (Haughn y Western, 2012).
Los mucílagos adheridos fueron teñidos después de ser incubados con extractos proteicos
obtenidos durante la purificación de FchRGL1. Como se aprecia en la Figura 36, solamente las
semillas que fueron incubadas con la fracción de proteína purificada producida heterólogamente
evidencia degradación completa del mucílago (Figura 36 E). En la Figura 36 A, la incubación
con agua en reemplazo de extracto proteico, descarta por completo el efecto de alguna RG-liasa
endógena de la semilla que pudiera estar escindiendo el mucílago. La principal diferencia entre
el extracto crudo sin dializar (Figura 36 B) y el extracto dializado (Figura 36 C) consiste
principalmente en que en la segunda, gracias al proceso de diálisis, se han removido todas
aquellas partículas de peso molecular inferior a 10 kDa. La fracción de las proteínas totales
concentradas (Figura 36 D) cuenta con el total de proteínas tanto de la levadura como FchRGL1
expresada heterólogamente. En esta fracción, a pesar de contener la concentración de proteínas
no se observa actividad RGL sobre el mucílago. Esto pudiera estar dado porque el pH en el cual
se encuentra la proteína (pH 7,4) no es el óptimo.
93
Figura 36. Ensayo in vivo de la enzima RG-liasa sobre mucílago de A. thaliana. Las semillas
fueron incubadas con: a) Agua, b) Extracto crudo de P. pastoris X-33 electrotransformadas, c)
Extracto dializado, d) Proteínas totales concentradas, e) Proteína FchRGL1 purificada. Luego
de 15 h de incubación a 30ºC, se realizó tinción con rojo rutenio al 0,05%.
3.3. Estructura 3D de FchRGL1 y su interacción proteína – ligando in silico
En la predicción de estructura secundaria se observó que FchRGL1 presenta un gran
número de regiones sin estructuras predichas, los cuales corresponden a loops que unen las
estructuras secundarias de a-hélices y sábanas-b de la proteína (Figura 37). En comparación a
la estructura cristalográfica PDB ID: 1NKG, usada para realizar el modelamiento por
homología. Esta cristal, proveniente del organismo A. aculeatus, fue la primera estructura
depositada en PDB correspondiente a este tipo de enzimas. Tiene una longitud de 508
aminoácidos y una resolución de 1,5 Å, que está dentro del rango para la construcción de
modelos por homología.
La secuencia de FchRGL1en comparación a la estructura de referencia, presenta 144
aminoácidos extras. Estos aminoácidos adicionales están repartidos dentro de la secuencia, lo
que provoca un incremento del tamaño de los loops, los que pueden tener una longitud superior
D) E)
: 100 µm
A) B) C)
94
a los 30 aminoácidos en la estructura modelada en esta investigación. Es importante tener en
consideración que el modelamiento por homología es solo una aproximación a la estructura
tridimensional de la proteína. En el alineamiento inicial para construir el modelo por homología,
se obtuvo un porcentaje de identidad de un 23% con la estructura de referencia. Ya que el
algoritmo de alineamiento realiza esta aproximación sin la comprensión de la información
biológica de por medio, fue fundamental realizar una optimización del modelamiento a mano,
manteniendo siempre en consideración la predicción de la estructura secundaria y los
aminoácidos clave en la actividad enzimática, en la unión a Ca2+ y al sustrato. De acuerdo a lo
anterior, se logró incrementar el porcentaje de identidad entre la secuencia de interés y la
estructura de referencia a un 28%, donde las principales coincidencias pueden observarse en el
dominio CBM (Figura 38). Como resultado de lo anterior, el alineamiento estructural tanto de
la proteína modelada por homología como la estructura de referencia, permite evidenciar la
construcción de una estructura sólida, con dominios y aminoácidos correspondientes a una
enzima RG-liasa (Figura 39).
95
Figura 37. Predicción de estructura secundaria de RG-liasa, realizada con el servidor web
PSIPRED. En cada línea se presenta un resultado complementario a la predicción. En la primera
línea, Conf indica el nivel de confianza de la predicción, donde la barra alta corresponde a un
alto nivel de confianza y una barra pequeña corresponde a un bajo nivel de confianza de la
predicción de la estructura secundaria. La segunda línea, Pred corresponde a la predicción de
estructura secundaria de manera gráfica, donde los cilindros corresponden a alfa hélices, las
flechas corresponden a sábanas beta y las líneas corresponden a regiones sin estructura
secundaria definida. A continuación, también se presenta la línea Pred, que muestra la
predicción de estructura secundaria en letras, siendo H alfa hélices, E sábanas beta y C regiones
sin estructura definida (coils). AA, corresponde a la secuencia de entrada para realizar el análisis.
96
Figura 38. Alineamiento entre la secuencia aminoacídica de FchRGL1 (FcRGlyase) y la
secuencia de la estructura de referencia utilizada para el modelado por homología PDB ID:
1NKG, donde se logró obtener un 28% de identidad. Con una flecha de color verde se destacan
los aminoácidos de coordinación de Ca2+. Imagen obtenida con el servidor web ESPript 3
(Robert y Gouet, 2014).
97
Figura 39. Estructura tridimensional de la enzima FchRGL1. Cada uno de los tres dominios se
encuentra etiquetados: dominio I (RGL4), dominio II (FNIII) y dominio III (CBM): En color
cian y blanco transparente se grafican coil y turn de la proteína para una mejor visualización.
La flecha naranja muestra el sitio activo (imagen izquierda). Alineamiento estructural de la
proteína modelada con la estructura de referencia (PDB, 1NKG) (imagen derecha).
La calidad del modelo construido con MODELLER fue evaluado con diferentes
herramientas bioinformáticas. El gráfico de Ramachandran realizado con RAMPAGE (Figura
40), muestra que el 87,1% de los residuos correspondientes a 506 aminoácidos, se encuentran
modelados en regiones favorables. Dentro de las regiones permitidas se encontró un 9,6% de
los residuos y sólo 19 aminoácidos se encontraron modelados en regiones no permitidas, no
obstante éstos pueden reubicarse en regiones permitidas y favorables posterior a la
minimización; además no están relacionados en funciones claves de la actividad RGL. Lo
anterior, permite comprobar que sobre el 90% de los residuos se encuentran en regiones
favorables y permitidas con lo cual, el modelo por homología realizado es aceptable. Se evaluó
además la calidad del modelo en su totalidad con el servidor ProSA-web, donde se obtuvo un
valor de Z-Score de -2,16, valor que se encuentra cercano al rango permitido (Figura 41). Si
bien este análisis solo considera los carbonos a de la estructura de entrada y los compara con
las estructuras depositadas en PDB, es necesario tener en cuenta que hubo solo tres estructuras
II
III
I
II
I
III
98
de referencia que alinearon en Protein BLAST con la secuencia de RG-liasa que se modeló.
Además las regiones alineadas coinciden principalmente en el dominio CBM.
Figura 40. Gráfico de Ramanchandran de la estructura modelada. El 96,7% de los residuos se
encuentran en regiones permitidas y favorables. Los residuos modelados en regiones no
favorables y no permitidas se encuentran representados con un cuadro o cruz roja.
99
Figura 41. Análisis de la calidad del modelo generado con ProSA-web. El rango de color celeste
corresponde a valores de estructuras obtenidas por cristalografía y en color azul estructuras
obtenidas por resonancia magnética nuclear (NMR). El Z-score para FchRGL1 fue de -2.16
previo a la minimización (imagen izquierda) y de -5.14 posterior a la minimización (imagen
derecha).
Una vez que se confirmó que la calidad del modelo se encuentra dentro de los rangos
permitidos, se construyó un sistema para realizar una minimización y posteriormente una
dinámica molecular. En primer lugar, FchRGL1 fue embebida en una caja de agua con
dimensiones 100 Å x 136 Å x 120 Å, superiores al tamaño de la proteína. Posteriormente el
sistema fue neutralizado con CaCl2 a una concentración de 0,05 M, que es la concentración
utilizada para los ensayos enzimáticos (Figura 42). No se adicionaron restricciones de
movimientos del backbone, cadenas laterales y estructuras secundarias, ya que se busca alcanzar
un mínimo energético de la proteína libre dentro del sistema. La minimización del sistema logra
alcanzar una meseta donde se logra el mínimo energético. En el caso de la dinámica molecular,
es a partir de los ~1.5 ns donde se alcanza una estabilidad energética con un valor de RMSD de
~5.4 Å (Figura 43).
100
Figura 42. Modelamiento molecular de FchRGL1 inserta en una caja de agua (color celeste)
con iones de cloro y calcio (verde y gris, respectivamente). Los tres dominios de la enzima son
representados en diferentes colores: dominio I, correspondiente al dominio RGL4 donde se
encuentran gran parte de los aminoácidos participantes de la actividad catalítica de la enzima
(color amarillo); dominio II o dominio FNIII, que se aproxima a la conformación de llave griega
(color púrpura); y dominio III, que corresponde al dominio que se une al sustrato y además se
encuentran los aminoácidos de coordinación de Ca2+ (color blanco).
101
Figura 43. RMSD de FchRGL1. La primera parte del gráfico, donde se alcanza un valor de
1.32Å, corresponde a los 100.000 pasos de minimización. Sobre los 1,5 ns de dinámica
molecular la proteína alcanza la estabilidad con un valor de RMSD de ~5,4Å.
Para la simulación de interacción proteína-ligando, el sustrato fue obtenido a partir del
pdb ID 3NJV, que posee la estructura tridimensional del complejo de la enzima RG-liasa de A.
aculeatus con RG-I de seis unidades de GalA y Rha intercaladas, agua y un ion de Ca2+ (Jensen
y cols., 2010). En el análisis computacional de la interacción de la proteína con el ligando, se
obtuvo que efectivamente éste se posiciona en el sitio activo (Figura 44). Sin embargo, al hacer
una caja más grande para el docking molecular que embebiera toda la proteína, se observó que
el ligando tiene afinidad con otros aminoácidos de la proteína que no se localizan en el sitio
activo, lo que podría estar estrechamente relacionado con la pérdida de actividad enzimática a
una alta concentración de sustrato.
En el dominio I, se encuentra gran parte de los aminoácidos claves para la actividad
enzimática. Los aminoácidos clave descritos para la actividad catalítica en la publicación de
Jensen y cols. (2010) se encuentran representados en color azul (Figura 45).
0
1
2
3
4
5
6
0 175 350 525
RM
SD (Å
)
Tiempo (ns)
0 0,5 1,0 1,5 2,0
102
A)
B) C)
Figura 44. A) Docking molecular entre FchRGL1 y un segmento de RG-I de seis unidades
(secuencia intercalada de Rha y GalA). B) Rotación en 90º hacia el lado derecho con respecto a
la figura inicial y C) Rotación en 90º hacia abajo, con respecto a la figura inicial.
90º 90º
103
A)
B)
Figura 45. A) Representación de la enzima FchRGL1 con sustrato RG-I de seis unidades
intercaladas de Rha y GalA (color amarillo). En color naranjo se representan los residuos D465
y D641, correspondientes a la coordinación de Ca2+. En azul, se destacan los residuos de unión
a sustrato N594 y R598. Los aminoácidos representados en color rojo, corresponden al sitio
activo. B) Vista superior de los aminoácidos del sitio activo. En amarillo se representa el sustrato
de RG-I compuesto por seis unidades intercaladas de Rha y GalA. En azul se representan los
aminoácidos de unión a sustrato y en rojo los aminoácidos del sitio activo.
Y195
R598
N594
E204
H276
K217
Y218
M154
K162 K83
A160
V271
T156
M269
R158
104
4. CONCLUSIONES
La enzima FchRGL1 fue exitosamente aislada y caracterizada. Se logró determinar los
parámetros óptimos de actividad los cuales resultaron ser pH 5,0, temperatura en un rango de
25ºC a 30ºC y se observó que los iones de Ca2+ son necesarios para la actividad catalítica. La
concentración óptima de sustrato para la realización del ensayo enzimático resultó ser 0,2
mg/mL, ya que a una concentración elevada de sustrato se observa inhibición de la actividad
por sustrato. El valor de KM con RG-I de papa fue de 0,2 mg/mL y Vmáx 769,2 mU/mg. La
enzima FchRGL1 producida en levadura resultó ser activa contra el sustrato comercial RG-I de
papa, sin embargo se observó la inhibición de la actividad enzimática al incrementar las
concentraciones de sustrato. Lo anterior se correlaciona con los análisis in silico, donde se pudo
observar en el docking que al construir una caja de grandes dimensiones que abarcara la
totalidad del tamaño de la enzima, aparecieron otras regiones donde posiblemente el sustrato
podía unirse (datos no publicados). En el caso de los ensayos in vivo, realizados en mucílago de
A. thaliana no se pudo cuantificar el mucílago escindido, sin embargo fue posible apreciar a
través del microscopio el desprendimiento completo del mucílago de las semillas y agregaciones
de éste dentro del medio de ensayo.
En los frutos se observó actividad RGL baja en los primeros estadios de desarrollo
(estadios SG al T), pero se observa un notorio incremento en la actividad en el estadio de fruto
maduro (R). Sin embargo, dado que el ensayo se realiza con extractos proteicos totales no es
posible descartar la presencia de otras isoformas de RG-liasas presentes en el fruto.
Los ensayos enzimáticos realizados confirman que existe actividad RGL en frutos de F.
chiloensis y que ésta incrementa durante la maduración, sin embargo no se cuenta con evidencia
que compruebe que la enzima está directamente relacionada con la pérdida de firmeza en estos
frutos. No obstante, estudios realizados en frutos de F. x ananassa donde se consiguió
sobreexpresar los niveles de transcritos de FaRGL1, se observó un menor engrosamiento de la
pared celular, la degradación de ésta y la desaparición de la lamela media casi por completo.
Además, el gen que codifica para la enzima estudiada, FaRGliasa1 se encuentra dentro de un
loci involucrado con la dureza y firmeza del fruto. Los frutos que presentaron este loci tienen
una notable disminución de la firmeza.
105
CAPÍTULO III
REGULACIÓN HORMONAL DE LA
TRANSCRIPCIÓN DE FchRGL1
106
1. INTRODUCCIÓN
1.1. Regulación transcripcional de enzimas de pared celular
La pared celular primaria de células vegetales se compone principalmente de
polisacáridos. Largas cadenas de celulosa, hemicelulosa y pectinas se entrelazan entre sí,
formando una estructura que permite la contención celular.
Del desarrollo vegetal, se sabe que inicialmente ocurre un importante incremento en el
número de células. Cuando comienza la etapa de elongación de los tejidos, las células vegetales
incrementan su tamaño, y por tanto, la pared celular debe ser capaz de adaptarse rápidamente al
cambio modificando el entrelazado de los polisacáridos y adicionando una mayor cantidad de
azúcares o eliminándolos por escisión de enlaces, tal como ocurre en la etapa de senescencia del
fruto. Esta acción, es realizada principalmente por enzimas que son secretadas a la pared celular
quienes actúan como verdaderos constructores.
En tomate, ha sido posible describir una serie de factores de transcripción necesarios para
una normal maduración (Wang y cols., 2017): TAGL1, involucrado en la pigmentación del fruto
(Itkin y cols., 2009); HB-1, relacionado con el control de la maduración y la organogénesis floral
(Lin y cols., 2008); APRR2-Like, gen asociado a la acumulación de pigmentación en el fruto
(Pan y cols., 2013). Un estudio realizado sobre la región promotora de la enzima sacarosa fosfato
sintasa, que participa en el proceso de maduración en frutos de tomate, banana y prunus, ha
determinado la presencia de elementos de respuesta para fitohormonas y factores ambientales
como la temperatura y luz (Choudhury y cols., 2010).
Los factores de transcripción MADS-box, parecen ser comunes en la maduración de
frutos, sin importar la dependencia de etileno en este proceso. En F. x ananassa, SEP1/2-like
(FaMADS9) es necesario para un desarrollo y maduración normal de los pétalos, aquenios y
tejido del receptáculo; en líneas transgénicas fue posible observar pétalos con una coloración
verde, abscisión tardía o abolida; retardo en la coloración del receptáculo y retención de la
clorofila en los aquenios (Seymour y cols., 2011). En Malus domestica, el gen MADS2, ortólogo
de FUL-like de A. thaliana, fue relacionado con la firmeza en fruta fresca (Cevik y cols., 2010).
De acuerdo a las evidencias anteriormente mencionadas, elementos de respuesta a fitohormonas,
factores ambientales y MADS-box serían los principales responsables de la regulación
transcripcional de enzimas presentes en la pared celular de frutos.
107
1.2. Regulación hormonal de la expresión génica en frutos
La dependencia de la regulación hormonal para la transcripción es posible comprobarla
experimentalmente y a través del análisis in silico de las secuencias promotoras de los genes,
donde se evalúan los elementos de respuesta encontrados en la región río arriba del sitio de
inicio de la transcripción.
A nivel experimental, y como se mencionó en la introducción general de esta tesis, la
regulación hormonal en la maduración de frutos puede ser clasificada de acuerdo a la
dependencia y no dependencia del incremento de la fitohormona etileno (Barry y cols., 2007).
Existen otras fitohormonas que influyen en el proceso de maduración y que varían en sus
niveles en cada especie. Auxina (AUX), es una hormona que tiene una estrecha relación con la
regulación del crecimiento y elongación de tejidos. En fruto, existe la evidencia de que puede
retardar la maduración en tomate y frutilla (Cohen y cols., 1996; Given y cols., 1988).
Adicionalmente, se ha demostrado que juega un rol fundamental en la iniciación del fruto
(Pandolfini y cols., 2007). Un antagonista de AUX, ácido 2,3,5-triyodobenzoico (TIBA) que
inhibe el transporte polar de esta fitohormona, ha permitido demostrar su relevancia a nivel
celular reduciendo hasta en un 90% el flujo de auxina desde el fruto al pedicelo en frutos de
Citrus unshiu.
Otra hormona relevante en la maduración de frutos es el ácido abscísico (ABA). Su
incremento se podría relacionar con los cambios en las cualidades organolépticas como la
textura, la acumulación de azúcares y color. En frutilla se ha descrito que ABA promueve la
maduración (Jia y cols., 2011). El inhibidor de la biosíntesis de ABA, fluoridona (FLUO), es
utilizado como herbicida acuático y además reduce drásticamente los niveles de ABA (Gómez
y García, 2006).
En el proceso de maduración de frutilla se han encontrado otras fitohormonas como
giberelinas (GAs) y citoquininas, las cuales influyen en menor grado en el crecimiento del fruto
(Archbold y Dennis, 1984; Perkins-Veazie y Huber, 1992). En el caso particular de la regulación
hormonal del gen que codifica para una RG-liasa, existe evidencia en F. x ananassa que los
niveles de transcritos de este gen se incrementan ante la presencia de ABA y se reprime bajos
los efectos hormonales de AUX (Molina-Hidalgo y cols., 2013). En frutilla chilena, no existe
información respecto a los elementos de respuesta presentes en el promotor de FchRGL1.
108
In silico, por medio de algoritmos computacionales, es posible predecir de acuerdo a la
secuencia nucleotídica que posee el promotor, los elementos de respuesta en ambas direcciones
de transcripción.
109
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1. Material vegetal
La ubicación del material colectado corresponde a la mencionada en el Capítulo I,
apartado 2.1. Muestras de tejido vegetativo como estolones, flores, hojas, raíces y tallos fueron
colectadas para evaluar los niveles de transcritos de FchRGL1. Adicionalmente, se colectaron
200 frutos en el estadio LG para ser usados en los tratamientos hormonales. El material vegetal
fue trasladado al Laboratorio de Fisiología Vegetal de la Universidad de Talca.
2.2. Tratamientos hormonales con ABA y AUX y sus respectivos inhibidores
Frutos de F. chiloensis en estadio LG fueron sometidos a tratamientos con ABA, AUX,
FLUO y TIBA. El pedúnculo de todos los frutos tratados fue inserto en una solución con agua
destilada, con la finalidad de evitar la deshidratación del fruto a lo largo del procedimiento
experimental. Los tratamientos fueron los siguientes:
a) Tratamiento con AUX: Un set de frutos fue sumergido por 10 min en solución 1 mM
de ácido naftalen acético (ANA, PhytoTechnology Laboratories) preparado en buffer
A (60 mM de ácido cítrico, 74 mM Na2HPO4, 5 mM DDT, 2% (v/v) de DMSO pH
4,5 y Sylwet al 0,05%). El set de frutos control se incubó sólo en buffer A sin ANA.
b) Tratamiento con TIBA: Un set de frutos fue sumergido durante 10 min en 100 µM
de TIBA (PhytoTechnology Laboratories) preparado en buffer A con 5% de etanol al
100% y Sylwet al 0,05%. El set control se incubó solo en buffer A con 5% de etanol
al 100%.
c) Tratamiento con ABA y FLUO: Un grupo de frutos fueron sumergidos en solución
de 1 mM de ABA (PhytoTechnology Laboratories) preparada en buffer A de acuerdo
a lo descrito por Opazo y cols. (2013) con modificaciones, adicionando además Sylwet
al 0,05%. Para su antagonista FLUO, se preparó una solución 100 µM (Sigma) con
110
metanol 20%. El set de frutos control para ABA se incubó sólo en buffer A y el set de
frutos control para FLUO con metanol 20%.
Un total de 24 frutos fue utilizado en cada tratamiento. Una vez transcurridas 1, 2 y 12
horas, 6 frutos por condición fueron trozados, congelados en nitrógeno líquido y almacenados a
-80°C hasta su utilización. El diseño experimental final puede ser visualizado en la Figura 46.
ABA 1mM Control ABA (Buffer A)
FLUO 100µM (+MeOH 20%) Control FLUO (Buffer A + MeOH 20%)
AUX (1mM ANA) Control AUX (Buffer A)
TIBA 100µM (+5% EtOH 100%) Control TIBA (Buffer A + 5% EtOH 100%)
Figura 46. Diseño experimental de los tratamientos hormonales realizados en frutos de F.
chiloensis, estadio LG.
111
2.3. Extracción de RNA y síntesis de cDNA
La extracción de RNA y síntesis de cDNA fue realizada de acuerdo al protocolo descrito
en el Capítulo I, apartados 2.4 y 2.5.
2.4. Análisis de la expresión génica de FchRGL1 por RT-qPCR en frutos con
tratamientos hormonales
A partir de la región 5′-UTR de FchRGL1 se diseñaron partidores para análisis de
expresión mediante RT-qPCR con el servidor web Primer3 v. 0.4.0. (Untergasser y cols., 2012).
Posteriormente, éstos fueron evaluados con los servidores web OligoAnalyzer y OligoCalc. En
el equipo Agilent Mx3000P QPCR Systems, se realizó RT-qPCR bajo las siguientes
condiciones: un ciclo de 10 min 95°C; 40 ciclos de 30 seg 95°C, un min a 60°C y un min a
72°C; un ciclo de un min 95°C, 30 seg 55°C y 30 seg 95°C. Como gen normalizador fue
utilizado FchGAPDH. Para cada muestra en la placa de RT-qPCR se utilizaron tres réplicas
técnicas por cada una de las réplicas biológicas. Un chequeo adicional se realizó a las muestras
con tratamientos hormonales, utilizando como controles positivos los genes FcXTH1 y SAUR,
que responden positivamente a ABA y AUX, respectivamente.
2.5. Análisis estadísticos de RT-qPCR
Los análisis estadísticos se realizaron con el software Microsoft Excel v16.25. Los análisis
de varianza fueron realizados considerando la prueba LSD de Fisher con un nivel de
significancia de p ≤ 0,05.
2.6. Extracción de DNA genómico
DNA genómico de hojas de F. chiloensis fue extraido de acuerdo a protocolo descrito por
Opazo y cols., (2012).
112
2.7. Construcción de librerías y Genome Walking en DNA de F. chiloensis
Tres partidores reverse fueron diseñados a partir de la secuencia nucleotídica de la región
codificante, de acuerdo al apartado 2.2.2 de este capítulo. Luego, con estos partidores se
amplificó la secuencia nucleotídica correspondiente al promotor de FchRGL1 utilizando la
técnica de Genome Walking (Siebert y cols., 1995). A partir de DNA genómico, se construyeron
cuatro librerías génicas con el kit GenomeWalker™ Universal Kit (Clontech), utilizando las
enzimas DraI, EcoRV, PvuII y StuI. Las secuencias amplificadas y superiores a 1000 bp fueron
separadas mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,5%; luego de ser purificadas fueron
clonadas y utilizadas para la transformación de cepas de E. coli DH5α mediante shock térmico.
La extracción de los plasmidios se realizó con el kit GeneJET Plasmid Miniprep (Thermo
Scientific). Todo el material fue enviado a secuenciar a Macrogen (Corea).
2.8. Búsqueda y análisis in silico de los elementos en cis de F. vesca
En NCBI, dentro de la base de datos de proteínas de referencia se buscaron las secuencias
nucleotídicas del organismo F. vesca subsp. vesca con mayor identidad a la secuencia
nucleotídica de FchRGL1. A continuación, a partir del sitio +1 de las secuencias obtenidas de
F. vesca, donde inicia la transcripción (ATG), se tomaron 2000 bp río arriba para analizar los
elementos en cis. Las bases de datos utilizadas fueron PLACE (Higo y cols., 1999), PlantPAN
(Chang y cols., 2008) y PlantCare (Lescot y cols., 2002).
113
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1. Expresión relativa del gen FchRGL1 en frutos con tratamientos hormonales
Existe evidencia de que muchas enzimas de pared celular son reguladas a nivel génico por
variaciones de fitohormonas (Bustamante y cols., 2009; Villarreal y cols., 2010; Zhao y cols.,
2012; Opazo y cols., 2013). En F. x ananassa, se ha logrado determinar la presencia espacio
temporal de diferentes hormonas de acuerdo al estadio de desarrollo que presenta el fruto, donde
existe aparentemente un coordinado incremento o reducción de diferentes hormonas que
influyen en la maduración (Figura 47).
Se ha reportado en F. x ananassa que la transcripción del gen FaRGL1 es regulado
positivamente por ABA y negativamente por AUX (Molina-Hidalgo y cols., 2013), por lo cual
se hace imprescindible estudiar la regulación de la expresión génica de FchRGL1 en frutos de
F. chiloensis sometidos a tratamientos hormonales con ABA y AUX y sus respectivos
inhibidores FLUO y TIBA.
Figura 47. Estadios de maduración en F. x ananassa (FL: flor; SG: verde pequeño; LG: verde
grande; SW: blanco pequeño; LW: blanco grande; P: rosado/transición; R: rojo/maduro) y la
representación esquemática de los cambios hormonales en los diferentes estadios de desarrollo
(BR: brasinoesteroides; IAA: ácido indol-3-acético; GA1: giberelinas; ABA: ácido abscísico).
Figura extraída de Symons y cols. (2012).
114
3.2. Tratamientos con ABA y FLUO
Frutos tratados con ABA muestran una rápida inducción de la transcripción de FchRGL1,
la cual es evidente a partir de una hora y permanece hasta las 12 h (Figura 48). Al inhibir la
síntesis de ABA mediante el tratamiento con FLUO, se aprecia la represión de la transcripción.
Estos resultados concuerdan con lo publicado por Molina-Hidalgo y cols. (2013), donde
aplicaciones en frutos de F x ananassa con ácido nordihidroguaiarético (NDGA) reducen el
nivel de transcritos de FaRGLiasa1.
3.3. Tratamientos con AUX y TIBA
Se ha descrito en F. x ananassa que la fitohormona AUX es sintetizada en los aquenios
durante los primeros estadios de desarrollo y de ahí es liberada al receptáculo. La hormona
alcanza su máxino nivel en el fruto estadio verde blanco, previo al notorio incremento de tamaño
del fruto. Posteriormente, los niveles hormonales de AUX declinan y se inicia el proceso de
maduración (Perkins-Veazie, 1995; Symons y cols., 2012). La expresión de FaRGLiasa1 fue
inducida al remover la fuente endógena de AUX (los aquenios) en estadios tempranos (Molina-
Hidalgo y cols., 2013). En F. chiloensis, el tratamiento de frutos en estadio LG con AUX
exógena reprime la expresión de FchRGL1 respecto del tratamiento control (Figura 49 A).
En el tratamiento con TIBA se observó igualmente una represión de FchRGL1 con
respecto al control. Si el gen de FchRGL1 es regulado negativamente por AUX, se esperaba que
en los tratamientos con TIBA existiera un incremento en los niveles de transcritos del gen
(Figura 49 B). Dado que no conocemos los niveles endógenos de AUX, en frutos de F.
chiloensis, es probable que los niveles disponibles en la célula sean suficientes para reprimir la
expresión de FchRGL1 aún luego de aplicar TIBA a los tejidos.
115
A)
B)
Figura 48. Cambios en la expresión relativa de FchRGL en frutos de F. chiloensis, en respuesta
a tratamientos hormonales con ABA (A) y FLUO (B). Frutos en estadio LG fueron tratados con
1 mM de ABA o 100 µM de FLUO. Las barras de error corresponden a la desviación estándar
y (*) indica diferencia significativa entre tratamientos (valor-p ≤ 0,05).
0
4
8
12
0 1 2 12
Exp
resi
ón r
elat
iva
Tiempo (h)
Control
FchRGL1
0
10
20
30
40
0 1 2 12
Exp
resi
ón r
elat
iva
Tiempo (h)
Control
FchRGL1
* *
*
* * *
116
A)
B)
Figura 49. Cambios en la expresión relativa de frutos en estadio LG de F. chiloensis, en
respuesta a tratamientos hormonales con AUX (A) y TIBA (B). Las barras de error corresponden
a la desviación estándar y (*) indica diferencia significativa entre tratamientos (valor-p ≤ 0,05).
0
2
4
6
0 1 2 12
Exp
resi
ón r
elat
iva
Tiempo (h)
ControlFchRGL1
0
2
4
0 1 2 12
Exp
resi
ón r
elat
iva
Tiempo (h)
ControlFchRGL1
* * *
* *
117
3.4. Elementos en cis presentes en el promotor de RG-liasa de F. vesca
La amplificación de la secuencia promotora con la técnica experimental de Genome
Walking permitió aislar un set de fragmentos sobre 1.000 bp en las librerías construidas con
diferentes enzimas (Tabla X y Figura 50). Desafortunadamente, la secuencia amplificada
correspondía a la región 5’UTR de FchRGL1 y no al promotor de la misma (Figura S-II, material
suplementario). Por tal razón, se diseñaron nuevos partidores desde esta región, con la finalidad
de amplificar río arriba una secuencia promotora confiable. Esto no fue posible debido a que en
el resultado de la secuenciación se observaron secuencias distintas, lo cual puede ser debido a
la naturaleza octoploide de F. chiloensis. Para sortear este problema y evaluar los elementos de
respuesta en el género Fragaria, es que planteó como estrategia de estudio analizar la secuencia
promotora de cinco RG-liasas de F. vesca, especie diploide que cuenta con su genoma
secuenciado.
Tabla X. Partidores diseñados para amplificar la región promotora de FchRGL1 por medio de
la técnica de Genome Walking. Los colores descritos en la descripción se correlacionan con el
diagrama descrito en la Figura 50.
DESCRIPCIÓN SECUENCIA (5’à3’) Tm (ºC)
Partidor 1 TAA CGG GGA TTG TTC TTT GTT GTT CTA GC 59,1
Partidor 2 GTC GAG ATC AAG ATG GTC AAA AAT GGA 57,1
Partidor 3 TAC TGG GAT GTG GTT TGG GAT AAC GT 59,8
118
ATGAGGAATCTGAAGGCGTTATTATTAACGGGGATTGTTCTTTGTTGTTCTAGCTTTGTTGATGGCACTGCGGCA
AGATCACCAGGAAGTCATGGACTACCAAGTCAAGAAAATGCGGTCGAGATCAAGATGGTCAAAAATGGAGTTGTG
TTGGACAATAAGCTTGTTCAGATAACTTTTTCTAATCCTGGTGGGGATGTTATTGCAATAAGTTATGGAGGAATT
GACAACTTGCTTGAAATTAACAATGTCGAAGGTAATAGAGGGTACTGGGATGTGGTTTGGGATAACGTCGCA
Figura 50. Diagrama del diseño de los partidores para Genome Walking. Se presenta la
secuencia parcial de la región codificante de FchRGL1 y en los diferentes colores se muestran
los tres partidores diseñados río abajo del sitio de inicio de la transcripción ATG (rojo), donde
el partidor 1 está representado en color verde, partidor 2 en gris y partidor 3 en fucsia.
En el alineamiento realizado en TBLASTX, donde se usó como query la secuencia
aminoacídica de FchRGL1, se obtuvieron 14 secuencias nucleotídicas de F. vesca. Se
consideraron las cinco primeras secuencias con un porcentaje de identidad superior al 60% y un
E-value de 0,0; los porcentajes de cobertura admitidos variaron entre un 99% y un 95%.
A nivel genómico, se observó que las tres primeras secuencias analizadas se encuentran
presentes en el grupo de ligamiento 1 (LG1), mientras que la secuencia cuatro y cinco están en
los grupos de ligamiento LG6 y LG5, respectivamente. En cuanto a la cantidad de exones en
cada secuencia, se observó que las secuencias uno, cuatro y cinco poseen solo un exón, mientras
que las secuencias dos y tres cuentan con 15 y 17 exones respectivamente. Los detalles de las
secuencias encontradas pueden ser revisados en la Tabla XI.
Tabla XI. Secuencias alineadas con el ORF de FchRGL1 a través de TBLASTX.
Secuencia Identidad
(%)
Cobertura
(%)
Grupo de
ligamiento
Número de
exones Gen ID
1 93 99 LG1 1 101297284
2 62 99 LG1 15 101292840
3 64 93 LG1 17 101303861
4 66 93 LG6 1 101309759
5 62 95 LG5 1 101302758
119
De cada uno de los genes seleccionados, se obtuvo la secuencia río arriba del CDS
considerando una extensión de 2.000 pb, donde podría estar ubicada la secuencia promotora del
gen. En cada uno de los promotores se buscaron elementos de respuesta a fitohormonas. La
cantidad de elementos regulatorios de cada fitohormona varió en cada uno de los promotores,
sin embargo las secuencias de respuesta ABRE, TATC-box, MBS, y TC-rich repeats, se repiten
más de una vez.
Para la secuencia uno (Figura 51, Tabla S-III, material suplementario) que tiene un 93%
de identidad con la secuencia proteica de FchRGL1, se encontraron elementos de respuesta a
las fithormonas ABA y AUX, lo que se correlaciona con los resultados de Molina-Hidalgo y
cols. (2013), donde la expresión relativa es regulada positivamente por ABA y negativamente
por AUX. Además se encontraron elementos de respuesta a otras hormonas como metil
jasmonato (MeJA), giberelinas (GA) y ácido salicílico.
En la secuencia dos (Tabla S-IV, material suplementario) solo se encontraron elementos
de respuesta a las hormonas AUX y MeJA y a otros elementos como MBS y TC-rich repeats,
que responden a estrés biótico (defensa) (He y cols., 2017) y abiótico (sequía) (Smita y cols.,
2015), respectivamente.
La secuencia correspondiente al tercer promotor (Tabla S-V, material suplementario) no
presenta elementos de respuesta a ABA, MeJA, ácido salicílico y a sequía.
En las secuencia cuatro sólo se encontraron elementos de respuesta a MeJA y a bajas
temperaturas (Tabla S-VI, material suplementario).
Finalmente, en la secuencia cinco se hallaron elementos de respuesta a GA, sequía,
defensa y respuesta a estrés (Tabla S-VII, material suplementario).
A)
120
B)
C)
D)
121
E)
Figura 51. Representación de la secuencia nucleotídica de los promotores de las diferentes RG-
liasas analizadas, considerando una longitud de 2.000 pares de bases río arriba desde el sitio de
inicio de la transcripción. En diferentes colores se destacan los principales elementos de
respuesta. Los códigos de cada una de las secuencias depositadas en NCBI corresponden a: A)
Gen ID 101297284, B) Gen ID 101292840, C) Gen ID 101303861, D) Gen ID 101309759 y E)
Gen ID 101302758.
122
4. CONCLUSIONES
Los experimentos de RT-qPCR del gen FchRGL1 en frutos con tratamientos hormonales,
demuestran que la expresión de este gen es inducida por ABA e inhibida por AUX, tal como lo
reportado para la FaRGLiasa1 (Molina-Hidalgo y cols., 2013). En cuanto a los inhibidores
utilizados, se observó que FLUO, inhibidor de la biosíntesis de ABA, reprime la expresión del
gen. Para el inhibidor del transporte polar de AUX, TIBA, se registró que a partir de 1h, la
expresión de FchRGL1 se ve reprimida. Si se compara con el comportamiento de las muestras
control, éstas no se ven afectadas de manera alguna, por lo cual es posible sugerir que la
represión observada en las muestras tratadas puede ser causada por la aplicación de TIBA.
A pesar de no ser posible estudiar in silico el promotor de FchRGL1, la aproximación
realizada en secuencias promotoras de F. vesca da indicios de los elementos de respuesta de éste
gen en frutos. La secuencia con mayor porcentaje de identidad a FchRGL1, que corresponde al
gen ID 101297284 posee elementos de respuesta a las fitohormonas ABA y AUX, lo que se
corrobora con los experimentos realizados en F. chiloensis.
123
CONCLUSIONES GENERALES
124
La degradación de los carbohidratos constituyentes de la pared celular durante el
crecimiento y maduración de frutos, es un proceso en el cual participan dinámicamente
múltiples actores, cada uno de ellos con un rol relevante.
En frutos de F. chiloensis, se han estudiado enzimas como poligalacturonasa, pectato liasa,
xiloglucano endotransglicosilasa/hidrolasa y endoglucanasa, que están relacionadas de alguna
manera con la modificación y degradación de la pared celular. En particular, las enzimas
poligalacturonasa y pectato liasa actúan sobre la fracción de pectinas del tipo
homogalacturonano, sin embargo, no había suficiente información en plantas acerca de enzimas
que actúen sobre el esqueleto de pectinas del tipo RG-I. Además, hasta ahora no se contaba con
la caracterización bioquímica de alguna RGL en plantas, por lo que esta tesis constituye el
primer reporte bioquímico de una RGL de plantas.
En una primera instancia, a partir del transcriptoma de F. chiloensis fue posible determinar
la existencia de 43 putativos contigs de codificarían para la enzima RG-liasa. A partir del total
encontrado se seleccionó en base a los cambios en transcritos (valores de FPKMs) durante la
maduración de frutos. El contig seleccionado fue analizado usando diversas herramientas
bioinformáticas. Así fue posible establecer in silico que la secuencia seleccionada codificaba
para una enzima RG-liasa, pues contenía los dominios RG-liasa, FNIII y CBM requeridos para
su funcionalidad. También, se pudo determinar la presencia de los aminoácidos imprescindibles
del sitio activo, actividad enzimática, y de unión a sustrato y a calcio.
En segundo lugar, la expresión heteróloga de FchRGL1 permitió determinar los
parámetros óptimos de su actividad enzimática in vitro, donde se comprobó que la temperatura
entre 20ºC y 30ºC, pH 5,0, iones de Ca2+ en una concentración 2 mM y RG-I de papa de 0,2
mg/mL como sustrato, son las condiciones adecuadas para su actividad. Adicionalmente, se
descubrió que la enzima es inhibida a elevada concentración de RG-I, efecto que no ha sido
reportado a la fecha en ninguna RG-liasa. No obstante, el docking realizado entre la enzima y
el sustrato, dio cuenta que el fragmento de RG-I no se une únicamente al sitio activo sino que
además se une a otras regiones de la enzima, lo que podría explicar la inhibición de la actividad
enzimática al incrementar las concentraciones de sustrato.
125
Existe un incremento importante en los niveles de transcritos del gen FchRGL1 a medida
que el fruto madura, lo que coincide con el incremento en los niveles de actividad cuantificados
en los distintos estadios de maduración de F. chiloensis. Podriamos inferir con ello que este gen
estaría involucrado con el desensamblaje del esqueleto central de RG-I, que conforma la
fracción de pectinas existente en la pared celular y lamela media de los frutos. Si bien nosotros
no podemos confirmar la participación de este gen en el ablandamiento de los frutos, estudios
recientes realizados por un grupo español confirman que este gen es importante para el
ablandamiento de los frutos, donde experimentos de RNAi del gen FaRGLiasa1 permitieron
observar que la lamela media presenta un engrosamiento en comparación a las plantas control.
Adicionalmente, experimentos de expresión constitutiva de una RG-liasa de tomate da cuenta
de un efecto de cosupresión, donde los frutos se mantienen firmes por cuatro semanas a una
temperatura de 25°C.
Nuestro estudio revela además que el gen también se expresa en tejidos en expansión
como tallo, estolón y raíz, donde es necesario que las células rápidamente respondan a los
cambios espacio temporales que ocurren, estando sometidas constantemente a elongación
celular. La remodelación de la pared celular mediada por RGL y otros actores biológicos seria
clave.
Los tratamientos hormonales ratificaron que FchRGL1 responde a los cambios
hormonales de ABA y AUX, induciendo o reprimiendo su expresión, respectivamente. Si bien
no fue posible aislar la región promotora de FchRGL1 y analizar los elementos en cis presentes
en ella debido a la ploidia de F. chiloensis (octoploide), la aproximación obtenida en el análisis
del promotor de una RG-liasa de F. vesca, da cuenta de la importancia de las fitohormonas en
la regulación de la expresión génica. El resultado experimental obtenido en F. chiloensis es
coincidente con los experimentos de Molina-Hidalgo y cols. (2012) y con los resultados de los
análisis in silico en F. vesca.
De acuerdo a la información expuesta anteriormente, se sugiere que la enzima FchRGL1
podría ser una de las enzimas participantes en el desensamblaje de la pared celular en frutos de
F. chiloensis. Se tiene evidencia que cuando el fruto comienza a madurar, las cadenas de
126
galactanos y arabinanos de RG-I son degradadas por enzimas arabinofuranosidasas y
galactosidasas, permitiendo el acceso de RG-liasas que pueden degradan el esqueleto central de
este polisacárido. Esta acción contribuiría al desensamblaje de la pared celular, donde las
cadenas de RG-I se encuentran unidas a diferentes polisacáridos y además, éste contribuiría a
las propiedades mecánicas de las células vegetales.
En conclusión, y a pesar de que los resultados obtenidos en esta tesis doctoral aportan
resultados en ciencia básica, es posible proponer diferentes experimentos a futuro como
mutaciones sitio dirigidas de la enzima, edición a nivel genómico de la enzima por medio de
CRISPR/Cas9 o desarrollar una proteína quimérica donde se escindan regiones que no sean
claves para la actividad enzimática. Estos experimentos pueden ser útiles para generar
conocimiento y sentar las bases en el desarrollo de ciencias aplicadas, con el objetivo de
optimizar la actividad enzimática o para determinar la influencia de esta enzima en la pérdida
de firmeza en frutos e inhibir su expresión por medio de RNAi u otras técnicas experimentales
avanzadas. Establecer la relación de las enzimas de pared celular con los cambios del fruto,
podría facilitar la comprensión de los mecanismos moleculares que influyen en su bioquímica
y así se podría prolongar la vida útil del fruto para su consumo y comercialización en los
mercados nacionales e internacionales.
127
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ANEXOS
147
1. Presentaciones a congresos
1.1. Resumen IX Reunión de Biología Vegetal, La Serena – Chile, 2014
MOLECULAR CLONING AND HETEROLOGOUS EXPRESSION OF A GENE
ENCODING A XYLOGLUCAN ENDOTRANSGLYCOSIDASE/HYDROLASE (XTH)
OF FRAGARIA CHILOENSIS DIFFERENTIALLY EXPRESSED DURING FRUIT
RIPENING
Angela Méndez, Sebastián Molinett, Raúl Herrera and María Alejandra Moya-León
Laboratorio de Genómica Funcional, Bioquímica y Fisiología Vegetal
Universidad de Talca – Chile.
Xyloglucan endotransglycosidase/hydrolase (XTH), is an enzyme with activity of
endotransglycosilation (XET; EC 2.4.1.207) and/or hydrolysis (XEH; EC 3.2.1.151) of
hemicelluloses of xyloglucan, which is involved in molecular remodeling of xiloglucans.
Previous studies have described that XTHs has a key role in fruit ripening of Fragaria
chiloensis. XET and XEH enzymatic activities and the presence of XTH-related protein were
detected at the turning stage. Furthermore, full-length cDNAs sequences of two divergent XTHs
isoforms -XTH1 and XTH2- were isolated, which evidenced a differential expression profile in
fruit and leaves, respectively. Interestingly, XTH1 presented higher expression levels between
large green and turning stages of fruit ripening, which present more significant changes in fruit
firmness. In this study, we present the molecular cloning and heterologous expression of a gene
encoding the FcXTH1 enzyme. This gene has been cloned in Escherichia coli and then
subcloned and expressed in the heterologous system Pichia pastoris. The recombinant protein
has been produced by yeast cell culture and purified by affinity chromatography. The obtained
protein were specifically detected by Immuno-blotting, evidencing the presence of a stable
recombinant protein and enzymatically active with a size of ~44 kDa. In silico analysis predicted
an inferior molecular weight than the experimental results (~35 kDa). Additionally, the XTH1
aminoacid sequence present putative motifs of N-glycosylation, which suggest that this post-
148
translational modifications might explain the differences in molecular weight between
predictions and experimental results.
149
1.2. Resumen X Reunión de Biología Vegetal, Valdivia – Chile, 2015
MOLECULAR CHARACTERIZATION OF A RHAMNOGALACTURONAN
ENDOLYASE GENE EXPRESSED DURING RIPENING OF Fragaria chiloensis (L.)
MILL.
Angela Méndez-Yáñez, Daniela Urbina, Carlos Gaete-Eastman, Makarena González, Raúl
Herrera and María Alejandra Moya-León
Laboratorio de Genómica Funcional, Bioquímica y Fisiología Vegetal
Universidad de Talca – Chile.
Fruit ripening is a coordinated event and involves several changes promoting the
development of an attractive fruit to eat. Particularly, texture modifications leading to fruit
softening are strongly related to cell wall metabolism, and several enzymes acting on cell wall
polysaccharides have been identified. Fragaria chiloensis (L.) Mill. is a Chilean endemic fruit
with excellent organoleptic properties, however its fast softening during ripening is responsible
of its brief postharvest shelf-life. Previous research has concluded that the main cell wall
polysaccharide lost during ripening are the pectins, primarily rhamnogalacturonan I (RG-I).
Until now there is information about enzymes acting on RG-I side chains, nevertheless little is
known about enzymes acting on RG-I backbone. From a transcriptome of F. chiloensis fruit a
contig encoding to a rhamnogalacturonan endolyase (RGL4, Polysaccharide lyase 4 family; EC
number 4.2.2.23) was identified whose FPKM values increased during its ripening. Through the
catalytic β-elimination mechanism RGL4 breaks the α-1,4-glycosidic bond between rhamnose
and galacturonic acid of RG-I backbone. The predicted RGL4 sequence consists of 676 amino
acid residues, including a signal peptide. Two putative N-glycosylation sites are predicted. It
shares 24% identity with RGL4 from the saprophytic fungus Aspergillus aculeatus, and also the
three characteristic domains in the tertiary structure are conserved as well as the key catalytic
residues (K217 and H276). Understanding the role played by this enzyme in cell wall
disassembly will contribute to a comprehensive knowledge of the molecular mechanisms
involved in the ripening of F. chiloensis fruit.
150
1.3. Resumen International Plant Molecular Biology Congress, Iguazú – Brasil, 2015
BIOCHEMICAL CHARACTERIZATION OF FCXTH1, A XYLOGLUCAN ENDO-
TRANSGLYCOSILASE/HYDROLASE
FROM FRAGARIA CHILOENSIS FRUIT
Dina Beltrán, Luis Morales-Quintana, Ángela Méndez-Yañez, Raúl Herrera and María
Alejandra Moya-León
Laboratorio de Genómica Funcional, Bioquímica y Fisiología Vegetal
Universidad de Talca – Chile.
Chilean strawberry (Fragaria chiloensis) has emerged as a new berry with excellent
organoleptic properties however its fast softening limits its commercialization. Fruit softening
is related to cell wall disassembling and several enzymes are taking place. Recently we
identified XTHs (xyloglucan endotransglycosidase-XET/ hydrolase-XEH) which may play a
key role during ripening of F. chiloensis fruit. XET and XEH activities were detected during
softening of the fruit, coincident with the increment in FcXTH1 transcripts. Therefore, we
decided to characterize the FcXTH1 protein. For this, FcXTH1 was cloned and heterologous
expressed in P. pastoris. The recombinant purified protein (~36.9 kDa) is active and displayed
both XEH and XET activities, with 10-12 times higher XET than XEH activity. The optimal pH
is 5.5, and the activity is stable at 4 ºC (>50 % recovery after 5 days). To clarify the mechanism
of action of FcXTH1, its 3D structure was built through comparative modeling methodology
and refined by molecular dynamics simulation (MDS). The model obtained displays the β-
jellyroll–type structure typical of GH16 family comprising 1 α-helix, 3 310 helices and 15 β-
sheets; a curvature generated by 8 antiparallel β-sheets holds the catalytic DEIDFEFLG motif
oriented towards the central cavity of the protein. The interaction of a set of putative substrates
with FcXTH1 was explored using MDS and molecular docking, finding a better interaction with
xyloglucans than cellulose. The data suggests that FcXTH1 might be involved in disassembling
of the hemicellulose framework during softening of this fruit.
151
1.4. Resumen XI Reunión de Biología Vegetal, Termas de Chillán – Chile, 2016
HETEROLOGOUS EXPRESSION AND ENZYMATIC ACTIVITY OF A
RHAMNOGALACTURONAN ENDOLYASE ENZYME OF FRAGARIA CHILOENSIS
Angela Méndez-Yáñez, Makarena González, Raúl Herrera and María Alejandra Moya-León
Laboratorio de Genómica Funcional, Bioquímica y Fisiología Vegetal
Universidad de Talca – Chile.
Rhamnogalacturonan endolyase (RG-lyase; PL4 family; EC number 4.2.2.23) is an
enzyme with catalytic β-elimination mechanism acting on the α-1,4-glycosidic bond between
rhamnose (Rha) and galacturonic acid (GalA) that exists in the main backbone of
rhamnogalacturonan-I (RG-I). RG-I is a type of pectin present in the cell wall of fruit tissues,
which is subjected to disassembling during softening of Fragaria chiloensis fruit. FcRGL4 was
isolated from F. chiloensis with a length of 2028 basepairs; the protein sequence has 676
aminoacids and a molecular weight of ~75,5 kDa without post-translational modifications.
Relative expression analyses indicate the increase in the level of transcripts of FcRGL4
throughout the ripening of F. chiloensis fruit, with maximum values at the turning and ripe fruit
stages. The coding sequence was heterologous expressed in the methylotrophic yeast Pichia
pastoris. The recombinant protein was purified through cation exchange (CMC) and affinity
(His-tag) consecutive chromatographies. Enzymatic activity assays were performed with RG-I
from potato as substrate, detecting the formation of a double bond in GalA at 235 nm.
Furthermore, the recombinant RG-lyase enzyme is able to breakdown the mucilage of A.
thaliana germinating seeds, which is rich in slightly branched RG-I. The role of FcRGL4 is
discussed in terms of its participation during softening of F. chiloensis fruit.
152
1.5. Resumen XII Reunión de Biología Vegetal, Pucón – Chile, 2017
FCRGL4: FROM THE GENE TO THE ENZYME ACTIVITY
Angela Méndez-Yáñez, María A. Moya-León
Laboratorio de Genómica Funcional, Bioquímica y Fisiología Vegetal
Universidad de Talca – Chile.
The ripening of a fruit is a complex process, and during its course softening of the fruit
occurs, in addition to other events. During softening the remodeling of plant cell wall
polysaccharides takes place favored by the presence of enzymes such as glycosyl hydrolases
and/or lyases. As the solubilization of pectins is intense during softening of F. chiloensis fruit,
we decided to study enzymes involved in their metabolism, in special the metabolism of
rhamnogalacturonan I (RG-I). We identified Rhamnogalacturonan endolyase (FcRGL4; PL4
family) as a gene that it is highly expressed during ripening of F. chiloensis fruit; in addition,
FcRGL4 transcripts are also abundant in expanding tissues such as stem and runners. On the
other hand, the expression of FcRGL4 is induced by abscisic acid treatments and repressed by
auxins. The open reading frame of FcRGL4 was cloned and then expressed heterologously in
Pichia pastoris yeast. The recombinant protein obtained presents RG-lyase activity against
rhamnogalacturonan I (RG-I) from potato, and it is also able to disassembly the mucilage of
Arabidopsis thaliana seeds. The protein was purified 61-fold through affinity chromatography
(Histidine-tag). The enzyme requires pH 5.0 for maximum activity. The disassembling of
pectins such as RG-I during the ripening of F. chiloensis fruit could be explained by the
increment in RGL activity.
153
1.6. Resumen Second International Conference in Bioinformatics, Simulations and
Modeling (iCBSM) 2017
IN SILICO CHARACTERIZATION OF A RHAMNOGALACTURONAN
ENDOLYASE GENE FROM THE CHILEAN STRAWBERRY
Angela Méndez-Yáñez and María A. Moya-León
Laboratorio de Genómica Funcional, Bioquímica y Fisiología Vegetal
Universidad de Talca – Chile.
Fragaria chiloensis is a Chilean exotic strawberry fruit of white flesh with a fruity aroma
which is very attractive for consumers. Unfortunately, its rapid loss of firmness during ripening
drastically reduces the shelf-life of the fruit, hindering its commercialization. Fruit softening is
closely related to cell wall disassembly and the modification of cell wall polysaccharides. In the
Chilean strawberry it has been determined that pectins are the main polysaccharides that are lost
from the cell wall throughout the ripening process. We search into an RNAseq library prepared
from F. chiloensis fruit samples for sequences coding for enzymes that could be involved in cell
wall polysaccharide modification. We found a sequence putatively coding for a
rhamnogalacturonan endolyase (RGL) enzyme. Interestingly, this contig also displays an
increment in its transcription as the fruit ripens. RGL acts on rhamnogalacturonan-I backbone,
an abundant pectic polysaccharide that exists in the cell wall of fruits. The full-length DNA
sequence was obtained through traditional biochemical methods and analyzed. FcRGLyase gene
sequence provides an open reading frame of 1957 bp. The translated protein has a molecular
weight of ~75.5 kDa, and an isoelectric point of 6.9. The sequence contains several putative N-
glycosylation sites and the key amino acids for catalytic activity were identified. A phylogenetic
analysis clustered FcRGL into clade 4 of polysaccharide lyases enzymes with an EC number
4.2.2.23. Furthermore, we obtained the three-dimensional model of FcRGL through
comparative modeling. The information generated through the in silico analysis could facilitate
the understanding of the role of this protein during the softening of F. chiloensis fruit.
154
2. Publicaciones
2.1. Glycosylation is important for FcXTH1 activity as judged by its structural and
biochemical characterization
GLYCOSYLATION IS IMPORTANT FOR FCXTH1 ACTIVITY AS JUDGED BY ITS
STRUCTURAL AND BIOCHEMICAL CHARACTERIZATION
Méndez-Yáñez A, Beltrán D, Campano-Romero C, Molinett S, Herrera R, Moya-León MA,
Morales-Quintana L
Plant Physiology and Biochemistry (2017) 119: 200-210
Xyloglucan endotransglycosylase/hydrolases (XTH) may have endotransglycosylase
(XET) and/or hydrolase (XEH) activities. Previous studies suggest that XTHs might play a key
role in ripening of Fragaria chiloensis fruit as FcXTH1 transcripts increase as fruit softens.
FcXTH1 protein sequence contains a conserved N-glycosylation site adjacent to catalytic
residues. The FcXTH1 structure was built through comparative modeling methodology, the
structure displays a b-jellyrolletype folding with a curvature generated by eight antiparallel b-
sheets that holds the catalytic motif that is oriented towards the central cavity of the protein.
Through Molecular Dynamic Simulations (MDS) analyses the protein-ligand interactions of
FcXTH1 were explored, finding a better interaction with xyloglucans than cellulose.
Nevertheless, the stability of the protein-ligand complex depends on the glycosylation state of
FcXTH1: better energy interactions were determined for the glycosylated protein. As a
complement, the molecular cloning and heterologous expression of FcXTH1 in Pichia pastoris
was performed, and the recombinant proteinwas active and displayed strict XET activity. A KM
value of 17.0 mM was determined for xyloglucan oligomer. The deglycosylation of FcXTH1
by PNGase-F treatment affects its biochemical properties (increase KM and reduce kcat/KM
ratio) and reduces its stability. As a conclusion, glycosylation of FcXTH1 is important for its
biological function.
155
2.2. Characterization of a ripening-related transcription factor FcNAC1 from Fragaria
chiloensis fruit.
CHARACTERIZATION OF A RIPENING-RELATED TRANSCRIPTION FACTOR
FCNAC1 FROM FRAGARIA CHILOENSIS FRUIT
Carrasco-Orellana C, Stappung Y, Méndez-Yáñez A, Allan AC, Espley RV, Plunkett BJ,
Moya-León MA and Herrera R
Scientific Reports 2018 (8): 10524
Fragaria chiloensis is a strawberry endemic from Chile with attractive white-pink fruit,
pleasant aroma and taste. However, this fruit has a limited post-harvest period due to fast
softening. Several transcription factors (TFs) are involved in the regulation of fruit ripening, and
members of the NAC family have been implicated in cell wall remodeling. FcNAC1 was
isolated from F. chiloensis fruit, coding a protein of 332 amino acid residues and displaying a
characteristic NAC domain at the N terminus. FcNAC1 protein showed nuclear localization. An
increase in transcript level was observed during ripening. A sequence of 1488 bp of FcNAC1
promoter was obtained. In silico analysis identified cis elements able to respond to some
hormones and Secondary wall NAC binding elements (SNBE), and responding to auxin and
ABA. A structural model of FcNAC1 provided evidence for interaction with DNA sequences
containing SNBE, while a dual luciferase assay confirmed the transcriptional activation by
FcNAC1 of the promoter of FcPL, a gene involved in cell wall remodeling in F. chiloensis fruit.
The results suggest the participation of FcNAC1 during ripening development of strawberry
fruit, by regulating pectin metabolism during softening
156
2.3. Isolation of a rhamnogalacturonan lyase from the Chilean strawberry fruit and its
biochemical characterization
Méndez-Yáñez A, González M, Carrasco-Orellana C, Herrera R and Moya-León MA Plant
Physiology and Biochemistry. Enviado.
Fragaria chiloensis (L.) Mill. fruit has exotic organoleptic properties however
commercialization is a challenge due to its fast and intensive softening. Texture modifications
associated to ripening are related to cell wall metabolism. Main cell wall polysaccharides
metabolized in F. chiloensis fruit are pectins, being rhamnogalacturonan I (RG-I) an abundant
pectin in strawberry. Several enzymes belonging to the fruit molecular machinery have been
described to act on different cell wall polysaccharides in F. chiloensis, but none acting on the
main chain of RG-I until now. A gene sequence coding for a rhamnogalacturonan endolyase
(RG-lyase) (EC 4.2.2.23) was isolated from F. chiloensis. The FchRGL1 sequence contains the
three functional domains of RG-lyases: RGL4 domain, fibronectin type III and the carbohydrate
binding module. In addition, it contains key amino acid residues for activity and Ca2+
coordination. RT-qPCR analyses indicate that FchRGL1 transcripts increase in fruit throughout
ripening. RG-lyase activity evidences a remarkable increase as the fruit ripens. The heterologous
expression of FchRGL1 in Pichia pastoris provided an active protein that allows its biochemical
characterization. RG-lyase activity is optimum at pH 5.0, 25-30ºC and 2 mM Ca2+. A KM of
0.086 mg.mL-1 was determined for potato RG-I, and the enzyme undergoes inhibition at high
substrate concentration. The enzyme is also able to degrade the mucilage of germinating A.
thaliana´s seeds. Finally, the properties of FchRGL1 and its expression pattern are congruent
with a crucial role in cell wall re-organization duringsoftening of F. chiloensis fruit.
157
MATERIAL SUPLEMENTARIO
158
Tabla S-I. Accesiones seleccionadas de la base de datos NCBI para la búsqueda de RG-liasas.
Familia Organismo Largo secuencia ID accesión
Sapindales Citrus sinensis
2023 XM_006466286.1
2507 XM_006472346.1
2498 XM_006472347.1
2210 XM_006472348.1
1878 XM_006472932.1
2778 XM_006490006.1
2040 XM_006490008.1
2088 XM_006495270.1
Solanaceae
Solanum lycopersicum
2468 XM_010320931.1
2277 XM_004237972.2
2238 XM_010321928.1
2245 XM_010321929.1
2485 XM_010321931.1
2153 XM_004237973.2
2162 XM_010314379.1
1980 XM_010314601.1
2185 XM_004252674.2
2105 XM_010316289.1
Solanum tuberosum
2534 XM_006337962.1
2002 XM_006337963.1
2150 XM_006337964.1
2090 XM_006338069.1
2318 XM_006360328.1
2153 XM_006364582.1
2167 XM_006364583.1
2221 XM_006366365.1
Monocotyledoneae
Musa acuminata
1884 XM_009399561.1
1866 XM_009399569.1
1710 XM_009399578.1
2376 XM_009420020.1
Zea mays 2755 XM_008666356.1
2610 XM_008666357.1
159
2577 XM_008679926.1
2226 XM_008681161.1
Rosaceae
Fragaria vesca subsp. vesca
2284 XM_004287274.1
2209 XM_004287357.1
2374 XM_004287360.1
2634 XM_004288446.1
2399 XM_004288823.1
2263 XM_004288824.1
2395 XM_004288827.1
2393 XM_004289463.1
2438 XM_004301077.1
2174 XM_004305768.1
Malus x domestica
2093 XM_008386443.1
2665 XM_008386550.1
2028 XM_008390817.1
2129 XM_008390818.1
2382 XM_008340759.1
1544 XM_008349583.1
2544 XM_008355738.1
2072 XM_008359337.1
2054 XM_008367024.1
Prunus mume
2770 XM_008238350.1
2398 XM_008220976.1
2136 XM_008220996.1
2071 XM_008220997.1
2100 XM_008221000.1
1905 XM_008226524.1
2074 XM_009368094.1
2276 XM_009368095.1
2037 XM_009339745.1
2074 XM_009348576.1
Brassicaceae Arabidopsis thaliana
1925 NM_100862.1
2234 NM_100865.2
2510 NM_127827.3
2379 NM_119956.3
160
2137 NM_119964.2
1899 NM_100863.6
2165 NM_118576.5
2204 NM_001202649.1
Brassica rapa
2100 XM_009133165.1
2340 XM_009142418.1
2341 XM_009150048.1
2373 XM_009150049.1
2238 XM_009150050.1
2337 XM_009150051.1
2140 XM_009150054.1
2216 XM_009150056.1
2061 XM_009107297.1
2341 XM_009111159.1
2336 XM_009111160.1
2286 XM_009111161.1
2133 XM_009111169.1
2060 XM_009111170.1
2416 XM_009114256.1
2430 XM_009114258.1
2701 XM_008441781.1
2314 XM_008441783.1
2446 XM_008442295.1
2426 XM_008442296.1
2960 XM_008446673.1
2164 XM_008446674.1
2364 XM_008467915.1
1939 XM_008467916.1
2347 XM_008467918.1
2483 XM_008467919.1
Cucumis sativus
2364 XM_004133704.1
2284 XM_004136202.1
2173 XM_004136203.1
2004 XM_004136369.1
2409 XM_004143494.1
161
2294 XM_004152560.1
162
Tabla S-II. Contigs que codifican para putativas RG-liasas encontrados en la base de datos de
RNA-seq de F. chiloensis. Los FPKMs indicados corresponden a fruto completo. En la lista se
destaca el contig seleccionado (fondo gris).
Código Receptáculo completo
LG T R
comp13142_c0_seq1 0,51 0,00 0,4
comp13142_c0_seq2 0,00 0,19 0,2
comp13142_c0_seq3 0,24 0,00 0,00
comp13142_c0_seq4 0,00 0,00 0,00
comp13142_c0_seq5 3,53 6,16 6,31
comp13142_c0_seq6 0,04 0,00 0,00
comp13142_c0_seq7 0,00 0,17 0,00
comp13142_c0_seq8 0,26 0,00 0,74
comp13142_c0_seq9 0,54 0,00 0,00
comp13142_c0_seq10 2,86 2,04 2,72
comp13142_c0_seq11 1,23 0,00 1,3
comp21913_c0_seq1 1,67 1,23 0,79
comp39788_c0_seq2 0,46 0,00 0,00
comp39788_c0_seq3 0,68 0,07 0,09
comp39788_c0_seq4 0,76 0,16 0,01
comp39788_c0_seq5 2,2 0,59 0,00
comp39788_c0_seq6 0,00 0,00 0,12
comp39788_c0_seq7 0,26 0,66 0,00
comp98855_c0_seq1 0,55 0,00 0,29
comp53394_c0_seq1 1,06 0,61 0,74
comp54601_c0_seq1 1,13 0,11 0,00
comp25956_c0_seq1 0,00 0,41 3,51
comp3052_c0_seq1 18,13 12,61 8,09
comp3966_c0_seq1 0,00 0,00 0,1
comp3966_c0_seq2 0,01 0,00 0,57
comp3966_c0_seq3 0,00 0,00 0,00
comp3966_c0_seq4 0,00 0,00 0,00
comp3966_c0_seq5 0,09 0,89 0,00
comp3966_c0_seq6 0,12 0,73 0,00
163
comp3966_c0_seq7 0,00 0,00 0,28
comp3966_c0_seq8 1,06 1,71 1,98
comp3966_c0_seq9 0,00 0,12 0,1
comp3966_c0_seq10 0,00 0,31 0,00
comp3966_c0_seq11 1,45 15,74 60,25
comp43633_c0_seq1 0,84 0,45 0,08
comp5644_c0_seq1 0,51 0,32 0,2
comp69121_c0_seq1 0,17 0,14 0,17
comp72788_c0_seq1 0,00 0,41 0,12
comp81086_c0_seq1 0,00 0,18 0,00
comp84565_c0_seq1 0,35 0,00 0,00
comp91850_c0_seq1 0,00 0,00 0,00
comp97516_c0_seq1 0,76 0,00 0,00
comp97645_c0_seq1 0,00 0,00 0,00
164
165
166
Figura S-I. Alineamiento entre la secuencia obtenida experimentalmente (Secuencia 1) y la
secuencia obtenida in silico (Secuencia 2). Ambas comparten 100% de identidad.
167
CATTCAAATGTGGAGACCCCTTAGCATTGCACTTGGTTAGGTAATTCCAAACCCAAAAAAAAAAATTTG
GTATTTTTGAAAAAAAAATTATATAAGGGGCACAATTTTTTTTTCCCGCACTGGGCCTTGAATTCTTCA
GGACCGGCCCTGGTTACAAATTCCCGTGTTTCCAGCAGGCATGCTATAACGTCAGGTATAGCAGAATTT
CTCTAAATGAGACCGATTAGCCACAAAATCGATTGTGAGTAGGAAAATTATGTTATACCTGGCGTTATA
GCATGCCTACTGGAAACACATGCCAAATTTAAAACCAACCACCCCCTGCTGAACCCTCTCTTTTTTAAT
GATAGATATGTTATATCGTTCGGTATAGCAGACAAACCCCTCTTGGATTATTCAAGAGAGCATTTTTCT
CACTCACGTAAAGTGACGCTTTCAAGCTCTCAAACTCGCTCTAGCTGGTTTTGTTTTCTACAAAAACTT
GTTATTGAATGGCTTTTTTAGCCAGCGCTATTAATTAAGTAGTGGATTATGGCCATGCATAATGACTAC
AAATGTGCCTAATTATAATTAGTGGCCATGCATGAATGACTAATTATCTATCCAATTAATTTCTATGTA
CATCTATTTTCTTTAATAGAAACACTCCGTGCTTTTCTCTCCTCCACCAAAAAGGTGGGATATATATCC
ATCATCCATCACCTATGTGATCGAAATTCGTGTCATCGGAGATATCTAAAAATCGAGAAAGTAGTTTGA
AAAGTGAGAAGATCAATG
Figura S-II. Secuencia nucleotídica de la región 5’UTR. Las flechas indican el diseño de los
partidores para RT-qPCR. La secuencia en letras negras indica el sitio de inicio de la
transcripción (ATG).
168
Tabla S-III. Elementos en cis presentes en el promotor del gen FvRGL NCBI ID 101297284.
Secuencias de 2000 pb, analizadas en PlantCARE, PlantPAN y PLACE.
Tabla S-IV. Elementos en cis presentes en el promotor del gen FvRGL NCBI ID 101292840.
Secuencias de 2000 bp, analizadas en PlantCARE, PlantPAN y PLACE.
Motivo Función Hebra Secuencia
ABRE Elemento involucrado en la respuesta a
ABA
-
-
+
TACGTG
TACGTGTC
GACACGTGGC
TATA-box Elemento central de promotor + TATATA
CGTCA-motif Elemento de respuesta a MeJA - CGTCA
P-box Elemento de respuesta a giberelinas - CCTTTTG
TATC-box Elemento de respuesta a giberelinas -
-
-
TATCCCA
TATCCCA
TATCCCA
TCA-element Elemento de respuesta a ácido salicílico - CCATCTTTTT
TGA-element Elemento de respuesta a AUX + AACGAC
Motivo Función Hebra Secuencia
ABRE Elemento involucrado en la respuesta a
ABA
+ ACGTG
TATA-box Elemento central de promotor + TATA
TATC-box Elemento de respuesta a giberelinas - TATCCCA
TCA-element Elemento de respuesta a ácido salicílico + CCATCTTTTT
TGA-element Elemento de respuesta a AUX - AACGAC
MBS Elemento de respuesta a sequía +
+
CAACTG
CAACTG
TC-rich repeats Elemento involucrado en defensa y
respuesta a estrés
+ ATTCTCTAAC
169
Tabla S-V. Elementos en cis presentes en el promotor del gen FvRGL NCBI ID 101303861.
Secuencias de 2000 bp, analizadas en PlantCARE, PlantPAN y PLACE.
Tabla S-VI. Elementos en cis presentes en el promotor del gen FvRGL NCBI ID 101309759.
Secuencias de 2000 bp, analizadas en PlantCARE, PlantPAN y PLACE.
Motivo Función Hebra Secuencia
ABRE Elemento involucrado en la respuesta a ABA +
-
+
-
ACGTG
CGTACGTGCA
ACGTG
ACGTG
TATA-box Elemento central de promotor + TATA
CGTCA-motif Elemento de respuesta a MeJA + CGTCA
TCA-element Elemento de respuesta a ácido salicílico - CCATCTTTTT
MBS Elemento de respuesta a sequía +
-
CAACTG
CAACTG
Motivo Función Hebra Secuencia
TATA-box Elemento central de promotor - TATA
CGTCA-motif Elemento de respuesta a MeJA - CGTCA
LTR Elemento de respuesta a baja temperatura + CCGAAA
170
Tabla S-VII. Elementos en cis presentes en el promotor del gen FvRGL NCBI ID 101302758.
Secuencias de 2000 bp, analizadas en PlantCARE, PlantPAN y PLACE.
Motivo Función Hebra Secuencia
GARE-motif Elemento de respuesta a giberelinas + TCTGTTG
TATA-box Elemento central de promotor - TATA
P-box Elemento de respuesta a giberelinas - CCTTTTG
MBS Elemento de respuesta a sequía +
-
CAACTG
CAACTG
TC-rich repeats Elemento involucrado en defensa y respuesta
a estrés
+
+
ATTCTCTAAC
ATTCTCTAAC