PRUEBAS FEBRILESInmunología Diagnóstica

Elaborado por:Gabriela Nohemí Espinoza de LeónLucia Rodríguez Pacheco

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NAYARIT

FiebreFiebre es un proceso patológico que refleja un proceso inflamatorio.

Los macrófagos, liberan algunas citosinas, las cuales..

Alteran el centro termorregulador.

La infección por estos microorganismos induce a una respuesta inmune de tipo humoral con la producción de anticuerpos que pueden ser detectados con el antígeno específico.

¿Que son las pruebas febriles? Son un conjunto de pruebas que sirven para

diagnosticar enfermedades que cursan con fiebre, como fiebre tifoidea (Salmonella), Brucelosis (fiebre ondulante, fiebre de Malta) y Rickettsiosis (fiebre Q, fiebre manchada de las montañas rocallosas).

FundamentoLa prueba se basa en una reacción inmunológica entre los anticuerpos séricos y el antígeno correspondiente produciendo una reacción de aglutinación macroscópica.

Las suspensiones de antígenos son bacterias muertas, coloreadas y estandarizadas para permitir una lectura más fácil.

Los test deben ser leídos después de los tiempos de incubación recomendados para evitar los falsos-positivos.

Se utilizan antígenos febriles para detectar anticuerpos en el suero del paciente contra Salmonella, Brucella y Rickettsias.

REACTIVOS: Un equipo para Reacciones Febriles que contiene

los siguientes antígenos:

1. Tífico “O” (antígeno somático)

2. Tífico “H” (antígeno flagelar)

3. Paratífico “A” (antígeno flagelar)

4. Paratífico “B” (antígeno flagelar)

5. Brucella abortus

6. Proteus OX-19

7. Suero control positivo

8. Suero control negativo

Toma y preparación de la muestra Suero reciente. Rechazar las muestras

hemolizadas o fuertemente lipémicas. Los anticuerpos son estables en el suero al

menos 48h a 2-8ºC

REACCIÓN DE WIDAL La reacción de Widal es un test basado en el principio de

aglutinación antígeno-anticuerpo, donde se determina la presencia de anticuerpos contra el antígeno O de la salmonella paratyphi A y B, el antígeno O y H de la Salmonella typhi para el serodiagnóstico de fiebre paratifoidea y tifoidea respectivamente..

Fue desarrollada por Georges Fernand Isadore Widal en junio de 1896.

Estructura antigénica de la Salmonella typhi.

El género Salmonella tiene una estructura antigénicasimilar al resto de enterobacterias, con tres tiposde antígenos (figura 2):1. Antígeno somático (O)2. Antígeno flagelar (H) o (d)3. Antígeno capsular o de envoltura (Vi) o (K)(específico para Salmonella typhi, dublin, yparatyphi C)

Fiebre tifoidea

La fiebre tifoidea es una enfermedad infectocontagiosa de alta prevalencia a nivel mundial, deriva su nombre del latín tyvphos, que significa oscurecimiento de los sentidos o mente turbia; es causada por la bacteria Salmonella typhi, nombrada así en honor del bacteriólogo estadounidense David Salmon.

La enfermedad consta de 4 fases.

Fundamento La reacción de Widal demuestra la presencia de

anticuerpos aglutinantes (aglutininas) contra los antígenos H (flagelar) u O (somático) de la Salmonella typhi en el suero de los pacientes con fiebre tifoidea.

Síntomas: aparecen a los 6-8 días y desaparecen de 3 a 6 meses.

Procedimiento de la Técnica1. Se obtiene el suero del paciente a partir de sangre total.

2. Se colocan distintas cantidades de suero en una placa transparente para cada una de las 4 reacciones (antígeno O, H, A y B) en la primer parte se ponen 80µL, en la segunda 40µL, tercera 20µL, cuarta 10µL y quinta 5µL.

3. A cadacirculo se le añade 1 gota (50µL aproximadamente) del antígeno correspondiente.

4. Al final quedan diluciones 1:20, 1:40, 1:80, 1:160 y 1:320 respectivamente para cada antígeno.

Interpretación de resultados Un diagnóstico de fiebre tifoidea puede considerarse si

los títulos iniciales se cuadruplican entre una y cuatro semanas.

Se toma en consideración la fiebre tifoidea con títulos Anti-O≥1:160-200 y/o H ≥160-200 en zonas endémicas (ej. Colombia); en zonas no endémicas se debe pensar con títulos mas bajos Anti-O ≥1:40-80

Limitaciones de la técnica

Puede haber reacciones antigénicas cruzadas con otras bacterias (principalmente enterobacterias, incluyendo Salmonellas no typhi), parásitos, virus y hongos, llevando con frecuencia al clínico a sobrediagnosticar síndromes febriles como fiebre tifoidea.

Como ejemplo de estos falsos positivos, se ha descrito en fiebre paratifoidea por Paratyphi A, títulos Anti-O y Anti-H ≥100 en un 53 y 22% de los pacientes, respectivamente.

Continuacion…

Falsos positivos: Puede haber reacción cruzada en pacientes con enfermedades autoinmunes como artritis reumatoide, lupus LES, etc.

Falsos negativos:

1. Antibioterapia temprana

2. Utilización de corticosteroides

3. Medición temprana de anticuerpos (primera semana)

4. Inmunodeficiencias adquiridas y congénitas.

5. Portadores crónicos de Salmonella typhi.

6. Relacionadas a estandarización de la prueba

Tabla 3. Reacciones cruzadas del test de Widal Falsos Positivos de la Reacción de Widal Bacterianas Salmonelosis no typhi (Serogrupos A-B-D) Infecciones por Enterobacterias+ Pseudomonas aeruginosa – Klebsiella sp. – Escherichia coli – Citrobacter sp.- Yersinia enterocolitica Neumonías-infecciones urinarias-Meningitis Tuberculosis pulmonar y miliar (36) Brucelosis Endocarditis bacteriana Rickettsiosis Infecciones por Staphylococcus aureus Infecciones por Burkholderia pseudomallei Tétanos Parasitarias Malaria Amebiasis Virales Dengue Infección por VIH Hepatitis viral aguda y crónica Hongos Cryptococosis (Meningitis) No infecciosas Hepatopatias crónicas Enfermedades autoinmunes (artritis reumatoide-lupus eritematoso sistémico)* Inmunización con antígeno de Salmonella Relacionadas a la estandarización de la prueba

REACCIÓN DE WEIL-

FELIX

Introducción Es un método para el diagnostico de tifos y otras

rickettsiasis. La Rickettsiosis se puede dividir en 3 grandes grupos:

1. Grupo Tifus: tifo epidémico, por Rickettsia prowazekii, transmitido por piojos y tifo clásico endémico, por Rickettsia typha por la pulga.

2. Grupo de Fiebre manchada: Rickettsia rickettsii, que implica más de 30 especies, transmitido principalmente por ácaros y pulgas

3. Tifus Scrub: Orientia tsutsugamushi,, transmitido por ácaros.

Otras Rickettsiosis como la Fiebre Q.

Rickettsiosis (Proteus 0X-19) Las Rickettsias son bacterias cocobacilares, muchas

de ellas son transmitidas por vectores como pulgas, garrapatas y piojos. En general la Rickettsiosis se considera una zoonosis, siendo el humano un huésped accidental excepto por el tifo epidémico (transmitido por piojos)

Son parásitos intracelulares estrictos, por eso existieron dudas mucho tiempo sobre si pertenecían a los virus o a las bacterias.

Fundamento Se basa en la capacidad del suero del paciente

infectado (que presenta Ac) por Rickettsias para aglutinar ciertas cepas de Proteus (Reacción cruzada) por lo que es poco sensible y específica y siempre deberá seguirse de pruebas confirmatorias (fijación del complemento, etc.).

Nota: Esta prueba siempre es negativa para la fiebre Q.

Suspensión de Antígeno1. Se realizan cultivos de el antígeno y se incuban a 37°C

por 18–24 horas.

2. Se hace la suspensión del cultivo en cloruro de sodio al .85%

3. Se filtra la suspensión con papel filtro en forma de embudo.

4. Se ajusta la turbidez de la suspensión.

Para la prueba se utilizan suspensiones frescas de gérmenes vivos. (se realizan pruebas cada 3 meses para comprobar que aun reaccionan).

Técnica de la reacción en tubo (weil-felix)

1. Numerar siete tubos ( 13x75mm) del uno al seis y un testigo (T) para cada antígeno.

2. Adicionar 0.9 ml de solución salina al primero y 0.5 ml a los restantates.

3. Agregar 0.1ml del suero problema al tubo uno. Mezclar y pasar 0.5 ml al tubo dos y así sucesivamente hasta el seis eliminando 0.5 ml de esta última dilución. Obteniéndose diluciones 1/10, 1/20, 1/40, 1/80, 1/160 y 1/320.

4. Adicionar 0.3 ml de antígeno diluido previamente 1:20 con solución salina en cada uno de los tubos.

5. Incubar el testigo y las pruebas por 2 horas a 37°C.

6. Observar la aglutinación producida en cada tubo en comparación con el testigo y la muestra positiva.

Otra técnica…1. Se obtiene el suero del paciente a partir de

sangre total.

2. Se colocan distintas cantidades de suero en una placa transparente en la primer parte se ponen 80µL, en la segunda 40µL, tercera 20µL, cuarta 10µL y quinta 5µL.

3. A cada circulo se le añade 1 gota (50µL aproximadamente) del antígeno correspondiente, proteus OX-16

4. Al final quedan diluciones 1:20, 1:40, 1:80, 1:160 y 1:320 respectivamente para cada una.

Lectura de los resultados

Se toma en cuenta el titulo del último tubo que aglutino, en el caso de la reacción en placa el resultado es el titulo de la última dilución en donde se observo la aglutinación.

En esta técnica en ocasiones se detectan títulos muy altos en pacientes que no han manifestado la enfermedad, por ello, es necesario realizar otras técnicas en conjunto para un mejor diagnóstico.

BrucelosisLa brucelosis es una enfermedad zoonótica causada por bacterias pertenecientes al género Brucella: B. canis, B. abortus y B. melitensis, que ocasiona problemas de salud importantes entre los individuos que ingieren alimentos contaminados o mantienen un estrecho contacto con el ganado.

Brucelosis (continuación)

La brucelosis en el hombre se transmite por la ingesta de leche, sus productos y derivados contaminados, no pasteurizados, por contacto con productos, subproductos y desechos como tejidos o excreciones de animales enfermos, y por inoculación de Brucella o inhalación de polco de corrales o mataderos, donde estas se encuentran.

Cuadro clínico La brucelosis se caracteriza por fiebre

que en la mayoría de los casos es alta e intermitente (ondulante).

La Brucelosis se presenta en la mayoría de los casos con anorexia, fiebre, decaimiento y escalofríos, pudiendo aparecer luego complicaciones importantes como son las óseas y neuropsíquicas.

Aglutinación lenta en tubo de Wright (SAT)Es la más antigua (1897) y la más utilizada aún para el diagnóstico de brucelosis animal y humana.

Bases metodológicas: se realizan diluciones crecientes del suero a investigar que se enfrentan con cantidades constantes de antígeno observándose la presencia de aglutinación luego de un período de incubación.De esa forma se determina el título como la máxima dilución aglutinante.

Antígeno: suspensión de B. abortus 1119-3 al 4,5%. Anticuerpos: IgM, IgG1 e IgG2. Título significativo: no existe consenso en cuanto al título que indica una infección activa, por lo que debe establecerse regionalmente.

Prueba de aglutinación con y sin 2-mercaptuetanol (2-ME)

Es una variante de la anterior que emplea el tratamiento previo con 2-mercaptoetanol como agente reductor que inactiva los anticuerpos de clase IgM perdiendo éstas su capacidad aglutinante, sin interferir con las de clase IgG, que son las que se cuantifican.Se usa solución salina al 0,85% con 0,1M de 2-mercaptoetanol.

Bases metodológicas: se realizan simultáneamente las pruebas de aglutinación en tubo con y sin tratamiento del suero con 2-ME.La diferencia de título obtenida entre ambas pruebas corresponde a los anticuerpos IgM.

Antígeno: suspensión de B. abortus 1119-3 al 4,5%. Anticuerpos: IgG e IgM. Título significativo: mayor de 1:20.

Reacción de Huddleson

Título significativo: mayor de 1:40. En ocasiones se observa el fenómeno de prozona, donde puede estar ausente la aglutinación en los títulos más altos a causa de un exceso de anticuerpos. Este hecho debe tenerse en cuenta para evitar falsos resultados negativos por esa causa

Es una reacción de aglutinación rápida en placa.La reacción de Huddleson es un método serológico que detecta anticuerpos contra B. abortus, B. melitensis y B. Suis , agentes causales de la brucelosisBases metodológicas: se enfrentan cantidades decrecientes del suero a investigar con cantidades constantes de antígeno y se observa la presencia o no de aglutinación. Existe una escala de títulos, establecida por convención, que permite la expresión de resultados.

Se utiliza una suspensión Antígenos de B. abortus al 3-10% de gérmenes en fenol, con verde brillante y cristal violeta para la búsqueda de anticuerpos. Anticuerpos: IgM, IgG1, IgG2 e IgA.

Interpretación En la interpretacion de estos resultados,

se deben tomar en consideración los aspectos clínico-epidemiológicos de cada caso, hay que considerar los falsos positivos y falsos negativos.

Rosa de BengalaSe utiliza un antígeno de Brucella abortus biotipo 1 (cepa 99S o cepa 1119-3) acidificado regulado y teñido con Rosa de Bengala a un pH de 3.65 +/- 0.05 para la detección de aglutininas específicas de Brucella.La suspensión del antigeno se enfrenta al suero sin diluir del enfermo. Proporciona una aproximación diagnóstica en pocos minutos con una sensibilidad y especificidad muy altas. Presenta elevado grado de correlación con la seroaglutinación y, por su simplicidad, es muy útil como prueba de despistaje inicial o screening.

Sus falsos negativos se limitan a enfermos con procesos de pocos días de evolución y a algunos casos de enfermedad de curso muy prolongado.

Procedimiento1) Llevar a temperatura ambiente el reactivo, controles y muestras de suero. 2) Utilizando la pipeta automática adicione 30 μL de la muestra del paciente en un círculo de la placa.3)Mezcle suavemente el Antígeno Rosa de Bengala hasta que se encuentre totalmente homogéneo, después coloque 30 μL en la placa de prueba, en el mismo circulo donde se coloco la muestra del paciente, mezcle ambas con un aplicador. (usar un aplicador diferente para cada muestra). Repita este paso para cada muestra de paciente y controles.4) Agitar la placa con movimientos rotatorios por 4 minutos.5) Con la ayuda de una fuente de luz directa lea el resultado. Importante: Después de este tiempo la lectura ya no es válida.

Resultados

* No Aglutinación - Suero Negativo*Cualquier cantidad de Aglutinación - Presencia de anticuerpos específicos. Suero PositivoSi resulta positiva debe ser confirmada mediante otra prueba cuantitativa para brucelosis como:Aglutinación Lenta Estándar o Aglutinación Lenta en Presencia de 2-Mercaptoetanol.SENSIBILIDAD 25 UI/mL.

Bibliografía William. Medicina interna. Segunda edición. Editorial

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Rojas,Espinoza. Inmunología (de memoria). 3º edición. Editorial. Médica Panamericana. México, DF. 2006. Pag. 226-227.

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