producciÓn de proteÍnas...
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PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS
RECOMBINANTES
ELECCIÓN DEL SISTEMA DE EXPRESIÓN
Características Importantes a Tener en
Cuenta en la Producción de proteínas
recombinantes
Complejidad de la molécula: estructura
terciaria y cuaternaria, modificaciones
postraduccionales
Uso: investigación, diagnóstico, farmacéutico,
terapia
Cantidad de producto
Economía
Aspectos regulatorios
Convenientes para crecimiento en grandes
fermentadores.
Se obtienen altos rendimientos (0,1-5 g/L).
En general las proteínas tendrán metionina
N-terminal.
Es frecuente la producción en forma de
cuerpos de inclusión.
No produce eventos postraduccionales.
Endotoxinas
BACTERIAS
Conveniente para el crecimiento en
grandes fermentadores.
Buenos rendimientos (0.01-1 g/L).
Introduce modificaciones
postraduccionales.
La glicosilación es distinta de la de
mamíferos: “high manosas”
La proteólisis suele ser un problema.
LEVADURAS
CÉLULAS DE MAMÍFEROS
Los cultivos en grandes escalas son difíciles de
realizar y muy costosos.
Los rendimientos son generalmente bajos (0,001-0,1
g/L).
Se producen modificaciones postraduccionales.
Para ciertas proteínas puede ser el único sistema de
expresión posible.
PLANTAS
Se producen modificaciones postraduccionales
Expresión localizada en diferentes órganos
Expresión en estadíos específicos del crecimiento
Crecimiento en campo barato
La glicosilación es distinta que la de mamíferos
Eficiencias bajas de transformación y expresión
Seguridad controvertida
Hay tres factores importantes que influencian la
expresión de una proteína recombinante
Huésped
Condiciones de crecimiento
Vector
Por lo tanto la solución a los problemas de expresión estará a nivel del vector, de las cepas y de las
condiciones de inducción.
Hay cuatro factores importantes que
influencian la expresión de una proteína
recombinante
Vector Huésped
Condiciones de crecimiento
Secuencia del gen precursor
EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS EN
BACTERIAS
¿POR QUÉ BACTERIAS?
¿POR QUÉ BACTERIAS?
Simplicidad
Cultivo barato y de alta densidad en tiempos cortos
Genética bien conocida
Gran cantidad de herramientas disponibles para
biotecnología (plásmidos, cepas mutantes…)
¿POR QUÉ NO BACTERIAS?
No producen modificaciones postraduccionales:
glicosilación, puentes disulfuro (sólo en periplasma).
No secretan la proteína al medio de cultivo (E. coli)
Cuerpos de inclusión
Endotoxinas
Escherichia coli
PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES
EN BACTERIAS
2 Estrategias:
sirve para purificar
Proteína de fusión generalmente es más estable
más soluble
Expresión directa
VECTORES DE EXPRESIÓN
PARA E. COLI
Secuencia Shine Dalgarno
Secuencia en el ARNm, complementaria a una secuencia
del ARNr 16S de la subunidad pequeña del ribosoma :
posiciona el ARNm en el ribosoma
AAGGAGGU
UUCCUCCA
AUG5’ 3’
ARNm
3’5’16S rRNA
Subunidad pequeña ribosomal
Efecto de una estructura secundaria en el
extremo 5’ del mRNA
Extremo 5’ del mRNA, en la
región del codón de inicio
AUG, NO debe ser
autocomplementaria, ya que
se podría bloquear el
movimiento del ribosoma e
impedir la traducción del
mensaje.
Inicio
TERMINADOR DE LA TRADUCCIÓN
Codón STOP + base siguiente
El más eficiente en E. coli: UAAU
Fuertes
simple químico
Inducibles: Inductor
barato térmico
Regulables: Baja o nula expresión basal
OPERÓN LACTOSA
Alolactosa : isómero de
lactosa. Isomerizado por
β galactosidasa
6-O-β-D-Galactopyranosyl-D-glucose;
β-D-Galactopyranosyl (1→6)-D-
glucose
galactosa-(β1-4)-glucosa
REGULACIÓN
Mecanismo dual de control
1- Regulación negativa: represor Lac, expresión constitutiva. Es secuestrado
por alolactosa e IPTG
2- Regulación positiva: por AMPc que se une a CAP: proteína activadora por
catabolito = CRP: proteína aceptora de AMPc, en respuesta a glucosa.
Curva bifásica de crecimiento de
Monod: Diauxia
I: crecimiento por glucosa
II: crecimiento por lactosa
IPTGisopropil-β-D-tio-
galactósido
No metabolizado
por βgal. Y no usa
la permeasa
ONPGorto-nitrofenil-β-D-
galactopiranósido
Sustrato de βgal
produce o nitro fenol
(amarillo)
X-gal5-bromo-4-cloro-3-
indolil-β-D-
galactósido
Sustrato de βgal
produce indoxil
(azul)
SISTEMA DE EXPRESIÓN pET
• Promotor híbrido T7/lac sólo funciona con ARN
polimerasa del fago T7, no con la de E. coli
• Cepa bacteriana BL(DE3): E. coli lisogenizada con un
fragmento del fagoDE3 que codifica para la ARN
polimerasa T7
• Inductor: IPTG
• Los niveles basales de expresión pueden ser disminuídos
con lisozima T7, inhibidor de T7ARN pol. Plásmidos pLysS
y pLysE
• La glucosa en el medio aumenta la represión del
promotor lacUV5.
Lisogenizada con un fragmento de fago DE3 que codifica para la T7 RNA
polimerasa bajo el control del promotor lacUV5 inducible por IPTG.
También posee una copia del gen lacI.
Células huésped para expresión
IPTG
Genoma de E.coli
lacI monómero
LacI tetrámero
LacI tetrámero
Plásmido pET
Transcripción
pET
SISTEMA DE EXPRESIÓN pET (plasmid for expression by T7 RNA pol)
Promotor: T7 RNA polimerasa o
promotores híbridos (T7-lac)
Gen lacI o lacIq
Sitios de clonado
Péptidos de fusión (cola de poliHis)
Sitios de corte para proteasas
Gen βlactamasa
SISTEMA DE EXPRESIÓN pBAD
Expresión muy regulada
Arabinosa: niveles altos de expresión
Sin arabinosa + glucosa: no expresión
Inducción dosis dependiente (aumento lineal en la
expresión con el incremento del inductor)
Buen rendimiento proteico
Cepas de E. coli con genes ara mutados, alta expresión con
bajos niveles de arabinosa (no metabolizan la arabinosa)
OPERÓN ARABINOSA
O1 I
Para la máxima activación de la transcripción se requieren dos eventos
Unión de arabinosa a araC
Unión de AMPc a CRP que estimula la unión de araC a O1 (I1)
O1 I
La glucosa puede reprimir la expresión basal al disminuir el AMPc
Inducción con concentraciones crecientes de arabinosa
Sistema pBAD
Otros promotores
• Promotor tac:
Promotor híbrido: región -35 del promotor trp +
región -10 del promotor/operador lacUV5.
La expresión es reprimida por lacI (inactivado por
IPTG).
Más fuerte que promotor lac (5-10 x) y trp (3x)
• Promotores de fagos:
Promotor lambda PL regulado por el represor cI.
cI857: temperatura sensible 30ºC 42ºC
cI: bajo el control del promotor lac (regulado por
IPTG)
Regulación del promotor λpL
La temperatura induce genes de heat shock (proteasas)
Desnaturalización térmica de la proteína expresada Desventajas
Los niveles de expresión de un gen son
determinados fundamentalmente por:
La eficiencia de transcripción
La estabilidad del ARNm
La frecuencia de la traducción del ARNm
ESTABILIDAD DEL ARNm
RNasa II
exonucleasas
Los ARNm son degradados por PNPasa
RNasa E endonucleasa (cepa BL21 star)
La protección del ARN de las RNasas depende de:
Plegamiento del ARN
Protección por ribosomas: Imp. iniciación de la traducción eficiente, evitar estructuras 2as
inhibitorias en RBS
FRECUENCIA DE TRADUCCIÓN
Diferentes organismos pueden usar los
diferentes codones a una frecuencia
distinta.
Uso de codones en E. coli y humanos
Uso de codones poco frecuentes
errores traduccionales
Sustitución de aminoácidos Terminación de la traducción prematura
Uso de Codones: Estrategias de
Optimización
Uso de cepas que sobreexpresan tRNAs de baja
abundancia (ej cepas Rossetta de Invitrogen).
Co- transformación del huésped con plásmidos que
expresen tRNAs de los codones problemáticos
Síntesis química de un nuevo gen.
Mutagénesis.
Destino de la proteína recombinante
Citoplasma
Periplasma
Medio extracelular
¿Por qué citoplasma?
Mayor producción
CUERPOS DE INCLUSIÓN
Agregados proteicos amorfos
Se generan como respuesta al estrés debido a la alta
expresión de proteínas recombinantes
Figure 2. Transmission electron microscopic photographs of (a) R.
sphaeroides ES16; (b) R. sphaeroides N20; and (c) R. sphaeroides U7 in
GM medium containing malate as a carbon source at the stationary
phase (72 hrs). Bacterial cells packed with poly-β-hydroxybutyrate inclusion
bodies. Bar = 2.0 μm.
Mecanismo de generación ¿?
Alta velocidad de síntesis impide el plegamiento
apropiado ?.
Ambiente citoplasmático en E. coli más reductor que
oxidante, lo que desfavorece la formación de puentes
disulfuro apropiados?
LA AGREGACIÓN PUEDE MINIMIZARSE
Temperatura….20-25ºC
Velocidad de expresión
Metabolismo del huésped
Ingeniería de la proteína recombinante………proteínas
de fusión
Co- expresión de chaperonas
Uso de cepas huésped deficientes en tiorredoxina y/o
tiorredoxina reductasa para mantener un potencial redox
favorable (cepas de E. coli “Origami”).
Sorensen, Mortensen. J. Biotechnol. 115 (2005) 113-128
Ventajas de los cuerpos de inclusión
Se acumulan en el citoplasma en mayor nivel (> del 25%) que la proteína en su forma soluble.
Son purificados por un procedimiento de centrifugación.
No tienen actividad biológica. En la producción de proteínas tóxicas en E. coli, ésta puede ser la única estrategia posible.
Son agregados amorfos resistentes a proteasas de E. coli.
Activador de plasminógeno en E. coli
Desnaturalización: 6 M clorhidrato de
guanidinio/urea
Remoción de los agentes desnaturalizantes:
diálisis, dilución, cromatografía
Separación de restos celulares por
Filtración del flujo tangencial o
normal
¿Por qué periplasma?
Disminución de proteínas contaminantes en el material a purificar
Mayor probabilidad de tener la PR con N terminal auténtico
Menor proteólisis
Fácil liberación de la proteína por shock osmótico
Disminución de efectos negativos de proteínas tóxicas sobre el
crecimiento celular.
Proteínas solubles, activas: por formación de puentes S-S facilitada
por ambiente menos reductor.
Secuencia de exportación o secuencia
señal de exportación
Secuencia de un péptido Señal en la PR, para ir a la
membrana plasmática y pasar a través de ella. Se
agrega al extremo NH2 de la proteína (extremo 5’ del
gen).
signal protein of interestNH2 COOH
Secuencias señal de genes ompA , pelB,
βlactamasa, malE…
Signal sequences Amino acid sequences
PelB (pectate lyase B) from Erwinia carotovora MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA
OmpA (outer-membrane protein A) MKKTAIAIAVALAGFATVAQA
StII (heat-stable enterotoxin 2) MKKNIAFLLASMFVFSIATNAYA
Endoxylanase from Bacillus sp. MFKFKKKFLVGLTAAFMSISMFSATASA
PhoA (alkaline phosphatase) MKQSTIALALLPLLFTPVTKA
OmpF (outer-membrane protein F) MMKRNILAVIVPALLVAGTANA
PhoE (outer-membrane pore protein E) MKKSTLALVVMGIVASASVQA
MalE (maltose-binding protein) MKIKTGARILALSALTTMMFSASALA
OmpC (outer-membrane protein C) MKVKVLSLLVPALLVAGAANA
Lpp (murein lipoprotein) MKATKLVLGAVILGSTLLAG
LamB (λ receptor protein) MMITLRKLPLAVAVAAGVMSAQAMA
OmpT (protease VII) MRAKLLGIVLTTPIAISSFA
LTB (heat-labile enterotoxin subunit B) MNKVKCYVLFTALLSSLYAHG
Appl Microbiol Biotechnol. 2004 Jun;64(5):625-35. Epub 2004 Feb 14.
Secreción de la proteína al medio extracelular
Post cosecha: shock osmótico
congelamieto/descongelamiento
lisozima
shock con cloroformo
Durante el crecimiento: agregar glicina o tritón X100 al medio
fusión a proteína transportadora como hemolisina
o de membrana como OmpF
uso de cepas deficientes en pared
Estrés en E coli recombinantes
Causas
•Mantenimiento del plásmido:
Nº de copias……..genes constitutivos (R a ATB)
•Expresión elevada de la proteína recombinante
gasto E x sint. Proteína rec.
vel. de crecimiento biomasa. Sint. de proteínas de estrés
respiración
RESPUESTA AL ESTRÉS
•“Stringent response”: reprogramación en el patrón
de expresión de genes y disminución en la expresión
de genes de transcripción, traducción y síntesis de
aa. como consecuencia de la disminución en la
disponibilidad de nutrientes, fundamentalmente aa.
Adición de aminoácidos
RESPUESTA AL ESTRÉS
•Proteólisis de la proteína recombinante
cepas deficientes en proteasas
Ingeniería cepas deficientes en proteínas heat shock
del huésped coexpresión de chaperonas
coexpresión de inhibidores de proteasas
síntesis de proteína de fusión
Ingeniería mutagénesis dirigida al sitio de corte de proteasa
del producto redireccionamiento por péptido señal
Los sistemas de chaperonas son cooperativos y las
estrategias más favorables involucran la co expresión
de combinaciones de chaperonas pertenecientes a
las familias de GroEl, DnaK, ClpB y del factor
disparador asociado a ribosoma (trigger factor)
Reducción de estrés: x adaptación de las células
¿Cómo?
gradual del inductor
lento del Nº de copias del plásmido durante el cultivo
La formación de los puentes disulfuro en E. coli es
catalizada activamente en el periplasma por el sistema
Dsb
La mutación de los genes trx y gor en E coli permite la
formación de puentes disulfuro en citoplama
Cepa trxB - AD494 Novagen
Cepa trxB-/gor- Origami Novagen
Proteínas de Fusión y purificación de PR
Fusión a fragmentos polipeptídicos o “tags” (etiquetas)
que confieren a la PR una cierta marca.
La unión incluye el sitio de reconocimiento específico
para una proteasa
¿Para qué?
Purificación por afinidad
Protección de proteólisis
Aumento de solubilidad
Detección de expresión
ETIQUETAS = TAGs
Secuencias de antígenos, reconocidas por
anticuerpos específicos.
Moléculas con afinidad a resinas cromatográficas:
His, GST (glutatión transferasa), MBP (maltosa
binding protein)
Proteínas que aumentan la solubilidad: MBP, NusA,
IF2 (www.biotech.ou.edu)
“Colas” de 6 histidinas, fusionadas a la proteína,
ya sea en el extremo amino o carboxilo
H-H-H-H-H-HH2N
IMAC: Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography
H-H-H-H-H-H COO-
Elución
Imidazol
Bajo pH
EDTA
Metal
Ni
Co
Cu
Proteasas
Factor Xa IEGR/X (X cualquier aa menos P o R)
Trombina LVPR/G
Enteroquinasa DDDDK/X (cualquier aa menos P)
HSPP (Amersham) LEVLFQ/GP
TEV ENLYFQ/G
Corte con Factor Xa
Es la cepa de Escherichia coli más comunmente
usada para la producción de proteínas
recombinantes
BL21
Produce mayor biomasa que que E.coli K12 con menor
producción de acetato
Deficiente en proteasas Lon y OmpT
E. coli B F- dcm ompT lon hsdS(rB- mB-) gal
Estrategias para
reducir la
formación de
acetato en E. coli
Biochemistry, Genetics
and Molecular Biology
"Advances in Applied
Biotechnology", 2012
Genotype Description Benefit
lacIq
This mutated version of LacI
gives high levels of lac repressor
expression. This allows tighter
regulation of gene expression
from the lac promoter
Tightly regulated gene
expression from lac
promoter
DE3
Lysogen that encodes T7 RNA
polymerase. Used to induce
expression in T7-driven
expression systems
Required for expression
from the T7 promoter in
E.coli
pLysS
pLysS is normally plasmid borne.
It harbors T7 lysozyme, which
destroys T7 polymerase
produced from DE3. Used to
reduce basal expression in T7-
driven expression systems by
inhibiting basal levels of T7 RNA
polymerase
Tightly regulated gene
expression from T7
promoter
CEPAS BACTERIANAS PARA EXPRESIÓN PROTEICA
lon
Defficiency in the Lon ATPase-
dependent protease. Decreases
the degradation of recombinant
proteins; all B strains carry this
mutation
Reduced degradation of
recombinant proteins
ompTDefficiency in an outer membrane
protease.
Reduced degradation of
recombinant proteins
araD/ara
-14Cannot metabolize arabinose
Enhances expression from
araB promoter
dnaJ dnaJ encoded chaparonin is
inactivated
Improves folding of some
heterologous proteins
gorMutation in glutathione reductase,
which enhances disulphide bond
formation
Improves folding of
heterologous proteins
requiring disulphide bonds
No sólo Escherichia coli
Bacilli: bacterias Gram positivas
Secretan proteínas directamente al
medio
No tienen LPS en la membrana
externa no ENDOTOXINAS
Expresión en cepas de Bacilli
No / Low Protein Production
Growth ConditionsHost StrainVectorReason
•Start induction at higher
OD
•Shorten induction time
•Add Glucose to suppress
leaky expression
•Use BL21AI or
BL21(DE3)pLysS/E
•Use T7 promoter-based
vectors (also arabinose)
•Tightly regulate induction
with lac operator
Toxic protein
•Re-clone with more A
residues at 5’
•Shorten distance between
RBS and first ATG (2-8 nt)
Initiation
problems
Slow translation by
reducing temperature or
grow in poor media
Use stains
supplementing rare
codons (Rosetta,
Codon +)
Mutate gene for codon
optimization
Rare codons
•Start from freshly
transformed bacteria
•Add Glucose to suppress
leaky expression
•Use recA- strains
(HMS174; BLR)
•Tightly suppress gene
expression prior to
induction
•Use low-copy origin of
replication plasmid
Your gene
induces
rearrangement
and loss of the
DE3 lysogen
Use RNAse deficient
strain (BL21Star)
Change vector to
structured RNA vector
RNA
degradation
Growth ConditionsHost StrainVectorReason
Lowaring induction
temperature usually helps
Use Trx(-)/gor(-)
strains (e.g.
Origami) for
creating oxidative
conditions in
cytosol
Use thioredoxin, DsbA, DsbC
fusion partners
Clone in a vector containing
secretion signal to the
periplasm (pelB, OmpA)
Protein is
misfolded due to
lack of correct
disulfide bond
formation
Slow expression rate (low
temp; low [inducer]; short
induction time; poor media)
Heat shock with
chemical chaperones
Membrane rich
strains
(C41/C43)
Solubility enhancing fusion
proteins (MBP, NusA, GST,
etc.)
Hydrophobic
protein
Heat shock with
chemical chaperones
Screen various
expressing
strains
Add vectors for various
chaperone co-expression
No appropriate
chaperones
Induce at low temp. Membrane rich
(C41/C43)
Replace with bacterial
signals (secretion) or omit
signals
Sub-cellular
localization
signals
Membrane rich
(C41/C43)
Use mistic fusion protein.
Generate truncated forms of
protein (soluble domains)
Membrane
proteins
Heat shock with
chemical chaperones
Transform with a partner :
combination of 2-4 vectors
for max 8 proteins
Protein is part of
a complex
Aggregation
Truncated protein
Growth ConditionsHost StrainVectorReason
Slow elongation by low
temp.; low inducer;
poor media
Use rare codon
strains (rosetta ,
codonPlus)
Optimize codon
usage
Rare codons
Slow expression rate
with low temp.; low
inducer; short harvest;
poor media
Sub-clone with
another fusion
partner or avoid N-
terminus fusion
protein
Faster,
uncoordinated-
translation of
fusion protein
Grow and induce at low
temp, use
protease
inhibitors when
breaking the cells
on ice
Induce at higher OD
and reduce
induction time
Low protease
strains (BL21
derivatives, M15)
Detect and replace
specific protease
sites
Degradation