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Comparación de los promotores alcohol oxidasa y formaldehido deshidrogenasa en la producción heteróloga de la lipasa de Rhizopus oryzae en Pichia pastoris en

cultivos discontinuo y fed-batch.

O. Cos, D. Resina, R. Ramón, P. Ferrer, J.L. Montesinos y F. Valero

Dept. Enginyeria Química. ETSE. UAB.

Optimización del sistema de producción de proteínas heterólogas en Pichia

pastoris: Aplicación a la producciónde lipasas y proteínas terapéuticas

Programa Nacional de Procesos y Productos Químicos CICYT PPQ2001-1908

BIOTEC’04F. Valero Dept. Enginyeria Química UAB Biotec 04

Objetivo:

Utilizar como proteína modelo la lipasa del hongo Rhizopus oryzae, para explorar, con la producción de esta proteína heteróloga en Pichia pastoris, la influencia de aspectos genéticos, fisiológicos, estrategias de cultivo, monitorización, control y escalado con el objetivo de maximizar su producción de manera reproducible, y aplicar todo el conocimiento adquirido sobre el sistema en la producción de otras dos proteínas heterólogas del proyecto: la lipasa 2 de Candida rugosa y la gonadotropina coriónica equina.

F. Valero Dept. Enginyeria Química UAB Biotec 04

ORIGEN SISTEMA DE EXPRESIÓN Pichia pastoris :

- Desarrollo de la tecnología de cultivo.- Elevadas densidades celulares (> 100 g l-1).

Sistema de expresión de proteínas heterólogasalternativo (SalK Institute, CA, EEUU)

E. coli, S. cerevisiae

Levadura metilotrófica interesante para la SCP:Single cell protein, 1970.

Consumo de metanol residual para la obtención de biomasa


¿QUÉ VENTAJAS OFRECE P. pastoriscomo sistema de expresión?:

Eucariota: modificaciones post-transcripcionales√Secreción√

No fermentativo√Manipulación genética sencilla√

Biomasa elevada ( > 100 g l-1)√

PAOX1: FUERTE y REGULABLE


Levadura metilotrófica:

Pichia pastoris: SISTEMA DE EXPRESIÓN

Metanol

Fuente de C y E

Formaldehído

O2

H2O2

Alcohol oxidasa(AOX) Síntesis

AOX hasta un 30 %

de la proteína total soluble.




ASPECTOS GENERALES DEL SISTEMA PAOX1

Metanol

INDUCCION

PAOX1 Gen de interés

Proteína

REPRESION

Glucosa, glicerol

Metabolismo del metanol

GAP

ATP ADP

HCHO GS-CH2OH

GSH

NAD+ NADH

HCOOH

NAD+ NADH

CO2HCHO

O2

H2O2

1/2O2 + H2O

CH3OH

GAP DHA

3 42

CH3OH

5Xu5P

F6P

1/3 GAP BIOMASA

DHA DHAP

FBP

Pi

6

7 8

PEROXISOMA CITOSOL

AOXFLD




SISTEMA DE EXPRESIÓN basado en el PAOX1

Dirigidos al locus AOX1 del

genoma de Pichia

Gen AOX1PAOX1

Solo AOX2 funcional 10% AOX

MutS (Methanol utilisation slow)

AOX1TT

5’AO

X1 PTEF1

PEM

7

Zeoc

ina

Cyc1

TTpUC ori

MCS

5’AO

X1

AOX1TT

Zeoc

ina

MCS

AOX1 y AOX2 funcionales 100% AOX

Mut+ (Methanol utilisation plus)

Características intrínsecasdel gen/la proteína

Fenotipo MutS/Mut+

Condiciones de cultivo:composición medioetapa de inducción

4584868

Factores influyentes en la expresión :

SISTEMA DE EXPRESIÓN basado en el PAOX1


Promotores alternativos:GAP, FLD

LIPASA DEL HONGO Rhizopus oryzae (ROL):

Rhizopus oryzae (R. arrhizus) : hongo filamentoso de elevado interés en biotecnología e investigación académica.

EXPRESIÓN RECOMBINANTE DE LA ROL ENPichia pastoris

Producción de enzimas lipolíticas:

-Principal aplicación: investigación básica académica.

Resolución de compuestos quirales.

-ROL comercializada: nativa

CARACTERÍSTICAS DE LA ROL:

Secuencia señal 26 aa

pro-secuencia 269 aa32 kDa

4 sitios N-glicosilación3 puentes disulfuro



SISTEMA DE EXPRESIÓN ALTERNATIVOS

CONSTITUTIVOS GAP

POR INDUCCIÓN FLD

El promotor FLDCH3OH

Metanol MetilaminaCH3NH2CH3NH2CH3OH

NH4+

O2

O2

HCHO

Glutamato

H2O

H2O

DHA GAP

AOXMOX

HCHO GS-CH2OH

GSH

NAD+ NADH

HCOOH

NAD+ NADH

CO2

Constituents Cel.lulars FLD FMD

Fuente de Carbono

Fuente de Nitrógeno


Glucosa+Amoni Glucosa+Metilamina Metanol+Amoni Metanol+Metilamina Glicerol+Metilamina Sorbitol+Metilamina Metanol+Amoni AOX

Act

ivita

t lip

olíti

ca U

A m

l-1

0,00

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

OD

600

nm

0

10

20

30Activitat lipolíticaOD 600nm

Cultivos con diferentes fuentes de C i N.

Gluc+NH 4

Met+NH 4

Met+MASorb+MA

Glic+MAMet+NH 4

AOXGluc+MA


Fermentación batchAOX - Mut+ versus FLD


0.030.06µmax (h-1)

14861413YP/X* (UA g-1 X)

0.430.27YX/S (g X / g S)

15.46.05Actividad máxima* (U/ml)

FLDAOX Mut+

1447Productividad esp. (UA g-1X h-1)

145201Productividad* (UA L-1 h-1)

Biom

asa

(g/l)

0

1

2

3

4

5

Tiempo (h)0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Activ

idad

lipo

lític

a (U

A/m

l)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Met

anol

(g/l)

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

15 UA/ml

6 UA/ml

YP/X similar

Menor µMAX del promotor FLD

Productividad esp. 2.2 mayorpara el promotor AOX

FLD promotor alternativo al AOX interesante

Tiempo (h)

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110

Bio

mas

a (g

/l)

0

2

4

6

8

10

12

Sorb

itol (

g/l)

02468

1012141618202224

Activ

idad

lipo

lític

a (U

A/m

l)

0

5

10

15

20


Fermentación fed-batchPromotor AOX


Discontinuo 40 g/L de glicerolRápido crecimiento del microorganismoInicio fase de transición pO2/CER

BATCH

TRA

NSI

CIO

N FED-BATCH

Pichia Mut+ única copia

Tiempo (h)

0 10 20 30 40 50 60

Bio

mas

a (g

/L)

0

10

20

30

40

50

60

70

Act

ivid

ad li

polít

ica

(UA

/ml)

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200C

once

ntra

ción

met

anol

(g/ L

)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10


MetOHGLI

Hora Glicerol Metanol1 300 02 300 0 3 160 1004 100 1005 65 100

BATCH

TRA

NSI

CIO

N FED-BATCH


Tiempo (h)

0 10 20 30 40 50 60

Bio

mas

a (g

/L)

0

10

20

30

40

50

60

70

Act

ivid

ad li

polít

ica

(UA

/ml)

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Con

cent

raci

ón m

etan

ol (g

/ L)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Etapa de transición


MetOH

Cromatografía de gases

Modificación delcaudal

Objetivo: Niveles de metanol por debajo de 2 g/l

BATCH

TRA

NSI

CIO

N FED-BATCH


Tiempo (h)

0 10 20 30 40 50 60

Bio

mas

a (g

/L)

0

10

20

30

40

50

60

70

Act

ivid

ad li

polít

ica

(UA

/ml)

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Con

cent

raci

ón m

etan

ol (g

/ L)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10


Parámetros monitorizados en líneaTemperaturapHpO2

rpmCaudal aireaciónCaudal ácido/base

Caudal metanolCaudal glicerol

Acciones de control

DCU FermentadorMicroburetas

FERMENTADOR1 ml1 ml1 ml1 ml

MicroburetasAdición de metanol y glicerol

Monitorización

RS-422

RS-232


Promotor AOX efecto fenotipoCultivos fed-batch


Degradación proteolítica

Niveles de actividad mayores en la MutS

Facilidad de controlar niveles demetanol mayor en la MutS

Diferencias en la velocidadde crec. del microorganismo

205 U/ml

Muts

Mut+

150 U/ml

YP/X 2.5 veces mayor en MutS

Productiv. similares

Tiempo (h)

0 15 30 45 60 75 90

Biom

asa

(g/l)

0

10

20

30

40

50

60

70

Activ

idad

lipo

lític

a (U

A/m

l)

0

50

100

150

200

250

Met

anol

(g/l)

0

1

2

3

4

5

6

B T FB

Biom

asa

(g·l-

1 )

0

10

20

30

40

50

60

70

Tiempo (h)

0 10 20 30 40 50 60

Activ

idad

lipo

lític

a (U

A·m

l-1)

0

50

100

150

200

250

Met

anol

(g·l-

1 )

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

16,0B T FB



23625775YP/X* (UA g-1 X)

150205Actividad máxima* (U/ml)

0.0450.005µ (h-1)

Muts Mut+F. Valero Dept. Enginyeria Química UAB Biotec 04

Fermentación fed-batchPromotor FLD


Tiempo (h)0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Biom

asa

(g/L

)

0

10

20

30

40

50

Sorb

itol (

g/L)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

Activ

idad

lipo

lític

a (U

/mL)

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

240

µ= 0.01 h-1

B T FB

Batch 40 g/l gliceroly amonio limitantes


Tiempo (h)0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Biom

asa

(g/L

)

0

10

20

30

40

50

Sorb

itol (

g/L)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

Activ

idad

lipo

lític

a (U

/mL)

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

240

µ= 0.01 h-1

B T FB

Transición 10 g/l sorbitol3 g/l metilamina


Tiempo (h)0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Biom

asa

(g/L

)

0

10

20

30

40

50

Sorb

itol (

g/L)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

Activ

idad

lipo

lític

a (U

/mL)

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

240

µ= 0.01 h-1

B T FB

Fed-batch Adición programadaµ constante = 0.01 h-1

( ) ( )[ ]( ) ( )[ ]0

0

00 exp ttSSYtVtXF

SX

−−

= µµ


Tiempo (h)0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Biom

asa

(g/L

)

0

10

20

30

40

50

Sorb

itol (

g/L)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

Activ

idad

lipo

lític

a (U

/mL)

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

240

µ= 0.01 h-1

B T FB

170 U/ml


Tiempo (h)0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Biom

asa

(g/L

)

0

10

20

30

40

50

Sorb

itol (

g/L)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

Activ

idad

lipo

lític

a (U

/mL)

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

240

µ= 0.01 h-1

B T FB

170 U/ml

Para intentar evitar la paradaen la síntesis de la proteína se

realiza un fed-batch manteniendoconstante la concentración de

sorbitol alrededor de 8 g/l.

YP/X y productividades específicas más próximas

a Muts

Productividades similares



23625775YP/X* (UA g-1 X)

150205Actividad máxima*

(U/ml)

0.0450.005µ (h-1)

58

2402

4084

170

0.010

FLDMuts Mut+


Tiempo (h)0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Biom

asa

(g/L

)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Sorb

itol (

g/L)

024681012141618202224262830

Activ

idad

Lip

olíti

ca (U

/mL)

0

50

100

150

200

250

300

350

400

B T FB

Sorbitol = 8 g/L

385 UA/ml


El promotor FLD es unaalternativa real al AOX para la

producción de proteínasheterólogas en el microorganismo

huésped Pichia pastoris sinnecesidad de utilizar metanol

Tiempo (h)0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Biom

asa

(g/L

)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Sorb

itol (

g/L)

024681012141618202224262830

Activ

idad

Lip

olíti

ca (U

/mL)

0

50

100

150

200

250

300

350

400

B T FB

Sorbitol = 8 g/L

385 UA/mlActividades, productividades

y YP/X máximas para el promotor FLD manteniendoconstante la concentración

de sorbitol en el medio a 8 g/l

74

4379

6553

385

0.02



23625775YP/X* (UA g-1 X)

150205Actividad máxima*

(U/ml)

0.0450.005µ (h-1)

58

2402

4084

170

0.010

FLDµ=0.01Muts Mut+ FLD

8 g/l


Comparación de los promotores alcohol oxidasa y formaldehido deshidrogenasa en la producción heteróloga de la lipasa de Rhizopus oryzae en Pichia pastoris en

cultivos discontinuo y fed-batch.

O. Cos, D. Resina, R. Ramón, P. Ferrer, J.L. Montesinos y F. Valero

Dept. Enginyeria Química. ETSE. UAB.

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