producción heteróloga de proteínas

7/17/2019 Producción Heteróloga de Proteínas

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PRODUCCIÓN

HETERÓLOGA DE PROTEÍNASTERAPÉUTICAS

Pablo Gómez Martíez Gr!"o #$#%



Introducción.

Standley Cohen (izq.) y Herbert Boyer (der.) impulsores de la

tecnologia del ADN recombinante en 1973.



Introducción.

http://www.dnalc.org/view/15916-DNA-transformation.html



Conceptos Básicos.Expresión biológica en sistemas heterólogos

1.Aislar el RNAm que codifica para una proteina concreta.

2.Obtener su correspondiente cDNA, previamente amplificado porPCR.

3.Insertar en un vector génico (plásmidos, virus,…).

4.Replicar el vector en una célula huésped.



Producción de Proteínas

Terapéuticas Recombinantes.

Estandarización de

condiciones de cultivo (Tª,

pH, etc.

Obtención de extracto con

PR (forma soluble y

funcional)

Purificación



Bacterias:fáciles de aislar,

no realizan splicing y tampoco glicosilan ni realizan todas lasmodificaciones postraduccionales necesarias para la función de

la proteína. Vectores:

virus, plásmidos.

Levaduras: realiza glicosilación, pero de forma distinta acomo la realizamos los humanos. Debido a ello estas proteínas

pueden ocasionar problemas de inmunorespuesta. En este caso,los vectores apropiados para estos organismos son los

plásmidos.

Insectos: células inoculadas con baculovirus, o bien insectoscompletos. La glicosilación sigue siendo un problema.

A veces, lo que se hace es buscar mutantes que sean capaces de

glicosilar.

Células de mamíferos(CHO, HEK293,..): si laproteína se excreta, se purifica el líquido. Y si es intracelular,

rompemos las células y purificamos. Suelen ser cultivos lentos.

Los vectores de expresión habituales son Virus (SV40).

Producción de Proteínas Terapéuticas Recombinantes.

Fábricas Biológicas para la Producción de

Proteínas Recombinantes




Producción en animales completos

(animales como bio-reactores)

Se les introduce DNA de ciertos genes

humanos, capacitándolos así para

producir ciertas proteínas humanas para

tratar enfermedades.

Pez T&la"&a: insulina humana

'a(a: insulina en leche

Cer)o: hemoglobina




Producción en animales completos

(animales como bio-reactores)

En febrero de 2009 la FDA (Food

and Drug Administration)

aprobó la producción de la

proteína recombinante humana

alfa-antitrombina, proteínaanticoagulante.

Las cabras poseen cinco copias de ADN construido que produce

directamente antitrombina humana, localizado en el sitio GTC 155-92,

insertados en los embriones de cabra usando la técnica de

microinyección, bajo el control de un promotor de la beta caseína.




Sistemas Basados en Tejidos Vegetales

La producción de PR en semillas es la plataforma más utilizada. Este sistema ofrece varias

ventajas, tales como: mnimo coste de producción, no propaga virus ! patógenos de

mamferos, confiere un almacenamiento estable.

El principal obstáculo para la producción de PR en tejidos vegetales ha sido su bajo nivel de

acumulación "una alternativa es la producción de PR en c#lulas de plantas en bio$reactores%.

El producto es susceptible de producirse envasado de forma natural "en los frutos o las hojas%.

Las protenas recombinantes a partir de plantas es a&n un camino en vas de e'plotación.




Ejemplos de Proteínas Recombinantes

• Insulina: Diabetes mellitus.

• Somatostatina: Hormona del crecimientohumano.• Eritropoyetina: Pacientes anémicos con

insuficiencia renal crónica.• Somatotropina: Enanismo congénito (algunos

casos de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob). La

bovina se usa para incrementar la producción deleche en vacas.



La Insulina.

La insulina Normal que es

biológicamente activa es

monomérica o existe como únicamolécula. Tiene dos

encadenamientos largos del

aminoácido o encadenamientos del

polipéptido. Los encadenamientos

son A de cadena con 21

aminoácidos y el encadenamientoB con 30 aminoácidos.

Dos puentes de disulfuro conectan

los encadenamientos, y encadenan

A contienen un puente de

disulfuro interno (residuos A6 a

A11).

Estas juntas son similares en

todos los formularios mamíferos

de la insulina.

Trabajos de Fred Sanger.



La Insulina.Existen dos rutas distintas para la producción de Insulina:

1.Producir por separado ambas cadenas para posteriormente

asociarlas químicamente.2. Producir proinsulina que será procesada hasta insulina madura

mediante métodos enzimáticos.

Obtención de insulina por primera vez en bacterias (1982)

http://www.dnalc.org/view/15926-Synthetic-insulin.html



La Insulina.1. Producir por separado ambas cadenas para posteriormente

asociarlas químicamente.



2. Producir proinsulina que será procesada hasta insulina madura

mediante métodos enzimáticos.

La Insulina.



Campo de aplicación Usos Benefcios

Industria armacéuticaProducción de compuestosactivos, intermediarios terapias.

Disminuye costos y tiempo deproducción, fármacos másespecícos, disminuyereacciones inmunológicas einfecciones

Aplicaciones ambientalesDetección de contaminantesmediante anticuerposmonoclonales

Más baratos y rápidos que laspruebas convencionales. Sepueden aplicar en campo

Industria papeleraMeora el proceso demanufactura mediante el uso deen!imas

Disminuye la to"icidad de losresiduos del procesamiento dela pulpa

Industria textil

#plicaciones en la fabricaciónsecado y terminación deproductos, adición de en!imas

en detergentes

Disminuye la to"icidad deresiduos de producción,detergentes más efectivos

Industrias de losalimentos

Procesos de producción,generación de aditivos yconservadores

Meora de procesos, calidad deproductos, t$cnicas de análisis

Industria energética%so de en!imas en procesos deproducción de biocombustibles

&eneración de biocombustiblesmás limpios y a partir dedesec'os industriales oagrícolas

Aplicaciones de las Proteínas

Recombinantes.



La expresión recombinante de DNA proporciona un

sistema de producción ilimitada de proteínas cuya

presencia en la naturaleza sea escasa o suaislamiento implique dificultades. Es

responsabilidad nuestra el uso que hagamos de ello.



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Referencias.

http://biogenmol.blogspot.com.es/





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