Nutrición de los microorganismos.

Substratos y medios de cultivo para

la fermentación industrial.

MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

INGENIERÍA EN AGROALIMENTOS

UNViME 2016

DRA. MARÍA CECILIA VILLA

LA MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

Es el estudio de la microbiología orientada a la producción de elementos de

interés industrial mediante procesos en los que interviene, en algún paso, un

microorganismo.

Surge con el ánimo de generar compuestos químicos complejos de una forma

mas sencilla y barata que mediante síntesis orgánica.

Esto es posible debido a la enorme versatilidad metabólica e los

microorganismos que frecuentemente son capaces de producir los compuestos

deseados o sus precursores.

Las Fermentaciones de Productos Industriales comprenden un buen número

de procesos industriales que son utilizados para producir satisfactores para la

salud y la alimentación.

Para aprovechar las fermentaciones se deben desarrollar tecnologías que

permitan fabricar los productos en cantidades industriales, para satisfacer los

requerimientos.

Se debe buscar siempre bajo costo, para poder competir con los productos

actuales.

Proceso de fermentación:

MICROORGANISMOS

Bacterias, levaduras , hongos

MEDIO DE CULTIVO

CONDICIONES AMBIENTALES

MICROORGANISMO

CO2

PRODUCTO

Intra o extra celular

CONCEPTO DE FERMENTACIÓN

Proceso realizado en un fermentador o biorreactor, mediante el cual

determinados sustratos que componen el medio de cultivo son transformados

por acción microbiana en metabolitos y biomasa.

La fermentación es un proceso de oxidación incompleto, siendo el producto final

un compuesto orgánico. Estos productos finales son los que caracterizan los

diversos tipos de fermentaciones.

El microorganismo aumenta su concentración y el medio se va modificando.

Resultado….. Formación de de nuevos productos como consecuenciadel metabolismo.

Es tan antigua como la manipulación de alimentos fermentados como el

vino y el pan.

HISTORIA DE LA MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

Ha sido clave en la producción de penicilinas:

-naturales, como la Penicilina G, (esto es de forma totalmente microbiológica),

-semisintéticas, como la meticilina (que requiere la purificación de un

intermediario que luego ha de modificarse química o enzimáticamente)

Por último, el estudio del ADN recombinante y el enfoque de la Ingeniería

Genética, han permitido producir proteínas humanas mediante

microorganismos transformados on genes humanos. Por ejemplo: la Insulina

recombinante

Procesos de fermentación en alimentos:

Naturales o espontáneas (fermentación del cacao,ensilado, pozol).

Inoculadas ( vino, yogurt, tempeh).

Procesos de fermentación en medios de cultivo:

Producción de biomasa (proteína unicelular, levadura de pan, levadura de cerveza).

Obtención de metabolitos primarios ( alcohol, ácidos orgánicos) y secundarios ( enzimas, polisacáridos).

IMPORTANCIA DE LA FERMENTACIÓN EN LA BIOTECNOLOGÍA

TIPOS DE FERMENTACIÓN DE VARIOS MICROORGANISMOS

Fermentación Productos Organismos

Alcohólica Etanol + CO2 Levadura(Sccharomyces)

Ácido láctico Ác. láctico Bacterias del ácido láctico

Ácido mixto Ác. láctico,acético,etanol, CO2, H2 Bacterias entéricas(Escherichia, salmonella)

butanediol Butanediol, ác. láctico, acético, etanol, CO2, H2 Bacterias entéricas(Aerobacter, Serratia)

Ácido buritico Ác. burítico, acético, CO2, H2 Clostridios(Clostridium butyricum)

Acetona- butanol Acetona, butanol, etanol Clostridios(Clostridium acetobutylicum)

Ácido propiónico Ác. propiónico Levadura(Sccharomyces)

Fermentación etílica:Se transforman los azúcares de las uva enetanol, debido a la acción de las levaduras.

Fermentación láctica:

EJEMPLOS DE PRODUCTOS OBTENIDOS POR FERMENTACIÓN

INDUSTRIAL

Producción de alimentos: Fermentación del vino

Fermentación del pan

Fermentación de la cerveza

Suplementos dietéticos: Cultivo de algas

Obtención de vitaminas o aminoácidos

Biopolímeros: Xantano, Alginato, Celulosa, Ácido hialurónico,

Polihidroxialcanatos

Biorremediación de entornos contaminados o Tratamientos de desechos

Principios activos medicinales: Insulina, Hormona de crecimiento

Reactivos diagnóstico e investigación: Taq polimerasas empledas en PCR

Los medios de producción deben incluir consideraciones económicas

además de las microbiológicas.

Se produjeron cambios tecnológicos y DE LAS CUBAS CLÁSICAS DE

FERMENTACIÓN construídas de materiales diversos se pasó a

BIORREACTORES DE ACERO INOXIDABLE muy instrumentados.

A LA PAR DE LOS AVANCES, EMPEZARON LAS CONSIDERACIONES…

Conceptos de microbiología, química, bioquímica y tecnología,

constituyen las bases de la microbiología industrial actual.

En un proceso si el objetivo es un producto, este debería ser de alto

rendimiento y fácil extracción del medio de cultivo.

EN EL DESARROLLO DE FERMENTACIONES INDUSTRIALES…

SELECCIÓN DE CEPAS PARA MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

Al seleccionarse un microorganismo, se deben tener en cuenta cierto

criterios como son:

La cepa debe estar libre de contaminantes, incluidos fagos.

Sus requerimientos nutricionales deberían ser satisfechos a partir de

medios de cultivo de costo reducido.

Debe ser de fácil conservación por largos períodos de tiempo, sin pérdida de

sus características particulares.

Debería llevar a cabo el proceso fermentativo completo en un tiempo corto.

Los microorganismos que se utilizan pueden ser obtenidos de

aislamientos a partir de su fuente natural o a partir de una

colección de cultivos.

EN GENERAL, EN LA INDUSTRIA CADA FIRMA POSEE SU

PROPIA COLECCIÓN DE ORGANISMOS, EN MUCHOS CASOS

MUCHOS DE LOS CUALES HAN SIDO MEJORADOS A TRAVÉS DE

TÉCNICAS CLÁSICAS DE MUTACIÓN E INGENIERÍA GENÉTICA.

CARACTERÍSTICAS DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Contener los elementos para la síntesis celular y para la formación de productoMedio ambiente favorable para el crecimiento y/o formación del producto.Económicamente rentable.Máxima producción.Adaptación constante al proceso de fermentación.

CRITERIOS UTILIZADOS EN LA FORMULACIÓN DEL MEDIO

Recuperación del producto.

Eliminación de la represión catabólica.

Materiales de fácil disposición en cantidad suficiente.

Bajos costes de transporte.

Impedir que las impurezas dificulten la recuperación de producto.

EL MEDIO INFLUYE EN:

En el crecimiento celular.En el procesado posterior.En la fisiología y morfología de los microorganismos.

INFLUENCIA DEL MEDIO EN EL CRECIMIENTO

CELULAR.

Los microorganismos necesitan:

Carbono

Nitrógeno

Minerales

Factores de

crecimiento

Agua

Oxígeno(aerobios)

MicroorganismosBiomasa

Biosíntesis y

mantenimiento celular

Condiciones medioambientales:

pH, Temperatura...

INFLUENCIA DEL MEDIO EN EL PROCESADO

POSTERIOR:

Subproductos, proceso de recuperación más caro y

complejo. (Procesos de purificación de productos y

tratamiento de desechos).

Necesidad de adicionar antiespumantes,

problemas en el procesado de productos asociados con

el crecimiento microiano

INFLUENCIA DEL MEDIO EN LA FISIOLOGÍA Y

MORFOLOGÍA DE LOS MICROORGANISMOS

Las condiciones relacionadas con el medio que han

demostrado tener influencia en la morfología

ViscosidadpH Cationes

divalentes

Polímeros

anióticos

Agentes

quelantes

Presencia de

sólidosAgentes

tensoactivos

Morfología

Por ej. PH: Las hifas del P. Chrysogenum se

vuelven más cortas y gruesas a medida que el

pH es más alcalino, forman gránulos.

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVOS. COMPONENTES DE UN

MEDIO DE CULTIVO.

La preparación de los medios de cultivos es fundamental para asegurar la

productividad.

La nutrición microbiana consiste en aportar a las células los ingredientes

químicos que necesitan para la síntesis de monómeros, que son los componentes de las

macromoléculas, que a su vez construyen las estructuras celulares.

Monómeros Macromoléculas Estructuras

celulares

Monosacáridos

Aminoácidos

Ácidos grasos

Bases nitrogenadas

Polisacáridos

Proteínas

Lípidos

Ácidos nucleicos

Pared celular

Glicocàlix

Membrana

Ribosomas

Flagelo

Pelos y fimbrias

Enzimas

Membranas

Cromosoma

Ribosomas

Plásmidos

DISEÑO

EL DISEÑO DE UN MEDIO DE FERMENTACIÓN TIENE COMO

FINALIDAD SELECCIONAR LOS COMPONENTES DE LOS MEDIOS

PARA ASEGURARNOS EL CRECIMIENTO DE LOS MICROORGANISMOS

Y LA FORMACIÓN DE LOS PRODUCTOS CORRESPONDIENTES AL

PROCESO A DESARROLLAR

CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Medio definido para Escherichia coli

K2HPO4 7 g

KH2PO4 2 g

(NH4)2SO4 1 g

MgSO4 0,1 g

CaCl2 0,02 g

Glucosa 4-10 g

Elementos traza 2-10 g

(Fe, Co, Mn, Zn,

Cu, Ni, Mo)

Agua destilada 1000 ml

pH7

El medio de cultivo químicamente definido se prepara añadiendo

cantidades precisas de compuestos orgánicos e inorgánicos puros a un

volumen conocido de agua destilada.

Se conoce su composición exacta.

Medio complejo

para Escherichia coli

y Leuconostoc mesenteroides

Glucosa 15 g

Extracto de levadura 5 g

Peptona 5 g

KH2PO4 2 g

Agua destilada 1000 ml

pH7

Para elaborar el medio complejo se utilizan hidrolizados de

proteínas y otras sustancias muy nutritivas pero no definidas

químicamente que se pesan y se añaden a un volumen conocido

de agua.

No se conoce la composición exacta del medio complejo.

REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES

Estará determinado por el metabolismo celular

Fuente de C:

Autotróficos (algas, algunas bacterias) necesitan CO2

Heterotróficos necesitan compuestos orgánicos

Requerimientos de O2:

Aerobios

Anaerobios

Algunas bacterias en vez de O2 emplean NO3 o SO4 como aceptores finales de

electrones.

Fuente de E:

Las bacterias metanogénicas requieren H2, para reducir CO2 a CH4 y obtener

E (auxótrofos anaerobios).

Algunos anaerobios obtienen su E por reacciones de óxido-reducción de

compuestos orgánicos. Las fuentes de C, son muchas veces importante fuentes

de E.

Fuentes de nitrógeno:

-Inorgánica u Orgánica

-Se emplea para síntesis de proteínas, ácidos nucleicos, polímeros de la pared celular

Macronutrientes:

- P y S en forma de PO4 y SO4

-PO4 para formar ADN, ARN y polímeros celulares

-SO4 para sínteis de aminoácidos azufrados, biotina, coenzima A, tiamina

-K y Mg, ligados al RNA. Mayor velocidad de crecimiento, aumento de RNA, mayor requerimiento de K

- K actúa como coenzima y Mg es estabilizador de organelas (ribosomas) y es cofactor.

Micronutrientes:

- Esenciales: Ca, Mn, Fe, Co, Cu, Zn.

- Poco esenciales: Na, Al, Si, Cl, Cr, Ni, Se, Mo

-Difíciles de cuantificar porque generalmente están presentes como impurezas de otros componentes principales.

- Sus requerimientos aumentan cuando el cultivo se somete a “stress”.

Factores de crecimiento:

-Aminoácidos, tiamina, riboflavina, niacina; la mayoría son constituyentes de

coenzimas.

Requerimientos específicos según el proceso:

-Por ej. Ác. Fenilacético para la Penicilina

-Por ej. Sulfato que favorece la producción de glicerol en la fermentación

alcohólica

-Un proceso caracterizado por descenso de pH, obliga a agregar al medio un

agente buffer, como mezcla de fosfatos o carbonato de calcio, o mediante el

agregado de una solución alcalina.

-En un proceso de producción de ácido cítrico el hierro en exceso influye

negativamente. Por lo cual se diseña un medio con ausencia total de hierro y

se va agregando hierro de manera controlada.

CATIONES DIVALENTES: inducen el crecimiento en forma de gránulos, sus efectos pueden contrarrestarse con AGENTES QUELANTES.

La presencia de cationes influye en la floculación de las levaduras (importante en su sedimentación y eliminación en la producción de bebidas alcohólicas no destiladas).

El manganeso afecta a la composición celular de la pared celular de A. Niger.

AGENTES TENSOACTIVOS: Algunos aumentan la velocidad de secrección de los enzimas microbianos extracelular.

NITRÓGENO: niveles bajos inducen la formación de esporas.

AMINOÁCIDOS: niveles elevados inhiben la formación de esporas.

OTROS CRITERIOS A TENER EN CUENTA EN LA FORMULACIÓN DE

LOS MEDIOS

MACRONUTRIENTES

MICRONUTRIENTES

FACTORES DE CRECIMIENTO

DISPONIBILIDAD DE LOS COMPONENTES

- Componentes susceptibles de ser usados por la célula.

- Concentración de iones metálicos modificada por quelación por componentes del

medio o productos de la fermentación, para controlar la concentración y

precipitación de los iones se emplean agentes quelantes, como el EDTA.

SE DEBE TENER EN CUENTA LA NATURALEZA DE LOS COMPUESTOS

ORGÁNICOS QUE PUEDEN ACTUAR COMO LIGANDOS Y SOBRE TODO

DEL ION METÁLICO CONSIDERADO, YA QUE ES NECESARIO

CONTROLAR SU CONCENTRACIÓN LIBRE.

Cte de Equilibrio para la formación del complejo ión metálico-ligando

Los compuestos petroquímicos ( hidrocarburos, alcoholes y

ácidos). Se empleaban cuando el petróleo era barato, no mucha

extensión.

En la actualidad: materias primas renovables que contienen

azúcar y almidón y menos grasas y aceites.

Futuro: los productos de la hidrólisis de la lignocelulosa las

materias primas más importantes en los procesos de la

fermentación.( La lignocelulora representa el 50% de la

producción anual mundial de biomasa).

MATERIAS PRIMAS

Se debe considerar costos, disponibilidad, estabilidad en su composición

química y problemas de impurezas.

Las materias primas fundamentales son las fuentes de C y N.

ALMIDÓN: es el más importante actualmente .

En forma de granos o raices, enteros o molidos, de plantas como el maíz, arroz, trigo , patatas y mandioca;como almidón purificado, modificado o como dextrinas

CELULOSA:

Presente en la madera combinado con la hemicelulosa y la lignina en forma de lignocelulosaLa lignina hace a la celulosa resistente al ataque microbiano . No son rentables los métodos químicos y enzimáticos que convierten la lignocelulosa en azúcares fermentables. (Para obtener champiñones y substrato para producir enzimas celulolíticas)

SACAROSA:En forma cristalina o en forma bruta como zumos o melazas (es el subproducto de la manufactura de azúcares más barato, varía su composición , causando problemas en la reproductibilidad de la fermentación)

LACTOSA: En el suero de la leche (4% al 5%)Baja concentración, caro su transporte. Solo se utiliza en lugares próximos a la factoría de quesos proveedora.

GLUCOSA:Se obtiene a partir de la conversión enzimática directa del almidón.Glucosa refinada, en forma de jarabe o cristalina para productos de mayor valor.

ACEITES VEGETALES ( de soja, palma y semillas de algodón como complemento delos carbohidratos), METANOL, ETANOL......

LAS FUENTES DE CARBONO PUEDEN SER:

Hidratos de C como gllucosa o dextrosa, sacarosa, lactosa, almidón, dextrina.

Alcoholes como el glicerol y manitol

Hidrocarburos como hexadecano, octadecano y otros

HIDRATOS DE CARBONO EMPLEADOS COMO FTE DE C EN LOS PROCESOS DE

FERMENTACIÓN

FUENTE DE NITRÓGENO

DE NATURALEZA INORGÁNICA:

Amoniaco, nitratos, urea, y el nitrógeno presente en los cereales y raíces y

sus subproductos.

Aminoácidos purificados, empleados como precursores.

DE NATURALEZA ORGÁNICA:

Hidrolizados de Proteínas (Peptonas): Obtenidas por hidrólisis ácida o

enzimática de distintas fuentes proteicas, como carne, pescado, caseína,

gelatina, harina de soja, algodón y girasol. Además de su función como fuente

nitrogenada, las peptonas aportan vitaminas, sales inorgánicas como fosfatos y

micronutrientes como Ca, Zn, Fe y Cu.

Extracto de carne: Se obtiene por extracción acuosa y concentración

posterior.

Extracto de Levadura: Se obtiene por autólisis o plasmólisis de levadura,

es una mezcla de aminoácidos, péptidos, vitaminas solubles en agua y

carbohidratos.

Extracto de malta: Es el extracto soluble en agua de la malta de la cebada

Cornsteep: Agua de maceración del maíz, es muy importante en la

producción de varios antibióticos y enzimas.

SUSTRATOS COMPLEJOS

Son una fuente barata de carbono, nitrógeno y otros nutrientes.

Presentes en plantas enteras y subproductos vegetales, animales y

microbianos.

FORMULACIÓN

Se refiere a los aspectos cuantitativos de los medios.

Se debe tener una aproximación a la composición de la biomasa delmicroorganismo. Una composición elemental en peso seco es:

-Carbono: 46 – 48%

-Nitrógeno: 7-12

-Fósforo: 1 – 3

-Azufre: 0.5 – 1

-Mg: 0.5 – 1

COMPONENTE ELEMENTO/FUNCION MASA. gr

Glucosa C, energía 22.7

NH4Cl N 4.37

KH2PO4 P + K 1.13

MgSO4.7H2O S + Mg 0.232

CaCl2.2H2O Ca 0.011

FeSO4.7H2O Fe 0.007

MnS.4H2O Mn 0.002

ZnSO4.7H2O Zn 0.002

CuSO4.5H2O Cu 0.0004

CoCl2.6H2O Co 0.0004

EDTA Quelante 0.394

Agua destilada 1 ml

Composición de medio mínimo para Klebsiella aerogens

SUSTRATOS COMPLEJOS UTILIZADOS EN LOS MEDIOS DE

FERMENTACIÓN MICROBIANA.

FUENTE INGREDIENTES PROT. CARBOH. GRASA FIBRA CENIZA

Cebada 11,5 68,0 1,8 7,0 2,5

Cebada malteada 13,0 70,0 2,0 3,5 2,5

Maiz 9,9 69,2 4,4 2,3 1,3

Avena 12,0 54,0 4,5 12,0 4,0

Arroz 13,0 65,0 2,0 10,0 4,5

Trigo 8,2 69,0 1,9 2,6 1,8

Melazas 3,0 54,0 0,4 9,0

Pulpa de remolacha 8,9 59,1 0,6 18,3 3,1

Pulpa de agrios (seca) 6,0 62,7 3,4 13,0 6,9

Harina de germen de maiz 22,6 53,2 1,9 9,5 3,3

Salvado de arroz 13,0 45,0 13,0 14,0 16,0

Harina integral de soja 42,0 29,9 4,0 6,0 6,5

Sangre 80,0 2,5 1,0 1,0 3,0

Harina de pescado 72,0 7,5 1,0

Harina de hueso 50,0 0,0 8,0 3,3 31,0

Subp deriv microorganismos Hidrolizado de levaduras 52,5 0,0 1,5 10,0

Cereales enteros

Subpr.derv. plantas

Subp. deriv.animales

CONTROL DEL PROCESO DE FERMENTACIÓN: VARIABLES

1.-PH

2.-ESPUMA

3.-OXÍGENO

4.-TEMPERATURA

5.-REGULACIÓN DE LA FORMACIÓN DE PRODUCTO.

1.-PH:

Control necesario para el desarrollo celular y formación de producto.

Control de forma indirecta o de forma directa:Directamente (Añadiendo agentes tamponantes):

Fosfato inorgánico pH entre 6.0 y 7.5.

Ácidos orgánicos pH bajos.

Carbonato cálcico frente a la producción de ácidos.

Hidroxisales, amoniaco, ácidos sulfúrico y clorhídrico.

Indirectamente ( mediante un balance equitativo entre las fuentes de carbohidrato y nitrógeno).

Los carbohidratos bajan el pH (formación de ácidos orgánicos).

La asimilación del nitrato produce alcalinidad.

DESVENTAJAS: Efectos represivos sobre la formación del producto.

2.- ESPUMA:

ORIGEN:

Desnaturalización de las proteínas

en la interfase gas- líquido.

PROBLEMAS:

Asciende hasta ocupar totalmente la

cabeza del fermentador por lo cual hay que

evacuar parte del contenido del aparato por

la salida del aire.

SOLUCIÓN:

Antiespumantes ( agentes tensoactivos

que reducen la tensión superficial de las

espumas hasta dispersarlas ).

Rompedores mecánicos.

ANTIESPUMANTES: Eficacia (Depende de las condiciones

de fermentación): Composición del medio, cepas microbianas, etapa

de crecimiento, configuración de las vías de aireación y del fermentador.

Selección y cantidad del antiespumante:

Procedimientos de ensayo y error.

Uso de soportes(aceites orgánicos y minerales)

Cantidad de antiespumante mínima ( afecta a la velocidad de transferencia de oxígeno hasta u 50%)

No deben ser tóxicos ni peligrosos, esterilizablespor el calor y baratos.

3.- OXÍGENO

Requerimientos en procesos aerobios.

Influencia sobre los procesos metabólicos.

Velocidad de absorción específica de oxígeno concentración de

oxígeno disuelto

Antioxidantes como protección del producto.

4.-TEMPERATURA

Temperatura óptima para la producción celular o de metabolitos.

Uso de termostatos

5.-REGULACIÓN DE LA FORMACIÓN DEL PRODUCTO

PERCUSORES

INDUCTORES

incorporarse al medio el inductor específico

mediante adiciones continuas o discontinuas

INHIBIDORES

minimizar la formación de otros intermedios metabólicos.

Prevenir el metabolismo posterior al producto deseado

Ejemplos:

Fuente de N utilizable rápidamente inhibe la producción de algunos antibióticos.

El ácido fenilacético es el ppal percusor en la producción de bencilpenicilina por fermentación.

MANTENIMIENTO DE LOS MEDIOS

El medio de almacenamiento y subcultivo de cepas industriales clave

debe ser diseñado para que las cepas:

•Conserven las características necesarias que permitan la capacidad

de producción particular.

•Minimicen la variación genética.

¿ POR QUÉ UTILIZAR MEDIOS DE MANTENIMIENTO?

CEPASMETABOLITOS

TÓXICOSEFECTOS

DESESTABILIZANTES

ESTERILIZACIÓN DE CULTIVOS

OBJETIVOS:

Evitar el desarrollo de microorganismos patógenos.

Evitar el desarrollo de microorganismos alterantes.

Incrementar la reproducibilidad del proceso (rendimiento, pureza y tiempo de producción).

MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN:

Calor húmedo (autoclave o chorro de vapor).

Calor seco

Radiación ( Rayos X ,UV)

Esterilización química con líquidos o gases.

Filtración (filtros de superficie o de profundidad). Nuevos métodos ( altas presiones, campos eléctricos)

¿DONDE SE CONTROLA LA ESTERILIDAD?

Mantener la pureza del inóculo.

Esterilizar el medio de cultivo y los aditivos.

Esterilizar el material en contacto con el medio

(recipiente, fermentador, válvulas y conductos)

Esterilizar los gases entrantes y salientes.

Manterner las condiciones asépticas durante la

manipulación.

Construcción apropiada del biorreactor para su

esterilización y para la prevención durante la

fermentación.

Para una buena rentabilidad, en virtualmente todos los

procesos, será necesario que en todas las etapas estén libres de

contaminantes.

También depende, no obstante, del campo en que nos estemos

moviendo. En el campo medio ambiental, hablar de esterilización

no tiene mucho sentido, mientras que en el campo alimentario

será esencial. Generalmente, la necesidad de un proceso de

esterilidad está en relación con el valor añadido del producto.

La probabilidad de que exista contaminación a lo largo del

proceso depende de las características del mismo. La probabilidad

de que exista contaminación en un cultivo mesófilo es mayor que

en un cultivo termófilo. También será más probable que exista

contaminación en un medio con pH aproximado a 7, más que a pH

ácido. La probabilidad de que haya contaminación será mayor en

los que consuman mucho oxígeno, que en los que consuman

menos.

Llegado a este punto hemos de plantear la optimización del

proceso a nivel de producción, sino a nivel de seguridad. Si se

puede ajustar el pH hacia abajo, mejor, que será más seguro.

Durante la fermentación hemos de observar diferentes puntos para

garantizar la esterilidad:

- Esterilidad del medio de cultivo: el medio nutritivo que se prepara

inicialmente contendrá un elevado número de células vegetativas y otras

derivadas ingredientes del medio. Todos estos microorganismos han de ser

eliminados por el proceso adecuado antes de la inoculación. Existen

diferentes métodos, pero normalmente se usa el calor, y raramente otros.

- Pureza del inóculo: el inóculo representa entre el 2 y el 5% del

volumen total del biorreactor, si el cultivo no es puro habrá

contaminaciones.

- Esterilización del aire que fluye: La mayor parte de fermentaciones se

dan en condiciones de agitación vigorosa. El aire que entra ha de ser estéril.

El aire puede contener entre 10-105 partículas/m3 de los cuales entre 5 y

2000 serán microorganismos, principalmente esporas de hongos, bacterias

Gram negativas y fagos en suspensión. La esterilización del aire que entra

es esencial.

- Construcción apropiada del biorreactor, para que la esterilización entre

fermentación y fermentación pueda servir para prevenir la contaminación.

Cuál será el método usado para la esterilización?

Mediante el uso de un agente biocida que inactive los microorganismos. Los agentes biocidas tienen diferentes dianas. Los usados en biotecnología se clasifican en:

- Agentes químicos: existe un elevado número de desinfectantes químicos líquidos y gaseosos. Pueden ser sustancias oxidantes como O3, óxido de etileno,... En la práctica se usan poco, porque son difíciles de eliminar y por lo tanto se corre el riesgo de inhibir el crecimiento de los microorganismos después, en la fermentación.

- Agentes físicos: son los más habituales.

- - Radiaciones ionizantes: Rayos X, UV, o γ. Aunque ocasionalmente se usan en industria alimentaria, no se usan de manera habitual en fermentaciones industriales por el riesgo que suponen para el manipulador.

- Calor: es el método más empleado, sobre todo para el medio y para las instalaciones. Usualmente se usa vapor de agua para esterilizar mejor.

- Métodos mecánicos: Filtración, Centrifugación,... La filtración es la única que se usa en la práctica. Es útil para la esterilización de medios con partes sensibles a calor y para esterilizar el aire.

Talycomoyahemos dicho, elcalor es elmétodo más empleado. Los agentes biocidas suelen tener

cinéticas de primer orden. Se ha de tener siempre en cuentaelfactor CT, siendo c laconcentración o

intensidad del agente biocida y t eltiempo de tratamiento. Es necesariorecordar esto, puesto que se puede

conseguir elmismo efecto esterilizando 2 horas a 90º Co 4 horas a 45º C.

En la microbiología industrial, cuando se habla de esterilización, no se considera la esterilidad absoluta,

como en el laboratorio, sino que se trata de esterilidad comercia. En muchos productos podemos

encontrar microorganismos, pero dado que no tienen efectosanitario,noresulta rentable eliminarlos.

El calor destruye vitaminas ydesnaturaliza proteínas, de aquíla

importancia del concepto CT. A partir deeste conceptosurgióla idea de

UHT. Se alcanza la misma eficiencia de inactivación de

microorganismos, pero elefecto que tiene sobre las proteínas yvitaminas es mucho menor.

Autoclave 120º C 10 – 15’

UHT 140º C Segundos

Comoya hemos dicho, el propio biorreactor se esteriliza mediante vaporde agua, pero los medios no se

pueden esterilizar así,porque elvapor de agua condensaría, de manera que aumentaríaelvolumen.

Además, resultaría muycaro calentar talvolumen de agua, y el tiempo aumentaría, porque se tendría que

esperar a que se enfriase. Existen diferentes métodos para esterilizar el medio, aparte de la filtración. Uno

de ellos es el que se conoce comoesterilización en continuo. Consiste en ir cargando el biorreactor poco a

poco con el medio, que se esteriliza por UHT. El medio va pasando porplanchas de acero a 140º C. El

tiempo que pase por laplancha será similar alde UHT. Elproblema es que elmedio que salga de aquí

estará demasiado caliente, por loque tendré que enfriarlo, yaque loquiero a unos 30º C.La solución es

un sistema que hace que pase cerca del medio fresco, aún no esterilizado, de manera que antes de la

esterilización a 140º, el medio ya está caliente. Si funciona bien se recupera el 80 – 90 % de la energía.

Otro problema al que nos enfrentamos es el aire, que es necesario esterilizar, que se suele hacer mediante

filtración. Podemos distinguir entre los filtros de adsorción, filtros en profundidad. En este caso, todo el

volumen del filtro tiene capacidad de filtrado. Está diseñado en forma de ovilloo bobina, de manera que

tarde o temprano, cualquier partícula en suspensión choque y quede retenida. Los filtros por retención

tienen eltamaño de poro más pequeño, puesto que las partículas quedarán retenidas.

ESTERILIZACIÓN DISCONTINUA ESTERILIZACIÓN CONTINUA

T 121ºC 20-30 segundos a 90-120 ºC

30-120 segundos a 140ºC

20-30 segundos refrigeración

Calentamiento por inyección de vapor Calentamiento por inyección de vapor

o intercambiadores de calor o intercambiadores de calor

Alto consumo de energía. Formación de sales insolubles

Alteración y destrucción de nutrientes. Tamaño de la partícula restringida a 1-2 mm

Tiempos de esterilización mayores(2-3h)