medios de cultivo
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MEDIOS DE CULTIVO. TIPOS, CLASIFICACIÓN, ENUMERACIÓN,
ELABORACIÓN GENERAL Y UTILIZACIÓN DE LOS MISMOS.
TECNICAS DE INOCULACION, INCUBACION Y RECUENTO DE LA MUESTRA BIOLOGICAS.
1.- INTRODUCCION
2.- MEDIOS DE CULTIVO
2.1.- CONDICIONES GENERALES PARA EL CULTIVO DE
MICROORGANISMOS
2.1.1.- DISPONIBILIDAD DE NUTRIENTES ADECUADOS 2.1.2.- CONSISTENCIA ADECUADA DEL MEDIO
2.1.3.- ESTERILIDAD DEL MEDIO
2.2.- CLASIFICACION
2.2.1.- SEGÚN SU ESTADO FISICO 2.2.2.- SEGÚN SU COMPOSICION
2.2.3.- SEGÚN AL USO AL QUE SE DESTINEN
2.3.- COMPOSICION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
2.4.- CONTROL DE CALIDAD
3.- PREPARACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
3.1.- MODELO ESTANDAR DE PREPARACION
4.- MEDIOS DE USO COMUN EN EL LABORATORIO. 4.1.- AGAR SANGRE.
4.2.- AGARCHOCOLATE
4.3.- AGAR MCCONKEY
4.4.- CALDO TIOGLICOLATO 4.5.- AGAR SCHAEDLER
4.6.- AGAR KANA-VANCO
4.7.- AGAR BBE
4.8.- AGAR SALMONELLA-SHIGELLA
4.9.- KLIEGER (KIA) 4.10.-AGAR SABOREUAD
4.11.- AGAR MUELLER-HINTON
4.12.- AGAR THAYER-MARTIN
4.13.- AGAR CLED
5.- INCUBACION
6.- INOCULACION.
6.1.- SIEMBRA EN TUBO EN MEDIO LÍQUIDO 6.2.- SIEMBRA EN TUBO EN MEDIO SÓLIDO
6.2.1.- TUBO.
6.2.2.- PLACA PETRI.
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1.- INTRODUCCION
Koch realizó sus investigaciones utilizando en un primer momento rodajas de patata como soporte nutritivo sólido, pero no
tardó en recurrir al caldo de carne líquido, diseñado por Loeffler, al que, en 1881, añadió gelatina, logrando un medio sólido transparente
ideal para la observación de la morfología macroscópica de las
colonias microbianas. En 1887 un ayudante de Koch llamado Petri,
comienza a utilizar placas de cristal planas, que se llaman desde entonces placas de Petri, para sustituir a las clásicas bandejas de
vidrio cubiertas con campanas que se usaban hasta entonces.
Actualmente se han preparado más de 10.000 medios de cultivo
diferentes.
Uno de los sistemas más importantes para la identificación de
microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material
alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de
Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo.
Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de
cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son:
temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuadas, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo
debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y
debe estar exento de todo microorganismo contaminante.
2.- MEDIOS DE CULTIVO
La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes
complejos similares en composición a los líquidos orgánicos del
cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una
infusión de estractos de carne y Peptona a la que se añadirán otros ingredientes
2.1.- CONDICIONES GENERALES PARA EL CULTIVO DE
MICROORGANISMOS
El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado por una serie de factores de gran importancia y
que, en algunos casos, son ajenos por completo al propio medio.
2.1.1.- DISPONIBILIDAD DE NUTRIENTES ADECUADOS
Un medio de cultivo adecuado para la investigación
microbiológica ha de contener, como mínimo, carbono, nitrógeno,
azufre, fósforo y sales inorgánicas. En muchos casos serán necesarias
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ciertas vitaminas y otras sustancia inductoras del crecimiento.
Siempre han de estar presentes las sustacnias adecuadas para
ejercer de donantes o captadores de electrones para las reacciones
químicas que tengan lugar.
Todas estas sustancias se suministraban originalmente en
forma de infusiones de carne, extractos de carne o extractos de
levadura. Sin embargo, la preparación de estas sustancias para su aplicación a los medios de cultivo provocaban la pérdida de los
factores nutritivos lábiles. Actualmente, la forma más extendida de
aportar estas sustancias a los medios es utilizar peptona que, además, representa una fuente fácilmente asequible de nitrógeno y
carbón ya que la mayoría de los microorganismos, que no suelen
utilizar directamente las proteínas naturales, tienen capacidad de
atacar los aminoácidos y otros compuestos más simples de nitrógeno presentes en la peptona.
Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas específicas por lo que se añade a muchos medios sustancias como suero, sangre,
líquido ascítico, etc. Igualmente pueden ser necesarios ciertos
carbohidratos y sales minerales como las de calcio, magnesio,
manganeso, sodio o potasio y sustancias promotoras del crecimiento, generalmente de naturaleza vitamínica. Muy a menudo se añaden al
medio de cultivo ciertos colorantes, bien como indicadores de ciertas
actividades metabólicas o bien por sus capacidades de ejercer de
inhibidores selectivos de ciertos microorganismos.
2.1.2.- CONSISTENCIA ADECUADA DEL MEDIO
Partiendo de un medio líquido podemos modificar su consistencia añadiendo productos como albúmina, gelatina o agar,
con lo que obtendríamos medios en estado semisólido o sólido. Los
medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que
muchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al punto de fusión de este solidificante y de
que otros tienen la capacidad de licuarla.
Actualmente los medios sólidos son de uso universal, por su
versatilidad y comodidad, pero hay también gran cantidad de medios líquidos cuyo uso está ampliamente extendido en el laboratorio.
2.1.3.- ESTERILIDAD DEL MEDIO
Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente
estériles para evitar la aparición de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano
normal del o de los especimenes inoculados en dichos medios. El
sistema clásico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave
(que utiliza vapor de agua a presión como agente esterilizante)
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2.2.- CLASIFICACION
Se pueden realizar distintas clasificaciones atendiendo a su
estado físico, composición, el uso al que se destinan:
2.2.1.- SEGÚN SU ESTADO FISICO
Se dividen en sólidos, semisólidos y líquidos:
Sólidos, presentan en su composición una agente solidificante (AGAR) en proporción de 12 a 15 gramos por
litro.
Semisólidos, presentan AGAR en su composición, pero a
una concentración mucho menor, entre 2,5 a 4 gramos del agente solidificante
Líquidos, no presenta ningún agente solidificante
2.2.2.- SEGÚN SU COMPOSICION Se dividen en empíricos, sintéticos y semisintéticos;
empíricos, en su composición aparecen sustancias
orgánicas
sintéticos, en su composición aparecen sustancias químicas
definidas semisintéticos, en su composición aparecen moléculas de
naturales hidrolizadas
2.2.3.- SEGÚN AL USO AL QUE SE DESTINEN Se dividen en: enriquecidos, diferenciales o aislamiento, selectivos
e inhibidores, transporte y mantenimiento, uso general, para filtros
de membrana.
enriquecidos, suelen ser medios con un nutriente simple que presentan enriquecedores, tales como sangre de
caballo, etc.
diferenciales o de aislamiento, contienen colorantes,
azucares e indicadores para provocar la respuesta
bioquímica conocida selectivos e inhibidores, además de los componentes de los
medios diferenciales, contienen en su composición una
serie de agentes que sirven para inhibir la flora
acompañante de la muestra a estudiar, y aislar, de esta forma, el microorganismo que se busca.
transporte y mantenimiento, se utilizan en la recogida,
transporte y conservación de muestras biológicas. son
medios muy reductores que inhiben las reacciones enzimáticas autodestructivas dentro de las células evitando
los efectos destructivos de la oxidación.
uso general, son medios que soportan el crecimiento de
una amplia variedad de microorganismos fastidiosos. filtros de membrana, son medios que permiten el examen
de grandes volúmenes con un baja concentración de
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microorganismos, la separación de los microorganismos del
medio de cultivo e incluso su cambio de un medio de
cultivo a otro, permite el crecimiento sin interrupción del
microorganismo.
2.3.- COMPOSICION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
Los constituyentes mas utilizados en la composición de los medios de cultivo son: agar, peptona, extracto de carne, extracto de
levadura, sangre, plasma, suero, bilis, sales biliares, gelatina,
carbohidratos, indicadores,
Agar, comercialmente se presenta en gránulos y polvos, la concentración en la que se encuentra en los medios de
cultivo, dependerá del uso que quiera darse al medio.
Peptona, es un producto de composición variable, obtenido
generalmente de la hidrólisis ácida o enzimática de las proteínas vegetales o animales.
Extracto de carne, contiene bases orgánicas solubles,
productos de degradación de las proteínas, vitaminas y
minerales.
Extracto de levadura, se consigue a partir de levadura de pan o de cerveza y es una fuente de aminoácidos y
vitaminas del complejo B.
Sangre, las mas utilizada es la de sangre o carnero, tiene
que estar libre de agentes antimicrobianos para evitar la inhibición el crecimiento de los
microorganismos. Se debe de comprobar siempre la
esterilidad, así como la ausencia de citratos ya que inhiben el crecimiento de estafilococos.
Plasma, se utiliza para emplear la actividad coagulasa de
las bacterias, se emplea plasma humano o de conejo.
Suero, se prepara a partir de sangre recolectada sin adición
de anticoagulante, eliminando el líquido que se separa cuando se contrae el coágulo.
Bilis, contiene varios ácidos biliares, como compuestos
conjugados con aminoácidos, bilirrubina y biliverdina.
Sales biliares, inhiben el crecimiento de bacterias grampositivas y bacilos en forma de esporas, sin afectar el
desarrollo de los bacilos entéricos gramnegativos.
Gelatina, proteína obtenida mediante extracción de
material colágeno a partir de tejidos animales... Es un agente solidificante pero se emplea poco ya que bastantes
bacterias provocan su licuación.
Carbohidratos se adicionan por dos motivos
fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentación de los
microorganismos que ayuden a identificarlos.
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Indicadores, para detectar, por ejemplo, la formación de
ácido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias
y no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que
es rojo en pH básico y amarillo en pH ácido. La Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya que impide el
crecimiento de la mayoría de las bacterias Gram-positivas).
2.4.- CONTROL DE CALIDAD
Los medios de cultivo pueden prepararse en el laboratorio a
partir de diferentes ingredientes químicos o a partir de productos en
polvo deshidratados comerciales, pero también pueden adquirirse medios listos para su uso. El laboratorio debe asegurarse de que la
calidad de los medios de cultivo y reactivos es apropiada para los
ensayos realizados. Se recomienda que provengan de empresas
certificadas según ISO 9000. El laboratorio debe asegurarse de que la certificación cubre todas las operaciones relevantes, entre ellas las de
suministro y entrega, cuando estas influyan en la calidad de los
productos, deberá solicitar también, una copia del certificado de
registro ISO 9000 a los proveedores de los productos.
El fabricante debería aportar, inicialmente, una "especificación
de calidad" que incluya el mayor número posible de los puntos
siguientes:
caducidad del producto condiciones de almacenamiento
control de esterilidad, incluyendo criterios de aceptabilidad
controles de la eficacia, incluyendo el microorganismo usado,
referencia de la colección de cultivos y criterios de aceptabilidad fecha de emisión de la especificación, plan y frecuencia de
muestreo
Se recomienda realizar controles adicionales con carácter
aleatorio, para asegurarse de que los productos siguen cumpliendo las especificaciones requeridas. Estos controles pueden incluirse en el
programa interno de control de calidad. Los medios de cultivo,
productos en polvo deshidratados y reactivos comerciales deben
consumirse antes de la fecha de caducidad. El laboratorio debe registrar la fecha de recepción, la fecha de caducidad y la fecha de
apertura del envase. El almacenamiento debe realizarse en las
condiciones apropiadas. Todos los envases, especialmente los que
contengan medios deshidratados, deben estar herméticamente cerrados. No deben utilizarse medios deshidratados que presenten
apelmazamiento o un cambio de color.
Los lotes de medios preparados según formula en el laboratorio deben verificarse para comprobar que facilitan el crecimiento de
determinados cultivos microbianos procedentes de una colección
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reconocida y debe verificarse que los medios selectivos inhiben el
crecimiento de microorganismos no deseados, así como demostrar su
esterilidad. Si se dispone de aislados bien caracterizados y
reconocidos por otros laboratorios, pueden también ser utilizados como cepas para el control de calidad de los medios.
En lugar de utilizar el método frecuente de cultivo en línea, se
recomienda utilizar un procedimiento cuantitativo que consiste en inocular en el medio un número conocido, normalmente pequeño, de
microorganismos y evaluar el número de microorganismos
recuperados. Este método puede utilizarse para establecer el nivel de
recuperación por debajo del cual se rechaza un lote.
Atendiendo a los factores que hemos comentado el control de
calidad se puede clasificar atendiendo, a su presentación y
almacenamiento: Atendiendo a su presentación:
Placa Petri : 2,5meses
Tubo: 6 meses
Vial : 6 meses
Frasco : 8 meses Laminocultivos: 6 meses:
Almacenamiento, encamaras frías a una temperatura entre 4-8
ºC
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3.- PREPARACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
La preparación de los medios de cultivo deshidratados, es en
esencia, una simple manipulación que pone especial atención en la calidad del medio y en la esterilidad del proceso. Si se utiliza un
medio comercializado, las instrucciones de uso vienen detalladas en
cada envase y debe seguirse de forma estricta.
La preparación de los medios de cultivo, consta de tres partes, medios deshidratados (seguir instrucciones del fabricante), material
(agua y esterilización). Respecto al agua, esta debe de ser destilada y
no debe de contener cloro, además debe de presentar una
conductividad adecuada y un contenido iónico tal como indican las especificaciones de agua purificadas de la USP
3.1.- MODELO ESTANDAR DE PREPARACION
En la preparación de los medios de cultivo en un laboratorio de
Microbiología, se siguen los siguientes pasos:
Paso 1, se disuelve la cantidad de medio que aconsejan
los manuales de microbiología del medio que se va a fabricar en el volumen de agua destilada o desionizada
que se nos indique. La disolución se debe hacer
calentando y agitando al mismo tiempo, cuando se trata
de un medio de cultivo sólido o semisólido, hasta que se disuelva por completo. Si el medio de cultivo es líquido
con una fuerte agitación e suficiente.
Paso 2, se esteriliza el medio de cultivo, ya disuelto, en
autoclave. Después de permanecer en el autoclave el tiempo requerido, (1litro de medio necesita 15 minutos
de autoclave a 121ºC, ciclo de esterilización), se abre
lentamente y se deja que se atempere.
Paso 3, los medios se trasladan a una zona estéril, para
irlos enfriando lentamente y añadirles, si procede, los suplementos requeridos para cada medio (sangre,
antibióticos, vitamins,etc).
Paso 4, se dosifica el medio de cultivo, la temperatura
oscila entre 45-50ºC, en el tipo de envase que se vaya a requerir en condiciones totalmente asépticas.
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4.- MEDIOS DE USO COMUN EN EL LABORATORIO.
A continuación se exponen los medios mas utilizados en el
laboratorio de Microbiología con sus características.
4.1.- AGAR SANGRE.
El AS al 5% con base de Tripticasa-Soja es un medio de uso general que permite el crecimiento tanto de microorganismos
exigentes como no exigentes, que incluyen bacterias aerobias y
anaerobias, aunque no es medio de elección para anaerobios. Permite
visualizar reacciones hemolíticas que producen muchas especies bacterianas. Tiene por base una fuente proteica (digeridos trípticos,
digeridos proteicos de soja) con una pequeña cantidad de hidratos de
carbono naturales, cloruro sódico y 5% de sangre.
La aportación de caseína y peptonas de soja al agar de
Tripticasa-soja hace el medio en muy nutritivo por el suministro de
nitrógeno orgánico, particularmente aminoácidos y pépticos de
cadena más larga. La presencia de estas peptonas en el medio
permite el cultivo de una gran variedad de gérmenes aerobios y anaerobios que crecen rápidamente, así como los del género
Cándida. También permite el crecimiento de algunos gérmenes
exigentes como estreptococos, pneumococos, Brucella,
corinebacterias, Erysipelothrix y Pasteurella.
Permite así mismo determinar la capacidad de algunas
bacterias de producir enzimas extracelulares que actúan sobre los
glóbulos rojos, ya sea por lisis completa (hemólisis beta, produce un halo transparente alrededor de la colonia hemolítica), parcial
(hemólisis alfa, coloración verdosa alrededor de la colonia) o por
ausencia de alteración (hemólisis gamma).
La producción de hemolisinas por las bacterias depende de muchos factores ambientales como pH o atmósfera de incubación.
Las muestras que puedan contener Brucella o Neisseria deben
incubarse en atmósfera enriquecida en CO2. Las muestras que
puedan contener Brucella o Neisseria deben incubarse en atmósfera enriquecida en CO2.
4.2.- AGAR CHOCOLATE
Este medio utiliza la misma base que el Agar Sangre.
Antiguamente se añadían los hematíes a la base fundida y se elevaba
la temperatura para lisarlos parcialmente y que soltasen al medio sus
componentes. Esto daba al medio su habitual color pardo chocolate. El Agar chocolate es un medio destinado principalmente al
aislamiento de gonococos y meningococos, pero en el que pueden
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crecer muchos otros microorganismos exigentes. Con un medio
análogo a éste es con el que Thayer y Martin han hecho sus primeros
asilamientos selectivos de gonococos, después de añadir antibióticos.
El Agar chocolate lleva Hemoglobina que aporta al medio otros
factores, en particular el factor V (nicotín-adenina nucleótido)
termosensible, que no se encuentran en el Agar chocolate pueden
aportarse en una mezcla químicamente definida: el PolyViteX. El Agar chocolate con PolyViteX permite el cultivo de la mayor parte de los
gérmenes encontrados en patología humana o veterinaria.
La siembra de líquidos cefalorraquídeos, pus, resiembra de hemocultivos, etc., es favorable en este medio, pero está
particularmente indicado para aislamiento de las Neisserias
patógenas y de los Haemophilus.
4.3.- AGAR MCCONKEY
El agar MacConkey II es una medio selectivo y diferencial para
la detección de organismos coliformes y patógenos entéricos.
Actualmente existen una gran cantidad de medios diseñados para el aislamiento, cultivo e identificación de bacterias entéricas. El artículo
base sobre el agar MacConkey, uno de los primeros que se
desarrollaron, fue publicado en 1905 y contenía una descripción
detallada de su composición y de los diferentes patrones de crecimiento obtenidos. Su composición se ha modificado en
numerosas ocasiones
Actualmente existen una gran cantidad de medios diseñados para el aislamiento, cultivo e identificación de bacterias entéricas. El
artículo base sobre el agar MacConkey, uno de los primeros que se
desarrollaron, fue publicado en 1905 y contenía una descripción detallada de su composición y de los diferentes patrones de
crecimiento
obtenidos. Su composición se ha modificado en numerosas ocasiones.
La fórmula del agar MacConkey II es de 1983 y se diseñó
especialmente para mejorar su capacidad de inhibir el “swarming” de Proteus spp y para alcanzar una definitiva diferenciación entre
fermentadores y no fermentadores de la Lactosa.
Este medio es ligeramente selectivo ya que la concentración de
sales Biliares, que inhiben el crecimiento de los microorganismos
Gram positivos, es baja en relación con otros medios similares. Se
incluye también cristal violeta para inhibir el crecimiento de las
bacterias Gram positivas, especialmente estafilococos y enterococos.
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La diferenciación de organismos entéricos se lleva a cabo con la
combinación de Lactosa con el indicador Rojo neutro. Se producen
colonias rosas a rojas si el aislado es capaz de fermentar la Lactosa y
colonias sin color en caso contrario.
colonias lactosa (-): incoloras (= no hay fermentación de la Lactosa). Salmonella, Shigella, Pseudomonas
colonias lactosa (+): rosa/rojo ladrillo rodeadas de un halo de
sales biliares precipitadas. E. coli (rosa/roja), E. aerogenes
(rosa y mucosa)
4.4.- CALDO TIOGLICOLATO
Es el caldo de enriquecimiento más utilizado en Microbiología.
Contiene 0,075 % de Agar para evitar que las corrientes de
convección transporten el oxígeno de la superficie a toda la masa del
caldo. El ácido tioglicólico actúa como agente reductor, disminuyendo aun más el potencial de óxido-reducción del medio.
Con el agregado de muchos factores nutrientes (Caseína, extractos de Levadura y Carne, Vitaminas, etc.), el medio permite el
desarrollo de la mayor parte de las bacterias patógenas. Hay distintas
fórmulas modificadas en las que se han incluido otros componentes:
un indicador de óxido-reducción (Resazurina), Glucosa, Vitamina K1 y
Hemina.
4.5.- AGAR SCHAEDLER
Schaedler + 5% sangre de cordero es un medio reductor está
particularmente adaptado al cultivo de los gérmenes anaerobios. La presencia de factores de crecimiento tales como el extracto de
levadura, la hemina y la vitamina K3, así como la adición de la sangre
de cordero, permiten el crecimiento de especies exigentes.
Debido al elevado contenido en glucosa de este medio, la intensidad de la hemólisis de los estreptococos puede disminuir.
Sembrar lo más rápidamente posible la muestra a su llegada al laboratorio. Las muestras deben ser transportadas en un medio que
garantice la anaerobiosis (Portagerm tubo o frasco). Después de
sembrar, colocar inmediatamente las placas en la jarra de
anaerobiosis o bien en sistema individual.
4.6.- AGAR KANA-VANCO
Se utiliza para el aislamiento rápido de Bacteroides sp. Contiene
75 µg/ml de Kanamicina, que inhibe a la mayoría de los bacilos
aerobios, facultativos y anaerobios excepto Bacteroides, y 7,5 µg/ml
de Vancomicina, que inhibe a la mayoría de los microorganismos
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grampositivos. Contiene también sangre "lacada" de conejo que
permite la pigmentación precoz de los Bacteroides sp pigmentados.
Muchas cepas de B. assaccharolyticus y B. gingivalis no crecerán en este medio debido a su sensibilidad a la Vancomicina. Las
levaduras y otros microorganismos resistentes a la Kanamicina pueden crecer en este medio, en consecuencia, debe realizarse una
tinción Gram y confirmar la tolerancia al aire de todos los organismos
aislados.
4.7.- AGAR BBE ( Bacteroides Bilis Esculina)
El medio BBE es un medio selectivo para el aislamiento e identificación presuntiva de bacterias del grupo Bacteroides fragilis.
Fue presentado en 1978 por Livingston y sus colaboradores. La
mayor parte de las infecciones humanas producidas por bacterias
anaerobias son debidas a gérmenes pertenecientes al grupo Bacteroides fragilis (B. fragilis, B. thetaiotaomicron, B. ovatus, B.
distasonis y B. vulgatus). Es importante una rápida detección e
identificación de estos microorganismos ya que se ha observado un
incremento de la resistencia a antibióticos mayor que en otros grupos de anaerobios.
El agar BBE permite una inhibición selectiva de microorganismos anaerobios facultativos y de la mayor parte de los
anaerobios Gram negativos debido a que contiene amikacina y oxgall.
La diferenciación del grupo Bacteroides fragilis se basa en la hidrólisis
de la esculina con producción de esculetina y dextrosa. La esculetina reacciona con la sal de hiero presente en el medio (citrato férrico
amónico) produciendo una coloración marrón oscuro-negro rodeando
a las colonias de de las cepas del grupo Bacteroides fragilis.
Contiene Amikacina que inhibe el desarrollo de los microorganismos aerobios, Bilis que inhibe a la mayoría de anaerobios excepto los del
grupo B. fragilis y otras pocas especies, y Esculina que es útil para
la detección de este grupo de microorganismos ya que por lo general
son Esculina positivos.
También pueden crecer en este medio: Fusobacterium
mortiferum, Klebsiella pneumoniae, Enterococcus sp, levaduras
y algunos otros microorganismos.
4.8.- AGAR SALMONELLA-SHIGELLA
Agar altamente selectivo que se utiliza para el aislamiento de
Salmonella y de alguna especies de Shigella. Se diseñó para
diferenciar fermentadores de lactosa de los que no la fermentan, proporcionando buena inhibición de coliformes sin restringir el
crecimiento de otros bacilos Gram-negativos (BGN) patógenos.
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Salmonella y Shigella (y otros no fermentadores de lactosa)
producen colonias transparentes, translúcidas, mientras los pocos
fermentadores de lactosa que se desarrollan dan colonias mucosas,
rojizas.
Bacteria Crecimiento
bacterias
Color
Salmonella enteritidis bueno incolora
Proteus mirabilis aceptable incolora
Shigella flexneri regular incolora
Enterococcus faecalis escaso incolora
Enterobacter
aerogenes
regular crema/rosa
4.9.- AGAR KLIEGER (KIA)
Se recomienda para la identificación de bacilos entéricos
gramnegativos. Se basa en la fermentación de dextrosa y lactosa y
en la producción de ácido sulfhídrico (H2S). Se recomienda para identificar posteriores cultivos de colonia tomados de medios
primarios (Agar McConkey, Agar SS, etc). El rojo de fenol es el
indicador de la producción de ácido y el sultafo ferroso es de la
producción de H2S
Bacteria Crecimiento
bacteriano
Pendiente Base Gas H2S
E .coli Buena Amarilla
(*)
Amarilla Si No
P.vulgaris Buena Rojo (**) Amarilla No Si
S.
eneteritidis
Buena Rojo Amarilla Si Si
(*) Amarillo: ambiente ácido
(**) Rojo: ambiente rojo
4.10.- AGAR SABOREUAD
Es un medio diferencial, recomendado para el cultivo y crecimiento de hongos. Para que ocurra el crecimiento selectivo de
hongos sobre bacterias en las muestras a analizar, este medio tan
solo depende de la reacción ácida (pH 5,6)
Hongo Crecimiento
Candida albicans Bueno
Saccharomyces
cerevisae
Bueno
Apergillus Níger Bueno
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4.11.- AGAR MUELLER-HINTON
Específico para la realización de antibiogramas, existen dos
variantes, Agar Mueller-Hinton/Sangre y Agar Mueller-Hinton/Chocolate , estas variaciones se realizan para obtener la
sensibilidad antimicrobiana de ciertos microorganimos, St.
Pneumoniae y Haemophilus spp. Respectivamente.
4.12.- AGAR THAYER-MARTIN
Es un medio empleado para el crecimiento de Neisseria spp, de
muestras que contengan flora acompañante (bacterias y hongos). Básicamente, el medio es un Agar Chocolate con los factores V y X, al
que se añaden cuatro antibióticos para que actúen de inhibidores
(Vancomicina, Colistina, Anfotericina, Trimetopin)
Bacteria Crecimiento
N. gonorrhoeae Bueno
N. meningitidis Bueno
C.albicans Inhibido
4.13.- AGAR CLED
Utilizado como medio diferencial para el aislamiento,
enumeración e identificación de microorganismos en orina. Al tener
deficiencia electrolítica, este medio inhibe la aglomeración de Proteus
spp al no formar el sobrecrecimiento en lámina. El medio incluye lactosa, para detectar contaminantes coniformes que fermenten la
lactosa, que hace que el medio en torno a la colonia vire a color
amarillo.
Bacteria Crecimiento Color
E. coli Bueno Transparente
P. mirabilis Bueno Transparente
S. aureus Bueno Amarillo
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5.- INCUBACION
A la hora del crecimiento bacteriano, existen una serie de
factores que pueden modificar dicho desarrollo, para la cual debemos de utilizar unos parámetros correctos de incubación para que
posteriormente permita realizar una buena identificación.
5.1.- CONDICIONES ADECUADAS DE HUMEDAD
Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la
atmósfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las células
vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el
mantenimiento de estas condiciones mínimas en las estufas de cultivo a 35-37ºC proporcionando una fuente adecuada de agua que
mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y
evitar así que se deseque el medio.
5.2.- PRESENCIA (O AUSENCIA) DE OXÍGENO Y OTROS GASES
Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmósfera con
tensión de oxígeno normal (aerobios estrictos). Algunas pueden
obtener el oxígeno directamente de variados sustratos (anaerobios facultativos) Pero los microorganismos anaerobios estrictos sólo se
desarrollarán adecuadamente en una atmósfera sin oxígeno
ambiental. En un punto intermedio, los microorganismos
microaerófilos crecen mejor en condiciones atmosféricas parcialmente
anaerobias (tensión de oxígeno muy reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a
cualquiera de las citadas condiciones.
5.3.- HUMEDAD
Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la
atmósfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las células
vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el
mantenimiento de estas condiciones mínimas en las estufas de cultivo a 35-37ºC proporcionando una fuente adecuada de agua que
mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y
evitar así que se deseque el medio.
5.4.- LUZ AMBIENTAL
La mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en la
oscuridad que en presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes
como sería el caso de los microorganismos fotosintéticos.
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5.5.- pH
La concentración de iones hidrógeno es muy importante para el
crecimiento de los microorganismos. La mayoría de ellos se
desarrollan mejor en medios con un pH neutro, aunque los hay que
requieren medios más o menos ácidos. No se debe olvidar que la presencia de ácidos o bases en cantidades que no impiden el
crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar
sus procesos metabólicos normales.
5.6. TEMPERATURA
Los microorganismos mesófilos crecen de forma óptima a
temperaturas entre 15 y 43ºC. Otros como los psicrófilos crecen a
0ºC y los termófilos a 80ºC o incluso a temperaturas superiores (hipertemófilos). En líneas generales, los patógenos humanos crecen
en rangos de temperatura mucho más cortos, alrededor de 37ºC, y
los saprofitos tienen rangos más amplios.
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6.- SIEMBRA E INOCULACION.
La siembra consiste en disponer las bacterias que queremos
estudiar en un medio de cultivo de una forma adecuada, La siembra puede ser: Para aislamiento, para poder llevar a término el estudio de
un microorganismo es condición necesaria aislarle del resto de
microorganismos acompañantes.
Otras técnicas, son pruebas que no permiten aislamento, en este caso se pueden utilizar tantos medios sólidos como líquidos.
6.1.- SIEMBRA EN TUBO EN MEDIO LÍQUIDO
Se puede realizar atendiendo al instrumento con que siembre,
bien asa de siembra, pipeta o hisopo.
Asa de siembra, los tubos, del que se a va a sembrar y el que
contiene el medio, se toman con la mano izquierda, colocando las bocas a la misma altura. Con la mano derecha se toma el
asa de siembra, se esteriliza en la llama en posición vertical
hasta que se ponga incandascente. Se destapan los tubos,
tomando se esterilizan las bocas de los tubos pasándolos por
la llama, se introduce el asa en el material y se introduce en el medio de cultivo hasta el borde de líquido. Por ultimo se
esteriliza el asa y el tubo se agita para una buena
homogenización del inóculo.
Tubo, se puede utilizar cualquier pipeta, pero generalmente se utiliza la pipeta PASTEUR, se utiliza la técnica expuesta
anteriormente, pero esta vez el inóculo el liquido.
Hisopo, el hisopo o torunda debe de ser estéril y viene
protegido dentro de un tubo de plástico
6.2.- SIEMBRA EN TUBO EN MEDIO SÓLIDO
Atendiendo al tipo de medio sólido, nos podemos encontrar que
sean en tubo, placa PETRI
6.2.1.- TUBO.
El agar tiene que estar en posicion inclinada, dejando una
lengüeta en la parte superior y en la parte inferior una parte más ancha. Se pueden realizar dos técnicas, por estría y picadura, en
ambos casos nos dice las características bioquímicas de la bacteria a
estudiar (fermentación de azucares, movilidad, reducción de
metales, etc.)
6.2.2.- PLACA PETRI.
Se realiza en agar, se emplea para aislamiento de bacterias y
para la realización de antibiogramas. En este último caso, previamente se tiene que realizar una dilución de la muestra (con la
bacteria totalmente aislada) y se siembra con el hisopo en el medio
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en el cual se va a realizar el antibiograma, generalmente Mueller-
Hinton, aunque atendiendo al tipo de bacterias podemos emplear
agar sangre (hemólisis) y agar chocolate (factores X y V).