4. medios de cultivo

8/15/2019 4. Medios de Cultivo

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Nutrición y Medios de cultivo

AGM -MGSeptiembre de 2014.

MEDIOS DE CULTIVO

OBJETIVOS

Uso adecuado de la terminología.Relacionar los conceptos químicos con la microbiología.Estudiar las diferentes clasificaciones de los medios decultivo.Relacionar la composición química de los medios decultivo con el tipo nutricional de los microorganismos.Hacer los cálculos químicos correspondientes para laformulación de los medios de cultivo.Describir los cuidados en la preparación de los medios.Determinar los puntos del Control de Calidad.Aplicar los conocimientos adquiridos.

MEDIOS DE CULTIVO

Se pueden emplear parael análisis de:

AlimentosMuestras clínicasProductos farmacéuticosZonas arqueológicasMuestras ambientales(aire, suelo, agua), etc.


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BACTERIAS LEVADURAS MOHOS

ALGASPROTOZOOS

MEDIOS DE CULTIVO

Hay para elcrecimientode losdiversosgruposmicrobianosy seempleanparaestudiarlosen ellaboratorio.

DEFINICIÓN

Los medios de cultivo sonuna mezcla equilibradade nutrientes(compuestos orgánicos /inorgánicas) quepermiten el desarrollo delos microorganismos “ in

vitro ”.

DEFINICIÓN

En concentracionesadecuadas y encondiciones físicasóptimas permiten unbuen crecimiento delos microorganismosCULTIVABLES.


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SUSTANCIAS EMPLEADAS EN LA ELABORACIÓN DE MEDIOS

ELEMENTO COMPUESTO FORMA UTILIZADA EN MEDIOS DECULTIVOCarbono (C) CO 2, compuestos orgánicos Almidón, Glucosa, malato, acetato,

piruvato, peptonas,

Hidrógeno (H) H2O, compuestos orgánicos H 2O, compuestos orgánicosOxígeno (O) H 2O, O2, compuestos

orgánicosH2O, O2, compuestos orgánicos

Nitrógeno (N)NH3, NO3-, NO2-, compuestosorgánicos nitrogenados

N2Inorgánicos: NH4Cl, (NH4)2SO4, KNO3,Orgánicos: aminoácidos basesnitrogenadas, etc.

Fósforo (P) PO43- KH2PO4, Na2HPO4Azufre (S) H2S, S2-, SO42- compuestos

orgánicos azufradosNa 2SO4, Na2S2O3, Na 2S,Compuestos orgánicos azufrados:aa

Potasio (K) K+ KCl, KH2PO4Magnesio (Mg) Mg 2+ MgCl2, MgSO4Sodio (Na) Na + NaClCalcio (Ca) Ca 2+ CaCl 2Hierro (Fe) Fe2+ o Fe3+, o FeS FeCl3, FeSO4

FUNCIÓN DE LOS COMPONENTES DELOS MEDIOS DE CULTIVO

Component Amount Function of componentBeef extract 1.5 g Source of vitamins and other

growth factorsYeast extract 3.0 g Source of vitamins and other

growth factorsPeptone 6.0 Source of amino acids, N, S,

and PGlucose 1.0 g C and energy sourceAgar 15.0 g inert solidifying agentWater 1000mlpH 6.6

MEDIOS DE CULTIVO

Generalmente se presenta en forma depolvo seco, fino o granular.


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MEDIOS DE CULTIVO

Puede presentarse también pre-hidratados o listospara usarse.

CLASIFICACIÓN

Medio sintético oquímicamentedefinido: Lacomposiciónquímica seconoce, tantocualitativamentecomocuantitativamente.

Ej. gNaNO3 1.5K2HPO4 3H2O 0.04CaCl2 2H2O 0.075 Acido cítrico 0.006Na2CO3 0.02 Agua destilada 1000 mL

pH final 7.4

Ej: Agar nutritivoPeptona de carne 5 g

Extracto de carne 3 gAgua destilada 1000 mL

pH 7.4 ± 0.2

CLASIFICACIÓN

Mmmmmmmmmmmmmmmmmmm

Medio natural, complejo

o químicamenteindefinido: Se preparacon componentescomplejos, cuyacomposición nutritivaexacta no se conoce yno se puede controlar.Ej. Medios con Peptonas

¿C, N, P, S, ….?


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SUSTANCIAS EMPLEADOS EN LA FORMULACIÓN DELOS MEDIOS DE CULTIVO

Peptonas:Productos de la

digestión (con ácidos ocon enzimas) dematerial proteico(carne, caseína,gelatina, etc.). Deacuerdo a la proteína yal método de digestiónusado, se obtienendiferentes tipos depeptonas. Ej. Peptonade caseína.

SUSTANCIAS EMPLEADAS EN LA FORMULACIÓN DELOS MEDIOS DE CULTIVO

Extracto de carne:• Digerido acuoso de carne magra de res.• Disponible en pasta o polvo.• Contiene carbohidratos, compuestos denitrógeno orgánico, vitaminas y sales minerales.


Extracto de levadura:Extracto acuoso de células delevadura. Comercialmentedisponible en polvo. Una fuentemuy rica en vitaminas delcomplejo B; también contienenitrógeno orgánico, vitaminas ycompuestos de carbono.


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Elagar es originario de Japón, aunque el nombrecorresponde a una palabra malaya que significa

"alga marina".Japón es el primer productor mundial de agar.


El agar es una mezcla de carbohidratos complejos, que seobtiene a partir de diversas especies de algas rojas de losgéneros: Gelidium y Gracilaria . Estas algas se suelen recolectar enla playa, durante la marea baja, aunque las de mejor calidad sonlas que se obtienen a mayor profundidad.

Químicamentees un polímerosulfatadocompuesto porD-galactosa,3,6-anhidro-L-galactosa yácido D-glucorónico.

AGAR


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AGARCaracterísticas:

No aporta ningún nutriente.

Es el agente gelificante más empleado enlos laboratorios de microbiología.La mayoría de los microorganismos no lo

degrada.No tiene sabor ni aroma y carece de color.Es un hidrocoloide completamente soluble

en agua a 100 ° C.Al contacto con agua fría se hincha y

puede aumentar hasta 20 veces suvolumen.Es un gel termoreversible.Sólidifica entre 35 ° C y 43° C y se funde entre

85° C y 95° C.

Clasificación

ESTADO FÍSICOLíquidos

Semisólidos(agar 0.2 a 0.7 %)

Sólidos(agar 1.5 a 2.0%)

MEDIOS DE CULTIVO LÍQUIDOS


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MEDIOS DE CULTIVO LÍQUIDOS

También conocidos como caldos.Por lo general todos sus

componentes son solubles en agua.Son útiles en:a) la propagación de

microorganismos,b) activación yc) evaluación de ciertas

actividades metabólicas.

Desventaja• No se ven los contaminantes.

MEDIOS DE CULTIVO SEMISÓLIDOS

• Contienen alrededor de0.2 a 0.8 % de agar. Seemplean para observar lamovilidad de algunosmicroorganismos, asícomo la determinacióndel tipo de metabolismo.Ej.SIM, O/F


Algunos de ellos seemplean como medio detransporte.Sirven para llevar losespecímenes quecontienen a losmicroorganismos,del sitio de la toma delproducto hasta ellaboratorio donde va aefectuarse el estudio.


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Estos medios impiden que se altere la

proporción original de la flora microbiana enlos especímenesEj. Stuart

MEDIOS DE CULTIVO SÓLIDOS

Contienen entre 1.5 y 2.0 %de agar, la concentraciónesta en función de sugrado de pureza.Esta cantidad permite queel medio tenga unaconsistencia dura.Estos medios están en:

• cajas Petri o en• tubos (medio inclinado).

CULTIVO EN AGAR INCLINADO(PICO DE FLAUTA)

•Se emplea para conservar microorganismos .


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Los medios sólidos en caja se emplean para:a) obtener crecimiento en la superficie del medio

(colonias).


Los medios sólidos en caja se emplean para:a) obtener crecimiento en la superficie del medio(colonias).


Se emplean para:b) cuantificar microorganismos.


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Se emplean para hacer :c) pruebas de sensibilidad a antibióticos,


Se emplean para hacer:d) muestreo de superficies, entre otros.


Para que los resultados sean satisfactorios, ladureza del gel debe estar entre 300 y 500dinas/cm 2


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Clasificación de los medios

Por su uso:MínimosGeneralesSelectivosDiferencialesDe enriquecimientoEnriquecidosDe transportePerfil bioquímicoDe conservación

Medios mínimos

Contienen los nutrientes mínimo necesariospara la multiplicación microbiana.Se usan para determinar necesidadesnutricionales específicas.Ej. MM (base: NH4Cl, MgSO4, K2HPO4, agua),variar la fuente de carbono.

Son aquellos que permiten el desarrollo delos microorganismos más comunes.Ej. Agar nutritivo.

Medios generales


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Medios de cultivo selectivosSólo permiten el crecimiento de los microorganismosde interés e inhiben el desarrollo de los que no son deinterés para el estudio.

Ejemplos de inhibidores: Sales biliares, colorantes(cristal violeta), alta concentración de NaCl,antibióticos, pH* y temperatura*

Ej. Manitol sal agar Caldo bilisverdebrillante Agar Saboraud *

Buscar en: www.dibico.com[NaCl], 75 g/L

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones

Bilis de buey deshidrat ada 20. 0 Suspender 40 g del polvo deshidratadopor litro de agua destilada. Disolver ydistribuir 10 ml por tubo con campanita deDurham. Preparar además, el medio adoble concentración.Esterilizar en autoclave a 121°C durante15 minutos.

Lactosa 10.0Peptona 10.0

Verde brillante 0.0133

pH final: 7.2 ± 0.2

Ej.

Caldo Bilis Verde Brillante 2% .Este medio está recomendado para el recuento de coliformes totales y fecales,por la técnica del número más probable.

FundamentoEn el medio de cultiv o, la peptona aporta los nutrientes necesarios para eladecuado desarrollo bacteriano, la bilis y el verde brillante son los agentesselectivos que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas y Gram negativasa excepción de coliformes, y l a lactosa es el hidrato de carbono fermentable.Es una propiedad del grupo col iforme, la fermentación de la lactosa conproducción de ácido y gas.

Medios de cultivo diferencialesLa composición de estos sustra tos permite distingui r la

fisiologíaparticular de los microorganismos .La detección esta basada en características de desarrollomicrobiano, aparienc ia en el medio o por la adición dereveladores.

Ej.Agar LD Caseina (+)Agar EMB Agar almidón


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Medio de cultivo selectivo y diferencial

Hay medios de cultivo que pueden ser selectivos ydiferenciales a la vez.

Ej.

Manitol ( + )

37° C

24 h

Manitol (-)

G(+)

rojo defenol

MSA

Medio de cultivo selectivo y diferencial

Hay medios de cultivo que pueden ser selectivos ydiferenciales a la vez.Ej. Agar EMB

Lac ( + )

Lac ( - )

G(-)

Medio selectivo y diferencial

Lac ( + ) Lac ( - )G(-)

Agar Mac Conkey

http://images.google.com.mx/imgres?imgurl=http://212.128.140.24/web/fundacion/universitas/es/sistemas/microacua/Demo1/fotos/placasMaC/Mac1_g.jpg&imgrefurl=http://212.128.140.24/web/fundacion/universitas/es/sistemas/microacua/Demo1/shigella.html&h=436&w=450&sz=50&hl=es&start=14&tbnid=8ADrhe6wIjPUBM:&tbnh=123&tbnw=127&prev=/images%3Fq%3DAgar%2BMac%2BConkey%2B%26gbv%3D2%26svnum%3D10%26hl%3Des%26sa%3DGhttp://images.google.com.mx/imgres?imgurl=http://212.128.140.24/web/fundacion/universitas/es/sistemas/microacua/Demo1/fotos/placasMaC/Mac1_g.jpg&imgrefurl=http://212.128.140.24/web/fundacion/universitas/es/sistemas/microacua/Demo1/shigella.html&h=436&w=450&sz=50&hl=es&start=14&tbnid=8ADrhe6wIjPUBM:&tbnh=123&tbnw=127&prev=/images%3Fq%3DAgar%2BMac%2BConkey%2B%26gbv%3D2%26svnum%3D10%26hl%3Des%26sa%3DGhttp://212.128.140.24/web/fundacion/universitas/es/sistemas/microacua/Demo1/fotos/placasMaC/Mac2_g.jpghttp://images.google.com.mx/imgres?imgurl=http://212.128.140.24/web/fundacion/universitas/es/sistemas/microacua/Demo1/fotos/placasMaC/Mac1_g.jpg&imgrefurl=http://212.128.140.24/web/fundacion/universitas/es/sistemas/microacua/Demo1/shigella.html&h=436&w=450&sz=50&hl=es&start=14&tbnid=8ADrhe6wIjPUBM:&tbnh=123&tbnw=127&prev=/images%3Fq%3DAgar%2BMac%2BConkey%2B%26gbv%3D2%26svnum%3D10%26hl%3Des%26sa%3DG


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Medios de enriquecimientoTienen sustancias que permiten la recuperación demicroorganismos de diversas muestras, favorecen el desarrollo deun tipo microbiano y disminuyen la velocidad de crecimiento dela flora acompañante.

Estos medios son útiles cuando los microorganismos estánsometidos a condiciones de estrés (congelamiento, refrigeracióndesecación, tratamiento químico o físico)

Caldo SelenitoRecuperación de Salmonellaa partir de alimentos.

Ej

Medios de enriquecimiento

Agua alcalina para recuperara V. cholerae de mariscos

Ej

pH=9

Medios enriquecidosSe utilizan para microorganismos que tienengrandes exigencias nutricionales (fastidiosos).Tienen un exceso de nutrientes y/o se le adicionaun extra de suplementos (sangre [NAD y hemina],huevo, vitaminas, entre otros.)Ej.

Sangre de carnero yema de huevo

Agar Baird ParkerAgar sangre


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Medio enriquecido y diferencial

Enriquecido: sangreDiferencial: hemólisis (alfa, beta y/o gamma)

Agar sangre

Medios de transporte

Son sustratos que se emplean para trasladar las muestras sinalterar la viabilidad y la proporción de microorganismos. Tienenconsistencia semisólida, con amortiguador de pH y estánreducidos en nutrientes para preservar la viabilidad de losmicroorganismos por varias horas.

Para pruebas bioquímicas

Son medios de cultivo con sustratos específicos para poner enevidencia la actividad enzimática o v ía metabólica de unmicroorganismo puro. Para visualizar su perfil bioquímico sesuele emplear reveladores y/o indicadores .

H2S citritasa


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Para pruebas bioquímicas

Utilizados en la identificación del fenotipobioquímico del microorganismo.

Medios de conservación

Algunos medios de cultivo son empleados para la conservacióntemporal de microorganismos, como son:

• Medio de agar inclinado a 4ºC (hasta 2 semanas), con sello deglicerol estéril a 4ºC (varios meses dependiendo delmicroorganismo).

Medios de conservación

Se usan viales con microorganismos y sealmacenan a temperaturas inferiores a cero gradoscentígrados.La leche descremada se emplea en la liofilización,conserva a los microorganismos por mas de diezaños.


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¡¡Necesitamos un descanso!!

• El medio está en función delmicroorganismo (s) en estudio y de lacomposición química de la célula, que esreflejo de los nutrientes que necesita.

• Ver el procedimiento.• Revisar si es un medio para hidratar o para

preparar por componentes.

FACTORES QUE INTERVIENENEN LA PREPARACIÓN

Usar material de vidrio limpio y seco.• Emplear agua destilada.• Ajustar el pH.• Contar con equipo adecuado.• Distribuir el medio en recipientes adecuados• CONTROL DE CALIDAD

FACTORES QUE INTERVIENENEN LA PREPARACIÓN


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PREPARACIÓN EN DIFERENTES AMBIENTES

DURANTE LA PREPARACIÓN ISeleccionar materias primas: medios de cultivodeshidratados, pureza de reactivos ysuplementos.Registrar todos los detalles de la preparación(peso, volumen, fecha, operador, etc.)Utilizar agua destilada de calidad apropiada.Verificar la calidad del agua empleada (cargabacteriana, presencia de inhibidores, etc.)Seleccionar material adecuado: matraces,tubos, cajas.Usar matraces de por lo menos 2 veces másdel volumen del medio a preparar

DURANTE LA PREPARACIÓN II

Leer las instrucciones del marbete.Pesar exactamente la cantidad solicitada.Uso de probetas adecuadas.Hidratar antes de disolver.Ajustar y registrar el pH (utilizar instrumentaladecuado y calibrado)Disolver completamente el medio, aplicarcalor si contiene agar.Agitar el medio mientras se disuelve.Tener cuidado de no sobrecalentar elmedio.Esterilizar***


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CONTROL DE MATERIAS PRIMAS

El agua es la materia prima másimportante.

Parámetros que deben controlarse:Iones Cu 2+Conductividad= 15 mSpH= ligeramente ácida (no menora 5.5)Cajas petri (


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SUSTANCIAS ADICIONALESAlgunos medios deben tener, además de losmacroelementos, microelementos y agua; lassiguientes sustancias, algunas de el las se adicionandespués de esterilizar.

Ejms.• Agentes selectivos: cloruro de sodio en altasconcentraciones.• Factores de crecimiento: aa, vitaminas.• Ácidos orgánicos : ácido tartarico.• Colorantes: eosina, rojo neutro.• Inhibidores: Antibióticos.• Indicadores de pH: azul de bromotimol.• Agentes reductores : tioglicolato• Indicadores de oxido-reducción: resarzurina.• Agentes solidificantes: Agar, sangre, huevo y/o

gelatina.

[NaCl]

MICROSISTEMAS


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Sistema Petrifilm™

Son medios de cultivo deshidratados sobre películas plásticas de tamaño ygrosor similar al de una tarjeta de crédito. El medio deshidratado contieneun componente que permite la gelificación en frio y colorantes para latincion de las colonias desarrolladas,facilitando su identificación y recuento.

La principal ventaja del metodo Petrifilm consiste en que no requiere lapreparación previa de los medios de cultivo, lo que reduce costos ytiempo de preparación.

http://www.3m.com/cms/mx/es/0-253/kRecrFS/view.html

Medios cromogénicos y fluorogénicos


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Medios cromogénicos y fluorogénicos

Mezcla de nutrientes (carbohidratos, peptonas,extracto de levadura, etc) y sustratoscromogénicos y/o fluorogénicos que permiten ladetección rápida de microorganismos (24 a 48 h).Los sustratos cromogénicos son derivados del fenol(ONP) o del indol (5-bromo-4 cloro-3-indoxilo).

OH

N+

O-

O

NH

Br

ClOH

Los sustratos fluorogénicos son derivadosde la cumarina (4-metilumbeliferona)

O

CH 3

OOH

Medios de cultivo cromogénicos yfluorogénicos

Los sustratos cromogénicos o fluorogénicos estan unidos

a un azúcar o aminoácido específico.Cuando son hidrolizados por enzimas presentes en lasbacterias, se genera un color o fluorescencia.

O

O

OH

OH

OH

OH

N+

O-

O


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Medios de cultivo cromogénicosy fluorogénicos

Aplicaciones

Áreas: Clínica, Alimentos, Farmacia,Ecología, etc.

Cuantificación o búsqueda debacterias, hongos y levaduras.

Búsqueda de algunos microorganismospatógenos.


VentajasSensibles (1 célula).Específicos.Rápidos.No se requierenpruebas bioquímicasadicionalesUtilizan poco materialDetectan variosmicroorganismos enuna sola placa.

DesventajasCostoSolubilidad delcompuestofluorescente


Ventajas

Desventajas


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ESTUDIODE LOS

MICROORGANISMOS

Identificación Distribuidos en lanaturaleza

Reproducción Relaciones conotros seres

FisiologíaEfectos

benéficos y/operjudiciales

MetabolismoAlteraciones físicas

y químicas queprovocan en su

medio

MEDIO DE CULTIVO

BIBLIOGRAFÍA

**CONTROL DE CALIDADNORMATIVIDAD:NOM-065-SSA1-1993 AGM/ agosto /2014.

Ejercicio


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LactosaPeptona de gelatinaPeptona especialCristal violetasales biliaresrojo neutroNaClaguaagar

Ejercicio

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