Medios de Cultivo, Siembra y Aislamiento, Técnica

Aséptica

CURSO: Laboratorio de Microbiología.

DOCENTE: Blgo. Mblgo. Carlos Azañero Díaz

GRUPO: “C”

ALUMNA: Aburto Rodríguez Ruddy

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

FACULTAD DE INGENIERÍAE.A.P. INGENIERÍA

2012

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I. INTRODUCCIÓN:

En la naturaleza, los microorganismos viven casi siempre en mezclas. No obstante antes de poder determinar la mayor parte de las características de un microorganismo en particular, este debe ser aislado en un cultivo puro (cultivo de un solo tipo de microorganismo).el procedimiento general consiste en usar un medio de cultivo (nutrientes apropiados) y condiciones de incubación (ambientales) que estimulen el crecimiento del organismo que se desea y que reduzca o afecten el crecimiento de otros organismos. Una vez que el organismo deseado ha aumentado en cantidad con respecto a otros, se purifica de modo que el cultivo contenga organismos del tipo deseado.

Los microorganismos se cultivan en agua, a la que se han añadido los nutrientes apropiados, dando una solución acuosa que se denomina medio de cultivo. Los nutrientes existentes en el medio de cultivo dan a la célula microbiana todos los ingredientes requeridos para que se produzca más células semejantes a ella misma. Además de las fuentes de energía, que pueden ser sustancias orgánicas e inorgánicas, o luz, el medio de cultivo debe tener fuentes de carbono, nitrógeno y otros macro y micronutrientes importantes para el desarrollo de los microorganismos.

Para el cultivo, aislamiento e identificación de un microorganismo en el laboratorio, es necesario realizar técnicas de siembra de la muestra en respectivo medio de cultivo. Estas técnicas varían según el estado físico del medio o las necesidades gaseosas de los microorganismos (aerobios, anaerobios, etc.). Una condición básica de la siembra es que debe realizarse bajo rigurosas reglas de asepsia, evitando el crecimiento de contaminantes.

II. OBJETIVO:

Describir los pasos en la preparación de medios de cultivo, indicando los componentes básicos necesarios en su formulación.

Obtener colonias de bacterias en cultivo puro mediante la inoculación (siembra por estría en superficie).

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Aplicar las técnicas de trabajo aséptico y de manipulación de microorganismos.

III. FUNDAMENTO TEÓRICO:

MEDIO DE CULTIVO

Conjunto de sustancias esenciales para el crecimiento y desarrollo microbiano.

Un medio de cultivo se refiere a aquel lugar en el espacio en el que se reúnen las características necesarias para el crecimiento y desarrollo, en este caso microbiano. Las sustancias necesarias para el crecimiento de los microorganismos pueden ser proporcionadas por un sistema vivo (in vitro).

Los medios de cultivo se pueden clasificar de la siguiente forma:

Medios Solidos: contienen aproximadamente 1.5% o más de agar (el cual les confiere la característica de sólidos) se utilizan principalmente para el crecimiento y aislamiento de bacterias.

Medios Líquidos: no contienen Agar, se conocen también como caldos, se utilizan para el crecimiento de inóculos puros.

Medios Semisólidos: aunque en la naturaleza no existe el estado físico de semisólido, en bacteriología se usa para definir a aquellos medios que contiene agar pero en proporción menos de 1.5% principalmente para estudios de movilidad.

Medios para Crecimiento: son los que contienen nutrientes que permiten el desarrollo de la mayoría de los microorganismos no exigentes, con su velocidad de crecimiento normal, y sin ofrecer a ninguna ventaja especial. Eje. Agar nutritivo.

Medios Enriquecidos: son los medios a los que se adiciona algunos componentes especiales con lo cual se busca solo el desarrollo de microorganismos exigentes.

De acuerdo a su estado físico

De acuerdo a sus propiedades sobre el crecimiento y desarrollo microbiano

Solido para el crecimientoLíquido enriquecidos

Semisólidosselectivos, indicadores o diferenciales

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Medios Selectivos: Son aquellos a los que se les incorpora un inhibidor del desarrollo bacteriano con lo cual busca solo el desarrollo de un tipo especial de bacterias.

Medios Indicadores: Son todos aquellos en las cuales se busca valorar características metabólicas especiales de cada especie de bacteria.

MÉTODO DE INOCULACIÓN O DE SIEMBRA

Inoculo:

Carga de microorganismos presentes un sitio y momento determinado.

Una vez conociendo los medios de cultivo, hay que conocer los métodos de inoculación o de siembra, los cuales estarán ligados al objeto de la inoculación.

1. Método por estriación o siembra por estría en superficie.

Toma de muestras:

2. Técnica de siembra para aislamiento:

Estría múltiple:

Con un asa de siembra, previamente esterilizada, se toma una muestra del cultivo de microorganismos y se extiende sobre un área pequeña de la superficie de la placa con agar nutritivo, en forma de estrías muy juntas, pero sin hacer presión para no dañar el agar.

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Se flamea el asa, se enfría y después de rozar la siembra realizada previamente, se extiende de nuevo por otra zona de la placa haciendo nuevas estrías. Este proceso se repite sucesivamente, flameando y enfriando el asa al comienzo de las sucesivas siembras en estría. Se lleva la placa a incubar, a la temperatura adecuada, siempre en posición invertida.

Mediante esta técnica se obtienen colonias aisladas a partir de una muestra que contenga un elevado número de gérmenes.

Ejemplo de estría múltiple crecida

3. Técnica de los cuatro cuadrantes:

Se divide la placa en cuatro cuadrantes. Se toma el inoculo y se siembra consecutivamente en 1-2-3-4. Incubar. En el cuarto cuadrante, al menos, obtendríamos colonias aisladas.

4. Siembra por agotamiento (o en superficie):

Se realiza una descarga y se realiza estría por toda la placa.

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IV. MATERIALES:

Para la práctica de laboratorio con respecto a los medios de cultivo utilizamos los siguientes materiales:

Material biológico:Cultivo puro E. coli (A)Cultivo puro de Bacillus subtilis (B)Suspensión bacteriana mixta (A+B)

Material del laboratorio:Frascos de agar, extracto de carne, peptona, NaCl, y agar MacConkey.Placas Petri con agar nutritivo Placas con agar OGYMatraz Erlenmeyer con 20 ml de SSF estérilEstufa o incubadoraAsa bacteriológica calibrada y en codo

V. METODOLOGÍA:

TECNICA DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO

5.1 Siembra por estría en superficie en agar nutritivo:

Se marcó la base de la placas Petri donde se depositó el inoculo y donde comenzaran las estrías para luego esterilizar el asa calibrada por flameado en el mechero y dejar enfriar

Se tomó el asa de la suspensión bacteriana mixta y para luego empiezar a sembrar el agrar nutritivo por la tecnica de los cuatro cuadrantes.

Se dejar incubar por 10horas a 37ºC.

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5.2 Siembra por suspensión:

VI. RESULTADOS:

6. Siembra por estría en superficie y suspensión en agar nutritivo:

Se esterilizó el asa calibrad por flameado en el mechero y se dejó enfriar, tomamos un amuestra del cultivo puro bacteriano(a) en frascos con agar nutritivo.

Se cogió un tubo conteniendo el medio líquido, se destapó el medio y flameó a la llama del mechero ligeramente, estando cerca del mechero inclinar el tubo y sembrar la muestra disolviendo en las paredes del tubo el inoculo, y agitar ligeramente.

Se esterilizó el asa de siembra y repetimos elprocedimiento anterior pero ahora utilizando el cultivo puro bacteriano (b), luego rotulamos los tubos e se puso a incubar a 37°c por 10horas.

BA

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VII. DISCUSIÓN:

Según Brook – Biología de los Microorganismos:

Pág.: 162

Crecimiento de aerobios, anaerobios, facultativos, microaerófilos y anaerobios aerotolerantes, puesto de manifiesto por la posición de microcolonias (representada como puntos negros) en tubos con medio de cultivos semisólido con tioglicolato. Se añade a los cultivos una pequeña cantidad de agar para evitar perturbaciones en el medio líquido y como indicador un colorante redox, resazurina, que es rosa cuando se oxida e incoloro cuando se reduce. (a) El oxígeno penetra sólo una corta distancia en el tubo, de modo que los aerobios estrictos solo crecen en la superficie. (b) Los aerobios, como son sensibles al oxígeno, solo crecen lejos de la superficie. (c) Los aerobios facultativos son capaces de crecer tanto en presencia como en ausencia de oxígeno y crecen por todo el tubo. (d) Los microaerófilos crecen apartándose de la son más óxica. (e) Los anaerobios aerotolerantes crecen por todo el tubo. No obstante, el crecimiento no es mejor cerca de la superficie porque estos organismos solo son fermentadores. Por lo tanto se pudo identificar que en la técnica por suspensión para el tubo A (cultivo puro de Bacillus subtilis), tiene el tipo de crecimiento en el cual el oxígeno penetra sólo una corta distancia en el tubo; sin embargo en el tubo B (cultivo puro de Escherichia coli), se observó que esta bacteria es anaerobia aerotolerante puesto que crece por todo el tubo.

Según Brook – Biología de los Microorganismos:

Pág.: 107-110

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Los centenares de compuestos químicos presentes en una célula viva se forman a partir de precursores llamados nutrientes. Los elementos que se necesitan en grandes cantidades se denominan macronutrientes, mientras que los metales y los compuestos orgánicos que se requieren en pequeñas cantidades se denominan macronutrientes y factores de crecimiento, respectivamente.Los medios de cultivo satisfacen las necesidades nutritivas de los microorganismos y pueden ser químicamente definidos o complejos (no definidos). En el laboratorio, los microorganismos se pueden cultivar en medios de cultivo que contienen los nutrientes necesarios. La obtención de cultivos axénicos o puros requieren la puesta en práctica de técnicas asépticas.

Según Encarta 2009:

Los métodos utilizados como es el caso de la técnica de siembra por estría en superficie y la siembra por suspensión son muy estudiados no solo en el laboratorio sino también por científicos y médicos que llevan a cabo cultivos bacterianos y estudian sus características con el fin de adquirir conocimientos respecto a las enfermedades bacterianas y su prevención. La bacteria Escherichia coli en circunstancias normales es inofensiva y habita en el intestino humano favoreciendo la digestión, si bien pueden convertirse en patógenas y producir infecciones del tracto urinario.

Según Brook – Biología de los Microorganismos:

Pág.: 109

Las técnicas de trabajo aséptico en el laboratorio, es necesaria para evitar la contaminación durante la manipulación de los microorganismos y de los medios de cultivos estériles. Su aprendizaje es esencial para tener éxito en el laboratorio de microbiología y presenta uno de los primeros métodos que tiene que dominar el microbiólogo. El problema más común es la contaminación ambiental a través del aire, ya que este siempre contiene polvo en suspensión que generalmente lleva una comunidad de microorganismos. Cuando las placas o tubos se abren deben manejarse de tal modo que los contaminantes del aire no penetren.

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VIII. CONCLUSIÓN:

La morfología de una colonia de bacterias en crecimiento en un medio nutritivo determinado es importante para determinar de qué tipo de bacteria se trata, pero no es infalible y se deben hacer otras pruebas bioquímicas.

Mediante la técnica de siembra por estría en superficie, se obtienen colonias aisladas.

En la técnica por suspensión el cual se realizó en dos tubos de ensayo; observamos que después de 10 horas de la siembra indica que sí se obtuvo crecimiento microbiano. Una de las cuales fue aerobia (A) y otra aerotolerante (B).

Las técnicas de trabajo aséptico en el laboratorio, es necesaria para evitar la contaminación durante la manipulación de los microorganismos y de los medios de cultivos estériles. Si se practica correctamente las técnicas de trabajo aséptico evitaremos que se produzca algún accidente en el cual nuestro organismo podría resultar seriamente afectado (con presencia de microbios).

IX. CUESTIONARIO:

1. ¿Qué es un medio de cultivo?

Satisfacen las necesidades nutritivas de los microorganismos y pueden ser químicamente definidos o complejos.

Para el cultivo correcto de una bacteria es necesario conocer sus exigencias nutritivas.

Medio sintético o definido

Son medios en que se conocen todos los componentes.

Los medios definidos se emplean ampliamente en investigación dado que con frecuencia se requiere conocer qué está metabolizando el microorganismo.

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Medios complejos

Son medios suficientemente ricos para satisfacer las necesidades nutricionales de diversos microorganismos.

De gran utilidad cuando se desconoce los requerimientos nutricionales de un microorganismo en particular.

2.¿Con que fin se realiza la siembra de estriación?

Para observar el crecimiento de las bacterias a través de colonias.

3.¿Qué se entiende por cultivo puro y cultivo mixto?

Cultivo puro: representa las condiciones artificiales para el desarrollo de las bacterias y otros microorganismos y las condiciones impuestas a los microorganismos mediante el manejo del laboratorio.

Para determinar las características de especies concretas de microorganismos.

El cultivo mixto de laboratorio es aquél en el que se contienen dos o más cepas de organismos.

4.¿Por qué se incuba a 37° la mayoría de cultivos?

Porque es la temperatura más propicia para que las bacterias crezcan y se dividan más rápido y así formar colonias en un tiempo máximo de 24 horas, por ese se les pone fuente nutritiva a partir del agar, y así poder trabajar con ellas.

5.En la figura siguiente describa los pasos de la técnica aséptica o transferencia aséptica:

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X. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS:

Broock – Biología de los Microorganismos, 10 décima edición, página 162, capitulo 6 - Crecimiento Microbiano.

"Escherichia coli." Microsoft® Student 2009 [DVD]. Microsoft Corporation, 2008.

Wolin, m. tratado de microbiología, 20ed, editorial interamericana, México (1973) p.p. 901

http://www.doschivos.com/display.asp?id=45&f=13547

http://www.higiene.edu.uy/cefa/2008/morfologiayestructurabacteriana.pdf

http://imb.usal.es/practicas2/p2/practicas2.pdf

a) Se calienta el asa de siembra hasta incandescencia y se deja enfriar

b) El tubo se destapac) Se pasa el extremo del tubo por la llamad) Se extrae la muestra con el asa esterilizadae) Se vuelve a flamear la boca del tubo y la

muestra se deposita en un medio estérilf) Se vuelve a tapar el tubo y se calienta el asa

al final.