7.- MICROSCOPIO

El Microscopio óptico compuesto

    

 PARTES DE UN MICROSCOPIO ÓPTICO

Sistema óptico o OCULAR: Lente situada cerca del ojo del observador. Amplía la imagen

del objetivo. o OBJETIVO: Lente situada cerca de la preparación. Amplía la imagen de

ésta. o CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la

preparación. o DIAFRAGMA: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador. o FOCO: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador.

Sistema mecánico o SOPORTE: Mantiene la parte óptica. Tiene dos partes: el pie o base y el

brazo. o PLATINA: Lugar donde se deposita la preparación. o CABEZAL: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser

monocular, binocular.o REVÓLVER: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar,

cambiar los objetivos. o TORNILLOS DE ENFOQUE: Macrométrico que aproxima el enfoque y

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micrométrico que consigue el enfoque correcto.

        MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO

1. Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platina completamente. Si el microscopio se recogió correctamente en el uso anterior, ya debería estar en esas condiciones.

2. Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas. 3. Comenzar la observación con el objetivo de 4x (ya está en posición) o colocar el

de 10 aumentos (10x) si la preparación es de bacterias. 4. Para realizar el enfoque:

a. Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando el tornillo macrométrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a través del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparación pudiéndose dañar alguno de ellos o ambos.

b. Mirando, ahora sí, a través de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparación con el macrométrico y, cuando se observe algo nítida la muestra, girar el micrométrico hasta obtener un enfoque fino.

Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micrométrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdió por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operación desde el paso 3. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparación y por ello es fácil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparación si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersión si se observa una preparación que ya se enfocó con el objetivo de inmersión. Empleo del objetivo de inmersión:

a. Bajar totalmente la platina. b. Subir totalmente el condensador para ver claramente el círculo de luz que

nos indica la zona que se va a visualizar y donde habrá que echar el aceite. c. Girar el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo a medio camino

entre éste y el de x40. d. Colocar una gota mínima de aceite de inmersión sobre el círculo de luz. e. Terminar de girar suavemente el revólver hasta la posición del objetivo de

inmersión. f. Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la

lente toca la gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la lente.

g. Enfocar cuidadosamente con el micrométrico. La distancia de trabajo entre el objetivo de inmersión y la preparación es mínima, aun menor que con el de 40x por lo que el riesgo de accidente es muy grande.

h. Una vez se haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación, ya no se puede volver a usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se mancharía de aceite. Por tanto, si desea enfocar otro campo, hay que bajar la platina y repetir la operación desde el paso 3.

i. Una vez finalizada la observación de la preparación se baja la platina y se coloca el objetivo de menor aumento girando el revólver. En este momento ya se puede retirar la preparación de la platina. Nunca se debe

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retirar con el objetivo de inmersión en posición de observación. j. Limpiar el objetivo de inmersión con cuidado empleando un papel

especial para óptica. Comprobar también que el objetivo 40x está perfectamente limpio.

     MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES

1. Al finalizar el trabajo, hay que dejar puesto el objetivo de menor aumento en posición de observación, asegurarse de que la parte mecánica de la platina no sobresale del borde de la misma y dejarlo cubierto con su funda.

2. Cuando no se está utilizando el microscopio, hay que mantenerlo cubierto con su funda para evitar que se ensucien y dañen las lentes. Si no se va a usar de forma prolongada, se debe guardar en su caja dentro de un armario para protegerlo del polvo.

3. Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Si se ensucian, limpiarlas muy suavemente con un papel de filtro o, mejor, con un papel de óptica.

4. No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si no se está utilizando el microscopio.

5. Después de utilizar el objetivo de inmersión, hay que limpiar el aceite que queda en el objetivo con pañuelos especiales para óptica o con papel de filtro (menos recomendable). En cualquier caso se pasará el papel por la lente en un solo sentido y con suavidad. Si el aceite ha llegado a secarse y pegarse en el objetivo, hay que limpiarlo con una mezcla de alcohol-acetona (7:3) o xilol. No hay que abusar de este tipo de limpieza, porque si se aplican estos disolventes en exceso se pueden dañar las lentes y su sujeción.

6. No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio (macrométrico, micrométrico, platina, revólver y condensador).

7. El cambio de objetivo se hace girando el revólver y dirigiendo siempre la mirada a la preparación para prevenir el roce de la lente con la muestra. No cambiar nunca de objetivo agarrándolo por el tubo del mismo ni hacerlo mientras se está observando a través del ocular.

8. Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si se derrama sobre ella algún líquido, secarlo con un paño. Si se mancha de aceite, limpiarla con un paño humedecido en xilol.

9. Es conveniente limpiar y revisar siempre los microscopios al finalizar la sesión práctica y, al acabar el curso, encargar a un técnico un ajuste y revisión general de los mismos.

UTILIZACIÓN DEL MICROSCOPIO

1. Colocar una preparación .

2. Abrir el diafragma de la fuente de luz al máximo.

3. Abrir el diafragma del condensador al máximo y llevar el condensador al máximo de su

trayectoria.

4. Colocar el objetivo de menor aumento ej. 10x.

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5. Prender la fuente de luz y ajustarla a una intensidad confortable.

6. Ajustar los binoculares a la distancia interpupilar y ajustar el foco de cada ocular si el

microscopio lo permite.

7. Enfocar la preparación.

8. Gradualmente cerrar el diafragma de la fuente de luz hasta ver una imagen poligonal.

9. Bajar el condensador hasta que los bordes del polígono se vean nítidos.

10. Ajustar el enfoque.

11. Si la imagen poligonal no está en el centro, centrarla utilizando los tornillos del

condensador. 12. Abrir el diafragma de la fuente de luz hasta que la poligonal apenas salga del

campo, no tocarlo mas. No tocar mas la altura del condensador.

13. Elegir el contraste óptimo ajustando el diafragma del condensador.

14. Verificar la iluminación quitando los oculares y mirando por el tubo hacia los objetivos

ajustar el diafragma a 2/3 abierto. (2/3 del campo iluminado).

15. Para cambiar el contraste regular el diafragma del condensador y para ajustar el brillo

modificar la intensidad de la fuente luminosa o colocar filtros. No cambiar la distancia del

condensador.

Al cambiar de objetivo solo modificar el diafragma de la fuente de luz y el diafragma del

condensador a la apertura del objetivo.

MANTENIMIENTO DEL MICROSCOPIO DIARIO (cada vez que se usa)

Limpiar el aceite de inmersión de lentes y otras superficies del microscopio. El aceite de

inmersión debe conservarse cerrado.

Apagar la fuente de luz del microscopio

Cubrir el microscopio con su funda.

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8.- Preparados en fresco

I. GOTA: SE REALIZAN A TRAVÉS DE SUSPENSIONES DE CÉLULAS O MICROORGANISMOS

Materiales:

Porta y cubreGotero(pipeta)Muestras de agua estancadas.Microscopio

Procedimiento:

1) Se prepara el microscopio para el uso respectivo.2) Con el gotero se saca la muestra.3) Se le coloca en el porta objetos, una gota.4) Luego se le coloca el cubre.5) Y se procede a la observación.6) Primero a 4x, 10x, 40x

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Se coloca en el porta

El listado de los protozoarios esta al final de la técnica de la gota pendiente

II. GOTA PENDIENTE: SON AQUELLAS QUE SE REALIZAN POR LA ACCIÓN DE LA TENCIÓN SUPERFICIAL QUE TIENE SUSPENSIONES DE LOS MICROORGANISMOS.

Materiales:

Laminas escavadasAgua estancada MicroscopioPipeta (o gotero)Porta y cubre objetos

Procedimiento:

1) al no encontrar laminas escavadas, realizamos una artesanalmente, usando cera de vela y con ayuda de un sacabocados.

2) Al no encontrar una lamina excavada, realizamos la misma operación que en la anterior muestra:

A) Se coloca una gota en el cubre objetos que previamente a sido untada un poco con vaselina cruda o cera.

b) Se le coloca en forma invertida en el porta objetos que artesanalmente fabricamos.

c) Procedemos al observación

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Al colocar el porta el liquido echado se extiende por todo el cubre

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Se echa cera de vela

Se le hace un hueco con el saca bocados

Se coloco vaselina después se coloco la gota de la muestra

Vista de horizonte

Se coloca el cubre con la gota de la muestra

EJEMPLOS DE PROTOZOARIOS OBSERVADOS A GOTA Y GOTA PENDIENTE

nombre Foto Espirilos

Bacilos

cianobacteria colonial

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Halteria  (20-50 µm)

Coleps  (50-110 µm)

(a) Loxodes  (125-600 µm)

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Tetrahymena  (<50 µm)

(b) Paramaecium caudatum (Tøffeldyr)  (100-200 µm)

Vorticella  (20-150 µm uden stilk)

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Stylonichia (?)  (50-300 µm)

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(c) Vaginicola  (50-200 µm)

(d) Prorodon(50-300µm)

(e) Spirostomum ambiguum  (1000-3000 µm)

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(f) Spirostomum teres  (300-600 µm)

(g) Stentor coeruleus  (1000-3000 µm)

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(h) Stentor polymorpha(1000-2000 µm)

(i)

(j) Cothurnia (?)( µm)

“La diferencia de la gota y gota pendiente es que en la gota es menor tiempo de observación y en la gota pendiente se puede observar”

III. SCOTCH TAPE: PERMITE MUESTREAR ENDOPARÁSITOS DE ANIMALES, PLANTAS. PARA EXTRAER HONGOS

Materiales:

Porta objetosCinta scotch Muestra de tomate mohoMicroscopio

Procedimiento:

1) Sacar la muestra del tomate con la cinta scotch 2) Colocar la muestra en el porta, extraida por la cinta scotch3) Proceder a la observación.;

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Naranja tomate

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Al microscopio

CITOLOGIA Y MORFOLOGIA DE HONGOS

Sección I.02 INTRODUCCIÓNLos hongos constituyen un grupo muy heterogéneo de organismos eucariotas, heterótrofos no fotosintéticos y con pared celular. Basándose en la apariencia macroscópica de la colonia se pueden diferenciar dos tipos de hongos: si producen colonias opacas, cremosas o pastosas se denominan levaduras; si producen crecimientos aéreos, velludos, algodonosos o pulverulentos se llaman hongos filamentosos o mohos.

Existe un tercer grupo que se desarrolla como levaduras cuando crece a 37ºC y como hongo filamentoso a 25ºC. Este fenómeno se denomina dimorfismo.

El conjunto de elementos que constituyen un hongo se denomina talo. El talo puede ser unicelular (en levaduras). En hongos filamentosos el talo incluye una parte vegetativa, el micelio, compuesto por hifas y una parte reproductora.

Las hifas son tubos que contienen núcleos y citoplasma. Pueden presentar septos (micelio tabicado) (fig.1) o no (micelio no tabicado) (fig.2).

Los septos presentan poros que conectan los distintos segmentos de la hifa. A veces las levaduras constituyen cadenas de células denominadas pseudomicelio (fig.3).

Pueden existir elementos de resistencia como los esclerotes que son masas endurecidas de micelio presentes en algunos géneros de Ascomycetes y Basidiomycetes. 

Los hongos se pueden reproducir asexuada y sexualmente. En algunas especies coexisten las dos formas de reproducción en el mismo organismo que se denomina entonces holomorfo. El holomorfo tiene a la vez una forma de multiplicación asexuada, el anamorfo o estado imperfecto y una sexuada, el teleomorfo o estado perfecto.

La reproducción asexuada puede ocurrir por propagación vegetativa a partir de fragmentos de micelio, o por formación de esporas de distinto tipo (conidios, esporangiosporas, etc.).

La reproducción sexuada se caracteriza por la unión de dos núcleos que dan lugar a esporas sexuadas (zigosporas, ascosporas, etc.). 

Los hongos pueden ser homotálicos si poseen en el mismo micelio núcleos complementarios que pueden conjugarse o heterotálicos cuando requieren núcleos provenientes de micelios diferentes.

En general la reproducción asexuada es más importante para la propagación de la especie. En muchos hongos la reproducción sexuada se da solo una vez al año. Hay un grupo de hongos a los que no se les conoce reproducción sexuada. Existe otro grupo que no forma esporas de ningún tipo y solo se reproduce por fragmentación del micelio.

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Fig. 1Micelio no tabicado Fig. 3

Pseudomicelio Fig. 2

Micelio tabicado

Fig. 5

Fig. 6Zygote

Fig. 4Clamidosporas

Fig. 9Cleistotecio

Fig. 7Gemación

Fig. 8Ascos desnudos

FIGURAS DE HONGOS

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Fig. 11Apotecio

Fig. 10Peritecio

Fig. 13Penicillium

Fig. 12Aureobasidium

Fig. 14Botrytis

Fig. 15Aspergillus

Fig. 16Geotrichum

Fig. 17Alternaria

Fig. 19Phoma

Fig. 18Fusarium

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IV. SQUASH

MATERIALES:

Raíz de las habas

cubre y porta objetos.

Microscopio

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aceite de inmersión

PROCEDIMIENTO:

1. Realizar la identificación de los nódulos.2. Después de haber ubicado la identificación se procede a la colecta.3. Realizar el lavado de los nódulos4. Proceder al chancado o aplastado al nódulo de la raíz.5. Bueno se observa que hay presencia de liquido lechosos y partículas pequeñas se

desecha las partículas y los demás se utiliza6. Primero se hace la extensión7. Segundo la fijación a fuego a mechero. 8. Tercero la coloración:

i) Coloración simple:ii) Coloración compuesta:

9. Cuarto: después de ese procedimiento observar al microscopio

9.- preparados en fresco

I. Coloración simple: Se denomina así, porque solo se utiliza un colorante, generalmente básico.Con este tipo de coloración no se pretende diferenciar microorganismos o estructuras celulares.Las técnicas de coloración simple pueden ser positivas cuando el colorante es fijado por las células apareciendo los microorganismos de color oscuro o coloreado sobre un fondo luminoso o claro, y son negativas cuando los microorganismos no fijan el colorante, en cuyo caso el fondo es el que se tiñe y los microorganismos aparecen brillantes sobre fondo oscuro.

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Materiales:

Azul de metilenoFucsinaCristal violeta Microscopio Porta y cubre objetos

Procedimiento:

Se agrega azul de metilenoEn otra muestra fucsinaEn otra muestra Cristal de violeta

II. Coloración compuestaes aquella donde usas mas de un (1) colorante. Con esta tincion tu vas a poder ver morfologia, tamaño, organizacion de las bacterias y ademas categorizar los microorganismos en varios grupos, segun su afinidad con el colorante que tu estas utilizando. Hay varios tipos de tincion diferencial pero las que uno mas usa son la TINCION DE GRAM O COLORACION DE GRAM y la COLORACION DE ZIEHL NEELSEN.

Con la TINCION DE GRAM tu puedes diferencias las bacterias en dos grupos: BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y BACTERIAS GRAM NEGATIVAS. Eso va a depender de si retienen o no el colorante CRISTAL VIOLETA o el colorante SAFRANINA. La capacidad que tengan de retener un colorante o no va a depender de la composicion de la pared celular de la bacteria.

Las GRAM POSITIVAS cuando realizar el procedimiento de tincion de gram, puede ver que luego de añadir lugol, el colorante cristal violeta se mantiene en el interior de la bacteria. Las GRAM NEGATIVAS al añadir lugol pierden la coloracion del cristal violeta y si le añades otro colorante, por ejemplo la safranina, adoptaran ese color.

Materiales:

Procedimiento:

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Primero se agrega cristal de violeta(esperar 1 minuto) Lavar Segundo Lugol(dejar 1 minuto) Lavar Safranina (dejar 1 -30 segundos) Lavar Observar al microscopio

Bacterias Escherichia coli (Gram negativas)

Bacterias Clostridium perfringens (Gram positivas)

III. Coloración neutra:

Tinción de las extensiones de sangre periférica:

El frotis, una vez seco, se fija y se tiñe mediante colorantes adecuados. Generalmente, en los laboratorios hematológicos se emplean colorantes basados en la tinción de Romanowsky, basado en una combinación de eosina y azul de metileno.

Con la tinción de los elementos formes de la sangre se pueden distinguir los siguientes aspectos morfológicos de las células: 1.- La forma, dimensión y contorno de los hematíes (de color rosa pálido), leucocitos (células nucleadas) y plaquetas (pequeños corpúsculos). 2.- El núcleo: de color púrpura 3.- El citoplasma: de color azulado o gris en los linfocitos y monocitos. 4.- Granulaciones: mezcla de colores pardos (neutrófilos), anaranajadas (eosinófilos) y azul oscuro (basófilos).

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Aunque cada laboratorio emplea su receta, los colorantes y los métodos de tinción más empleados son los siguientes:

Tinción de Giemsa: 1.- Secar el frotis. 2.- Fijar con alcohol absoluto durante 3 minutos. 3.- Sumergir en solución de Giemsa (1 volumen de colorante y 9 de PBS) durante 10 minutos. 4.- Lavar con abundante agua y dejar secar antes de observar al microscopio. Colorante de Giemsa: 1 g de polvo de Giemsa + 66 mL de glicerina calentado a 50 grados durante 2 horas, añadir 66 mL de actohol metílico absoluto, dejar a temperatura ambiente 7-14 días (maduración). Filtrar antes de su empleo.

Tinción de May-Grünwald-Giemsa: 1.- Secar el frotis. 2.- Fijar en solución de May-Grünwald (1 volumen de colorante y 1 volumen de PBS) durante 2 minutos. 3.- Sumergir en solución de Giemsa durante 15-20 minutos. 4.- Lavar en abundante agua y dejar secar. Colorante May-Grünwald: 0,3 g de polvo de May-Grünwald + 100 mL de acohol metílico absoluto calentado a 56 grados hasta la disolución completa del colorante, dejar enfriar a 4 grados durante 24 horas (agitación intermitente). Filtrar antes de su empleo.

Tinción de Wright: 1.- Secar el frotis. 2.- Teñir con colorante de Wright durante 1 minuto. 3.- Teñir con una mezcla de colorante en 2 ó 3 volúmenes de tampón (PBS) durante 10 minutos. 4.- Lavar en abundante agua y dejar secar antes de observar al microscopio. Colorante Wright: 1 g de polvo de Wright + 600 mL de alcohol metílico absoluto calentado a 56 grados hasta la disolución completa del colorante. Dejar enfríar.

Colorantes usos

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Azul de metileno

El azul de metileno es un colorante que se usa para tratar una enfermedad llamada metahemoglobinemia.

Es un compuesto químico heterocíclico aromático con fórmula molecular: C16H18Cl N 3S.

El azul de metileno se usa como tintura para teñir ciertas partes del cuerpo antes o durante la cirugía. Su uso es principalmente como antiséptico y cicatrizador interno. También se utiliza como colorante en las tinciones para la observación en el microscopio.

Esta sustancia tiene forma de cristales o polvo cristalino y presenta un color verde oscuro, con brillo bronceado. Es Inodoro o prácticamente inoloro. Es estable al aire. Sus soluciones en agua o en alcohol son de color azul profundo. Es fácilmente soluble en el agua y en cloroformo; también es moderadamente soluble en alcohol.

Fucsina Tinte natural de naturaleza lipidica. La fucsina es la materia prima para el colorante clorhidrato de rosalina, el cual es formado tras su desecación. A la Fucsina también se le conoce como Magenta, Rojo anilina, Roseína y Rubina. Al colorer con fucsina permite demostrar la presencia de carbohidratos en el tejido.

Rojo de congo

La coloración con rojo Congo funciona sobre la base de enlaces por puente dehidrógeno con el componente de hidrato de carbono del substrato. El amiloide,teñido por el rojo Congo, muestra un llamativo bicromatismo bajo la luzpolarizada, los sedimentos muestran sectores verdes luminosos sobre fondooscuro, mientras que otros materiales, como colágeno, que también sonteñidos por el rojo Congo, no muestran este efecto.

Coloración de Wringht

Materiales:

Sangre Lanceta Algodón AlcoholPorta y cubre objetosColorante WrightAgua destilada puente de tinciónMicroscopio.

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Procedimiento:

1) Lavarse la mano, desinfectar la mano 2) Ingresar la lanceta en el pulpejo del dedo 90º3) La primera gota se desecha 4) La segunda se utiliza y se le coloca en el porta 5) Se procede al frotis

6) Colocamos el colorante winghr7) Dejamos en el puente de tinción.8) Cubrimos con colorante9) Adicionamos agua destilada(gotas de colorante =gotas de agua)10) Dejar secar11) Después colocar el aceite de inmersión para observar a 100x

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10.-Microscopio Estereoscopio

Se utiliza para ofrecer una imagen estereoscópica (3D) de la muestra. Para ello, y como ocurre en la visión binocular convencional, es necesario que los dos ojos observen la imagen con ángulos ligeramente distintos. Obviamente todos los microscopios estereoscópicos, por definición, deben ser binoculares (con un ocular para cada ojo), por lo que a veces se confunden ambos términos. Existen dos tipos de diseño, denominados respectivamente convergente (o Greenough) y de objetivo común (o Galileo).

El diseño convergente consiste en usar dos microscopios idénticos inclinados un cierto ángulo uno con respecto a otro y acoplados mecánicamente de tal forma que enfocan la imagen en el mismo punto y con el mismo aumento. Aunque es un diseño económico, potente y en el que las aberraciones resultan muy fáciles de corregir, presenta algunas limitaciones en cuanto a modularidad (capacidad de modificar el sistema para poner accesorios) y la observación durante tiempos largos resulta fatigosa.

El microscopio estereoscópico es apropiado para observar objetos de tamaños relativamente grandes, por lo que no es necesario modificar los objetos a ver, (laminar) ni tampoco lo es que la luz pase a través de la muestra. Este tipo de microscopios permite una distancias que van desde un par de centímetros a las decenas de ellos desde la muestra al objetivo, lo que lo hace muy útil en botánica, mineralogía y en la industria (microelectrónica, por ejemplo) como en medicina (microscopios quirúrgicos) e investigación, fundamentalmente en aplicaciones que requieren manipular el objeto visualizado (donde la visión estereoscópica es esencial). En la fotografía se aprecia una concha de 4 cm de diámetro.

Podríamos decir que un microscopio estereoscópico sirve para las disecciones de animales.

Los estereoscopios permiten hacer estudios de objetos y especímenes demasiado pequeños para ser estudiados a simple vista, pero demasiado grandes para ser estudiados bajo el microscopio compuesto.  Su magnificación va desde cerca de 5x hasta más de 60x.  Los estereoscopios también son conocidos como microscopios de disección, pues en muchas ocasiones son usados para disecar los especímenes o muestras, separando de ellos aquellas partes que serán examinadas mediante otros tipos de  microscopía.

Materiales:

EstereoscopioInsectos GlicerinaPorta y cubreEsmalteCinta Scott

Procedimiento:

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1) Primero el insecto tiene que estar muerto en alcohol 2) Se procede al observado 3) Par insectos más pequeños como pulgas piojos o hormigas se procede lo siguiente:

a) Se hace derretir la glicerina b) Se le coloca al porta junto con el insecto.c) Se coloca el cubre y se procede al esmaltado de las costados para que no este

cerrado herméticamente y no entre cualquier organismo, que le perjudiqued) Se procede al observado

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Algunas observaciones

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