PRÁCTICA DE BIOQUÍMICA

Ing. Hueman Isaac González Ríos.

FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA (Primera parte)

Antecedentes:

Fermentación.

La palabra “fermentar” procede del termino latino “fervere”, que significa “hervir”, lo anterior nos permite hacer una idea

del aspecto que toma un líquido fermentado. El aspecto de agitación se genera por el desprendimiento de CO2. El

significado científico de la fermentación, es que la energía celular anaeróbica del metabolismo microbiano transforma sus

nutrientes, básicamente carbohidratos, a sustancias más simples como: ácido láctico, ácido acético, y etanol. La

fermentación cambia lentamente las características de los alimentos por la acción de enzimas, producidas por algunas

bacterias, mohos y levaduras. A continuación se mencionan ejemplos del producto final de fermentación de algunos

microorganismos:

Saccharomyces: alcohol etílico.

Estreptococo y Lactobacillus: el ácido láctico.

Escherichia coli: ácido acético, ácido láctico, ácido succinic, alcohol etílico.

Enterobacter: ácido fórmico, alcohol etílico, ácido 2,3 butanodiol y láctico.

En términos generales, la fermentación hace referencia al crecimiento de microorganismos en los alimentos en

condiciones anaerobias.

La levadura Saccharomyces cerevisiae.

Se trata de un modelo de estudio desde hace más de cien años. Levadura es un nombre genérico que agrupa a una

variedad de hongos, incluyendo tanto especies patógenas para plantas y animales, como especies no solamente inocuas

sino de gran utilidad. De hecho, las levaduras constituyen el grupo de microorganismos más íntimamente asociado al

progreso y bienestar de la humanidad. Algunas especies de levaduras del género Saccharomyces son capaces de llevar a

cabo el proceso de fermentación, propiedad que se ha explotado desde hace muchos años en la producción de pan y de

bebidas alcohólicas, y que a su vez ha inspirado un sinnúmero de obras de arte que ensalzan al Dios del vino y a aquellos

que disfrutan su consumo. Desde el punto de vista científico, el estudio de las levaduras como modelo biológico ha

contribuido de manera muy importante a elucidar los procesos básicos de la fisiología celular.

Dentro del género Saccharomyces, la especie cerevisiae constituye la levadura y el microorganismo eucariote más

estudiado. Este organismo se conoce también como la levadura de panadería, ya que es necesario agregarla a la masa

que se utiliza para preparar el pan para que este esponje o levante; de hecho el término levadura proviene del latín

levare, que significa levantar.

En 1897, los hermanos Hans y Edward Buchner obtuvieron extractos libres de células moliendo levadura para pan con

granos de arena, a los cuales adicionaron grandes cantidades de azúcar de caña para evitar su posible contaminación.

Para su sorpresa, encontraron que el azúcar se fermentaba rápidamente: por primera vez se había descubierto un modelo

para el estudio de la fermentación alcohólica en un sistema carente de células. Este descubrimiento atrajo la atención de

los bioquímicos, que decidieron analizar cada uno de los pasos que conducían a la producción de etanol y bióxido de

carbono a partir de la glucosa. Este trabajo implicó el esfuerzo de muchos científicos y dio como resultado el

descubrimiento y descripción del metabolismo del carbono; algunas de las vías metabólicas que conocemos actualmente,

llevan los nombres de los científicos que participaron en este trabajo, como Embden y Meyerhof. La vía metabólica que

permite la utilización de glucosa fue la primera ruta metabólica descrita, y la metodología empleada para lograrlo se

utilizó para el estudio posterior de otras vías que constituyen el metabolismo celular. (Texto:

http://www.biblioweb.dgsca.unam.mx/libros/microbios/Cap16/)

La sacarosa:

Es el azúcar de mesa común, se trata de un

disacárido de glucosa y fructosa sintetizado en las

plantas. Es un producto intermedio principal de la

fotosíntesis, en muchas plantas constituye la

forma principal de transporte de azúcar desde las

hojas a otras partes de la planta. En las semillas

germinadas de plantas, las grasas y proteínas

almacenadas se convierten en sacarosa para su

transporte a partir de la planta en desarrollo. Su

fórmula es C12 H24 O12.

Objetivo:

Realizar una fermentación alcohólica con desechos de frutos para la obtención de alcohol etílico, y realizar una

comparativa con una fermentación de un sustrato conocido.

Material por alumno:

2 Matraces Erlen Meyer de 1 o 2 litros.

2 Matraces Erlen Meyer de 250 ml.

1 Probetas de 100 ml.

2 vasos de precipitados de 100 ml.

2 agitadores de vidrio.

1 Mechero bunsen.

1 Termómetro.

1 Tripie.

1 Rejilla con asbesto.

1 Pipeta graduada de 10 ml.

1 Propipeta.

1 Espátula pequeña.

1 Papel filtro de cafetera.

1 Cristalizador.

Material por grupo

1 Balanza analitica.

1 Potenciometro.

1 Microscopio óptico.

5 Porta objetos.

5 Cubre objetos.

1 Piceta con agua destilada.

Reactivos y/u otros:

Sacarosa. (90 g)

Desechos de diferentes frutos.

Levadura comercial seca.

H2SO4 o HCl

NaOH (Para preparar 50 ml ml al 5 % m/v)

(NH4)2 SO4 (Para preparar 500 ml [5 g/l])

Metodología:

Fermentación:

1. Activar la levadura necesaria para la muestra total. (Ver anexo)

2. Determinar la densidad de los desechos licuados.

3. Tomar la cantidad necesaria para tener una masa de 250 ml en total.

4. Filtrar la muestra y obtener la disolución, llevar la muestra a 1 litro con agua destilada.

5. Agregar 10 ml de la disolución de ácido al 5% y someter a calentamiento a 100 ° C y suspender calentamiento.

6. Espera a que baje la temperatura hasta 60 °C y medir pH ajustándolo entre 4.5 y 5.

7. Inocular con 10 ml de la levadura activada.

8. Dejar reposando la muestra durante 72 horas.

Muestra con sustrato conocido:

1. Disolver 90 g de sacarosa en 1 litro de agua corriente, agregar 5 g de (NH4)2 SO4 , someter a calentamiento hasta

llegar a 60 °C.

2. Inocular con 10 ml de levadura activada.

3. Dejar reposar bajo las mismas condiciones que la muestra de fruta.

Identificación de la levadura:

1. Tomar una muestra de la levadura cada 10 minutos durante la activación observarla al microscopio con un

objetivo máximo de 40 X.

Anexo 1

Rehidratación y activación de levadura.

La levadura de cerveza (Saccharomyces cerevisiae) se trata de un hongo unicelular, su uso a nivel industrial es

básicamente para la fabricación de pan, cerveza y vino. Las células de levadura secas han pasado por un proceso llamado

liofilización, y es necesario revertir este proceso de forma correcta para evitar pérdidas significativas. Por cada gramo de

levadura seca existen 20 mil millones de células vivas, si matamos el 60 % por una mala rehidratación vamos a seguir

teniendo 8 mil millones y estas células harán su trabajo aunque sea más lento. Para evitar está perdida debemos

considerar lo siguiente.

Básicamente en este proceso es necesario rehidratar la pared celular, es delicado debido a que se trata de

microorganismos vivos susceptibles a los cabios de su medio, tales como:

1. Temperatura.

De acuerdo a la literatura reportada la a temperatura óptima para la rehidratación se encuentra entre 35 - 40 °C,

al sobre pasar esta temperatura se pueden llegar a destruir las células, y al contrario por debajo de esta

temperatura, existen reportes que se pierden alrededor del 60% de los microorganismos. Las células se hinchan

rápidamente durante los primeros segundos de su rehidratación y explotan a bajas temperaturas.

2. Agua.

La ideal debería tener una dureza entre 250 a 500 ppm, debe contener algunas sales y ser alcalina, para fines

prácticos es suficiente usar agua de la red urbana.

3. Tiempo.

Después de la rehidratación para poder agregar la levadura o inóculo, deben haber transcurrido alrededor de 30

minutos, este es el periodo ideal pues es en donde la célula tiene el pico energético óptimo para ser

aprovechada. En este momento existe la máxima formación de glicógeno y trealosa. Esta última es un azúcar, un

disacárido que son dos grupos de glucosa y es fundamental en el proceso energético de la celular y la formación

de las paredes celulares.

4. Inoculo.

La concentración recomendada en la industria vitivinícola es 1 g/l (levadura/mosto). Por lo que se rehidratar a

una concentración de 1 g / 10 ml (levadura/agua) para activarla, añadiendo 5 g/l (NH4)2 SO4. Se calienta el agua

35 °C y se disuelve el sulfato de amonio, posteriormente se añade la levadura esperando 30min. Como inóculo se

tomaran 10 ml para 1 litro de nuestra mezcla.