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UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA Facultad de Ingenierías

Departamento de Ingeniería de Alimentos Maestría en Ciencias Agroalimentarias

i

EVALUACION DEL PROCESO DE FERMENTACION

DEL LACTOSUERO ÁCIDO (ENTERO Y DESPROTEINIZADO)

UTILIZANDO Lactobacillus casei

KATIA ISABEL CURY REGINO

UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA

FACULTAD DE INGENIERÍAS

MAESTRIA EN CIENCIAS AGROALIMENTARÍAS

BERÁSTEGUI, CÓRDOBA

2013



ii

EVALUACION DEL PROCESO DE FERMENTACION

DEL LACTOSUERO ÁCIDO (ENTERO Y DESPROTEINIZADO)

UTILIZANDO Lactobacillus casei

KATIA ISABEL CURY REGINO

Tesis presentada en opción al Título Académico de Máster en Ciencias

Agroalimentarias con énfasis en Tecnología de los alimentos

MSc. MARGARITA ARTEAGA MARQUEZ

Ph. D. ALBA DURANGO VILLADIEGO

Directoras

UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA

FACULTAD DE INGENIERÍAS

MAESTRIA EN CIENCIAS AGROALIMENTARÍAS

BERÁSTEGUI, CÓRDOBA

2013



iii

La responsabilidad ética, legal y científica de las ideas, conceptos y resultados

del proyecto, serán responsabilidad de los autores.

Artículo 61, acuerdo N0 093 del 26 de noviembre de 2002 del consejo superior.



iv

Nota de aceptación

_____________________________

_____________________________

_____________________________

_____________________________

Firma del jurado

______________________________

Firma del jurado

_____________________________

Firma del jurado



v

DEDICATORIA

Dedico lo que representa este trabajo de grado en mi vida personal y

profesional a

CAMILO ANDRES…

Mi guerrero de mil batallas…el ser más valiente que he conocido…

Quien hoy está en un mejor lugar, lleno de paz y rodeado del amor de Dios...

A quien siempre llevare en mi corazón y en mis recuerdos, como el motor que

me impulsa a seguirlo intentando… Quien me enseño que no existen imposibles

y que se puede sonreír en la adversidad…

Descansa en paz mi monito hermoso…

KATIA ISABEL

“Las pruebas te hacen fuerte. Las penas te hacen humano. Los fracasos te

hacen humilde. Y solo Dios, te mantiene en pie”…



vi

AGRADECIMIENTOS

A DIOS todopoderoso, por el don de la vida y por permitirme superar los

obstáculos y alcanzar con éxito esta meta.

A mis padres JULIO y LUZ NELLY y a mis hermanas ANY, YULY y

LORENA, gracias por su apoyo incondicional paciencia y permanente

motivación a seguir adelante a pesar de las dificultades.

A mis Directoras de trabajo de grado Msc MARGARITA ARTEAGA

MARQUEZ, Ph. D. ALBA DURANGO VILLADIEGO y a los docentes

Ph. D. GUILLERMO MARTINEZ y Ph. D. CLAUDIA DENISE DE PAULA

por su invaluable apoyo y por el tiempo dedicado para aconsejarme y orientarme

a lo largo de este proyecto de investigación, a CARLOS MARIO GAMERO

REDONDO por su colaboración.

A mis jurados de trabajo de grado por sus aportes y contribución de

conocimiento para con este trabajo.

A la Universidad de Córdoba y a los tutores de la Maestría, mi recuerdo e

inmensa gratitud por compartir conmigo sus conocimientos y por regalarme su

amistad y confianza.

A mis amigos y compañeros del programa de Maestría en Ciencias

Agroalimentarias, en especial a LINDA, BEATRIZ, YENIS, DALDO,

ANGELLY Y JORGE EMILIO que de una u otra manera contribuyeron con la

investigación y a mi crecimiento profesional y personal.

A la Universidad de Sucre, en especial a ANA MARTINEZ, DERIS

CUMPLIDO, YELITZA AGUAS, OLGA PERNA, BRYDYZ MAZZY y

ROBER BETIN, al igual que a mis compañeros de la Secretaria de Desarrollo

Economico y Medio Ambiente de la Gobernación de Sucre por su paciencia en

mis crisis, su colaboración y motivación constante y a la empresa

COLQUESOS, por su contribución para con el desarrollo de este trabajo.

A todos aquellos amigos que facilitaron de algún modo mi tránsito a través de

este nuevo camino lleno de dificultades y satisfacciones.



vii

TABLA DE CONTENIDO

pag

1. INTRODUCCION 2

2. REVISION DE LITERATURA 6

2.1. EL LACTOSUERO: PROBLEMÁTICA EN TORNO A SU

PRODUCCION Y MANEJO 6

2.2. TIPOS DE LACTOSUERO 16

2.3. COMPOSICION Y CARACTERISTICAS 18

2.3.1 Características fisicoquímicas del lactosuero 21

2.3.2 Composición del lactosuero 22

2.3. USOS Y APROVECHAMIENTO DEL LACTOSUERO 22

2.4. APROVECHAMIENTO BIOTECNOLOGICO DEL LACTOSUERO 27

2.5. PRODUCCIÓN DE ÁCIDO LÁCTICO A PARTIR DE LACTOSUERO 34

2.6. Lactobacillus casei COMO PRODUCTOR DE ACIDO LACTICO 39

3. MATERIALES Y MÉTODOS 44

3.1. TIPO DE INVESTIGACIÓN 44

3.2. LOCALIZACIÓN DEL PROYECTO 44

3.3. MATERIALES EMPLEADOS 44

3.4. PROCEDIMIENTO DE LA INVESTIGACIÓN 45

3.4.1. Obtención del lactosuero 45

3.4.2. Caracterización de los lactosueros utilizados 45

3.4.3. Proceso de fermentación 46

3.4.4. Seguimiento de la fermentación 51

3.4.5. Procesamiento y análisis 55

3.4.6. Diseño Estadístico 55

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 57

4.1. CARACTERIZACIÓN DEL LACTOSUERO 57

4.2. RELACIÓN DE LA ACIDIFICACIÓN CON EL TIPO DE

LACTOSUERO E INÓCULO. 58

4.3. CINÉTICA DE CRECIMIENTO, CONSUMO DE SUSTRATO Y

FORMACIÓN DEL PRODUCTO. 64

4.3.1. Parámetros fermentativos 73

4.3.2. Parámetros cinéticos 77

5. CONCLUSIONES 85

6. RECOMENDACIONES 86

BIBLIOGRAFIA 87



viii

LISTA DE TABLAS

Pág.

Tabla 1. Clasificación de los lactosueros según su acidez. 17

Tabla 2. Composición porcentual de los lactosueros 19

Tabla 3. Caracterización de lactosuero ácido entero y desproteinizado 20

Tabla 4. Características fisicoquímicas de los lactosueros dulce y ácido. 21

Tabla 5. Composición porcentual del lactosuero dulce y ácido. 22

Tabla 6. Producción de ácido láctico, acético y etanol por lactobacillus

casei

42

Tabla 7. Producción de ácido láctico a partir de lactosuero 42

Tabla 8. Análisis fisicoquímicos 46

Tabla 9. Características fisicoquímicas de los lactosueros 57

Tabla 10. Medias de producción biomasa, ácido láctico y consumo de

lactosa.

71

Tabla 11. Coeficientes estequiométricos Yp/s, Yx/s y Yp/x,Op,Ox 74

Tabla 12. Parámetros de los modelos 82

Tabla 13. Parámetros cinético α de formación de ácido láctico 84

Tabla 14. Especificaciones de Lactobacillus Caseí ATCC 393 105

Tabla 15. Especificaciones de AGAR M.R.S OXOIDCM0361 109

Tabla 16. Estadística descriptiva - Análisis de Covarianza de las variables

Lactosuero e inóculo

111

Tabla 17. Análisis estadístico de los lactosueros para los tratamientos y el

tiempo

114

Tabla 18. Análisis de varianza para biomasa 121

Tabla 19. Análisis de Varianza para Consumo Lactosa 122

Tabla 20. Análisis de Varianza para Ácido Láctico 123

Tabla 21. Análisis de Varianza para Yp/s 124

Tabla 22 Análisis de Varianza para Yp/x 125

Tabla 23 Análisis de Varianza para Yx/s 126

Tabla 24 Anova para los parámetros cinéticos de Ludeking Piret.

128



ix

LISTA DE FIGURAS Pag

Figura 1. Exportaciones de Quesos - Enero a Junio de 2012 13

Figura 2. Producción de ácido láctico a partir de lactosa 35

Figura 3. Ecuación estequiometrica de producción de ácido láctico

36

Figura 4. Fermentación Heteroláctica 43

Figura 5. Efecto de la interacción del tipo de lactosuero (a) 1: entero,

2: desproteinizado; y del porcentaje de inóculo (b) en la acidificación

(°D).

59

Figura 6. Acidificación con del L. casei debido al efecto combinado del tipo de

lactosuero y concentración de inóculo (■: 5%; ▲:10%; ♦: 15%)

60

Figura 7. Acidificación con L. casei debido al efecto de lactosuero entero

inoculado al ■: 5%, ▲:10% y ♦: 15%.

63

Figura 8. Acidificación con L. casei debido al efecto de lactosuero

desproteinizado inoculado al ■: 5%, ▲:10% y ♦: 15%.

63

Figura 9. Perfil de fermentación con L. casei en Lactosuero. Concentración de

lactosa (■), ácido láctico (♦) y recuento de L. casei (▲) en

lactosuero entero y 5% de inóculo.

65



lactosuero desproteinizado y 5% de inóculo.

65




67




68

Figura 13. Perfil de fermentación con L. casei en Lactosuero. Concentración

de lactosa (■), ácido láctico (♦) y recuento de L. casei (▲) en


69




69

Figura 15. Cinética de crecimiento en lactosuero entero con 5% de inóculo,

experimentales (♦), Gompertz (□) y Logístico modificado (∆).

78



79



79



x

Figura 18. Cinética de crecimiento en lactosuero desproteinizado con 5% de

inóculo, experimentales (♦), Gompertz (□) y Logístico modificado

(∆).

80



(∆).

80



(∆).

81

Figura 21. a) Determinación de Acidez por titulación y b) Medición de pH de

los lactosueros

106

Figura 22. c) Determinación de densidad d) Humedad y ST 106

Figura 23. e) Determinación de contenido de nitrógeno y porcentaje de proteína

presente en los lactosueros

107

Figura 24. f) Determinación de porcentaje de grasa presente en los lactosueros 107

Figura 25. g) Determinación de contenido de cenizas h) Determinación de

Contenido de Lactosa.

107

Figura 26. Lactobacillus casei activado 108

Figura 27. Formación del cultivo madre en leche entera UHT a) antes de

inocular la cepa de Lactobacillus caseí b) luego de incubación de la

cepa c) Control

108

Figura 28. Montajes Proceso de Fermentación batch 108

Figura 29. Curva de calibrado para azucares reductores – Lactosa 110

Figura 30. Curva patrón microorganismo 110

Figura 31. Gráfico de medias de la Acidez 113

Figura 32. Efectos principales para biomasa

121


121

Figura 34. Gráfico de Interacción para consumo de lactosa

122

Figura 35. Gráfico de interacción para ácido láctico

123

Figura 36. Gráfica de interacción para Yp/s

124

Figura 37. Gráfica interacción para Yp/x

125

Figura 38. Gráfica de interacción para Yx/s

126



xi

ANEXOS

Pág.

Anexo A. Ficha técnica del microorganismo empleado 105

Anexo B. Evidencias fotográficas de las técnicas utilizadas para la

caracterización fisicoquimica y evaluación del proceso de

fermentación de los lactosueros objeto de estudio.

106

Anexo C. Ficha técnica del medio de cultivo empleado 109

Anexo D. Curvas de calibración 110

Anexo E.

Análisis de Covarianza de las variables Lactosuero e

inóculo.

111

Anexo F.

Análisis estadístico de los lactosueros para los

tratamientos y el tiempo

114

Anexo G. Análisis factorial de los parámetros estequiométricos 121

Anexo H. Anova para los parámetros cinéticos de Ludeking Piret. 128

Anexo I. Modelos cinéticos aplicados 130



xii

RESUMEN

El empleo de suero de leche acidificado de manera controlada para la obtención de

quesos hilados, se perfila como una alternativa mucho más eficiente que la aplicada

actualmente por empresas productoras de quesillo o queso tipo mozzarella. Se fermenta

de manera espontánea e incontrolada el lactosuero, lo cual pone en riesgo la salud del

consumidor y reduce la calidad del producto obtenido. El propósito de esta

investigación fue evaluar el proceso de acidificación del lactosuero ácido (entero y

desproteinizado) a través de una fermentación con Lactobacillus casei para determinar

la influencia del tratamiento aplicado al lactosuero y el porcentaje de inóculo adecuado

en la producción de la acidez requerida para la elaboración de quesos hilados (quesillo

y tipo mozzarella). Se caracterizó fisicoquímicamente el lactosuero y se sometió a una

fermentación anaeróbica a 37°C en constante agitación (120 rpm) por un periodo de 96

horas. Se evaluó la concentración de biomasa en el medio, consumo de lactosa,

producción de ácido láctico y se estimaron los parámetros cinéticos y estequiométricos.

Se aplicó un diseño experimental completamente al azar con arreglo factorial 2x3,

donde el primer factor es el tipo de lactosuero, con 2 niveles (entero y desproteinizado)

y el segundo factor es la cantidad de inóculo adicionada con 3 niveles (5%, 10%, 15%)

con tres repeticiones, para un total de 18 unidades experimentales. El procesamiento de

los datos y su análisis se realizó empleando los paquetes estadísticos SAS versión 9 y

Statgraphics® centurión XVI. Los lactosueros, entero y desproteinizado empleados,

se encontraron dentro de los rangos fisicoquímicos aceptables para su acidificación. Se

logró una acidificación hasta valores superiores a los 120°D con la inoculación de L.

casei a 37°C y 120 rpm, excepto en el lactosuero desproteinizado, inoculado con un

15% de cultivo. Las ecuaciones logística modificada y Gompertz presentaron mejor

ajuste para describir las etapas logarítmica, exponencial y estacionaria del L. casei en

los medios. El modelo de Luedeking-Piret se ajusta adecuadamente a la formación de

ácido láctico. El lactosuero entero con 15% de inóculo, alcanzo 120°D en el menor

tiempo (34 horas), mostrando parámetros cinéticos de crecimiento (µmax = 0.004 h-1

) y

de formación de producto (α = 0,37 g ácido láctico UFC-1

y = 0,09 g ácido láctico

(UFC h)-1

), donde α es la contantes estequiometrica y una constante de

proporcionalidad.

Palabras claves: aprovechamiento agroindustrial, suero de leche, L casei, ácido láctico,

queso hilado, parámetros cinéticos



xiii

ABSTRACT

The use of acidified whey controlled way to obtain yarn cheeses, it emerges as a much

more efficient alternative than the currently applied by producers of mozzarella string

cheese or cheese where spontaneously fermented and uncontrolled the whey, which

threatens consumer health and reduce the quality of the product obtained. The purpose

of this study was to evaluate the process of acidification of the acid whey (whole and

deproteinized) through fermentation with Lactobacillus casei, to determine the

influence of treatment applied to the whey and the percentage of suitable inoculum for

the production of the required acidity for cheese making yarn (string cheese and

Mozzarella). Was characterized physicochemically the whey and was subjected to

anaerobic fermentation at 37 °C under constant agitation at (120 rpm) for a period of 96

hours. We assessed the concentration of biomass in the medium, lactose consumption,

lactic acid production and were estimated kinetic and stoichiometric parameters. It was

performed a experimental design completely random with factorial arrangement in 2x3,

where first factor is the type of whey, with 2 levels (whole and deproteinized), and

second factor are the amount of inoculum added, with 3 levels (5%, 10%, 15%), with

three repetitions, for a total of 18 experimental units. The data processing and analysis

was performed using SAS statistical package version 9 and Statgraphics® centurión

XVI. The whole and deproteinized whey used were found within ranges

physicochemical acceptable for its acidification. Acidification was achieved to values

above 120 ° D with inoculation of L. casei at 37 °C and 120 rpm, except in the

deproteinized whey inoculated with 15% of crop. The modified logistic and Gompertz

equations presented best fit to describe the stages logarithmic, exponential and

stationary of L. casei in the media. The Luedeking-Piret model fits well to the

formation of lactic acid. The whole whey with 15% of inoculum, reached 120 °D in the

shortest time (34 hours), showing kinetic parameters of growth (μmax = 0.004 h-1

) and

product formation (α = 0.37 g lactic acid UFC-1

and = 0.09 g lactic acid (UFC h-1

),

where α is the stoichiometric constant and a proportionality constant.

Keywords: Agroindustrial utilization, whey, L casei, lactic acid, cheese yarn, kinetic

parameters



2

INTRODUCCION

En los procesos de obtención de queso, caseína o coprecipitados se genera

lactosuero, subproducto que se puede convertir en un problema ambiental

importante; siendo este líquido translúcido y amarillo verdoso, uno de los

materiales más contaminantes que existen en la industria alimentaria (Parra

2009).

La industria láctea está enfrentada a regulaciones que prohíben el vertimiento de

lactosuero en fuentes naturales de agua, por su carácter contaminante y alta

producción; se estima que a partir de 10 litros de leche de vaca se puede

producir de 1 a 2 kg de queso y un promedio de 8 a 9 kg de lactosuero, lo cual

representa cerca del 85 - 90% del volumen de la leche, que contiene alrededor

del 55% de sus nutrientes; lo que corresponde a decir que el volumen de

lactosuero es aproximadamente 7 a 10 veces mayor que el queso producido,

según su variedad (Liu et al. 2005; Callejas et al. 2012).

El lactosuero se constituye en el principal residuo de la industria láctea, pues

solo una parte de este es usado para alimentación animal o es procesado, pero el

resto es tratado como un desecho; de manera que, aproximadamente, 47 % de

las 115 millones de toneladas de lactosuero, producido a nivel mundial, fueron

desechadas sin tratamiento previo al ambiente, en ríos, lagos o en el suelo, lo



3

que además de ocasionar un gran daño, también representa una pérdida

significativa de recursos (Guerrero et al. 2012). El no darle un uso adecuado al

lactosuero, crea un enorme desperdicio de nutrientes que pueden ser

aprovechados en la alimentación humana; se estima que en términos de

composición y de valor energético, los sólidos del lactosuero son comparables a

la harina de trigo (357 Kcal/100 gr), lo que hace un alimento con mucho

potencial. (Inda 2000; Lagua 2011).

El no darle un uso adecuado al lactosuero, crea un enorme desperdicio de

nutrientes que pueden ser aprovechados en la alimentación humana, pues cerca

del 70% de la proteína cruda que se encuentra en el suero corresponde a

proteínas con un valor nutritivo superior al de la caseína (Kirk et al. 2005); que

se caracterizan porque contiene proteínas y fracciones proteicas de alto valor

biológico. El alto contenido de nutrientes que genera aproximadamente con un

contenido de materia orgánica entre 40 y 60 g/L de DBO y entre 50 y 80 g/L de

DQO de lactosuero líquido (Kavacik y Tapaloglu 2010; Guerrero et al. 2012), se

compone principalmente de lactosa, proteínas, grasas y minerales; siendo la

lactosa, el principal componente de sólidos que contribuye a la alta DBO y DQO

(Ghaly y Kamal 2004; Mukhopadhyay et al. 2005; Koutinas et al. 2009;

Almeida et al. 2009; Kavacik et al. 2010; Guerrero et al. 2012).



4

En los últimos años se ha creado la necesidad de conocer la naturaleza del

lactosuero, su composición y valor nutricional, con el objetivo de concentrarlo o

modificarlo para usarlo apropiadamente como ingrediente, fuente de nutrientes

o materia prima para la de otros derivados; el lactosuero se ha empleado en

muchos productos alimenticios, como bebidas, cremas para untar, mantequilla,

concentrado proteínico, lactosa, proteínas en polvo, suero en polvo

desmineralizado y quesos como el quesillo, entre otros,

Colombia, para el año 2012, registró en los departamentos de Antioquia y

Cundinamarca un total de 10 millones de kg de queso comercializado, donde se

obtuvieron aproximadamente 90.000.000 L de lactosuero (Martínez 2012). Los

departamentos de Córdoba y Sucre, presentan un creciente desarrollo en lo que a

la industria láctea se refiere, en especial en la producción de quesos frescos.

Alrededor del 70% del total de la producción lechera se destina a la elaboración

de queso, para lo cual se emplean sistemas artesanales e industriales. La

fabricación no estandarizada de quesos constituye un renglón importante en la

economía de muchos pobladores; siendo un producto de consumo masivo

(Gallegos et al. 2007). Empresas productoras de quesillo o queso tipo

mozzarella fermentan de manera espontánea el lactosuero producto del proceso

del día anterior, pero estas fermentaciones se producen de manera incontrolada

de modo que en algunos casos podrían representar un riesgo para la salud del



5

consumidor y van en detrimento de la calidad del producto obtenido; lo

conveniente es que este se realice empleando los microorganismos y

condiciones adecuadas para garantizar mejoras en el proceso y en el producto

obtenido; así como el aprovechamiento de este importante subproducto

agroindustrial por parte de las plantas productoras de queso de pasta hilada

como la empresa COLQUESOS de la ciudad de Sincelejo, pudiéndose

posteriormente replicar esta tecnología en otras queseras de la región.

El propósito de esta investigación es evaluar el proceso de acidificación de

lactosuero ácido (entero y desproteinizado) por fermentación con Lactobacillus

casei para su utilización en elaboración de quesos de pasta hilada, buscando

determinar la influencia del tratamiento aplicado al lactosuero y del porcentaje

de inóculo adicionado en la producción de acidez, como alternativa para el

aprovechamiento de los nutrientes que contiene este subproducto. De este modo

no será necesario el empleo de acidulantes durante el proceso de coagulación

mixta aplicado en la elaboración de quesos como tipo mozzarella; de modo que

se desarrolle una tecnología que permita suprimir la práctica de someter a

fermentación espontánea el lactosuero, afectando la calidad higiénica del

producto terminado; y el mejoramiento de sus características organolépticas.



6

2. REVISION DE LITERATURA

2.1. EL LACTOSUERO: PROBLEMÁTICA EN TORNO A SU

PRODUCCION Y MANEJO

La leche ha sido uno de los primeros productos pecuarios utilizados por el

hombre, es un alimentos completo e incluso, uno de los primeros alimentos

sometidos a procesos fermentativos debido a la facilidad con que pueden crecer

y multiplicarse diferentes bacterias que la acidifican, constituyéndose esta

materia prima en la base de numerosos derivados ampliamente utilizados en las

industrias agroalimentarias, químicas y farmacéuticas (Valencia y Ramírez

2009). Esta industria, ha sido ampliamente cuestionada por generar impacto

negativo ambiental y por caracterizarse por la producción de cantidades

importantes de residuos orgánicos e inorgánicos, que presentan características

contaminantes (FAO 2012).

Hay una tendencia sostenida de incremento de la demanda de productos lácteos

en los países en desarrollo (China, Norte de África, Oriente Medio y Rusia),

impulsado por el aumento del ingreso per cápita y por un proceso de

urbanización de la población (la población urbana ha superado a la rural en el



7

mundo) que ha generado cambios en los hábitos alimenticios y un mayor

consumo de lácteos en la dieta. Se dice que el queso es el producto más

representativo, llegando a considerarlo como el más importante de los productos

lácteos en valor. La producción de quesos en 2011 fue de 14,9 Mtn, apenas un

1,1% más que en 2010; siendo los principales elaboradores la UE con 7 Mtn,

EE.UU con 4,8Mtn, Brasil quien fabricó 0,67 Mtn, seguido de cerca por

Argentina con 0,55 Mtn. El consumo de quesos fue de 14,5 Mtn. Las

exportaciones alcanzaron 1,4 Mtn; estos países al liderar la producción de

queso, son los a su vez los mayores productores de lactosuero, al igual que

Francia, Alemania e Italia, donde la producción mundial anual de suero lácteo es

de aproximadamente 145 Mtn, de las cuales 6 millones son de lactosa (Valencia

y Ramírez 2009; Cadenas Agroindustriales 2012)

Durante la coagulación de la leche, presentada en todo proceso industrial donde

se produzca queso, caseína o coprecipitados, se obtendrá un subproducto que se

puede convertir en un problema ambiental importante: el lactosuero o suero de

leche; líquido claro de color amarillo verdoso, obtenido al separar la leche en

dos fases: la cuajada, que posteriormente es escurrida y prensada dando lugar al

queso y el líquido resultante que representa del 80 al 90% del volumen de leche

tratada de la cual contiene el 50% de los nutrientes; obteniéndose cantidades 7 a

10 veces mayores de lactosuero que de queso producido (Monsalve y Gonzales



8

2005). También se dice que el suero es la fase acuosa de la leche, obtenida por

medio de acidificación, aplicación de calor o coagulación enzimática (Gutiérrez

2006).

Aproximadamente 90% del total de la leche utilizada en la industria quesera es

eliminada como lactosuero, el cual retiene cerca de 55% del total de

ingredientes de la leche como la lactosa, proteínas solubles, lípidos y sales

minerales. Algunas posibilidades de la utilización de este residuo han sido

propuestas, pero las estadísticas indican que una importante porción de este

residuo es descartada como efluente el cual crea un serio problema ambiental

(Aider et al. 2009; Fernandes et al. 2009), debido a que afecta física y

químicamente la estructura del suelo, lo anterior resulta en una disminución en

el rendimiento de cultivos agrícolas y cuando se desecha en el agua, reduce la

vida acuática al agotar el oxígeno disuelto (Aider et al. 2009).

El uso que tradicionalmente se le ha dado a este subproducto, es suministrarlo

como alimento a los animales domésticos especialmente cerdos. Cuando el

productor de queso no encuentra otra forma de utilizarlo, escoge esparcirlo a las

fuentes de agua o al suelo, causando deterioro del medio ambiente y

desaprovechamiento de un nutriente proteico potencialmente útil en la

alimentación humana (Gómez et al. 2010).



9

Los productores de queso están enfrentados a las regulaciones encaminadas a

prohibir el vertimiento de éste en fuentes naturales, por su carácter corrosivo y

alta carga de materia orgánica. Por lo tanto, en los últimos años se ha dado la

necesidad de conocer su naturaleza, composición y valor nutricional; para

concentrarlo o modificarlo y darle un uso apropiado como ingrediente, fuente de

nutrientes y fuente de otros derivados o compuestos de interés o en caso

contrario someterlo a tratamientos o transformaciones biológicas encaminadas a

su descontaminación (Pelayo 2009).

En el año 2005, a nivel mundial, la distribución de la producción de lactosuero

fue: Europa 53%, América del Norte y central 28%, Asia 6%, África 5%,

Oceanía 4%, América del Sur 4%, anualmente, estos porcentajes representan

110-115 millones de toneladas métricas de lactosuero y son producidas para la

elaboración de queso (Briczinski y Roberts 2002; Revillion et al. 2003;

Londoño 2006; Almécija 2007; Parra 2009). Para el año 2008 ascendió a 186

millones de toneladas; la Unión Europea (UE) y los EE.UU producen alrededor

del 70% del volumen mundial de este producto (Cruz et al. 2009).

En 1999, la producción de quesos en España, según estimaciones de la Unión

Europea fue de 287.000 toneladas; produciendo aproximadamente

2.870.000.000 de litros de lactosuero, que equivale a 8.000.000 de litros/día,



10

cuyo poder contaminante corresponde al de una población de 26-32 millones de

habitantes/día (Ronda 2000).

En Tulancingo y Acatlán, México, 450.000 L/día de lactosuero, son producidos

por 67 plantas productoras de queso tipo Oaxaca y mantequilla, generando gran

polémica y encendiendo las alarmas, por las afectaciones de tipo ambiental

generada al verterse sin tratamiento hacia arroyos y drenajes de los municipios

de la región, canalizándose hacia el río Tulancingo y perneándose hacia el

subsuelo, agregándose a los mantos acuíferos. Otra parte del lactosuero

impermeabiliza las capas del suelo con sus contenidos grasos, desperdiciando el

alto contenido proteínico de esta sustancia (Cervantes et al. 2010). En el estado

de Hidalgo, se encuentran establecidas un gran número de empresas

procesadoras de lácteos, las cuales generan lactosuero dulce y ácido y con la

mezcla de ambos producen requesón, dando origen a un tercer tipo de lactosuero

(Guerrero 2012).

Durante el 2009, en Argentina de las 508.069 toneladas de quesos producidas se

repartieron entre los tres tipos de pasta y los quesos fundidos; existiendo

aproximadamente 12 plantas procesadoras de suero de leche, en su mayoría

localizadas en la zona pampeana y se producen aproximadamente 450.000 ton

de suero líquido/año, de los cuales el 62% se destina para alimentación animal,

el 33% se procesa para obtención de lactosa, caseínas, caseinatos y concentrados



11

proteicos, un 4% se destina para la producción de suero en polvo y el 1%

restante es tratado como efluente (Moreau 2003; Cruz et al. 2009).

Venezuela para el año 2011 produjo 49.300.000 kilogramos de queso industrial

(en plantas); observándose una muy importante producción de quesos

artesanales (frescos de menor duración), elaborados con técnicas principalmente

manuales. De igual modo, se registraron importaciones de quesos en todas sus

variedades de 21.430.406,79 kilogramos, según cifras de importaciones oficiales

del país, donde se puedo observar que Uruguay se encuentra en primer lugar

como proveedor con un 44% de participación en el mercado Venezolano.

Seguidamente, Argentina con un 36% de participación y en tercer lugar Holanda

con un 13% de participación (ProChile 2012). Estos volúmenes representan de

igual modo una apreciable producción de lactosuero, que desde tiempos remotos

ha despertado el interés no solo por lo polémico de su manejo, sino por la

presencia de proteínas con altos niveles de aminoácidos como triptófano, lisina,

y aminoácidos azufrados que le imparten un alto valor nutricional, incentivando

la realización de investigaciones orientadas hacia su aprovechamiento a escala

industrial (Monsalve y Gonzalez 2005).

En Colombia, en el año 2011, según ANALAC, la producción de leche se

estimó en 5595 millones de litros (Suarez et al. 2012, MADR et al. 2011).



12

Estudios señalan que la producción de leche en un día del año 2011, se estimó

en 12.979.075 litros, obtenidos de un total de 2.858.779 vacas en ordeño con

una productividad de 4,5 lts./vaca/día. Los departamentos que presentaron la

mayor producción de leche fueron: Antioquia (18,5%), Cundinamarca (16,3%),

Boyacá (11,7%) y Nariño (6,0%) (DANE-ENA 2011).

El Acopio industrial de leche (millones de litros), fue de 2.557 para el año 2010

y 2.669 para el año 2011, mostrando una variación del 4,40%; durante el primer

semestre del año 2012 (Salamanca, 2012), de igual modo, para el año 2010, en

los departamentos de Antioquia y Cundinamarca se registró un total de 10

millones de kg de queso comercializado, donde se obtuvieron aproximadamente

90.000.000 L de lactosuero (Martínez 2012).

Es poca la información actualizada que se consigue en cuanto a producción de

lactosuero, sin embargo, se opta por estimar el que se generaría durante la

producción del queso que es exportado, sumado al producido de manera

industrial para consumo interno, pero resulta imposible conocer las cifras

totales, si se considera que el generado a nivel artesanal en muchos casos no es

reportado. Del mismo modo, no se cuenta con datos concretos en cuanto a usos

o destino dado a este subproducto. Se sabe que Colombia exportó 50 toneladas

de leche en polvo a USA y Ecuador, 10 toneladas de Lactosuero a Bolivia y 372

toneladas de queso a otros países, estas exportaciones fueron realizadas solo por



13

las empresas Alpina y Colanta (Salamanca, 2012), con los destinos descritos en

la Figura 1.

.

Figura 1.Exportaciones de Quesos - Enero a Junio de 2012

Fuente: Salamanca, 2012

En Colombia, en el Departamento de Córdoba la producción industrial de leche

y sus derivados ha ido en aumento, de la mano con la expansión ganadera. Se

produce alrededor de 677.746 Litros de leche/día, de los cuales 77.544 son

procesados, 101.263 se destinan a autoconsumo y 498.939 es vendida; de esta

leche vendida, solo 237.098 se destina a la industria, y el valor restante es

tomado por intermediarios (DANE-ENA 2011).

Según Marinovich y Villadiego (2010), la relación entre el volumen de leche

empleada y de queso productivo oscila de 10.3 a 11.47 Kg/100 Kg de leche. De

acuerdo con la información de producción de leche en finca en Córdoba,

reportada en las encuestas nacionales agropecuarias de Minagricultura, del total

de la producción de leche diaria, alrededor de una quinta parte se destina a la



14

elaboración de queso: 9% procesada en finca y 11% por queseros

independientes.

Por lo tanto, se evidencia un alto nivel de informalidad empresarial, pues

alrededor del 80% de las empresas queseras no poseen registros de Cámara de

Comercio ni registro sanitario expedido por el INVIMA, pese a lo cual es

evidente que constituye un eslabón importante en la cadena láctea, al producir

alrededor de 61,0 toneladas de queso por semana, siendo una fuente no

despreciable de empleo e ingresos para una parte de la población; y este es un

producto ampliamente comercializado hacia mercados regionales y nacionales,

aproximadamente el 40% de la producción se destina a los mercados de

Medellín y Bogotá y el 60% restante para consumo interno (Castillo 2012 y

Cabeza 2011).

El Departamento de Sucre, donde la principal actividad económica es la

ganadería vacuna y se caracteriza por ser de tipo extensivo, escasa preparación

tecnológica, bajo nivel empresarial y de baja productividad, donde el principal

mercado de los productos lácteos se concentra en 11 de los 16 municipios,

ubicándose la mayoría de las empresas en la subregión sabanas y en los

municipios Sincelejo y San Marcos. El 83,3% de las industrias del sector lácteo,

en estas regiones son plantas de procesamiento que en su mayoría producen

queso doble crema o quesillo como también, se fabrica el queso costeño picado



15

o amasado, el suero y el yogurt (Gómez et al. 2010, Gobernación de Sucre,

2011).

Empresas productoras de quesillo o queso tipo mozzarella, fermentan de manera

espontánea el lactosuero obtenido en el proceso por un tiempo de 24 horas

aproximadamente, pero estas fermentaciones se producen de manera

incontrolada de modo que en algunos casos podría representar un riesgo para la

salud del consumidor su empleo en la coagulación, además, de ir en detrimento

de la calidad del producto obtenido.

El considerar esta situación, conlleva a la búsqueda de mecanismos para lograr

un aprovechamiento del lactosuero mediante la extracción de nutrientes o su

transformación en insumos o aditivos alimentarios y a plantear y analizar

alternativas como la propuesta en la presente investigación, que pretende

evaluar el proceso de fermentación de lactosuero ácido (entero y

desproteinizado), inoculado con bacterias lácticas como Lactobacillus casei

buscando determinar la influencia del tratamiento aplicado al lactosuero y del

porcentaje de inóculo adicionada en la producción de acidez, como alternativa

para el aprovechamiento de los nutrientes que este subproducto contiene en el

proceso de coagulación mixta aplicado en la elaboración de queso tipo

mozzarella; alternativa que podría conllevar a mejorar el proceso y producto

obtenido, al igual que al aprovechamiento de este importante subproducto



16

agroindustrial por parte de las plantas productoras de queso de pasta hilada,

pudiéndose posteriormente, replicar esta tecnología en otras queseras de la

región.

2.2 TIPOS DE LACTOSUERO

Existen varios tipos de lactosuero, dependiendo del origen de la leche, el queso

y las variaciones del proceso: se conoce como lactosuero ácido al proveniente de

la coagulación ácida y es el que se utiliza para la fabricación de quesos frescos o

de pasta blanda; y generalmente debe neutralizarse primero para la mayor parte

de sus aplicaciones y el contenido de lactosa se reduce a causa de la

fermentación láctica (ácido láctico). El lactosuero dulce, proveniente de la

coagulación enzimática (renina), y es un buen sustrato para todas las

utilizaciones o transformaciones. De modo que se dice que si en la coagulación

de la leche se utiliza enzimas, el lactosuero se denomina dulce, y si se remplaza

la enzima por ácidos orgánicos se denomina ácido (Parra 2009).

Según las propiedades fisicoquímicas, los lactosueros también pueden ser

clasificados como ácidos o dulces. En el primer grupo, se encuentran aquellos

que provienen de la fabricación de quesos frescos de pasta blanda, obtenidos a

partir de leche de vaca y/o de cabra; en ellos, la lactosa se ha transformado en

ácido láctico, son ricos en calcio y fósforo; el pH es < 4,5 y los Grados Dornic

son < 20 °. Un lactosuero Dulce, en cambio, proviene de la fabricación de



17

quesos de pasta cocida y prensada (vaca) y quesos de ovejas; pobres en calcio y

fósforo; el pH es > 6,0 y presentan > 50 ° grados Dornic (ºD) (Callejas et al.

2012). En la Tabla 1 se describe la clasificación de los lactosueros derivados de

la producción de queso, considerando su acidez.

Tabla. 1. Clasificación de los lactosueros según su acidez.

Tipo de suero Acidez Titulable

(%) Ácido Láctico

pH

Suero dulce 0.10 a 0.20 5.8 a 6.6

Suero medianamente ácido 0.20 a 0.40 5.0 a 5.8

Suero ácido 0.40 a 0.60 4.0 a 5.0

Fuente: Gutierrez 2006

Dado que el lactosuero ácido es obtenido de una coagulación ácida o láctica de

la caseína de la leche, presenta un pH próximo a 4,5 que se produce al alcanzar

el punto isoeléctrico de la caseína con anulación de las cargas eléctricas que las

mantienen separadas por las fuerzas de repulsión que generan, impidiendo así, la

floculación, lo que implica una total destrucción de la estructura micelar. Es un

suero muy mineralizado pues contiene más del 80 % de los minerales de la leche

de partida; en éste, el ácido láctico secuestra el calcio del complejo de

paracaseinato cálcico, produciendo lactato cálcico y el fosforo de la caseína se

encuentra bajo la forma de monoéster ortofosfórico de un aminoácido

hidroxilado (Callejas et al. 2012).



18

Por otro lado, los lactosueros ácidos y dulces pueden ser condensados, secados,

fermentados, deslactosados, desmineralizados y desproteinizados por medio de

tecnología como la ultra-filtración, ósmosis inversa, intercambio de iones y

electrodiálisis (Gutiérrez 2006). El lactosuero desproteinizado en su estado

natural ha sido poco estudiado, pese a los grandes volúmenes que se derivan del

mismo y los posibles usos que se le podría dar al mismo.

2.3 COMPOSICION Y CARACTERISTICAS

La composición de los lactosueros y de sus subproductos, puede depender de

las condiciones de producción, al igual que de la inclusión durante el proceso

industrial primario de bacterias ácido-lácticas y podrían determinar el destino

último de este subproducto en la producción de alimentos tanto para el consumo

humano como animal (Miranda et al. 2009).

El lactosuero de quesería contiene principalmente lactosa, proteínas como

sustancias de importante valor nutritivo, minerales, vitaminas y grasa. La lactosa

es el principal componente nutritivo (4,5 % pv-1

), proteína (0,8% pv-1

), y lípidos

(0,5%). La lactosa es el componente mayoritario de la materia seca de la leche,

de modo que el 95% de la lactosa se pierde en el lactosuero durante el proceso

de fabricación de quesos (Gutiérrez 2006). Este es un glucócido reductor que

pertenece al grupo de los diholósidos y está formada por la unión de una

molécula de α o β-glucosa y otra β-galactosa (Early 2004).



19

En la composición del lactosuero se encuentran las α-lacloalbúmina (20-44%),

β-lactoglobulina (44-52%), sero albúminas (5-7%), inmunoglobulinas (12-16%)

y proteosa-peptonas (19%). También, contiene la mayor cantidad de

aminoácidos esenciales (400 mg/g) siendo superior al huevo, y posee 32 mg/g

de aminoácidos azufrados con un valor superior al de la carne y la caseína

comparados nutricionalmente (Londoño et al. 2008; Smithers 2008; FAO 1985).

Estas proteínas son un conjunto de sustancias nitrogenadas que no precipitan a

pH 4.6, que corresponde al punto isoeléctrico de la caseína bruta, por lo que, se

les denomina también caseínas solubles; su valor nutritivo es de un 25 a 35%

superior que el de la caseína (Gutiérrez 2006).

En la Tabla 2. Se observa la composición de lactosueros dulce y ácido en sus

estados líquido y sólido.

Tabla 2. Composición porcentual de los lactosueros

Fuente: Restrepo 2006.

Componente Liquido Sólido

Dulce* Ácido** Dulce Ácido

Proteína 0.8 0.7 12 12

Lactosa 4.9 4.4 73.3 68.7

Minerales 0.5 0.8 7.9 11.5

Grasa 0.2 0.04 1.3 0.8

Agua 93 93.5 4.6 3.9

Ácido láctico 0.2 0.5 1.7 4.6

* Suero procedente de la coagulación enzimática de la leche (pH = 6.4)

** Suero procedente de la coagulación ácida de la leche (pH= 4.5)



20

A pesar que el lactosuero tiene un contenido proteico bajo, sus proteínas son de

alto valor biológico (por su contenido en triptófano, lisina y aminoácidos

azufrados), tienen una calidad igual a las del huevo y no son deficientes en

ningún aminoácido. Además, presenta una cantidad rica de minerales donde

sobresale el potasio, seguido del calcio, fósforo, sodio y magnesio. Cuenta

también con vitaminas del grupo B (tiamina, ácido patogénico, riboflavina,

piridoxina, ácido nicotínico, cobalamina) y ácido ascórbico (Londoño et al.

2008).

En la Tabla 3, se compara lactosueros ácidos entero y desproteinizado empleado

en la producción de ácido láctico a partir de suero de leche, utilizando

lactobacillus helveticus en cultivo continuo

Tabla 3. Caracterización de lactosuero ácido entero y desproteinizado

Parámetros Suero de leche fresco Suero de leche desproteinizado*

X±S X±S

Lactosa

(kg/m3)

44,2 0,1290 44,93 0,1290

Nitrógeno (%) 0,21 0,0050 0,12 0,0104

Proteínas (%) 1,34 0,0032 0,76 0,0048

Fósforo (%) 0,34 0,0221 0,35 0,0010

pH 5,45 0,0023 5,97 0,0098

X: Valor promedio. *Suplementado y ajustado su pH a 5,9

Fuente: Urribarrí et al. 2004



21

2.3.1 Características fisicoquímicas del lactosuero

La caracterización físico-química de los sueros de queso constituye un paso

importante en la utilización de estos subproductos de la industria láctea en los

distintos procesos industriales propios tanto de la alimentación humana como

animal.

Investigaciones realizadas en los sueros resultantes de la producción de quesos

en el Combinado de Quesos de la ciudad de Bayamo (Granma - Cuba),

demostraron que el suero de queso ácido presentaba un pH menor (Ácido: 4.220

± 0.500 vs. Dulce: 6.620 ± 0.800; p < 0.05); una mayor acidez (Ácido: 0.320 ±

0.020 vs. Dulce: 0.080 ± 0.020; p < 0.05); y un menor contenido de lactosa

(Ácido: 4.100 ± 0.050 vs. Dulce: 4.670 ± 0.600; p < 0.05) (Miranda et al. 2009).

Los lactosueros dulce y ácido evaluados, presentaron las características físico-

químicas descritas en la Tabla 4. Resaltando que las variedades de lactosuero

ácido se caracterizan por presentar un pH menor, una mayor acidez y un menor

contenido de lactosa (Miranda et al. 2009).

Tabla 4. Características fisicoquímicas de los lactosueros dulce y ácido.

Característica Lactosuero dulce Lactosuero ácido Especificación de calidad

pH 6.620 ± 0.800 4.220 ± 0.500 6.600 ± 0.600

Acidez (%) 0.080 ± 0.020 0.320 ± 0.020 0.100 ± 0.300

Densidad (gcm-3

) 1.025 ± 0.020 1.024 ± 0.010 1.024 ± 0.010

Materiaseca (%) 6.410 ± 0.700 6.400 ± 0.600 6.400 ± 0.211

Grasa (%) 0.330 ± 0.010 0.330 ± 0.020 0.330 ± 0.100

Proteínabruta

(%)

0.960 ± 0.040 0.940 ± 0.030 0.900 ± 0.500

Lactosa (%) 4.670 ± 0.600 4.100 ± 0.050 4.700 ± 0.700

Calcio (%) 0.530 ± 0.020 0.510 ± 0.020 0.500 ± 0.800

Fósforo (%) 0.330 ± 0.030 0.310 ± 0.020 0.300 ± 0.300

Fuente: Miranda et al. 2009.



22

2.3.2 Composición del lactosuero

En la Tabla 5 se encuentra detallada la composición porcentual del lactosuero

dulce y ácido. Estos se originan dependiendo principalmente de la eliminación

de la caseína, de modo que el denominado lactosuero dulce, está basado en la

coagulación por la renina a pH 6,5; mientras el llamado lactosuero ácido resulta

del proceso de fermentación o adición de ácidos orgánicos o ácidos minerales

para coagular la caseína como en la elaboración de quesos frescos (Jelen 2003).

Tabla 5. Composición porcentual del lactosuero dulce y ácido.

Componente Lactosuero dulce Lactosuero ácido

Sólidos totals 6,300 - 7,620 6,745 - 7,375

Agua 93,700 – 93,000 93,255 – 92,625

Lactosa 4,600 - 5,200 4,400 - 4,600

Proteína 0,600 - 1,000 0,600 - 0,800

Grasa 0,050 – 0,370 0,040 – 0,270

Minerales 0,500 0,800

Calcio 0,043 0,120

Fosfatos 0,137 0,065

Sodio 0,050 0,050

Cloro 0,110 0,110

Potasio 0,160 0,160

Ácido lactic 0,050 0,400

Fuente: Panesar et al.2007; Franchi 2010

2.3. USOS Y APROVECHAMIENTO DEL LACTOSUERO

El lactosuero presenta características nutricionales adecuadas para ser utilizadas

en alimentación, medicina y farmacología, constituyéndose en un sustrato

económico y atractivo para el procesamiento, demostrándose mediante

investigaciones la diversidad de usos posibles para este subproducto y



23

concluyéndose que es más beneficioso emplearlo que convertirlo en efluente

(Monsalve y Gonzales 2005). Su valor nutricional constituye una ventaja si se

piensa en su aprovechamiento, considerando su contenido de lactosa, fácilmente

fermentable, proteínas de excelentes propiedades funcionales y alto valor

nutritivo, su riqueza en potasio, calcio, fósforo, sodio y magnesio, y en

vitaminas del grupo B (Londoño et al. 2006).

A finales del siglo XX, el lactosuero se empleaba en la elaboración de productos

alimenticios como bebidas, cremas para untar, mantequilla, concentrado

proteínico, lactosa, proteínas en polvo, suero en polvo desmineralizado y

quesillo, entre otros (Londoño 2006). Del mismo modo, se han desarrollado

productos de exitosa aceptación debido a sus bajos costos de producción, grado

de calidad alimenticia y aceptable sabor, se encuentran las bebidas refrescantes,

bebidas fermentadas, y alcohólicas, proteína unicelular, biopeliculas, producción

de ácidos orgánicos, concentrados de proteínas, derivados de lactosa entre otros

(Londoño 2008; Lagua 2011).

Por lo anterior, el uso que se le puede dar al lactosuero varía desde la

producción como medio de cultivo, propagación de inóculo en las queserías,

producción de ácidos orgánicos, bebidas fermentadas (cerveza y vino),

producción de biopelículas a partir de proteínas del suero, producción de

probióticos y bacteriocinas, entre muchos más (Díaz et al. 2004).



24

Investigaciones realizadas en el estado de San Luis Potosí en México,

evidencian o establecen que a pesar de las numerosas investigaciones realizadas,

en la actualidad, no se ha desarrollado ningún proceso capaz de dar rentabilidad

de las importantes cantidades de suero que se producen y vierten cada año,

representando un importante problema medioambiental debido a su elevada

carga orgánica (Reyes et al. 2008). Si se considera que 0,25-0,30 litros de suero

sin depurar equivalen, aproximadamente, a la contaminación de las aguas

residuales correspondientes a un habitante/día; y que una industria quesera

media de cualquier país que produzca diariamente 400.000 litros de suero sin

depurar, está produciendo una contaminación diaria similar a una población de

1.250.000 habitantes, y que la eliminación de los sueros lácteos a los ríos está

prohibida, moral y legalmente, se tiene obligatoriamente que pensar en que hay

que seguir dos caminos: aprovechamiento íntegro del suero o depuración del

mismo (Ronda 2000).

La depuración es muy costosa y las industrias queseras no pueden pagar tan alto

valor, por lo que, la concentración de la industria quesera agrava el problema.

Por otra parte, el lactosuero, depurado, biológica y mecánicamente, siempre

aporta sustancias residuales que contaminan los ríos (sales minerales) (Berruga

1999). Sin embargo, no hacer uso del lactosuero como alimento es un

desperdicio de nutrientes, por su alto valor nutricional y por cada 1000 L de



25

lactosuero se puede extraer 9 kg de proteína, 50 kg de Lactosa, 3 kg de grasa,

los cuales constituyen los requerimiento/día de 130 personas y de energía/día de

100 personas (Pérez 2008).

Considerando lo anterior, se ha desarrollado tecnologías basadas en el

aprovechamiento de nutrientes; e investigadores y expertos realizan un llamado

a que la industria quesera tenga opciones para usar el lactosuero como base de

alimentos, preferentemente para el consumo humano, con el fin, de no

contaminar el medio ambiente y de recuperar con gran margen el valor

monetario del lactosuero (Díaz et al. 2009).

Estudios recientes han demostrado la diversidad de usos nutricionales de este

subproducto, concluyéndose que es más beneficioso emplearlo que convertirlo

en afluentes, de igual modo, se ha estudiado ampliamente la aplicación de

mecanismos como la coagulación de proteínas lactoséricas mediante

acidificación, con calcio y tratamientos térmicos, obteniéndose productos, como

el requesón, ricottone ó Ricotta, económicos y deseables para los consumidores

(García et al.2002; Londoño et al.2008).

Se obtuvo quesos tipo Mysost, empleando los sólidos del lactosuero sin requerir

grandes inversiones económicas, mediante un proceso de concentración de

sólidos, similar a la fabricación de dulce de leche, adquiriendo incluso el color



26

del mismo, debido a las reacciones de oscurecimiento no enzimático, y que

puede ser formulado con textura para cortar o untar (Inda 2000).

El lactosuero en polvo, puede sustituir el agregado de leche en polvo

descremada, aportando proteínas de alta calidad a casi la mitad del costo y

reduciendo el agregado de endulzantes al reemplazarlos por la lactosa, siendo

los lactosueros y concentrados proteicos ampliamente utilizados como

ingredientes versátiles en elaboración de alimentos, para mejorar su calidad y

funcionalidad y los efectos benéficos para la salud (Moreau 2003)

En la actualidad se utiliza lactosuero en la fabricación de alimentos lácteos

(helados, yogur, untables), productos cárnicos (carnes procesadas, embutidos),

panificados (bases para pasteles, galletas, barras nutritivas), productos de

confitería, entre otros (Ronda 2000).

Por lo tanto, es importante darle una buena utilización a este subproducto de la

industria quesera, con el fin, de disminuir la contaminación ambiental que está

causando y así generar valor agregado.



27

2.4 APROVECHAMIENTO BIOTECNOLOGICO DEL

LACTOSUERO

En la actualidad, la legislación prohíbe el vertimiento directo del suero a los

cursos de agua sin un tratamiento previo, que consiste principalmente en la

remoción de la lactosa y las proteínas; sin embargo, son estos componentes los

más valiosos en el momento de aprovechar el lactosuero, por lo que resulta un

inmenso desperdicio de nutrientes no usarlo como alimento o como medio de

cultivo para fermentaciones industriales (Sanchez et al. 2004).

Los procesos biotecnológicos son una excelente alternativa en la biodegradación

de desechos, convirtiéndolos en materias primas para la obtención de

importantes productos de consumo y perfilarse como una herramienta para el

control de residuos contaminantes (Caselles et al. 2003). Lactosueros no salados

pueden utilizarse para la fabricación de bebidas refrescantes energéticas;

consideradas bebidas nutricionales análogas de la leche, ideales para programas

gubernamentales (Lagua 2011).

Por otro lado, los suplementos nutricionales y los probióticos han encontrado

nichos importantes en la industria de alimentos y la industria farmacéutica

(Nerlich y Koteiko, 2008; Pham y Day 2008; Rosmini et al. 2004). Resulta

entonces atractivo dirigir hacia estos destinos los esfuerzos por conferir valor a

los productos derivados del suero de leche; trabajos de este tipo fueron



28

desarrollados en México donde se determinó la factibilidad de la obtención de

proteína liofilizada y biomasa probiótica liofilizada a partir de suero de leche de

cabra empleando Lactobacillus casei; y mediante la aplicación de procesos de

ultrafiltración se logró la obtención de un permeado conformado por una alta

relación proteína/lactosa.

Esta proteína luego de ser liofilizada presentó características de solubilidad

superiores a productos comerciales similares y además, demostró ser fácilmente

empleable como medio de cultivo para el crecimiento del microorganismo

probiotico L. caseí (Aguirre et al. 2009)

En Egipto se evaluó el efecto de condiciones de fermentación en la producción

de ácido cítrico a partir de suero de queso, empleando cepas de Aspergillus

niger, y durante la fermentación fueron medidos aspectos como lactosa

utilizada, concentración de ácido cítrico, coeficiente de transformación de

lactosa en ácido cítrico, y peso seco del micelio, obteniendo una concentración

máxima de ácido cítrico y coeficiente de conversión con lactosuero inoculado

con A. niger CAIM 167 a pH de 3,5 luego de 9 días de fermentación y de

adición de 4% de metanol en el medio de fermentación (Y. A. El-Samragy et

al.1995).



29

En la Universidad de Oviedo España, se trabajó con el lactosuero en polvo o

permeado, como substrato de fermentación alcohólica empleando la cepa

Kluyveromyces fragilis, el producto puede emplearse en la elaboración de

bebidas para consumo humano al igual que etanol industrial, obteniéndose una

concentración, de alcohol superior a la de la sidra y cervezas comunes.

También, se empleó como sustrato en una fermentación acética, obteniéndose

vinagre de grado alimentario que puede emplearse en la elaboración de

conservas e incluso para consumo directo (Parrondo 2001).

Investigadores del Centro Universitario de Ciencias Exactas e Ingenierías

(CUCEI) de México, desarrollaron procesos de producción de ácido propiónico

a partir de lactosuero y glicerol usando bacterias inmovilizadas. Este ácido, es

utilizado como aditivo en alimentos, agente antimicrobiano para conservación

de quesos, mantequillas, embutidos, panes, pasteles, cereales y similares. Estas

investigaciones, señalan la fermentación microbiana como una ruta atractiva

para producir ácido propiónico a partir de fuentes renovables (Marcelli 2000).

En Colombia, en la Universidad libre de Barranquilla, se realizó un estudio

basado en la biotransformación del lactosuero con microorganismos de Kéfir

para la obtención de una bebida refrescante tipo lácteo (Caselles 2003), en

ecuador se desarrolló una investigación similar, en la cual se elaboró una bebida

nutricional con pulpa de maracuyá (pasiflora incarnata), y suero láctico, en la



30

planta procesadora de frutas y hortalizas de la Universidad Estatal de

Bolívar (Lagua 2011).

La Universidad de Caldas de Manizales, adelantó una investigación empleando

hongos del género Aspergillus con miras al aprovechamiento del lactosuero y a

la reducción del impacto ambiental que causa el vertimiento de este subproducto

en cuerpos de agua. Se evaluó la biosíntesis de ácido cítrico a partir de suero de

leche modificado mediante diferentes tratamientos, (desproteinización, hidrólisis

y evaporación), obteniéndose que las cepas de A. carbonarius no presentaron

diferencias significativas en la formación del ácido, mientras A. niger NRRL 3

alcanzó mayores concentraciones cuando se utilizó suero de leche

desproteinizado, evaporado y con lactosa hidrolizada con â -galactosidasa. A.

carbonarius arrojó concentraciones promedio de ácido cítrico mayores que A.

niger (Sanchez et al. 2004).

De madera similar, en la Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín, se

elaboró una bebida fermentada con adición de pulpa de maracuyá a partir del

lactosuero (Flórez y Peña 2001; Londoño et al. 2008), también se empleó la

biotransformación del lactosuero con un conjunto de microorganismos de

genero kéfir para obtener una bebida refrescante de tipo lácteo (Caselles y Vega

2003) y una bebida fermentada de suero de queso fresco inoculada con

Lactobacillus casei (Londoño et al. 2008).



31

En la Universidad Popular del Cesar, se desarrolló una investigación de tipo

descriptiva-experimental con enfoque cuantitativo, en la cual se evaluó la

obtención de etanol por fermentación de lactosuero con dos tipos de levaduras

(Candida kefyr y Saccharomyces cerevisiae), variando la temperatura (28, 31 y

34ºC), lográndose una productividad máxima del 6,8% de etanol con la levadura

Candida kefyr a 34°C, durante un tiempo de 192 horas; al realizar análisis

fisicoquímicos al etanol obtenido, demostró características fisicoquímicas

favorables; y un estudio de viabilidad técnica y económica, que el proceso es

económicamente viable (Orozco et al. 2012).

En la Universidad de Córdoba se obtuvo una bebida deslactosada y fermentada a

partir de lactosuero proveniente de la elaboración de queso costeño, enriquecida

con L-glutamina, hidrolizado con β-galactosidasa, adicionada con pulpa

comercial de maracuyá y estabilizantes. Encontrándose que los tratamientos con

β-galactosidasa conllevan a el mismo grado de hidrólisis; se observó que la

relación bebida deslactosada y fermentada/pulpa preferida por los consumidores

fue aquella donde la pulpa de maracuyá aportó el 7,5% de los sólidos

solubles. La bebida obtenida cumplió con los requerimientos de la normatividad

colombiana hasta los 14 días de almacenamiento que podría brindar al cuerpo

humano parte de los beneficios funcionales referenciados por el aminoácido

L-glutamina (Martínez 2012).



32

Se ha aplicado procesos de bioconversión al lactosuero empleando bacterias del

genero Lactobacillus obteniendo ácidos orgánicos de alto valor comercial que

son ampliamente demandados a nivel industrial (Jakymec et al. 2001). De igual

modo, se ha discutido el uso de ácidos orgánicos (acético, láctico, propiónico)

para acidificar directamente la leche y acelerar el tiempo de acidificación de la

cuajada en queso Mozzarella (Kimura et al.1992, Kiely et al.1992). Debido a

que el tipo de ácido afecta significativamente la composición química, textura,

sabor y color, obteniendo quesos con alto contenido de humedad (Shehata et

al.1989), también en quesos como el Oaxaca (queso de pasta hilada elaborado

artesanalmente en México), ha sido evaluado el efecto de la adición de suero

fermentado a la leche y cuajada a diferentes porcentajes, para disminuir el

tiempo de acidificación de la cuajada y evaluar las características fisicoquímicas

y sensoriales del queso (Aguilar et al.2006).

Más allá de las soluciones biotecnológicas a las que se somete el lactosuero en

la actualidad, se han buscado otras vías de salida a este residuo y se ha

modificado la bacteria Lactobacillus casei mediante técnicas de manipulación

genética, para que sintetice dos compuestos químicos el diacetilo y la acetoína

muy utilizados como aditivos aromáticos en la industria alimentaria (Pelayo

2009).



33

En investigaciones realizadas con el objetivo de desarrollar una bebida

fermentada a partir del lactosuero fresco, inoculado con un cultivo liofilizado

estandarizado para kéfir que en su composición contenía Lactobacillus casei y

otros microorganismos, se obtuvo una bebida refrescante con características

similares al kéfir. En el proceso de elaboración de esta bebida, se empleó una

combinación de 5% de sacarosa y 25% de inóculo, con un tiempo de

fermentación de 24 horas y una temperatura de -2 a 24 ºC (Caselles y Vega

2003).

Mientras que en otras investigaciones se elaboró una bebida fermentada

inoculada con Lactobacillus casei y saborizada con pulpa de maracuyá

(Passiflora edulis), en la cual se evaluó la viabilidad del microorganismo. En

esta experiencia se utilizó medios de cultivos selectivos bajo condiciones

anaeróbicas, simulando así, las condiciones del tracto gastrointestinal de los

humanos y se verificó la supervivencia durante un período de almacenamiento;

observándose que la composición físico – química de la bebida, almacenada a

4°C, no tuvo una variación significativa durante el período de 21 días de

conservación, los microorganismos permanecieron viables, obteniendo valores

superiores a 106 ufc·g-1

. La bebida tuvo un nivel de aceptación bueno,

obteniendo el calificativo de “Me gusta” (Londoño et al. 2008).



34

La aplicación de procesos biotecnológicos permite obtener sustancias con

interesantes aplicaciones en la industria de alimentos, química y farmacéutica;

como es el caso del ácido L (+) láctico cuya demanda mundial ascendió en el

2007 a 130-150 TM/año, estimando un crecimiento del 10 al 15% anual (Araya

et al. 2010). Razón por la cual, investigaciones como la realizada por García

(2012) quien desarrolló un modelo cinético para la producción de ácido láctico a

partir de lactosuero utilizando Lactobacillus casei en un cultivo batch;

observándose adecuadas condiciones de producción a una temperatura de 37 ºC

y pH de 6.5. Se estableció que los modelos basados en Monod no logran

describir las etapas del crecimiento del microorganismo empleado, mientras que

al aplicar los modelos reparametrizados logísticos, Gompertz y Baranyi se

observa un mejor ajuste.

2.5. PRODUCCIÓN DE ÁCIDO LÁCTICO A PARTIR DE

LACTOSUERO

El ácido láctico es un valioso producto en la industria de alimentos y también

como materia prima en la industria química, lo mismo que sus sales, como el

lactato de sodio, calcio, hierro y antimonio principalmente. Este, tiene un amplio

rango de aplicaciones en la industria alimenticia, farmacéutica, química, y

cosmética, entre otras, por lo que recientemente se ha acelerado la investigación

en L(+) y D(−) ácido láctico por vía biotecnológica, debido a su posibilidad de



35

transformación en poliláctido biodegradable (PLA). Por lo que, los esfuerzos en

la investigación del ácido láctico, están enfocados a disminuir los costes de

producción a través de nuevos sustratos, nuevas tecnologías de fermentación y

separación y nuevos microorganismos capaces de alcanzar altas concentraciones

de ácido láctico, altos rendimientos y altas productividades (Parra 2009).

Uno de los sustratos es el lactosuero que ha sido un medio de cultivo para la

producción de ácido láctico por vía biotecnológica (Ghasemi et al. 2009), la

fermentación láctica ha sido típicamente conducida en modo batch utilizando

cepas homofermentativas de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, y

Lactobacillus casei donde fuentes de complejos nutricionales como licor de

maíz, malta o extracto de levadura pueden ser suplementados al medio

(Wit 2003; Serna y Rodríguez 2005). En la Figura 2. Se esquematiza la reacción

mediante la cual se obtiene ácido láctico a partir de lactosa, considerándose

como su evolución más frecuente, y a la vez, más importante, llevada a cabo por

las bacterias lácticas.

Figura 2.Produccion de ácido láctico a partir de lactosa

Fuente: Spreer 1991



36

Las bacterias lácticas como L. casei usualmente metabolizan la glucosa por la

vía Embden-Meyerhof, dando como resultado dos moléculas de ácido láctico de

cada molécula de glucosa con un rendimiento mayor a 0,9 gg-1

(Garcia et al.

2010).

En la Figura 3 se muestra la estequiometria clásica de la fermentación

homoláctica.

Figura 3. Ecuación estequiometrica de producción de ácido láctico

Fuente: Salminen 1993; Serna y Rodriguez 2005

Es así, como la fermentación de lactosuero por bacterias ácido lácticas podría

disminuir el contenido de lactosa produciendo principalmente ácido láctico y

otros metabolitos como componentes aromáticos contribuyendo al sabor y

textura e incrementado la solubilidad de carbohidratos y el dulzor final del

producto (Pescumma et al. 2008).

El lactosuero es un medio de cultivo con la lactosa como fuente de carbono, por

ello se utiliza en innumerables procesos fermentativos para la producción de

etanol, ácido acético, ácido láctico, ácidopropiónico, ácido gluconico, ácido

succínico, ácido cítrico, glicerol, proteína unicelular, enzimas (β-galactosidasa o



37

lactasa), grasas y aceites, butanol y acetona, polisacáridos extracelulares y

vitaminas, entre otros (Giraldo 2007; Lopez et al. 2005; Parra 2009). Surgiendo

los procesos de bioconversión como una alternativa para el aprovechamiento de

este subproducto como sustrato para el crecimiento de muchos

microorganismos. Streptococcus thermophilus, Lactobacillus helvetiens,

Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y lactobacillus delbrueckii ssp

lactis son capaces de producir sustancias como el ácido láctico, ampliamente

usado en la industria alimenticia, farmacéutica, textil y cosmética (S.A EL-

AASAR 2006; Wittcoff, 2000; Reyes y Franco 2006; Londoño et al. 2008).

En Zulia Venezuela, se ha producido ácido láctico a partir de suero de leche,

utilizando Lactobacillus helveticus en cultivo continuo, revelando el potencial

uso del lactosuero como sustrato para bacterias homolácticas (Urribarrí et al.

2006).

Almario y Pérez (2008), evaluaron el rendimiento y características de calidad

del quesillo mediante el empleo de cepas de cultivos lácticos mixtos

obteniéndose como resultado que la utilización de Streptococus thermophilus,

Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y Lactobacillus helveticus

inoculados al lactosuero entero y desprotenizado permiten alcanzar niveles de

acidez requeridos para la elaboración del quesillo.



38

Urribarn et al. (2004). Realizaron estudios sobre el comportamiento en cultivo

continuo de la bacteria Lactobacillus helveticus ATCC 8018 en suero de leche

desproteinizado suplementado con extracto de levadura y peptona tripsina de

caseína, obteniendo como resultado una máxima productividad de biomasa y

ácido láctico de 6.2 y 1.83 Kg/m3.h respectivamente y un D=0.2h-1,

revelándose así, el potencial del uso del lacto suero como sustrato para bacterias

homolacticas.

En Sucre (Colombia), investigaciones realizadas sobre la fabricación de quesos

de pasta hilada revelaron que esta labor se realiza mediante adición de suero

ácido, el cual se manipula en forma inadecuada, poco higiénica permitiendo su

contaminación. Sobre lo cual investigaciones realizadas por la Universidad de

Sucre al proceso de elaboración de queso costeño revelan que en la mayoría de

los casos, la fermentación del lactosuero se efectúa de manera inadecuada

favoreciendo la contaminación del suero ácido, de la masa de la cuajada y del

producto final, debido al desconocimiento de las personas involucradas en el

oficio (Chávez y Romero 2006).

Otras investigaciones realizadas en esta misma Institución sobre la producción

de queso costeño a partir de la acción fermentativa de cultivos lácticos,

arrojaron mejores resultados en cuanto a las propiedades fisicoquímicas y

organolépticas del producto final, en comparación a las del queso costeño



39

elaborado mediante el empleo de suero ácido en forma tradicional (Contreras y

Salgado 2006). Por lo que, se hace necesario profundizar en cuanto al

aprovechamiento de lactosueros empleando bacterias ácido lácticas para su

empleo en la elaboración de quesos de pasta hilada como el quesillo, reduciendo

así, los costos de producción y los riesgos sanitarios de emplear lactosueros

fermentados de manera espontánea.

El empleo de suero acidificado de manera controlada utilizando microrganismos

productores de ácido láctico, se perfila como una alternativa mucho más

eficiente que la que actualmente se viene aplicando por empresas productoras de

quesillo o queso tipo mozzarella, que fermentan de manera espontánea e

incontrolada, por aproximadamente 24 horas, y representan un riesgo para la

salud de consumidores al emplear este suero en la elaboración de lotes

posteriores de quesos, además, de ir en detrimento de la calidad del producto

obtenido.

2.6. Lactobacillus casei COMO PRODUCTOR DE ÁCIDO LACTICO

El Lactobacillus casei, es un microorganismo que se encuentra ampliamente

distribuido en la naturaleza, ha sido aislado de leche cruda, productos lácteos

como quesos, leches fermentadas, vegetales frescos y fermentados; habita en la



40

boca, vagina y en el tracto intestinal de varios animales, donde no afecta al

organismo, más bien lo beneficia.

Se ha comprobado que el Lactobacillus casei tiene efectos benéficos sobre el

sistema defensivo del cuerpo pero no existen pruebas suficientes que determinen

su eficacia en la protección ante determinadas enfermedades como la gripe o los

resfriados , por lo que además, de su empleo como productor de ácido láctico, es

un probiotico, cuya ingestión regular reduce los niveles de colesterol sérico,

ayuda a prevenir ciertos tipos de cáncer y mejora las funciones digestivas e

intestinales, entre otras características (Londoño et al. 2008).

Este es un bacilo de tamaño mediano de 1-2.5 μm de largo con un diámetro de

aproximadamente 0.5 μm, aunque, en general su tamaño varia durante el

cultivo; a veces en etapas tardías del cultivo se ha llegado a observar células de

más de 4 μm de largo, son microrganismos de rápido crecimiento con pequeños

genomas; no presenta flagelo o cilios, ni cápsula, y su pared celular es de entre

20 y 30 nm de ancho (Rojas 2009; Takahashi 1999; Gutiérrez 2006).

Es una bacteria anaerobia facultativa, Gram-positiva, mesófila

homofermentativa, produce ácido L-láctico, como producto principal de la

fermentación y la estructura de peptidoglicano de su pared celular es del tipo

Lisina-Aspartato. Se ha usado ampliamente en la industria alimentaria como un



41

probiótico, debido a su capacidad de sobrevivir al jugo gástrico; ha probado ser

más resistente que otras bacterias ácido lácticas a pH bajo, pudiendo demostrar

su adecuado desempeño a amplios rangos de pH y evidenciando que a pH de 6,0

a 6,5 no tiene un efecto significativo en la producción se ácido láctico (Kandler y

Weiss 1986; Aguirre 2009; García 2012),

Las bacterias ácido lácticas son generalmente clasificadas en homofermentativas o

heterofermentativas, las primeras pueden a su vez dividirse en homofermentativas

obligadas y homofermentativas facultativas, estas últimas pueden cambiar a

heterofermentativas cuando cambian las condiciones del cultivo. El Lactobacillus

casei se encuentra en el grupo de las bacterias homofermentativas facultativas, ya

que produce trazas de ácido acético y etanol (Morishita y Deguchi, 1999). La

mayoría de especies pertenecientes a este género tienen alta tolerancia a pH por

debajo de 5.0, que les da una ventaja competitiva sobre otras bacterias; respecto a la

temperatura, 28 °C su temperatura óptima, pero para la producción de ácido láctico,

prefiere de 28 a 35 °C (Nabi y Ardalan 2004) y reportando su máxima producción

a 37 °C (Garcia 2012).

Cuando Lactobacillus casei, se cultiva en medio con glucosa o lactosa como

principal fuente de carbono, produce ácido láctico como el producto predominante

de la fermentación, es un microorganismo de metabolismo simple y relevancia

industrial (Morishita y Deguchi 1999).



42

En la Tabla 6 se presenta la producción de ácidos orgánicos láctico, acético y

etanol por lactobacillus casei.

Tabla.6. Producción de ácido láctico, acético y etanol por lactobacillus casei

Tiempo de

incubación

Ácido láctico (mg/L) Ácido acético (mg/L) Etanol (mg/L)

24 horas 6 600 150 3.6

72 horas 154 010 200 3.0

Fuente: Morishita y Deguchi 1999

En la Tabla 7. Se establece la relación entre las características del sustrato,

microorganismo y condiciones de producción de ácido láctico de acuerdo a

varias investigaciones donde se emplea el lactosuero.

Tabla. 7 Producción de ácido láctico a partir de lactosuero.

Fuente: García 2012



43

La fermentación de determinados azúcares, empleando lactobacilos produce

ácido láctico, por lo que se obtienen productos como el yogur a partir de la

leche. La viabilidad o la rentabilidad o el éxito de la producción biotecnológica

de ácido láctico está sujeta a que las materias primas tengan las siguientes

características: baratas, bajos niveles de contaminantes, rápidas tasa de

producción, alto rendimiento, subproductos formados, capacidad para ser

fermentado con poco o ningún pre-tratamiento y disponibilidad durante todo el

año. Se han usado materias primas baratas para la producción económica del

ácido láctico, entre estos materiales están los celulósicos, los amiláceos, el

lactosuero y la melaza.

En la Figura 4 se muestra la ruta metabólica de una fermentación heteroláctica

(Parra 2010).

Figura 4. Fermentación Heteroláctica

Fuente: Parra 2010



44

3. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1. TIPO DE INVESTIGACIÓN

Se desarrolló una investigación de tipo experimental

3.2. LOCALIZACIÓN DEL PROYECTO

El estudio se realizó en la Planta piloto de Operaciones unitarias de la

Universidad de Sucre, ubicada en la granja los Pericos en el municipio de

Sampués – Sucre, Colombia. Los análisis fisicoquímicos se desarrollaron en los

laboratorios de bromatología y bioingeniería y laboratorio de microbiología de

la Universidad de Sucre, al igual que en el laboratorio de control de calidad de la

empresa COLQUESOS ubicado en Sincelejo – Sucre.

3.3. MATERIALES EMPLEADOS

Los dos tipos de lactosuero, se obtuvieron en la elaboración de queso tipo

Mozzarella, (lactosuero ácido entero) y a partir del proceso de obtención de

requesón (lactosuero ácido desproteinizado) desarrollado por la empresa

COLQUESOS de la ciudad de Sincelejo – Sucre.

El microorganismo empleado en la investigación para promover la fermentación

fue la bacteria Lactobacillus casei ATCC 393 (Liofilizada), suministrada por la



45

American Type Culture Colection (ATCC) (Anexo A), esta bacteria fue

seleccionada por ser de fácil manejo, tener la habilidad para fermentar una

amplia variedad de fuentes de carbono, además de ser económica, de fácil

consecución y presentar altos rendimientos en producción de ácido láctico.

3.4. PROCEDIMIENTO DE LA INVESTIGACIÓN

3.4.1. Obtención del lactosuero

700 ml de cada tipo de lactosuero fueron tomados a manera de muestra para

cada repetición; estos fueron mantenidos en refrigeración por una (1) hora,

previo al desarrollo de los experimentos.

3.4.2. Caracterización de los lactosueros utilizados

Los lactosueros fueron caracterizados siguiendo los protocolos de análisis

fisicoquímico que se enuncian en las técnicas referenciadas en la Tabla 8. Las

mediciones fueron realizadas en base húmeda.

En el Anexo B, se observa evidencias fotográficas de las técnicas utilizadas para

la caracterización fisicoquimica efectuada a los lactosueros objeto de estudio.



46

Tabla 8. Análisis fisicoquímicos

ANÁLISIS MÉTODO

Acidez AOAC 947.05/09 adaptado (Jaramillo, 1994)

Densidad AOAC 925.22, 1990

pH AOAC 981.12/90

Sólidos Totales AOAC 925.105/90 adaptado

Proteína AOAC 920.05/90 adaptado

Nitrógeno AOAC 976.06/90

Materia grasa AOAC 989.04/90 adaptado CAA, Tomo II, 13-8, 1989

Cenizas AOAC 945.05/90 adaptado

Lactosa AOAC 16051/84

3.4.3. Proceso de fermentación

Activación del microorganismo y mantenimiento del cultivo. Cepas

liofilizadas de Lactobacillus casei, fueron activadas según las instrucciones del

inserto (Anexo A), en agar MRS (Merck) (Anexo C), para lo cual se adicionó

una asada de microorganismos, en 20 ml de caldo MRS e incubada por 2 días a

37oC y 90 rpm (Hujanen y Linko 1996; Vicente et al. 2009). A partir de cultivo

obtenido, se realizaron repiques periódicos tomando las cepas de trabajo,

extrayendo una asada del medio líquido que fue extendida sobre la superficie de

una caja de petri con agar MRS, e incubada a 37°C durante dos días y

posteriormente almacenada a 4°C (Hujanen y Linko 1996).

Preparación del Cultivo Madre. El cultivo madre se preparó empleando 800

ml de leche entera UHT que fue calentada a 37°C e inoculada con 5 a 6 asadas



47

asadas del caldo de cultivo de la cepa Lactobacillus casei ATTC® 393TM

activado el cual tenía una turbidez del estándar de 0.5 de McFarland que

contiene aproximadamente 1 a 2 x 106 UFC/mL, y luego se llevó a cabo la

incubación a 37°C, por el tiempo necesario para la formación de un coagulo

transparente y firme; característica que fue tomada como referencia,

considerando que las bacterias ácido lácticas como Lactobacillus casei en

productos alimenticios como la leche, forman gelificación, además, producen un

sabor ácido, inhibición de organismos patógenos, reducción de contenido de

lactosa, formación de aromas, entre otros (Parras 2010). Desde el momento de la

siembra, hasta la formación del coagulo, se realizaron mediciones de la biomasa

con Cámara de Neubauer, cada 2 horas, de igual modo, se midió la acidez, cuyo

incremento en el tiempo demostraba la viabilidad de las bacterias, facilitándose

la estimación del comportamiento del microorganismo hasta un crecimiento

mayor a 108

UFC mL-1

.

Para el control se tomaron 100 ml de leche entera UHT a 37ºC, que fueron

dejadas en incubación sin la siembra del microorganismo de modo que se

pudiera comprobar la no existencia de contaminación por presencia de otra

cepa. Inicialmente se realizó un preensayo en el que se sometía a esterilización

la leche UHT a emplear, lo cual teóricamente es innecesario si se considera que



48

ya fue sometida a un tratamiento térmico severo, pero se observó que esta sufría

desproteinizacion, formándose grumos y afectando el crecimiento de la cepa.

Pretratamiento de lactosueros y Preparación del Cultivo de adaptación

(Preinóculo). Para desarrollar el proceso de fermentación, el lactosuero ácido

entero debió ser sometido a un proceso de pasteurización lenta hasta alcanzar

una temperatura de 60°C por un tiempo de 30 minutos a fin de disminuir la

carga bacteriana, lo que garantiza el crecimiento del cultivo seleccionado, sin

lograr la desproteinizacion del mismo; posteriormente este fue enfriado hasta

37°C. Para el caso del lactosuero de requesón, por proceder de un tratamiento

térmico severo, no se consideró conveniente pasteurizarlo. Los lactosueros

empleados en la investigación se consideraron higiénicamente confiables, ya

que la empresa Colquesos controla sus procesos para alcanzar la inocuidad del

producto; cuenta con alta tecnología y con certificación en HACCP e ISO

9000:2000; además, se manejó adecuadamente las muestras desde el momento

de su recolección, transporte y aplicación de tratamientos de fermentación.

Se preparó un cultivo de adaptación (Preinóculo) para cada uno de los

lactosueros, empleando un 10% del cultivo madre y adicionando los lactosueros

hasta completar 1000 ml de cultivo de adaptación. El lactosuero se utilizó sin

suplementar, debido a que se pretendía conocer su comportamiento con su

composición normal (Alvarez y Aguirre 2008); mas sin embargo se realizaron



49

preensayos en los cuales se determinó que el desarrollo de esta fermentación era

viable en ese estado.

Se realizaron mediciones de pH, acidez y recuento de microorganismos por

Cámara de Neubauer, en intervalos de una hora, se consideró que los cultivos

presentaban condiciones óptimas para ser inoculados al observar un conteo

superior a 108 UFC mL

-1, momento en el cual se suspendió la fermentación por

una disminución lenta de la temperatura a 4ºC. Los preensayos realizados

demostraron que se alcanzó el conteo de deseado (108 UFC mL

-1 de L. casei)

alrededor de las 12 horas.

Proceso de fermentación batch. La fermentación se llevó a cabo en 6

montajes diseñados siguiendo las especificaciones del FERMENTADOR

AEROBIO – ANAEROBIO TECFERM 2L serie 0204, fabricado por Tecferm y

distribuido por PBM Colombia en el año 2003, tal como se observa en el

Anexo B (Figura 28). Estos permitieron el desarrollo simultaneo de las

repeticiones necesarias, realizando control de temperatura y aplicando una

agitación de 120 rpm (Lee 2004; Serna y Naranjo 2005; Serna y Rodríguez

2005, 2007), durante 96 horas; en investigaciones similares, se demostró una

disminución en la absorbancia y en el recuento de microorganismos vivos a

partir de las 96 horas (Escobar et al. 2010).



50

La temperatura de fermentación en todos los experimentos fue de 37ºC (Serna y

Rodríguez 2005; Aguirre et al. 2009; Escobar et al. 2010; García 2012); ambos

tipos de Lactosuero fueron inoculados con cepas del cultivo de Lactobacillus

casei, en un 5, 10 y 15% (vv-1

) de los 700 ml en cada repetición, bajo

condiciones asépticas; es decir, el volumen final de cada ensayo fue de

700 ml. Para el control, se sometieron ambos lactosueros a las mismas

condiciones de fermentación, pero sin la adición de microorganismo.

El Lactobacillus casei puede autoinhibirse, por producto (ácido láctico) en el

lactosuero (Aguirre et al. 2009; Aguirre et al. 2010), por lo tanto, se realizó una

serie de preensayos para determinar el pH óptimo de desarrollo de este

microorganismo, para lo cual se adicionó NaOH 0.1 N con el fin de estabilizar

los lactosueros a un pH 5.7. En estas condiciones, se realizaron prensayos del

proceso de fermentación, sin embargo, la acidez del medio durante las primeras

22 horas no aumento significativamente, y solo a partir de las 34 horas de

fermentación, se observaba un cambio en la acidez en ambos sueros.

Simultáneamente se realizaron preensayos sin modificación del pH, observando

que la acidez aumentaba de manera considerable, razón por la cual se optó por

trabajar con el pH inicial de los sueros. Otras investigaciones reportan que el pH

óptimo para la producción de ácido láctico en los lactosueros varía entre 5 y 7

(Vijayakumar et al. 2008).



51

3.4.4. Seguimiento de la fermentación

Se realizó un seguimiento de la fermentación mediante un monitoreo de los

parámetros, consumo de sustrato, recuento en placa, acidez desarrollada,

contenido de nitrógeno y proteína y estimación de parámetros cinéticos, tal

como se describe a continuación. Tomando mediciones cada 2 horas durante las

primeras 10 horas y luego cada 12 horas hasta completar 96 horas de

fermentación. Es decir, se realizaron mediciones a las 2, 4, 6, 8, 10, 22, 34, 46,

58, 72 y 96 horas.

Consumo de sustrato. Para establecer el comportamiento en relación al

consumo de sustrato (Lactosa), se tomó como base la curva patrón de azúcares

reductores (Anexo D), determinada por el método colorimétrico modificado

DNS (ácido dinitrosalicilico). La concentración de lactosa presente en el medio

de cultivo, fue medida por el método espectrofotométrico a 540 nm (AOAC

16051; Serna y Naranjo 2005; Serna y Rodríguez 2007).

Recuento en placa. Se utilizó peptona universal (0.1% p/v), para realizar

diluciones sucesivas de las muestras inoculadas hasta 108

UFC mL-1

en

proporción 1:9. Se sembró en profundidad en agar MRS y se incubó a 37oC, por

72 h en condiciones de anaerobiosis. El conteo de células viables se realizó

como UFC/ml y se expresó el resultado en unidades logarítmicas (UFC/ml).

Para cada sustrato en los tiempos de control, el recuento se efectuó por



52

triplicado. Se estableció, a través de preensayos que se debía realizar diluciones

de 10-7

y 10-8

UFC mL-1

porque se encontró que para 10-5

UFC mL-1

era

incontable.

Acidez desarrollada. La acidez fue medida mediante titulación según AOAC

947.05/09, en términos de grados Dornic (ºD). Se tomó como referencia la

acidez requerida en lactosuero a emplear en la elaboración de quesos de pasta

hilada, que según lo reportado por la empresa Colquesos es de mínimo 120°D

(información primaria; Jaramillo et al. 1993).

Cabe anotar que como el peso molecular del ácido láctico es 90 g/mol, un

°Dornic equivale a 1mg de ácido láctico lo que equivale a 0.01 gramos de ácido

láctico.

Contenido de nitrógeno y proteína. Este se determinó por el método Kjendahl

(AOAC 976.06), para luego calcular el porcentaje de proteína.

Estimación de parámetros cinéticos. Fueron estimados los parámetros

cinéticos empleando un modelo descriptivo para el crecimiento, utilizando la

información recaudada como respuesta al efectuar la medición de variación de

las concentraciones de lactosa, recuento en placa y acidez, en relación al tiempo

de fermentación para cada uno de los tratamientos, que son requeridos para la

solución de los modelos matemáticos siguiendo las ecuaciones propuestas



53

donde se relacionan parámetros cinéticos definidos; luego se procedió a

solucionar dichos modelos numéricamente; y a compararlos gráficamente con

los puntos experimentales a fin de corroborar y dar validez a los modelos

planteados.

Considerando que la bacteria crece exponencialmente, se graficó en una escala

logarítmica la población bacteriana contra el tiempo (h), y se ajustó

acorde a los modelos de Gompertz y Logístico modificado (Anexo I). La

velocidad de producción de ácido láctico fue descrita por el modelo de

Luedeking y Piret (Luedeking y Piret 2000; Jakymec et al. 2001; Garcia 2012).

Dónde α y β son los parámetros asociados y no al crecimiento (Luedeking y

Piret 2000). De modo que las velocidades volumétricas de crecimiento

(UFC/ml.h), de producto (mg/ml. h), de consumo de sustrato, la velocidad

especifica de crecimiento (μ) y los parámetros de producción α y β, permitieron

modelar el crecimiento y la producción de ácido láctico por Lactobacillus casei

y principalmente el desarrollo de acidez en los distintos tratamientos. Los

valores de los parámetros del modelo fueron ajustados minimizando la función

objetivo:



54

La ecuación (SSE) es la suma del cuadrado del error, donde n es el número de

observaciones en la fermentación de cada tratamiento, Xiexp representa el dato

experimental y Xical el dato calculado por los modelos.

La naturaleza sigmoidal de la curva de crecimiento de los microorganismos,

hace que los modelos aplicables deban ajustarse a esta característica; de tal

forma, que los modelos logístico modificado, Gompertz, Baranyi describen

apropiadamente este comportamiento basándose en la representación del

logaritmo del tamaño de la población (ln(N/No)) versus el tiempo y la obtención

de parámetros microbianos de fácil interpretación como son μmax, λ y As. El

parámetro λ representa el tiempo lag, periodo en el cual la fase exponencial se

caracteriza por la velocidad máxima de crecimiento μmax, parámetro común a

los anteriores modelos. Cuando aparece la fase estacionaria se alcanza el valor

de la asíntota del parámetro As (Van Boekel 2009). La velocidad específica

máxima de crecimiento (μmax) fue determinada ajustando los modelos de

crecimiento a los modelos de Gompertz, Logistico modificado y Baranyi

integrado.



55

3.4.5. Procesamiento y análisis

Las pruebas y los análisis aplicados fueron los de varianza ANAVA, pruebas de

comparación de Duncan y polinomios ortogonales. Se realizaron análisis por cada

tiempo y al final se realizó una regresión para ver el efecto del tiempo. Como

prueba de validación se aplicó Shapiro-Wilk y la prueba de homogeneidad de

varianza de Hartley (Anexos E y F)

Los parámetros estequiométricos y cinéticos fueron evaluados aplicando un

análisis de varianza (ANOVA) a los diferentes tratamientos y una prueba de

comparación de medias de Tukey a los tratamientos que mostraron diferencias

significativas (p<0.05). (Anexo F)

Se realizó un ajuste de modelos cinéticos de Gompertz y Logístico modificado

por regresión no lineal, para lo cual se empleó el software STATGRAPHICS®

Centurión XVI (Warrenton, Virginia. U.S.A). Para seleccionar el modelo que

presento el mejor ajuste se utilizaron como criterios estadísticos el valor del

coeficiente de determinación, basado en la observación del menor valor en el

error estándar (SSE) y en el R2

de acuerdo a lo planteado por (Montgomery

1997; Sprinthall 2007 y Gutiérrez y de la Vara 2008) (Anexos G, H e I)

3.4.6. Diseño Estadístico

Se aplicó diseño experimental completamente al azar con arreglo factorial 2x3,

donde el factor 1 es el tipo de lactosuero empleado, con 2 niveles (suero ácido



56

entero y suero ácido desproteinizado) y la cantidad de inóculo empleado, con 3

niveles 5, 10 y 15%, con tres repeticiones, para un total de 18 unidades

experimentales, evaluando, el consumo de lactosa, producción de ácido láctico, los

parámetros cinéticos y estequiométricos durante las 96 horas de fermentación.



57

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1. CARACTERIZACIÓN DEL LACTOSUERO

La tabla 9 muestra las características fisicoquímicas de los tipos de lactosuero

empleados en la investigación.

Tabla. 9. Características fisicoquímicas de los lactosueros

Lactosuero desproteinizado Lactosuero entero

Ceniza (%) 0,22±0,13 0,45±0,26

Lactosa (g/dL) 4,37±0,03 4,12±0,06

Densidad (g/ml) 1,026±0,00 1,029±0,00

pH 4,8±0,00 5,35±0,00

Acidez (°D) 34,67±0,58 28±0,00

Nitrogeno (N) 0,098±0,00 0,185±0,01

Proteína (%) 0,628±0,02 1,03±0,15

Grasa (%) DLD 0,3±0,00

ST (%) 5,22±0,11 6,09±0,37

Humedad (%) 94,78±0,11 93,91±0,37

DLD: Debajo del límite de detección

La caracterización realizada a los lactosueros coincide con el rango de valores

reportado para lactosuero ácido y lactosuero de requesón por (Guerrero et al.

2012). Se pudo observar en el suero desproteinizado una notable concentración

de la acidez posiblemente causada por el calor al efectuar la desproteinización,

al igual que una disminución en el contenido de nitrógeno. Los valores de



58

nitrógeno y proteína para este suero son comparables a los hallados por

(Urribarri et al. 2004). Así mismo, los resultados obtenidos para el lactosuero

entero son similares a lo encontrado por (Monsalve y Gonzalez 2005; Madrid

1999; Panesar et al.2007; Franchi 2010).

El valor del pH en los dos tipos de lactosueros, los define como sueros ácidos

(Miranda et al. 2009), pudiéndose considerar medianamente ácido al suero

entero y ácido al desproteinizado, de acuerdo a lo observado por (Gutiérrez

2006); estudios realizados señalan que la mayoría de las bacterias ácido lácticas

tienen alta tolerancia a pH por debajo de 5.0, lo que da la ventaja competitiva

sobre otras bacterias (Hofvendahl y Hagerdal 2000), y al empleo de L. casei en

lactosuero con estas características viable desde el punto de vista biotecnológico

para ser usado en producción de ácido láctico.

4.2. RELACIÓN DE LA ACIDIFICACIÓN CON EL TIPO DE

LACTOSUERO E INÓCULO.

Se observa que el tipo de lactosuero, la concentración del inóculo el tiempo de

fermentación y la interacción de estas variables tienen un efecto significativo

(p<0,05) sobre la formación de ácido (Anexo E).

En los tratamientos con lactosuero desproteinizado se presenta una mayor acidez

promedio que en aquellos donde se usó lactosuero entero (Figura 5), mientras



59

que el inóculo al 15% logró una mayor acidez media en todos los tratamientos y

las concentraciones de 5 y 10%, mediante un análisis de comparación de medias

por Tukey, no mostraron diferencias significativas (p>0,05) (Anexo E).

Figura5. Efecto de la interacción del tipo de lactosuero (a) 1: Entero,

2: Desproteinizado; y del porcentaje de inóculo (b) en la acidificación (°D).

La interacción entre el tipo de lactosuero y el inóculo muestra un efecto

favorable a altas concentración de inóculo y lactosuero desproteinizado (Figura

6); sin embargo, la acidez media más alta fue de 108°D con el lactosuero entero

y 15% de inóculo, en los demás casos se formaron dos grupos estadísticamente

significativos formados por los tratamientos con lactosuero entero inoculado con

5 y 10%; lactosuero desproteinizado inoculado con 5, 10 y 15%, tal como lo

Entero Desproteinizado

1 2

Tipo de Lactosuero

61

64

67

70

73

76

Ácid

ez(ºD

)

a



60

establece el análisis de diferencias de las interacciones tipo de lactosuero :

inóculo por la prueba de Tukey (Anexo E).

Figura6. Acidificación con L. casei debido al efecto combinado del tipo de lactosuero

1: entero, 2: desproteinizado y concentración de inóculo (■: 5%; ▲:10%; ♦: 15%)

En términos generales, se deduce que el lactosuero entero y las altas

concentraciones del inóculo al inicio de la fermentación favorecen una alta

acidificación del medio. Tal como lo reportado (Aguirre et al. 2009), al

producir biomasa de L. casei a partir de lactosuero ultrafiltrado de leche de

cabra, al obtener una bebida fermentada acidificada por Lactobacillus, ellos

demostraron que las bacterias ácido-lácticas inoculadas en el suero de queso,

durante el proceso de elaboración, lograron crecer en este medio, gracias en



61

parte a la composición de nutrientes de la materia prima inicial y el nivel de

inóculo utilizado (Miranda et al. 2007),

En este estudio los dos tipos de lactosuero, no se presentaron diferencias

estadísticamente significativas en el valor de la acidez durante las primeras 10h

de la fermentación (Anexo E), con muestreos cada dos horas. Lo anterior

concuerda con lo aportado por (Machado et al. 2007), quienes establecieron que

a medida que se fermenta el suero lácteo, la mayor cantidad de ácido láctico se

obtiene, en general, con mayores tiempos de fermentación. Sin embargo, otras

investigaciones señalan que el producto principal del metabolismo de L. casei,

el ácido láctico, inhibe el desarrollo de biomasa, la estrategia de cultivo por lote

alimentado se recomienda como la que preferentemente debe utilizarse, para

contrarrestar esta limitante. (Aguirre et al. 2009).

En la actividad desarrollada por la empresa Colquesos, para la elaboración de

quesos de pasta hilada, se requiere el uso de lactosuero ácido con 120°D mínimo

(información primaria suministrada por Colquesos; Jaramillo et al. 1993). Es así

como, las Figuras 7 y 8 muestran que los tratamientos con lactosuero entero y

lactosuero desproteinizado inoculado al 5% y 10% con L casei, alcanzaron el

valor mínimo de acidificación; mientras el tratamiento con 15% de inóculo en el



62

Lactosuero desproteinizado, no alcanza el valor deseado en todo el desarrollo

de la fermentación.

En la presente investigación, para el caso específico de los tratamientos con

lactosuero entero inoculados al 5% el valor de referencia se alcanzó a las 82h y

con10% a las 86h; mientras que con el lactosuero desproteinizado inoculado al

5% a las 72h y a las 87h para el 10% de inóculo. En el lactosuero inoculado al

15% se alcanza la acidez deseada a las 34h, lo cual no se consiguió para el suero

desproteinizado aun completándose las 96h de la fermentación. Según lo

observado por (Orozco y Solarte 2003), los microorganismos toman los

nutrientes del medio y lo utilizan para llevar a cabo todas sus funciones

metabólicas: mantenimiento, crecimiento, reproducción y biosíntesis de

metabolitos. En muchos casos el producto de las fermentaciones industriales es

la biomasa, pero en la gran mayoría de los esquemas de producción son

sustancias de alto valor agregado por fermentación, una vez que se verifica el

crecimiento de la biomasa se favorece la biosíntesis de un metabolito como

producto; de este modo el lactosuero entero mostro un comportamiento como

sustrato que favorece la síntesis de producto, mientras el lactosuero

desproteinizado el crecimiento del microorganismo.



63

Figura7. Acidificación con L. casei debido al efecto de lactosuero entero

inoculado al ■: 5%, ▲:10% y ♦: 15%.

Figura 8. Acidificación con L. casei debido al efecto de lactosuero

desproteinizado inoculado al ■: 5%, ▲:10% y ♦: 15%.



64

El lactosuero ha sido un medio de cultivo empleado para la acidificación por vía

biotecnológica (Ghasemi et al. 2009), de igual modo, se ha desarrollado

fermentaciones lácticas en el sistema batch usando cepas homofermentativas de

Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, y Lactobacillus casei a partir de

otras fuentes complejas nutricionales o por la suplementación de estas.

4.3. CINÉTICA DE CRECIMIENTO, CONSUMO DE SUSTRATO Y

FORMACIÓN DEL PRODUCTO.

La formación de ácido láctico en los medios con lactosuero entero y

desproteinizado e inoculados con 5, 10 y 15% de cultivo madre, fue evaluada y

representada mediante un perfil de fermentación con L. casei, donde se

consideró la formación de ácido láctico, concentración de lactosa, y recuento de

L. casei, tal como se observa en las figuras de la 9 a la 14.

Se evidencio que en los medios inoculados con 5% (Figura 9, 10) al final del

periodo de fermentación (96h) la concentración de lactosa fue de 27,7g/L en el

lactosuero entero y 40,1g/L en el desproteinizado, correspondiente a una

conversión del 32,8% y 8,2% de lactosa respectivamente. Esto concuerda con lo

encontrado por (Serna y Rodriguez 2007), quienes concluyeron que la

concentración de azúcares totales muestra un efecto mucho menor e inverso

sobre la concentración de ácido láctico, lo que significa que un aumento en la



65

concentración de azúcares produce una ligera disminución en la concentración

de ácido láctico.

Tiempo(h)

Lacto

sa, Á

cid

ez(g

/L)

Variables

Lactosa(g/L)

Ácidez(g/L)

UFC/L

UFC/L

0 20 40 60 80 100

0

10

20

30

40

50

14

17

20

23

26

29(X 1,E7)

Figura9. Perfil de fermentación con L. casei en Lactosuero. Concentración de

lactosa (■), ácido láctico (♦) y recuento de L. casei (▲) en lactosuero entero y

5% de inóculo.

Lacto

sa, A

cid

ez (

g/L

)

Tiempo(H)

Variables

Acidez (g/L)

Lactosa (g/L)

UFC/L

UFC/L

0 20 40 60 80 100

0

10

20

30

40

50

11

15

19

23

27

31(X 1,E7)


lactosa (■), ácido láctico (♦) y recuento de L. casei (▲) en lactosuero

desproteinizado y 5% de inóculo.



66

El mayor crecimiento fue de 3,08E+08 UFCL-1

en el lactosuero desproteinizado

y de 2,88E+08 UFC L-1

en el entero a las 96h de fermentación. El

comportamiento del lactosuero desproteinizado al ser empleado como sustrato,

sugiere que en este se encuentran, además de los micronutrientes señalados en la

caracterización, factores de crecimiento, aminoácidos y ácidos grasos,

considerados esenciales para el crecimiento y la producción de ácido láctico por

L.casei tal como plantean (Serna y Rodriguez 2007), quienes sometieron a

fermentación sustratos vegetales no enriquecidos, encontrando comportamientos

similares.

En los medios inoculados con 10% del cultivo madre, en el caso del lactosuero

entero (Figura 11) se logró una conversión de 43,6% y una concentración de

ácido láctico 13,9gL-1

. En el lactosuero desproteinizado (Figura 12) la

conversión de lactosa fue de 22,2% para una producción de 13,7 g L-1

de ácido

láctico. Al final de la fermentación del lactosuero entero e inoculado con 10%,

se observa una reducción del crecimiento del microrganismo de 3,16E+08

UFC/L a las 72h hasta 1,86E+08 UFC/L a las 96h; mientras en el lactosuero

desproteinizado no se observa reducción del crecimiento. Estudios realizados al

inocular 10% de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, con ajuste de pH y

suplementación de nutrientes (extracto de levadura, peptona tripsica de caseína

y lactosa), demostraron que los rendimientos de biomasa disminuyen al



67

aumentar la concentración de lactosa, de modo que la mayor concentración de

ácido láctico se obtiene en suero desproteinizado sin adición de lactosa,

evidenciando que entre mayor es el sustrato, mayor es el consumo y mayor la

velocidad de consumo; puesto que la producción de ácido láctico origina una

disminución del pH en el medio y este bajo pH afecta el crecimiento, el

consumo y la producción (Jakimec et al. 2001). Lo cual sucedió con el

lactosuero entero que muestra mayor producción de ácido, pero menor

crecimiento en términos de biomasa.

La

cto

sa

, Á

cid

ez(g

/L)

VariablesLactosa(g/L)Ácidez(g/L)UFC/L

UFC/L

0 20 40 60 80 100

Tiempo(h)

0

10

20

30

40

50

12

16

20

24

28

32(X 1,E7)


lactosa (■), ácido láctico (♦) y recuento de L. casei (▲) en lactosuero entero y

10% de inóculo.



68

Lacto

sa, Á

cid

ez(g

/L)

Tiempo(h)

Variables

Lactosa(g/L)

Ácidez(g/L)

UFC/L

UFC/L

0 20 40 60 80 100

0

10

20

30

40

50

16

19

22

25

28

31(X 1,E7)




Con respecto a los medios inoculados con un 15% del cultivo madre, durante la

fermentación del lactosuero entero (Figura13) se logró la mayor concentración

final de ácido láctico (20,8 g L-1

), una conversión de 36,2% de lactosa y

3,63E+08 UFCL-1

de L. casei; caso contrario en el lactosuero desproteinizado

(Figura14) donde se obtuvo la menor concentración final de ácido láctico

(8,1g/L).



69

La

cto

sa

, Á

cid

ez(g

/L)

VariablesLactosa(g/L)Ácidez(g/L)UFC/L

UFC/L

0 20 40 60 80 100

Tiempo(h)

0

10

20

30

40

21

25

29

33

37(X 1,E7)


lactosa (■), ácido láctico (♦) y recuento de L. casei (▲) en lactosuero entero y 15% de

inóculo.

Lacto

sa, Á

cid

ez(g

/L)

Variables

Lactosa(g/L)

Ácidez(g/L)

UFC/L

UFC/L

0 20 40 60 80 100

Tiempo(h)

0

10

20

30

40

50

18

20

22

24

26

28

30(X 1,E7)






70

Las figuras concuerdan con lo arrojado en la Tabla 10, donde se observa que los

medios con lactosuero entero obtuvieron las mayores conversiones de lactosa a

ácido láctico, a las tres concentraciones de inóculo, la menor (8,2%) fue en el

lactosuero desproteinizado e inoculado con 5% de L casei, (5,09g/L) de ácido

láctico, mostrando que la fermentación se direcciono al desarrollo del L. casei

en el medio. En cuanto al crecimiento, la concentración de Lactobacillus casei

fue de 2,82E+08±0,097 UFCL-1

promedio de los tratamientos a las 96h de

fermentación. Los resultados obtenidos muestran que los residuales de lactosa

no son mejores a los reportados en la fermentación con L. helveticus a

concentraciones iniciales de lactosa de 36 g L-1

y 52 g L-1

se alcanzó un azúcar

residual de 8,5 g L-1

y 7,5 g L-1

(Plessas et al. 2008), así confirman que el efecto

de la suplementación favorece la bioconversión a ácido láctico (Garcia 2012);

tal como lo muestran los estudios cuando al suplementar con una fuente de

nitrógeno se mejoró la velocidad de bioconversión y se duplico el ácido láctico

producido (De Lima et al. 2009).

La Tabla 10 muestra los tratamientos evaluados para producir ácido láctico a

partir de lactosuero entero, desproteinizado y los inóculos a 5%, 10% y 15%, sus

respectivos valores medios obtenidos por diferencia desde las 2h hasta las 96h

de fermentación para el crecimiento de L. casei (X), concentración de ácido

láctico (P) y lactosa (S); y los coeficientes estequiométricos o rendimientos.



71

Tabla 10. Medias de Producción biomasa, ácido láctico y consumo de lactosa.

Crecimiento Producto Consumo

Biomasa A. Láctico Lactosa

Tratamientos X(UFC/L) P(g/L) S (g/L)

1 L1I5 1,18E+08±0,009ac 8,88±0,12ª 13,50±0,63ª

2 L1I10 5,28E+07±0,02b 11,21±0,035b 17,96±0,49b

3 L1I15 1,36E+08±0,03abc 16,27±0,12c 14,92±0,28ª

4 L2I5 1,82E+08±0,005d 5,09±0,087d 3,57±0,80c

5 L2I10 1,36E+08±0,011c 10,50±0,036e 9,69±0,33d

6 L2I15 9,06E+07±0,049ab 4,51±0,07f 7,72±0,35e

L1: lactosuero entero, L2: lactosuero desproteinizado, I: inóculo (5=5%, 10=10%, 15=15%)

Valores con igual letra, en una misma columna, no son significativamente diferentes, (α=0,05)

Se observó que el tipo de lactosuero, inóculo y la interacción de estos indican un

efecto significativo (p<0,05) sobre el crecimiento, el consumo de sustrato, la

formación de producto y los rendimientos de la fermentación (Anexo G). El

tratamiento con lactosuero desproteinizado favoreció el crecimiento del

L. casei, observándose valores de 1,82E+08UFC L-1

a partir de un inoculo del

5% (Tabla 10), con respecto al lactosuero entero donde se obtuvo el menor

crecimiento (5,28E+07UFC L-1

) con el inoculo del 10% de cultivo. Respecto a

la producción, cabe destacar que el tratamiento con lactosuero entero y 15% de

inóculo, mostró la mayor producción de ácido láctico (16,27 g L-1

), mientras



72

que el lactosuero desproteinizado con 15% de inoculo presento la menor

producción de ácido láctico (4,51 g L-1

); en cuanto al consumo de lactosa, el

tratamiento con lactosuero entero y 10% de inóculo, presento el mayor consumo

de lactosa (17,96 g L-1

), y el lactosuero desproteinizado con 5% evidencio el

menor consumo de lactosa (3,57 g L-1

); lo cual indica que probablemente el

primero fue un medio propicio para el desarrollo del microorganismo en lugar

de sintetizar producto, mientras que en el segundo el rendimiento de producto

con respecto a la biomasa (Y´p/x) fue superior. Otras investigaciones

desarrolladas en lactosuero inoculado por L. casei, demostraron que al optimizar

las condiciones del proceso se consiguió una conversión alta de lactosa

(95,62%) a L (+) producción de ácido láctico (33,73 g/L) después de un período

de incubación de 36 h (Panesar et al. 2010).

La acidificación y el consumo de lactosa muestra diferencias significativas

(p<0,05) para los factores de variación en el tipo de lactosuero, porcentaje de

inóculo y la interacción de estos, cuando son evaluadas en cada periodo de

tiempo monitoreado hasta las 96h (Anexo F). Mediante el test de media de

Duncan se obtuvieron 3 grupos diferentes asociados a cada uno de los inóculos

y tipos de lactosuero. En el caso del consumo de lactosa, la fuente de variación

mediante el test de Duncan mostró dos grupos en cada periodo evaluado; esto no

se presentó cuando se consideró el porcentaje de inóculo. La cinética de la



73

fermentación de los tratamientos muestra que deben ser considerados durante

todos los periodos y aplicar los modelos que nos permitan conocer los

parámetros cinéticos y estequiométricos, dado que modelos lineales y cuadrados

derivados del análisis por periodo (Anexo F) no nos permitieron caracterizar

adecuadamente los seis tratamientos.

4.3.1. Parámetros fermentativos

Basado en los datos experimentales de concentración de lactosa, ácido láctico y

recuento de L. casei los coeficientes estequiométricos fueron determinados para

formación de producto, consumo de sustrato y biomasa (Tabla 11) en cada uno

de los tratamientos, donde los factores de variación mostraron un efecto

significativo (p<0,05) sobre estos (Anexo G). El rendimiento de producto a

partir del sustrato (Y´p/s) fue más estable en los tratamientos con lactosuero

entero que cuando se usó el desproteinizado, y no está relacionado directamente

con el logro de la acidificación del medio al estándar requerido (120°D). El

medio con lactosuero entero e inoculado con 15% de cultivo madre logró la

acidificación a las 34h de fermentación, contrastado con el mejor rendimiento

Y´p/x igual a 80,38.



74

Tabla 11. Coeficientes estequiométricos Y´p/s, Y´x/s y Y´p/x, Qp, Qx

Rendimientos

experimentales

Productividad

Volumétrica

Tratamientos Lactosa

inicial

(g L-1)

Acidez

°D

Y´p/s Y´x/s Y´p/x

Qp gAL/Lh

Qx

UFC/Lh

1 Entero /5% 41,2 152

0,65ª 0,0169ª 38,83ª 0,095 1,25E+06

2 Entero /10% 41,2 139

0,62ª 0,0081ª 77,32b 0,119 5,62E+05

3 Entero /15% 41,2 236

0,86c 0,0136ª 80,38b 0,173 1,44E+06

4 Desproteinizado/5% 43,7 82

0,49c 0,1080b 13,18c 0,054 1,93E+06


0,68b 0,0275ª 39,43ª 0,112 1,45E+06


0,58ª 0,0218ª 26,88ac 0,048 9,64E+05

Los rendimientos obtenidos Y´p/s son superiores a los rendimientos de 0,47 a

0,33 cuando suplementaron con glucosa (Mirdamadi et al.2008); 0,15 y 0,23 en

lactosuero diluido (36 g L-1

) y no diluido (52 g L-1

) respectivamente (Plessas et

al.2008) usando L. helveticus. (Aguirre et al. 2009) reportaron 0,52 g g-1

en

suero de leche de cabra en un cultivo batch con un consumo de lactosa de 28,36

g L-1

después de 40 h de fermentación y al reportado de 0,53 g g-1

por García

(2012) cuando suplemento lactosuero desproteinizado con 2,62 g L-1

de sulfato

de amonio y 1,4 g L-1

de lactosa.

Considerando que el ácido láctico es el componente mayoritario de los ácidos

orgánicos formados en el suero lácteo; la cantidad teórica de ácido láctico que se



75

puede producir en la fermentación se calcula a través de reacción de

descomposición de la lactosa en glucosa y galactosa y luego de la glucosa en

ácido láctico. Esto indica que por cada mol de glucosa se forman 2 moles de

ácido láctico, si se considera los pesos moleculares de la lactosa y ácido láctico,

el máximo rendimiento teórico de ácido láctico producido seria de

1,05 gac.lactico/gLactosa, lo cual en la práctica, generalmente no ocurre y de obtienen

rendimientos de alrededor un 85% en los mejores casos (Serna y Ridriguez

2005). Este caso, es distinto a lo observado en sustratos como el lactosuero,

dado que en condiciones teóricas un sustrato puro adicionaría una fuente de

vitaminas y cofactores que son aprovechados en su totalidad, sin considerar que

una parte de estos en la realidad no son transformados, pues son usados para la

realización de las actividades metabólicas del microorganismo.

Los resultados muestran que a altas concentraciones de inóculo se favoreció la

acidificación en el lactosuero entero. Mientras que en el lactosuero

desproteinizado el crecimiento microbiano fue mayor y favorecido por la baja

concentración inicial de inóculo. Varios factores estimulan el crecimiento y

tienen considerable efecto sobre la producción de ácido láctico; entre ellos la

mezcla de aminoácidos y péptidos usualmente no solo estimulan el crecimiento

y resultan en velocidades de crecimiento mucho más altas (Vásquez 2008).

Estudios similares realizados con suero de leche de cabra desproteinizado,



76

demostraron que este es un sustrato adecuado (sin necesidad de suplementación

con fuentes adicionales de carbono o nitrógeno) para obtener concentraciones en

el orden de 3 a 4 g/L de biomasa probiótica de L. casei. Una vez liofilizada, esta

biomasa tiene una viabilidad en el orden de 1010

UFC/g de biomasa (Aguirre et

al. 2009). En otros estudios, se logro estandarizar curvas de crecimiento de

L. casei en lactosuero dulce con una producción celular de 5,9x1010

UFC/mL

en 75 h, y de ácido láctico de 70,39 y 76,24 g/L en 93 h, con 0% y 5% de

glucosa respectivamente (Escobar et al. 2010).

En investigaciones realizadas empleando residuos de cosecha, se obtuvieron

concentraciones de ácido láctico por encima de 70,19 g L-1, una conversión de

sustrato (CS) de 85,46%, Yp/s de 0,88 g g-1 y rp de 0,97 g L-1 h-1 con una

concentración de 90 g L-1 de azúcar total usando una mezcla de jugos de

cogollos y hojas (JCG) de la caña de azúcar y jugos extraídos de esta caña

(JCL), cosechada con quema y sin quema, con adición de 3% (p/v) de extracto

de levadura y la cepa Lactococcus lactis subsp. Lactis, la cual fue adicionada en

un 10% respecto al volumen. Aún sin adición de extracto de levadura, estas

mezclas presentaron muy buen comportamiento como sustrato de fermentación

ácido láctica; este comportamiento se explica en parte por el mayor contenido en

nitrógeno del JCG y del JCV, comparado con el JCL (Serna y Rodríguez 2007).



77

Los resultados obtenidos al evaluar la productividad Qp y Qx, evidenciaron que

el tratamiento con lactosuero entero y 15% de inoculo presento mayor

productividad en relación a la formación de ácido láctico, siendo la menor la

obtenida en el lactosuero desproteinizado inoculado con 5% de L .Casei; esto

concuerda con el comportamiento mostrado al evaluar los rendimientos

Y´p/s en esta investigación, y con lo establecido por (Serna y Rodríguez 2005),

para quienes las cepas que dan altas concentraciones y rendimientos, dan altas

productividades.

Respecto a Qx, se encontró que la mayor productividad fue obtenida en el

lactosuero desproteinizado con 5% de inoculo y la menor en el tratamiento con

lactosuero entero inoculado con 10% de L. casei, estos resultados concuerdan

con lo establecido por (Aguirre et al. 2009), quienes afirman que dado que el

producto principal del metabolismo de L. casei, el ácido láctico, se inhibe el

desarrollo de biomasa, recomendando la estrategia de cultivo por lote

alimentado como la que preferentemente debe utilizarse para conseguir altas

productividades tanto de biomasa como de producto.

4.3.2. Parámetros cinéticos

Los modelos Logístico modificado y Gompertz durante las 96 horas de

fermentación fueron los que mejor se ajustaron al crecimiento del L. casei en los



78

diferentes tratamientos (Figuras 15 a 20). Los datos experimentales (ln(N/No))

y los modelos ajustados de Gompertz y Logístico modificado describen las

etapas lag, exponencial y estacionaria en el lactosuero entero más no en el

lactosuero desproteinizado.





79







80


inóculo, experimentales (♦), Gompertz (□) y Logístico modificado (∆).





81



La Tabla 12, muestra las velocidades específicas de crecimiento máximas

(μmax) y tiempos lag (λ), calculadas para cada uno de los sueros y tratamientos,

calculados para cada uno de los modelos; arrojando que al calcular el Error

experimental y el R2

para los mismos, los modelos Gompertz y Logístico

modificado fueron los que mejor ajuste presentaron.

Para las fermentaciones analizadas, se encontró velocidades específicas de

crecimiento máximas (μmax) similares y tiempos lag (λ) diferentes.



82

Tabla 12. Parámetros de los modelos.

Lactosuero / Inóculo Modelo μmax (h-1

) As λ(h) SSE

Entero /5% Gompertz 0,032 0,585 33,61 0,098

Logístico modificado 0,014 0,535 38,54 0,100

Desproteinizado/5% Gompertz 0,26 492,14 289,15 0,27


Entero /10% Gompertz 0,007 0,886 43,53 0,231




Entero /15% Gompertz 0,0044 0,433 10,18 0,055




La velocidad específica de crecimiento (μmax) es afectada por el incremento de la

acidez en el medio y es menor en los tratamientos donde mayor acidificación se

logró a las 96h. En los medios inoculados con 5% las μmax fueron mayores a los

otros tratamientos, acorde al rango de 0.013 a 0.037 h-1 reportado por

(Mondragón y Nájera 2006), mientras que valores inferiores a 0,01 h-1 fueron

reportados por (Aguirre et al. 2009) usando L. casei y entre 0,26 y 0,4 h-1

en un

lactosuero suplementado (Garcia 2012).

La velocidad de formación de ácido láctico está directamente relacionada a la

velocidad de crecimiento definida por los parámetros α y β del modelo

Luedeking Piret. El valor α es el parámetro asociado al crecimiento del

microorganismo y el β está asociado a la biomasa, muestran diferencias



83

significativas en todos los casos (Anexo H) excepto el primero que no muestra

diferencias significativas (p>0,5) con respecto al tipo de lactosuero. Los

resultados muestran que hay un buen ajuste al modelo con los parámetros

α (g ácido láctico UFC-1

) y β (g ácido láctico log UFC-1

h-1

) y que la asociación

de la formación de ácido al crecimiento del L. casei (Tabla 13) caracteriza la

fermentación en todos los tratamientos y en un menor grado el parámetro β

asociado a la biomasa presente. Los modelos que se escogieron fueron ajustados

con base a que son asociados al crecimiento.

En otra investigación similar, realizada a partir de lactosuero desproteinizado

suplementado con extracto de levadura y peptona trípsica de caseína,

fermentada en un cultivo continuo con L. helveticus, se encontró una tasa

específica de crecimiento máximo, (μmax= 0,469 ± 0,012 h-1), un rendimiento

real (Yc= 0,759 ± 0,061 kg de biomasa producido/ kg de lactosa consumido para

crecimiento), Similar a lo observado en la presente investigación para el

lactosuero entero con 10% de inoculo. La máxima concentración de biomasa y

ácido láctico fue de 55 y 10,97 kg/m3, siendo la máxima productividad de

biomasa y ácido láctico 6,2 y 1,83 kg/m3.h respectivamente. Estos resultados

revelan y sugieren el potencial uso del lactosuero como sustrato para bacterias

homolacticas (Urribarrí et al. 2004). Del mismo modo, otros estudios han

demostrado que la fermentación en continuo da en la mayoría de los casos



84

mayores concentraciones y mayores rendimientos, comparado con la

fermentación en discontinuo; además, altas y concentraciones se obtienen

manteniendo constante el pH durante la fermentación. (Hofvendahl y Hagerdal

2000).

Tabla 13. Parámetros cinético α de formación de ácido láctico.

Lactosuero / Inóculo α Β SSE R2

Entero /10% 0,250ª 0,039b 0,19 95,5

Desproteinizado/5% 0,256ª 0,051c 0,28 93,7

Desproteinizado/10% 0,297b 0,042b 0,045 99,2

Entero /5% 0,344c 0,034ª 0,03 98,1

Entero /15% 0,370c 0,098d 0,68 93,0

Desproteinizado/15% 0,423d 0,039b 0,75 94,3

La cepa de L. casei logro alcanzar la acidificación deseada 120°D a partir de

lactosuero entero e inóculo al 15% en 34h de fermentación, sin control de pH y

sin agitación; la cepa se adaptó a las concentraciones de lactosa y gracias a que

este microorganismo puede hidrolizar el disacárido y metabolizar luego la

glucosa por vía glicolitica, logro su transformación alcanzando adecuados

parámetros cinéticos µmax, Y´P/S, Y´X/S, Qp, Qx, α y β (Salminen 1993; Serna y

Naranjo 2005).



85

5. CONCLUSIONES

Los lactosueros entero y desproteinizado proveniente de la elaboración de queso tipo

mozzarella y requesón en la empresa COLQUESOS de la ciudad de Sincelejo – Sucre,

se encuentran dentro de los rangos fisicoquímicos aceptable para su acidificación y

posterior empleo como suero ácido en la elaboración de nuevos lotes de producción de

este tipo de queso.

La acidificación de los tratamientos se logró con la inoculación de L. casei a 37°C y

120rpm, hasta valores superiores a los 120ºD, excepto en el lactosuero desproteinizado

inoculado con un 15% de cultivo.

Las ecuaciones logística modificada y Gompertz son las que mejor ajuste tienen para

describir las etapas lag, exponencial y estacionaria del L. casei en los medios y el

modelo de Luedeking-Piret se ajustan adecuadamente a la formación de ácido láctico de

acuerdo a lo observado al analizar el Error experimental y del R2.

Los parámetros cinéticos de crecimiento (µmax de 0.004 h-1) y de formación de

producto α de 0,37 g ácido láctico UFC-1

y de 0,09 g ácido láctico (UFC h)-1

) de la

fermentación corresponde al tratamiento con lactosuero entero y 15% de inóculo,

representa la acidificación hasta 120ºD en el menor tiempo, encontrando en este tipo de

lactosuero el mayor valor de y´p/s 0,86 g g-1

, al igual que la mayor productividad. Sin

embargo, el mayor crecimiento se experimenta en lactosueros desproteinizados.



86

6. RECOMENDACIONES

Evaluar el comportamiento de la acidificación de los lactosueros objeto de

estudio suplementando con fuentes de carbono, nitrógeno y minerales.

Ensayar empleando mayor porcentaje de inóculo para establecer si se puede

reducir el tiempo de fermentación.

Ampliar el estudio hacia la evaluación de las características de hilado del queso

tipo Mozzarella elaborado empleando lactosuero ácido entero fermentado hasta

120°D mediante la inoculación de 15% de L. casei.

Realizar mediciones de peso seco durante el proceso de fermentación para hacer

seguimiento al crecimiento de los microorganismos.



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104

ANEXOS



105

Anexo A. Ficha técnica del microorganismo empleado

Tabla 14. Especificaciones de Lactobacillus Caseí ATCC 393

Organism Lactobacillus casei (orla-Jensen) Hansen and

Lessel deposited as Lactobacillus casei subsp.

Casei (Orla-Jensen) Hansen and Lessel

Designations 03 [7. LAM 12473. Orland L-323.R.P Tittsler

303]

Isolation Dairy products (cheese)

Depositor GJ Hucker

Biosafetv Level 1

Shipped Freeze-dried

Growth ATCC medium 416: Lactobacilli MRS broth

Conditions Temperature: 37.0 °C

Permits/Forms In addition to the MTA mentioned above,

other ATCC and/or regulatory permits may be

required for the transfer of this ATCC

material. Anyone purchasing ATCC material

is ultimately responsible for obtaining the

permits. Please click here for information

regarding the specific requirements for

shipment to your location.

References Nucleotide (GenBank): AF129168

Lactobacillus casei sorbose operon partial

sequence.

Nucleotide (GenBank): Z75478 L. casei m

operon. 165-235 rRNA spacer (long). tRNA-

lle and tRNA-Ala genes.

Nucleotide (GenBank): Z80834 L.casei lacT

gene.



106

Anexo B. Evidencias fotográficas de las técnicas utilizadas para la

caracterización fisicoquimica y evaluacióndel proceso de fermentación de

los lactosueros objeto de estudio.

Figura 21. a) Determinación de Acidez por titulación y b) Medición de pH

de los lactosueros

Figura 22. c) Determinación de densidad d) Humedad y ST

a) b)

c) d)



107

Anexo B. (Continuación)

Figura 23. e) Determinación de contenido de nitrógeno y porcentaje de

proteína presente en los lactosueros

Figura 24. f) Determinación de porcentaje de grasa presente en los

lactosueros

Figura 25. g) Determinación de contenido de cenizas h) determinación de

contenido de lactosa

e)

f)

g) h)



108

Anexo B. (Continuación)

Figura 26. Lactobacillus casei activado

Figura 27. Formación del cultivo madre en leche entera UHT a) antes de

inocular la cepa de Lactobacillus caseí b) luego de incubación de la cepa c)

Control

Figura 28. Montajes proceso de fermentación batch.

a) b) c)



109

Anexo C. Ficha técnica del medio de cultivo empleado

Tabla 15. Especificaciones de AGAR M.R.S OXOIDCM0361

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones

M.R.S AGAR (de Man, Rogosa, Sharpe) - For Laboratory Use

Only/500g makes 8 Litres/ Typical Formula (gL-1) pH 6.2±

0.2 at 25°C

Proteosa peptona Nº 3 10.0 Suspender 64 g del medio en

un litro de agua destilada.

Reposar 5 minutos y mezclar

calentando a ebullición

durante 1 ó 2 minutos.

Esterilizar en autoclave

durante 15 minutos a 121 ºC.

Extracto de carne 8.0

Extracto de levadura 4.0

Glucosa 20.0

Monoleato de sorbitán 1 ml

Fosfato dipotásico 2.0

Acetato de sodio 5.0

Citrato de amonio 2.0

Sulfato de magnesio 0.2

Sulfato de manganese 0.05

Agar 13.0

pH final: 6.4 ± 0.2

Almacenar de 10 a 30 °C

Incubation method

42°C thermophilic: 2 days

35°C mesophilic: 2 days

30°C + 22°C mesophilic-

psychrotrophic

2+1 days

25°C psychrotrophic: 3 days



110

Anexo D. Curvas de calibración

Figura 29. Curva de calibrado para azucares reductores – Lactosa

Figura 30. Curva patrón microorganismo

Absorbancia a 540 nm

Azucare

s R

educto

res (

mg/L

)

[AR]=1492.49*Abs + 59.37

r2=98.79%

0 0,2 0,4 0,6 0,8

0

200

400

600

800

1000



111

Anexo E. Análisis de Covarianza de las variables Lactosuero e inóculo

TABLA 16. Estadística descriptiva - Análisis de Covarianza de las variables Lactosuero e inóculo

Análisis ANOVA Type I Sum of Squares:

Análisis de las diferencias por Tukey entre los tipos de lactosuero con un intervalo de confianza de 95%:

Categoría Media estimada Grupos 2 61,757 A 1 73,202 B

Variable Observaciones Observaciones con datos perdidos

Observaciones sin datos perdidos

Mínimo Máximo Media Desviación típica

ACIDEZ 594 0 594 22,700 267,900 67,480 43,757 Tiempo 594 0 594 2,000 96,000 32,545 30,310

Fuente GDL Suma de los cuadrados

Media de los cuadrados

F Pr > F

Tiempo 1 665645,934 665645,934 1760,107 < 0,0001 LACTOSUERO 1 19453,267 19453,267 51,438 < 0,0001 PORCENTAJE DE INÓCULO 2 114773,812 57386,906 151,743 < 0,0001 INTERACCIÓN: Tiempo*LACTOSUERO 1 29396,046 29396,046 77,729 < 0,0001 INTERACCIÓN: Tiempo*PORCENTAJE DE INÓCULO 2 13654,035 6827,018 18,052 < 0,0001 INTERACCIÓN:LACTOSUERO*PORCENTAJE DE INÓCULO 2 71616,926 35808,463 94,685 < 0,0001



112

Anexo E. (Continuación) Análisis de las diferencias por Tukey entre los porcentajes de inóculo con un intervalo de confianza de 95%:

Categoría Media estimada Grupos 10 56,692 A 5 58,641 A

15 87,106 B Análisis de diferencias de las interacciones tipo de lactosuero : inóculo por la prueba de Tukey

Categoría Media estimada Grupos

LACTOS-1*PORC-10 53,600 A

LACTOS-1*PORC-5 57,700 A LACTOS-2*PORC-5 59,583 A B

LACTOS-2*PORC-10 59,784 A B LACTOS-2*PORC-15 65,904

B

LACTOS-1*PORC-15 108,307 C



113

Anexo E. (Continuación) Análisis de las diferencias entre los tiempos de fermentación y la acidez observada con un intervalo de confianza de 95%: por la prueba de tukey

Categoría Media estimada Grupos

96 129,187 A

72 116,598

B

58 98,848

C 46 86,211

D

34 72,378

E 22 55,561

F

10 42,065

G

8 36,007

G

4 35,385

G

2 35,030

G

6 35,006 G

Figura 31. Gráfico de medias de la acidez

Tiempo (h)



114

Anexo F. Análisis estadístico de los lactosueros para los tratamientos y el tiempo

Tabla 17. Análisis estadístico de los lactosueros para los tratamientos y el tiempo

Cuadrados medios para acidez

TIEMPO

G

L

2 4 6 8 10 22 34 46 58 72 96

F.V

Tipo de Lactosuero 1 112.811** 167.481** 35.122** 15.041** 422.8** 58.593NS 194.180NS 1640.106NS 1917.689NS 8172.120NS 76915.629**

Porcentaje de

inóculo

2 1095.560** 1169.675** 1495.688** 2162.240** 3158.848** 12993.355** 10923.031** 16150.806** 18932.401** 12333.192** 7880.067*

Interacción:

Lactosuero*Porcen

taje

2 68.865** 136.192** 44.027** 22.465** 41.350** 831.768NS 5469.972** 13257.286** 13521.079** 16200.245** 26416.911**

Error

Experimental

1

2

0.368 2.470 1.410 1.222 5.084 130.202 275.469 617.377 983.241 1729.284 1261.604



115

Anexo F. (Continuación)

Pruebas de Duncan para acidez-lactosuero:

TIEMPO 2 4 6 8 10 22 34 46 58 72 96

Tipo de Lactosuero

1 36.559A 37.181A 35.925A 36.759A 42.755A 58.470A 74.274A 91.722A 104.807A 128.90A 176.022A

2 33.668B 33.659B 34.313B 35.703B 37.159B 56.387A 70.481A 80.700A 92.889A 104.30A 100.541B

Pruebas de Duncan para Acidez-Porcentaje de Inóculo

TIEMPO 2 4 6 8 10 22 34 46 58 72 96

PORCENTAJED

E INÓCULO

5% 34.522B 35.444B 32.577B 32.305B 33.055B 40.267B 60.333B 73.000B 88.24B 110.83B 117.48B

10% 27.625C 27.347C 27.544C 27.775C 31.586B 43.628B 50.083B 65.133B 73.05B 93.79B 138.04AB

15% 33.194A 43.469A 45.236A 48.613A 55.230A 88.392A 100.717A 120.500A 135.26A 145.18A 159.32A



116


Polígonos ortogonales para Interacción lactosaxporcentaje de inóculo para acidez

TIEMPO 2 4 6 8 10 22 34 46 58 72 96

POLÍGONO

LINEAL-L1 297.680* 102.722** 527.042** 1139.235** 2755.293** 11390.435** 22890.867** 43394.580** 43483.005** 38281.445** 32055.120**

CUAD-L1 1277.014** 1527.478** 1102.518** 1277.014** 1167.615** 6268.356** 8829.449** 14055.360** 18455.609** 13795.215* 18503.706NS

LINEAL-L2 381.800NS 571.783** 495.400** 1255.840** 1729.700** 9496.716** 401.388NS 46.080NS 81.920NS 2492.180NS 2.275NS

CUAD-L2 372.356** 409.751** 504.472** 697.322** 747.749** 494.738NS 664.302NS 1320.166NS 2886.426NS 2516.036NS 18032.856**



117


Pruebas de validación para acidez

TIEMPO 2 4 6 8 10 22 34 46 58 72 96

R2 (%) 99.54 99.66 99.92 99.79 99.81 97.83 99.86 99.98 99.96 99.90 99.96

C.V (%) 1.727 4.437 3.381 3.051 5.642 19.869 22.931 28.821 31.724 35.664 25.686

MEDIA 35.113 35.420 35.119 36.231 39.957 57.428 72.377 86.211 98.848 116.598 138.281

SHA-WILK 0.9432* 0.7628** 0.9697NS 0.7934** 0.8332** 0.7966** 0.8461** 0.9380** 0.9798NS 0.9303** 0.9565**

F.MAX 232.370NS 323.619* 47.544NS 59.710NS 187.911** 139.415NS 69.038NS 8.540NS 87.209NS 9.548NS 116.154NS



118


Cuadrados medios para lactosa

T GL 2 4 6 8 10 22 34 46 58 72 96

F.V

LACTOSA 1 1.211* 1.191** 1.004NS 1.802* 0.903NS 0.915NS 1.504* 0.827NS 10.973* 8.768* 16.237**

PORCENTAJE DE INÓCULO 2 0.595NS 0.991** 1,694NS 0.333NS 0.131NS 0.209NS 0.129NS 1.923NS 1.836NS 0.277NS 1.260NS

INTERACCIÓN:

LACTOSA*PORCENTAJE DE

INÓCULO

2 0.929* 0.579* 0.060NS 0.785NS 0.023NS 0.092NS 0.697NS 0.242NS 0.816NS 0.264NS 0.085NS

ERROR EXPERIMENTAL 12 0.209 0.115 0.868 0.203 0.325 0.547 0.282 1.089 1.349 1.444 1.469

Pruebas de Duncan para la lactosa

TIEMPO 2 4 6 8 10 22 34 46 58 72 96

LACTOSA

1 4.366A 4.108A 3.912A 4.093A 3.838A 3.898A 3.698A 3.235A 3.018B 2.760B 2.573B

2 4.066B 3.811B 3.639A 3.728B 4.096A 3.637A 3.364B 3.482A 3.920A 3.566A 3.670A



119

Anexo F. (Continuación) Pruebas de Duncan para la lactosa-porcentaje de inóculo

TIEMPO 2 4 6 8 10 22 34 46 58 72 96

PORCENTAJE

DE INÓCULO

5% 4.245BA 3.776B 3.468A 3.762A 3.871A 3.887A 3.439A 3.688A 3.816A 3.299A 3.390A

10% 4.382A 4.224A 4.081A 4.028A 3.993A 3.677A 3.606A 3.354A 3.405A 3.055A 2.861A

15% 4.021B 3.878B 3.777A 3.941A 4.036A 3.738A 3.548A 3.034A 3.187A 3.134A 3.112A

Polígonos ortogonales para interaccion LactosueroxPorcentaje de inóculo para lactosa:

TIEMPO 2 4 6 8 10 22 34 46 58 72 96

POLÍGONO

LINEAL-L1 2.070** 0.293NS 0.278NS 0.254NS 0.242NS 0.001NS 0.338NS 1.409NS 1.644NS 0.043NS 0.090NS

CUAD-L1 0.363NS 0.802* 0.835NS 0.184NS 0.002NS 0.038NS 0.007NS 0.188NS 0.442NS 0.010NS 0.844NS

LINEAL-L2 0.239NS 0.946* 0.615NS 1.608* 0.042NS 0.345NS 1.087NS 2.517NS 1.921NS 0.239NS 0.773NS

CUAD-L2 0.376NS 0.100** 1.780NS 0.191NS 0.021NS 0.218NS 0.221NS 0.218NS 1.298NS 0.791NS 0.982NS



120


Pruebas de validación para azúcar:

TIEMPO 2 4 6 8 10 22 34 46 58 72 96

R2 (%) 91.05 89.99 90.11 85.02 76.38 90.98 90.47 97.34 98.63 96.09 98.67

C.V (%) 10.84 8.56 24.67 11.52 14.37 19.62 15.03 31.07 33.48 37.99 39.18

MEDIA 4.216 3.959 3.775 3.910 3.967 3.768 3.531 3.358 3.469 3.163 3.121

SHA-WILK 0.957NS 0.980NS 0.874** 0.963NS 0.973NS 0.970NS 0.967NS 0.989NS 0.915** 0.933** 0.897**

F.MAX 17.04NS 85.53NS 35.08NS 8.18NS 24.41NS 44.35NS 84.86NS 13.19NS 64.19NS 195.74NS 143.02NS



121

Anexo G. Análisis factorial de los parámetros estequiométricos


Tabla 18 . Análisis de varianza para biomasa Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P

A:Inóculo 0,0444083 1 0,0444083 41,19 0,0000

B:Tipo Lactosuero 0,0288 1 0,0288 26,72 0,0003

AA 0,005625 1 0,005625 5,22 0,0432

AB 0,027075 1 0,027075 25,12 0,0004

Bloques 0,00123333 2 0,000616667 0,57 0,5803

Error total 0,0118583 11 0,00107803

Total (corr.) 0,119 17

R-cuadrada = 90,035 porciento

R-cuadrada (ajustada por g.l.) = 86,9689 porciento

Error estándar del est. = 0,0328334

Error absoluto medio = 0,0200926

Estadístico Durbin-Watson = 1,95748 (P=0,2926)

Autocorrelación residual de Lag 1 = 0,0197939


Gráfica de Interacción para Biomasa

0,16

0,2

0,24

0,28

0,32

0,36

0,4

Bio

ma

sa

Inoculo

5,0 15,0

Tipo Lactosuero=Entero


Tipo Lactosuero=desproteinizado


5,0

Tipo Lactosuero

desproteinizado

Gráfica de Efectos Principales para Biomasa

0,16

0,19

0,22

0,25

0,28

0,31

Bio

ma

sa

Inoculo

15,0 Entero



122

Gráfica de Interacción para Consumo Lactosa

0

4

8

12

16

20

Co

nsu

mo

La

cto

sa

Inoculo

5,0 15,0





Anexo G. (Continuación)

Pruebas de Múltiple Rangos para Biomasa por Tipo Lactosuero

Método: 95,0 porcentaje Tukey HSD

Tipo Lactosuero Casos Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos

Entero 9 0,193333 0,00906084 X

desproteinizado 9 0,273333 0,00906084 X

Pruebas de Múltiple Rangos para Biomasa por Inóculo


Inóculo Casos Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos

15 6 0,185 0,0110972 X

10 6 0,208333 0,0110972 X

5 6 0,306667 0,0110972 X

Tabla 19. Análisis de Varianza para Consumo Lactosa Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P

A:Inóculo 23,213 1 23,213 77,75 0,0000


AA 60,866 1 60,866 203,88 0,0000

AB 5,56241 1 5,56241 18,63 0,0012

Bloques 0,0522111 2 0,0261056 0,09 0,9169

Error total 3,28399 11 0,298545

Total (corr.) 415,727 17

R-cuadrada = 99,2101 porciento

R-cuadrada (ajustada por g.l.) = 98,967 porciento

Error estándar del est. = 0,546392

Error absoluto medio = 0,355216



Figura 34. Gráfico de Interacción para consumo de lactosa



123


Pruebas de Múltiple Rangos para Consumo Lactosa por Tipo Lactosuero Método: 95,0 porcentaje Tukey HSD


Desproteinizado 9 6,99667 0,173554 X

Entero 9 15,4656 0,173554 X

Pruebas de Múltiple Rangos para Consumo Lactosa por Inóculo Método: 95,0 porcentaje Tukey HSD


5 6 8,54 0,212559 X

15 6 11,3217 0,212559 X

10 6 13,8317 0,212559 X

Tabla 20. Análisis de Varianza para Ácido Láctico Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P

A:Inóculo 34,8502 1 34,8502 7,68 0,0182


AA 18,7345 1 18,7345 4,13 0,0670

AB 47,561 1 47,561 10,48 0,0079

Bloques 0,00854444 2 0,00427222 0,00 0,9991

Error total 49,9046 11 4,53678

Total (corr.) 283,361 17

R-cuadrada = 82,3883 porciento R-cuadrada (ajustada por g.l.) = 76,9694 porciento

Error estándar del est. = 2,12997 Error absoluto medio = 1,56852


Autocorrelación residual de Lag 1 = -0,223426

5,0



Gráfica de Interacción para Ácido Láctico

5,6

7,6

9,6

11,6

13,6

15,6

Ácid

o L

áctic

o

Inoculo

15,0



Figura 35. Gráfico de interacción para ácido láctico




124

Pruebas de Múltiple Rangos para Ácido Láctico por Tipo Lactosuero Método: 95,0 porcentaje Tukey HSD



Entero 9 12,1267 0,0293552 X

Pruebas de Múltiple Rangos para Ácido Láctico por Inóculo Método: 95,0 porcentaje Tukey HSD


5 6 6,99 0,0359526 X

15 6 10,3983 0,0359526 X

10 6 10,8583 0,0359526 X

Tabla 21. Análisis de Varianza para Yp/s Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P

A:Inóculo 0,157552 1 0,157552 5,78 0,0349


AA 0,0387434 1 0,0387434 1,42 0,2581

AB 1,3101 1 1,3101 48,10 0,0000

Bloques 0,0312148 2 0,0156074 0,57 0,5798

Error total 0,299589 11 0,0272354

Total (corr.) 2,13339 17





5,0



Gráfica de Interacción para Yp/s

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

Yp

/s

Inoculo

15,0



Figura 36. Gráfica de interacción para Yp/s




125

Pruebas de Múltiple Rangos para Yp/s por Inóculo Método: 95,0 porcentaje Tukey HSD


15 6 0,838167 0,0575286 X

10 6 0,854333 0,0575286 XX

5 6 1,06733 0,0575286 X

Pruebas de Múltiple Rangos para Yp/s por Tipo Lactosuero Método: 95,0 porcentaje Tukey HSD


Entero 9 0,791667 0,0469719 X


Tabla 22. Análisis de Varianza para Yp/x Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P

A:Inóculo 0,00667408 1 0,00667408 29,05 0,0002


AA 0,00219336 1 0,00219336 9,55 0,0103

AB 0,00567675 1 0,00567675 24,71 0,0004

Bloques 0,000147444 2 0,0000737222 0,32 0,7320

Error total 0,00252681 11 0,00022971

Total (corr.) 0,0246604 17





Gráfica de Interacción para Yp/x

-0,01

0,01

0,03

0,05

0,07

0,09

0,11

Yp

/x

Inoculo

5,0 15,0

Tipo Lactosuero=EnteroTipo Lactosuero=Entero



Figura 37. Gráfica interacción para Yp/x


Pruebas de Múltiple Rangos para Yp/x por Tipo Lactosuero



126



Entero 9 0,0131111 0,00387059 X


Pruebas de Múltiple Rangos para Yp/x por Inóculo Método: 95,0 porcentaje Tukey HSD


15 6 0,0176667 0,00474049 X

10 6 0,0178333 0,00474049 X

5 6 0,0648333 0,00474049 X

Tabla 23. Análisis de Varianza para Yx/s Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P

A:Inóculo 2537,17 1 2537,17 37,62 0,0001


AA 1363,95 1 1363,95 20,22 0,0009

AB 556,132 1 556,132 8,25 0,0152

Bloques 39,353 2 19,6765 0,29 0,7526

Error total 741,944 11 67,4495

Total (corr.) 12166,2 17





No puede ejecutarse la prueba de falta de ajuste.

No hay grados de libertad para el error puro.

5,0



Gráfica de Interacción para Yx/s

0

20

40

60

80

100

Yx/s

Inoculo

15,0



Figura 38. Gráfica de interacción para Yx/s



127


Pruebas de Múltiple Rangos para Yx/s por Tipo Lactosuero Método: 95,0 porcentaje Tukey HSD



Entero 9 66,3456 2,6896 X

Pruebas de Múltiple Rangos para Yx/s por Inóculo Método: 95,0 porcentaje Tukey HSD


5 6 26,0315 3,29407 X

15 6 55,1128 3,29407 X

10 6 59,038 3,29407 X



128

Anexo H. Anova para los parámetros cinéticos de Ludeking Piret.

Tabla 24. Anova para los parámetros cinéticos de Ludeking Piret.

Fuente GDL

Suma de los

cuadrados

Media de los

cuadrados F Pr > F

Inóculo 2 0,050 0,025 150,891 < 0,0001

Tipo 1 0,000 0,000 0,473 0,505

Inóculo*Tipo 2 0,019 0,010 57,535 < 0,0001

Inóculo / Tukey (HSD) / Análisis de las diferencias entre las categorías con un intervalo de confianza de 95%:

Contraste Diferencia Diferencia estandarizada

Valor

crítico

Pr >

Dif Significativo

10 vs 15 -0,123 -16,483 2,668

<

0,0001 Si

10 vs 5 -0,026 -3,491 2,668 0,011 Si

5 vs 15 -0,097 -12,992 2,668

<

0,0001 Si

Valor crítico del d de Tukey:

3,773

Categoría Media

estimada Grupos

10 0,274 A

5 0,300

B

15 0,397 C

Tipo / Tukey (HSD) / Análisis de las diferencias entre las categorías con un intervalo de confianza de

95%:

Contraste Diferencia Diferencia estandarizada Valor crítico

Pr > Dif Significativo

Entero vs

desproteinizado -0,004 -0,687 2,179 0,505 No

Valor crítico del d de Tukey:

3,081

Categoría

Media

estimada Grupos

Entero 0,322 A

Desproteinizado 0,326 A



129

Anexo H. (Continuación) Resumen de las comparaciones por pares para Tipo (Tukey

(HSD)):

Categoría Media estimada(alfa) Grupos

Entero 0,322 A


Categoría Media estimada(beta) Grupos


Entero 0,057 B

Resumen de las comparaciones por pares para Inóculo*Tipo

(Tukey (HSD)):

Categoría Media estimada(alfa) Grupos

Entero /10% 0,250a A

Desproteinizado/5% 0,256a A

Desproteinizado/10% 0,297b

B

Entero /5% 0,344c

C

Entero /15% 0,370c

C

Desproteinizado/15% 0,423d D

Categoría Media estimada(beta) Grupos

Entero /5% 0,034a A


B

Entero /10% 0,039b

B


B

Desproteinizado/5% 0,051c

C

Entero /15% 0,098d D



130

Anexo I. Modelos cinéticos aplicados

Modelos Ajustados:

Gompertz

Logistico modificado

evaluacion del proceso de fermentacion … del proces… · curva de calibrado para azucares...

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